Summary
In Vivo Säugetier-Modelle der kritischen Größe Knochendefekte sind essentiell für Forscher heilenden Mechanismen und orthopädische Therapien. Hier stellen wir ein Protokoll für die Erstellung von reproduzierbaren, segmentale, femoralen Mängel bei Ratten mit Fixateur externe stabilisiert.
Abstract
Orthopädische Forschung stützt sich stark auf Tiermodelle Mechanismen der Knochenheilung in Vivo zu untersuchen als auch die neue Behandlungstechniken zu untersuchen. Kritische Größe segmentale Mängel sind anspruchsvoll, um klinisch zu behandeln, und Forschungsanstrengungen könnten davon profitieren, eine zuverlässige, ambulante kleine Tiermodell eine segmentale femoralen Mangels. In dieser Studie präsentieren wir eine optimierte chirurgische Protokoll für die konsequente und reproduzierbare Schaffung eines kritischen Diaphysen Mangels 5 mm in eine Ratte Femur mit einem Fixateur externe stabilisiert. Die Diaphysen Ostectomy erfolgte mittels eine benutzerdefinierte Schablone 4 Kirschner Drähte Bicortically, platzieren die waren mit einem angepassten Fixateur externe stabilisiert. Eine oszillierende Knochensäge wurde verwendet, um den Defekt zu erstellen. Entweder ein Kollagen Schwamm allein oder eine Kollagen Schwamm RhBMP-2 in den Defekt implantiert wurde, und die Knochenheilung wurde über 12 Wochen mit Röntgenaufnahmen überwacht. Nach 12 Wochen Ratten wurden geopfert und histologischen Untersuchung erfolgte über die ausgeschnittenen Kontrolle und Oberschenkelknochen behandelt. Knochendefekten mit nur Kollagen Schwamm führte Pseudarthrose, während RhBMP-2 Behandlung die Bildung einer periostalen gefühllos und neue Knochenaufbau ergab. Tiere wieder gut nach der Implantation und externe Fixierung erwies sich als erfolgreich bei der Stabilisierung der femoralen Mängel über 12 Wochen. Dieses optimierte chirurgische Modell könnte leicht angewendet werden, um die Knochenheilung zu untersuchen und testen neue orthopädischen Biomaterialien und regenerative Therapien in Vivo.
Introduction
Orthopädische Unfallchirurgie konzentriert sich auf die Behandlung von einer Vielzahl von komplexen Frakturen. Kritischen Diaphysen segmentale Knochen, die Mängel schwierig nachweislich, klinisch durch die verminderte Regenerationsfähigkeit der umliegenden Muskeln und Knochenhaut sowie das Scheitern der Behandlung lokalisiert Angiogenese1. Moderne Behandlungstechniken beinhalten operative Fixierung mit Knochentransplantation, verzögert Knochentransplantation (Masquelet), Knochen-Beförderung, Fusion oder Amputation2,3,4. Bei den meisten Patienten, die ambulante Funktion erhalten nach ihrem Trauma mit gut funktionierenden distalen Gliedmaßen, ist Limb Salvage eindeutig eine bessere Behandlung Option5. Diese Bergung Behandlungen erfordern oft inszenierten chirurgische Eingriffe über eine lange Behandlungsdauer. Einige Autoren haben vorgeschlagen, dass externe Fixation verglichen mit der Fläche Osteosynthese für diese Anwendungen durch die verminderte Gewebeschädigung während der Implantation, verringerte implantiert und erhöhte postoperative Einstellbarkeit der überlegen ist der Fixateur6. Allerdings ist eine prospektive, randomisierte, kontrollierte Studie derzeit im Gange zur Klärung dieser Kontroverse der interne vs. externe Fixation in schweren offenen Frakturen der Tibia-7. Leider bestehen wesentliche Komplikation und Fehlerraten mit entweder Behandlung ausgewählt,8,9. Mit beiden Behandlungsmethode, in Bezug auf die segmentale Knochenschwund muss der Chirurg mit segmentale Diaphysen Mängel, die bedeutende Herausforderungen zu kämpfen. Korrekturen der segmentalen Mängel müssen Knochen Stabilisierung maximieren und gleichzeitig verbessern die knochenbildenden Prozess10,11.
Aufgrund der klinischen Bedeutung, doch das geringere Volumen der kritischen Größe Diaphysen segmentale Mängel ist eine effektive und reproduzierbare Tiermodell notwendig, Forschungsteams Behandlungstechniken und letztlich bessere klinische Ergebnisse zu ermöglichen. Forscher müssen in Vivo physiologischen heilenden Mechanismen in einem Säugetier Tiermodell studieren. Zwar gibt es solche Modelle der Fixateur externe bereits12,13,14,15hoffen wir ermöglichen eine zuverlässigere Methode für Pseudarthrosen in den unbehandelten Tieren und Verringerung der Kosten durch die Wahl der erschwingliche Fixateur Materialien und Gliederung eine einfache chirurgische Protokoll für die einfache Anwendung auf zukünftige Studien. Das primäre Ziel dieses Protokolls ist es, eine zuverlässige und reproduzierbare Modell eines kritischen Diaphysen Mangels an Ratten zu etablieren. Das Verfahren wurde durch Beurteilung der Stabilisierung und Knochenheilung in Ratte Oberschenkelknochen über 12 Wochen ausgewertet. Die sekundären Ziele enthalten: ein Modell als kosteneffektiv wie möglich, chirurgisches Vorgehen und Stabilisierung zu vereinfachen und sicherzustellen ethische Betreuung der Tiere machen. Die Autoren und Forschungsteam durchgeführt Vorversuchen mit einer Reihe von verschiedenen Biomaterialien und potenzielle regenerative Therapien zur Verbesserung der Heilung in dieser segmentalen defekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Ratten, die in dieser Studie verwendeten erhalten tägliche Pflege nach der AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren: 2013 Ausgabe16. Die institutionelle Animal Care und Use Committee der University of Wisconsin-Madison überprüft und genehmigt dieses experimentelle Protokoll vor Projektbeginn.
(1) Tiere
- Verwenden Sie die outbred Sprague-Dawley männliche Ratten mit einem Gewicht von ca. 350 g.
2. Vorbereitung der Knochen morphogenetische Protein-2 (RhBMP-2) getränkten Schwamm Gerüste
Hinweis: Gerüst Vorbereitung sollte nur vor der Implantation in das Femur auftreten (siehe Schritt 6.14).
- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Nutzung eines etablierten RhBMP-2 Knochen-Transplantat-Kit mit einem Kollagen Schwamm, lyophilisierter RhBMP-2 und steriles Wasser zur Rekonstitution17. Aufrechterhaltung der Sterilität, rekonstruieren Sie die RhBMP-2 mit sterilem Wasser zu einer Konzentration von 1,5 mg/mL.
- Mit steriler Schere und einem sterilen Lineal, trimmen Sie RhBMP-2 getränkt Kollagen Schwamm Umformen eine 5 x 3 mm x 3 mm defekt angepasst.
- Mit einer Spritze, die RhBMP-2-Lösung gleichmäßig verteilen Sie über das Kollagen Schwamm damit es absorbiert wird.
3. Vorbereitung des benutzerdefinierten Fixateur externe Gerät
Hinweis: Für die vollständige Auflistung der Abmessungen siehe Abbildung 1A .
- Schneiden Aluminium Blech Lager (Typ 6061, 0,088" Dicke) auf zwei Stücke (1,4" x 6") mit einer Stichsäge oder einem anderen geeigneten Werkzeug.
- Einteiler in die Fräsmaschine zu montieren und mit einer 1/8" 90°-Punkt Hartmetall Bohrer Mühle, cut vier 'V'-Rillen (0,035" tief) in Längsrichtung. Lassen Sie das andere Stück frei von Kürzungen.
- Einzelne Platten von 0.3" Breite der beiden Stücke (Abbildung 1 b). Messen Sie und Bohren Sie der Schraubenlöcher für 4-40 Gewinde. Tippen Sie auf Platte mit 'V'-Grooves mit 4-40 Gewinde. Bohren Sie die Platte ohne Rillen für eine #4 Schraube Körper Bohrer.
- Schleifen Sie beide Stücke um Ecken abrunden und reduzieren das Gewicht (Abbildung 1).
- Schrauben Sie Stücke zusammen mit 4-40, 18-8 Edelstahl-Taste Kopf Kopfschrauben (0,25"), so dass Nuten bündig mit der einfachen Platte (Abbildung 1 sind)
(4) Narkose Verfahren und Analgesie
- Anästhesie zu induzieren, indem man die Ratte in Induktion Kammer 4 L O2/min mit 4 % Isofluran zu liefern.
Achtung: Wissenschaftliches Personal müssen nicht einatmen betäubende Gas und richtige Kapuze und Belüftung im Labor. - Entfernen Sie die Ratte aus der Kammer zu, nachdem die Ratte aufrichtenden Reflex verliert, befestigen Sie einen Nase Kegel und auf die Erhaltungsdosis von Anästhesie durch die Nase (O2 Fördermenge um ca. 2-3 L/min und 0,8 % Isofluran).
- Platzieren Sie die Ratte auf das Heizkissen oder unter das wärmende Licht, um Unterkühlung zu verhindern.
- Bestätigen Sie die ausreichende Tiefe der Narkose durch Einklemmen der Zehs oder palpebrale Reflex-Tests.
- Augen zu verhindern Austrocknung der Hornhaut zuweisen Sie Schmierung.
- Eine subkutane Injektion von extended-Release Buprenorphin (1 mg/kg) auf den Stamm/Dorsum der Ratte, weit weg von der Operationsstelle Analgesie für bis zu 3 Tage nach der Operation zu liefern.
(5) aseptischen Vorbereitung und antibiotische Schutzausrüstungen
- Gegend um Hinterbein mit der 13th Rippe, der Fuß, der dorsalen Mittellinie und der ventralen Mittellinie als Margen zu rasieren.
- Scrub rasiert-Bereich mit steriler 2 x 2 Gaze getränkt mit 10 % Povidon-Jod gefolgt von 70 % EtOH (4 mal jeweils abwechselnd).
- Eine intramuskuläre Injektion von Cefazolin (20 mg/kg) in der operativen Quadrizeps zu verwalten.
- Verwalten von Enrofloxacin (0,25 mg/ml) im Trinkwasser für 7 Tage postoperativ um weiterhin Antibiotika geschützt.
- Stellen Sie Ratten auf Medizinalfutter (z. B. Uniprim) für die Dauer der Studie Pin Infektionen zu verhindern.
- Gelten Sie doppelte antibiotische Salbe für die Haut-polige Schnittstelle einmal täglich für 3 Tage postoperativ.
Hinweis: Vermeiden Sie jeder Fixateur externe Pin oder Klemmen Sie lösen, die zu die Entwicklung einer Infektion beitragen können.
(6) chirurgischen Eingriff
Hinweis: Stellen Sie eine konzertierte Anstrengungen zur Aufrechterhaltung eines sterilen Bereich und Arbeitsbereich und sterilen Technik während der Ganzheit des Falles zu folgen.
- Erweitern Sie rasierte Bein durch gefenstert, klar klebrigen drapieren und Deckel op Bank in sterilen Tüchern um einen sterilen Bereich zu erstellen.
- Ertasten der Femur und verwenden Sie eine #15 Klinge erstelle ich einen anterolateralen Einschnitt durch die Haut, die Verlängerung von der Patella auf den Trochanter Major am proximalen Femur.
- Vorsichtig einschneiden der seitliche Bein-Faszie entlang der intermuscular Septum, trennen den Vastus Lateralis Muskel des Quadrizeps anterior aus dem Oberschenkel nach hinten bis die laterale Femur ausgesetzt ist. Bewahren Sie die Entführer gluteal sehnen Einfügung auf den Trochanter Major.
- Führen Sie eine sorgfältige, atraumatische umlaufende Weichgewebe Dissektion und setzen Sie das Femur in seiner Mitte Diaphyse, beginnend auf der Mantelfläche. Um dies zu tun, verwenden Sie eine #15 Klinge sanft den Muskel vom darunter liegenden Knochen verringern, indem die Klinge gegen die Kontur der Knochenoberfläche parallel zu halten. Verwenden Sie einen periostalen Aufzug zu heben den Muskel von den freiliegenden Knochen, wie es zerlegt ist und fahren um die femoral Welle bis ca. 7-10 mm zentrale Diaphyse des Weichgewebes auf allen Seiten zur Vorbereitung der Ostectomy behoben wurde.
Hinweis: Vermeiden Sie Verletzungen an den medialen femoralen neurovaskuläre Bündel. - Fügen Sie vier 1,0 mm Kirschner (k) Kabel: 2 proximalen und distalen im Femur senkrecht in den seitlichen Oberschenkelknochen, 2 gerichtet gerade Lateral, Medial. Stellen Sie sicher, dass alle Pins beide Cortex (Bicortical) für ausreichende Stabilität (Abb. 2A) engagieren.
- Beginnen Sie mit der distalen-die meisten Pin zunächst nur auf der Ebene der seitlichen Epicondylus. Ort Jig bündig mit der lateralen distalen Femur und fügen Sie einen 1,0 Gewindespitze k-Draht.
- Beibehaltung der Position von der Schablone auf den Knochen, identifizieren Sie, wo die meisten proximalen Knochen anhand der Schablone Löcher die Eingabe der Pin wird. Sobald die Position bestimmt wird, einzuschneiden Sie sorgfältig Parallel zu den Fasern der gluteal Sehnen nach Bedarf erstelle ich eine kleine Lücke im Gewebe des proximalen Pins zu durchfahren, damit Minimierung iatrogener Schäden an der Sehne. Bohren Sie einen 1,0 mm ohne Gewinde k-Draht in diese Lücke wieder sicherstellen, dass der Stift greift beide Cortex (Abb. 2 b).
- Halten Sie die Gigue Position in Kontakt mit dem Knochen zu und Bohren Sie zwei 1,0 mm Gewinde k-Drähte, auf beiden Seiten des Standortes zukünftige defekt. Sicherzustellen Sie, dass Pins führen beide Cortex (Abbildung 2).
- Legen Sie den Fixateur externe bar Level 1 cm über der Haut und festschrauben Sie, sperren die Bar im Ort. Schneiden Sie die überschüssige Pin-Längen (Abb. 2D).
- Bereiten Sie für die Ostectomy (mangels Schöpfung) indem man einen kleinen, gebogenen Retraktor um die vorderen und hinteren Oberschenkel zum Schutz der umgebenden Weichgewebe, Muskel und neurovaskuläre Bündel. Unter Verwendung einer ~ 5 mm sagittale oszillierenden Sägeblatt, einen 5 mm segmentale defekt durch die Mitte Diaphyse sehr vorsichtig zu schaffen. Gelten Sie eine leichte, gleichmäßige Druckverteilung mit der Säge zu vermeiden unnötigen Bruch (Abb. 2E).
- Kleine Mengen von Bewässerung (Raumtemperatur 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung (NS)) je nach Bedarf während der Erstellung Fehler um thermische Nekrose des Knochens zu vermeiden gilt.
- Spülen Sie die Wunde mit 10 mL NS nach dem Erstellen des Mangels.
- Verabreichen Sie 0,1 mL ein Bupivacain 0,25 % mit Adrenalin (1: 200, 000) an die Wunde als Analgetikum und Vasokonstriktor.
- Legen Sie das Gerüst (5 x 3 x 3 mm) von Kollagen Schwamm oder RhBMP-2 getränkten Schwamm (aus Schritt2) in den defekt. Jedes Gerüst sollte entsprechend dimensioniert sein, um die Länge und Umfang des Mangels, helfen den Schwamm in Position bleiben zu überspannen.
Hinweis: an dieser Stelle mRNA-komplexe können vorbereitet und gespritzt wie in Schritten 7.1-7.3 unten beschrieben, wenn die Biolumineszenz Bildgebung durchführen. - Schließen Sie die Muskel-Ebene mit dem einfachen unterbrochene Muster mit 4: 0 resorbierbaren Naht. Schließen Sie die Hautschicht mit einem laufenden Subcuticular Muster mit 4: 0 resorbierbaren Naht und Haut kleben, um die überstehenden Stifte Lücken zu schließen.
- Entfernen Sie die Ratte aus die Bugnase, noch auf das Heizkissen und überwachen Sie kontinuierlich bis die Ratte in der Lage, konsequent eine aufrechte Körperhaltung beizubehalten. An dieser Stelle legen Sie in einem sauberen Käfig zu erholen.
7. Vorbereitung der komplexiert mRNA und Biolumineszenz Bildgebung
Hinweis: Transfektion mit mRNA-komplexe sollte während der Operation 1 Tag vor der Lumineszenz Bildgebung durchgeführt werden. Verwenden Sie sterile Techniken im Umgang mit mRNA.
- Mischung 10 µL der mRNA Kodierung für Gaussia Luciferase (Lager Konzentration von 1 µg/µL) mit 30 µL des Lipid-transfecting Agenten.
- Ermöglichen Sie die mRNA-Lipid-komplexe zu bilden durch Inkubation für mindestens 5 min bei Raumtemperatur. Die Lipid-transfecting Agent wird die mRNA-Moleküle kondensieren, sie zu stabilisieren und Transfektion Effizienzsteigerung.
Hinweis: Wenn die komplexe nicht sofort verwendet werden, speichern Sie sie im Eis für maximal 1 h. - Mit einer 20 µL Pipette mit gefilterten Tipps ausgestattet, die Hälfte des Volumens der mRNA-komplexe an den proximalen und distalen Enden des Mangels, bzw. Spritzen.
- Betäuben Sie am nächsten Tag, 3 min vor Bildgebung, die Ratte mit inhalativen Isofluran wie zuvor im Schritt 4.1 beschrieben.
- Positionieren Sie die Ratte in eine in-Vivo imaging-Kammer mit einem Prüfkopf liefert Wartung Isofluran (0,8 % Isofluran, O2 Fördermenge von ca. 2-3 L/min) ausgestattet.
- Coelenterazine Nukleinsäuretablette in Kochsalzlösung in einer Dosis von 4 mg/kg Körpergewicht in der Nähe des Mangels zu injizieren.
- Biolumineszenz-Bilder mit dem in-Vivo imaging-System (IVIS) laut des Herstellers Anweisungen18zu erwerben.
(8) Imaging-Protokoll
- Betäuben Sie nach der Kalibrierung der schlichten radiologischen Maschine, ein x-ray System19Ratte mit inhalativen Isofluran wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 4.1) zu und positionieren Sie die Ratte in einem Prüfkopf mit inhalativen Isofluran (0,8 % Isofluran, O2 Fördermenge von ca. 2-3 L/min) für eine Anteroposterior (AP) Femur Röntgenbild.
- Während die Ratte sternalen liegen wird, voraus die chirurgische Megalosauridae nach vorne beugen in der Hüfte und Gelenk zu ersticken. Das Knie Gelenk um ca. 90° Flex. Kleben Sie die Pfote plantaren Seite nach unten, in der Nähe der Körperwand. Positionieren Sie die Tibia nach vorne aus dem Oberschenkelknochen, die Möglichkeit der Überlagerung der Knochen zu beseitigen. Um leichtes Entführung der Hüfte zu bieten, legen Sie einen transluzenten Schwamm (ca. 15 mm dick) in der Leistengegend. Dann erhalten Sie ein anterior-posterioren (Cranio-caudale) Bild des Oberschenkelknochens.
- Wiederholen Sie diese AP Femur radiologischen Ansicht sofort nach der Operation, 4 und 12 Wochen. Verwenden Sie Band und Gaze, um des Tieres Extremität für Qualität und konsequente Imaging angemessen zu positionieren.
- Entfernen Sie die Ratte aus der Bugnase und überwachen Sie kontinuierlich bis die Ratte in der Lage, konsequent eine aufrechte Körperhaltung beizubehalten. Platzieren Sie anschließend zurück in den Käfig.
9. histologischen Verfahren
- Ratten in einer Kammer mit inhalativen CO2 gemäß AVMA ethischen Standards16einschläfern.
- Nach Euthanasie rasieren die Megalosauridae, entfernen Sie die Haut von der operative Extremität und Machtkonfiguration Femur an der Hüfte. Entfernen Sie vorsichtig alle Weichteile aus dem operativen Oberschenkelknochen (einschließlich alle Muskeln, Sehnen und Bänder). Lassen Sie nur eine dünne Schicht der Muskulatur rund um die defekt-Website, um die heilende Region vor versehentlicher Beschädigung während der Präparation zu schützen.
- Legen Sie das Femur in 10 % Neutral gepufferte Formalin bei Zimmertemperatur ca. 3-4 Tage für Fixierung ermöglichen. Halten Sie ein 15:1 Formalin Gewebe-Volumen-Verhältnis. Wechseln Sie die Lösung einmal auf halbem Weg durch die Fixierung Prozess.
- Entkalken Sie das Femur in eine 15 % Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) pH 6,5 Säurelösung für 3-4 Wochen. Sammeln Sie serielle Röntgenaufnahmen um Entkalkung Endpunkt zu bestimmen.
- Halbieren Sie den Oberschenkelknochen längs mit einem Schnitt von anterior Posterior in der Mitte sagittale Ebene. Gewebe für standard Paraffin einbetten und Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung einreichen.
- H & E Folien zu einem Pathologen zur histologischen Beurteilung zu senden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Operationen wurden in ca. einer Stunde durch einen Operateur mit Hilfe eines Assistenten durchgeführt. Nach chirurgischen Optimierung Intra- und postoperative Komplikationen wurden stark minimiert und der Jig Apparatur gewährleistet einheitliche Größe (5 x 3 x 3 mm) und Lokalisierung von femoralen Mängel verwenden. Ratten wurden ambulante unmittelbar folgenden Erholung aus der Narkose und schien nicht zu einer veränderten Verhaltensmuster haben; Ihr Gang war nicht Schmerzkur, und sie erschien nicht durch den Fixateur externe gestört werden.
Non-Thread k-Drähte wurden für die meisten proximalen Pin (Abbildung 2 b), ausgewählt, als die proximale Pin hatte das höchste Risiko brechen wenn Gewinde Drähte verwendet wurden. In einigen Fällen steuern insbesondere Kontrolle Tiere ohne RhBMP-2 oder Gerüste deren Mängel keine Hinweise auf Heilung/Knochenbildung, eine oder mehrere k-Draht-Tipps nach etwa 8 Wochen brach zeigte, wie gesehen in den Schwamm nur Röntgenaufnahme des ausgeschnittenen Femur ( Abbildung 3).
Röntgenaufnahmen und Histologie (H & E Fleck) wurden analysiert, um die Ebenen der Knochenheilung zu beurteilen. Negative Kontrolle Mängel mit nur einem Kollagen Schwamm ergaben sich keine Hinweise zur Überbrückung Osteogenesis zwischen der proximalen und distalen Knochen Kanten (Abbildung 3, Abbildung 4). Eine kleine Menge von neuen Knochenaufbau kann direkt angrenzend an den geschnittenen Femur Rand gesehen werden; für der Mangel selbst zeigt einen Mangel an knöchernen Material, das Vorhandensein von Knorpel und einige verbleibende Hämatome (Abbildung 4). Defekte mit RhBMP-2 getränkten Schwamm demonstriert erhebliche Knochenheilung bereits 4 Wochen nach der Operation, wie durch die röntgendichten gefühllos Brücken über den Defekt in Abbildung 3dargestellt. Von 12 Wochen, bedeutende neue mineralische Ablagerung (Abbildung 4, NB: neuer Knochen, PC: periostalen Herzlosen) in den Defekt gebildet hat. Bedeutender neue periostalen Knochen kann man in die gefühllose erstreckt sich von der geschnittenen Femur-Kante und Knochensplitter von gewebten und lamellarer Knochen während des Mangels entwickelt. Knorpel-Abscheidung ist nicht gesehen (Abbildung 4).
Histologie (H & E Fleck) wurde auch für eine nicht infizierte Steuerung und ein Beispiel für eine infizierte Femur (Abbildung 5) durchgeführt. Die infizierten Femur ist stark vergrössert und Anzeichen einer endosteal Reaktion den Knochen Kortex zu infiltrieren. Pfeile zeigen Bereiche der Osteoklasten vermittelten krankhaften Knochenabbau. Der nicht infizierten Femur Cortex bleibt kompakt und mit einem klar abgegrenzten lamellare Kortex. Antibiotika-Dosierung wurde optimiert, um maximale Abdeckung postoperativ enthalten. Während Infektion um die defekte Stelle,, auftreten kann kontinuierliche Verabreichung von Antibiotika topisch um Stift Websites und in Wasser und Ernährung bewährt postoperative Infektion zu minimieren.
Weitere Bildgebung mit In Vivo Imaging System (IVIS) veranschaulicht die Fähigkeit der Biolumineszenz Zellen innerhalb des Mangels nach Implantation der Fixateur externe (Abbildung 6) visualisiert werden. Die externe Platte kann leicht für die Bildgebung entfernt und nach Abschluss ersetzt werden. Zellen in der Markhöhle lumineszieren nach Transfektion mit komplexiert mRNA Kodierung für Gaussia Luciferase. Das höchste Niveau der Lumineszenz konzentriert sich auf dem Gelände des femoralen defekt und das Signal wird nicht durch die Fixierung Gerät Pins behindert. Dies ist vielversprechend für zukünftige Studien unter Berufung auf die Biolumineszenz oder Fluoreszenz, biologische Veränderungen z. B. ein Gen oder Protein Ausdruck während des Heilungsprozesses zu messen.
Abbildung 1: Fixateur externe Fertigung. A: CAD-schematische Darstellung der montierten Fixateur externe mit kommentierten Dimensionen für die ordnungsgemäße Herstellung. Jede Fixateur besteht aus zwei Aluminiumplatten mit zwei Schrauben zusammengehalten. B: Platten sind mit "V" Rillen in das untere Blatt Schneiden von 1,4 "x 6" Aluminiumbleche geschnitten. C: Schraube Bohrungen in den Platten (Gewinde in die Platte mit "V" Rillen) und alle Kanten und Ecken werden abgeschliffen werden Runde und Gewicht zu reduzieren. D: montierten Fixateur externe wird mit Schrauben (4-40 x 0,25", 18-8 Edelstahl-Taste Kopf Kappe) angezogen sobald Stifte in die 'V'-Rillen an den Innenseiten der Aluminium-Platten vorhanden sind. Die linke Pin ist ohne Gewinde und am proximalen am Femur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische Pinplatzierung, Fixateur Platzierung und mangels Schöpfung. A: die distale Pin (k-Draht 1,0 mm Gewinde) befindet sich an der Epicondylus Metaphysärer Region mit der Spannvorrichtung (blaues Rechteck), um korrekte Pin einsetzen zu führen. Die Vorrichtung ist auf der anterolateralen femorale Oberfläche gelegt. B: die proximale Pin (1,0 mm ohne Gewinde k-Draht) ist mit der Vorrichtung nach macht einen kleinen Schnitt in der gluteal sehnen platziert. C: die mittleren Pins (1,0 mm Gewinde k-Draht) sind mit der Spannvorrichtung eingefügt. D: die Schablone wird entfernt und die 2 Platten hängen an den Pins mit den 2 Schrauben um die Platten zu sichern. Die Platten werden festgezogen, 1 cm über dem Hautniveau, Druck auf der Haut zu vermeiden. E: eine sagittale oszillierende Säge wird verwendet, um einen Mangel von 5 mm zwischen den beiden mittleren Pins zu erstellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Repräsentative hochauflösende Röntgenbilder zeigen Knochenheilung mit RhBMP-2. Bilder für die Negativkontrolle Kollagen Schwamm und die getränkten Schwamm RhBMP-2 Gruppen angezeigt werden, bei 0, 4 und 12 Wochen postoperativ. Die RhBMP-2 behandelten Gruppe weist erhebliche Heilung nach 4 Wochen mit gefühllos überspannt den defekt. Heilen der Negativkontrolle Oberschenkelknochen endet nicht mit Überbrückung Knochen und der Mangel bleibt eine Pseudarthrose. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Erhebliche Knochenneubildung wird mit RhBMP-2 Behandlung gesehen. Vertreter 4 x vergrößerte H & E histologische Bilder für die Negativkontrolle Kollagen Schwamm und RhBMP-2 getränkten Schwamm Gruppen am Rande geschnittenen Femur und innerhalb des Mangels. Neuer Knochen gebildet, um den Femur Steuerkante, aber erhebliche Erweiterungen des neuen trabekulären Knochen sowie der periostalen gefühllos Projekt aus der behandelten Oberschenkelknochen. Keine knöchernen Material wird innerhalb der Steuerung defekt gesehen, während bedeutende Knochenbildung während der RhBMP-2 behandelten Fehler beobachtet werden kann. NB: F: Femur, C: Knorpel, Knochen, H: Blutung, PC: periostalen Herzlosen. Maßstabsleiste: 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Infizierte Femur Exponate Hypertrophie und entzündlichen Zellenmarkierungen. H & E histologische Bilder von einer nicht infizierten Oberschenkelknochen im Vergleich zu einer infizierten Femur, in der Vollbildansicht und bei 4 X Vergrößerung von Box Standorte. Der nicht infizierte femorale Cortex bleibt organisiert und abgegrenzter, mit kleinen Zeichen für eine Entzündung. Infizierten Femur vergrößert sich erheblich, wie in der Vollbildansicht zu sehen, und der Kortex ist durch Bereiche der Resorption und Nekrose (lila Zellcluster durch schwarze Pfeile angedeutet) aufgebrochen. F: Femur. Maßstabsleiste: 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Gaussia Luciferase Signal in den Mangel erkannt. Lumineszenz von Zellen transfiziert mit Gaussia Luciferase, die mRNA nach Entfernen der externen Platte mit IVIS abgebildet wird. Rot steht für die höchste Lumineszenzintensität auf dem Gelände des femoralen defekt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kleiner Tiermodelle der orthopädischen Verletzungen wie komplette Knochenbrüchen ermöglichen Forschung, die die Mechanismen der Osteogenesis und Beurteilung des therapeutischen Potenzials von Biomaterialien20untersucht. Diese Studie stellt eine Ratte segmentale defekt Modell stabilisiert durch eine benutzerdefinierte Fixateur externe, die eine Labor und biomedizinische Technik Team für weitere Studien der tragenden osteosynthetischen Knochen Reparatur leicht reproduzieren kann.
Frühere Studien mit kritischen Größe Mängel in Ratte-Modelle häufig verlassen sich auf interne Fixation Platten21,22,23,24. Zwar entweder Befestigungsmethode klinisch akzeptabel, hat Fixateur externe die deutliche Vorteile verursachen weniger Weichgewebe Störung und Blutverlust, Verringerung der implantierten Gesamtfläche um Chancen für bakterielle Besiedlung zu minimieren, und damit für postoperative Verstellbarkeit und inszenierten chirurgische Eingriffe6. Fixateur externe Tier Fraktur Vorgängermodelle haben unterschiedliche Plattenmaterialien, Pin Befestigung und/oder Knochen schneiden Methoden12,13,14verwendet. Da der externe Fixateur in diesem Protokoll in das Labor Werkstatt mit kostengünstigen Aluminium hergestellt wurde und kann leicht renoviert, wurden Kosten minimiert. Dies bietet eine wirtschaftliche Fixateur externe Forscher Experimente mit mehreren Tiergruppen durchführen ohne finanziell begrenzt erlaubt. Im Vergleich zu einer Osteosynthese-Modell glauben wir, dass dieses System technisch einfacher und mehr in einem kleinen Tiermodell reproduzierbar ist. Nach unserer Erfahrung mit diesen Modellen interne Fixation ist deutlich mehr technisch anspruchsvoll und kann individuell bearbeitet Implantate benötigen. Die Autoren wissen dieses allgemeine Protokoll ist einzigartig in seinem Gebrauch von einer maßgeschneiderten Jig in Kombination mit einer angepassten Metall Fixateur externe Design15, ebenso wie die Verwendung von einem oszillierenden Knochen besser sah das gemeinsame klinische Szenario darstellen periostalen Abisolieren durchgeführt, um die Fraktur Websites zur Fixierung vorzubereiten. Ein letzter Hinweis auf die Verwendung von einer oszillierenden Säge in diesem Modell ist, dass die erzeugte Wärme und der periostalen Störung, die auftritt, bietet ein letztes Element der Kontrolle bei der Bildung eines nicht-EU-Modells. Unsere Erfahrungen waren mit anderen Methoden in diesen Tiermodellen Ermittler das Risiko, dass die Steuerelemente, die Heilung.
Um chirurgische Erfolg zu gewährleisten, sollte darauf geachtet werden auf mehrere wichtige Schritte: beim einritzen und die Durchführung der umlaufenden Dissektion, aussetzen der Oberschenkelknochen aus den umliegenden Muskel, vermeiden Sie störende der Ischias Nerv kaudal, der femoralen Gefäße medial, und die gluteal Sehne proximal. Achten Sie darauf, die Jig Apparat Parallel zu positionieren und gegen die Wohnung anterolateralen Gesicht des Oberschenkelknochens zu spülen, so dass alle Pins genau senkrecht bis auf die Knochen. Dies bestätigen die korrekte Ausrichtung der Fixateur externe und verringern die Wahrscheinlichkeit des Pin Bruch. Die Reihenfolge der Pinplatzierung fand direkteste sein distalen zuerst, gefolgt von proximal und dann beide mittleren Pins. Dies ermöglichte weniger Unterbrechungen der Gesäßmuskel Sehne durch den proximalen Stift. Endlich, es ist wichtig, dass jeder Pin Bicortically platziert wird, beide Cortex eindringen, so dass es nicht wieder aus den Knochen oder schalten Sie in die Markhöhle.
Ein Röntgengerät in der Lage, hochauflösende Radiographie wurde zur Knochenheilung Status zu überwachen, wie qualitative Veränderungen im Laufe der Zeit leicht und nicht-invasiv visualisiert werden können. Konsequente Bein Positionierung ist jedoch entscheidend für genaue radiologische Interpretation, da Unterschiede in der Positionierung können irreführend sein. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten zeigen, dass ein 5 mm femoralen defekt verhindert spontane Knochenheilung in normalen Ratten25. Daher merkte jede Heilung d. h. mit zusätzlichen Therapien wie RhBMP-2 getränkten Schwamm der jeweiligen Behandlung (Abbildung 3) endgültig zugeschrieben werden kann.
Mögliche Bedenken für diese Technik sind Pin-Bruch, Lockerung und Infektionen. Probleme mit proximalen Pin Bruch in der vorläufigen Prüfung aufgefordert, einen Schalter aus, ohne Gewinde Gewinde k-Draht. Non-Thread-Pins sind mechanisch stärker aber auch mehr Gefahr von rückwärts aus der Rinde. Insbesondere in der leeren Knochendefekten k-Drähte können brechen oder rund 8 Wochen aufgrund der längeren zyklische Pin laden und Mangel an Heilung (ähnlich wie Radfahren/biegen eine Büroklammer) vertrieben werden. Eine strenge antibiotische Therapie wurde eingesetzt, um gehören eine sofortige Cefazolin Injektion, tägliche Anwendung der antibiotische Salbe am Standort Schnitt 7 Tage von Enrofloxacin, Trinkwasser und eine Medizinalfutter hinzugefügt. Dieses Antibiotikum Protokoll, zusammen mit den korrekte chirurgische Techniken, die oben beschriebenen minimiert Infektion (Abbildung 5).
Zusätzliche Vorteile der Verwendung von Fixateur externe im Tiermodell gehört einfache Entfernung für einen freien Blick auf die Fehler und den Ersatz nach dem Imaging. Dies ermöglicht eine effektivere in Vivo bildgebende Verfahren unter Berufung auf Fluoreszenz und Lumineszenz, Änderungen wie die Expression von Genen oder Proteinen zu beurteilen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass Zellen in der Markhöhle mit komplexiert mRNA Kodierung für Gaussia Luciferase transfiziert mit IVIS visualisiert werden können. Abbildung 6 zeigt das Detektionsvermögen Lumineszenz-Signal durch diesen Fixateur externe Ansatz nicht behindert wird, wie es möglicherweise mit internen Platten, Schrauben, oder intramedulläre21,22,23 Nägel , 24. kostengünstig und reproduzierbar chirurgischen Protokolls ermöglicht die konsequente Schaffung und Stabilisierung eines kritischen Größe femoralen Mangels, die die erste klinische Behandlung dieser komplexen Frakturen imitiert. Die Schaffung einer zuverlässigen Tiermodell ist entscheidend für jede experimentellen Behandlungen für den späteren klinischen Einsatz vorgesehen. Unser Modell hat vorhersagbare Ergebnisse und minimale Verhaltensänderungen oder Beschwerden bei unseren Tieren gezeigt. Dieses Modell kann mit einer Vielzahl von Biomaterial-basierte Gerüste in Verbindung mit bildgebenden Verfahren, die in diesem Papier für künftige translationale Testzwecke verwendet verwendet werden. Es ist unsere Hoffnung, dass mit diesem Modell arbeiten, Forscher neuartige Wege zur Behandlung von kritischen knöcherne Defekte in Trauma-Patienten entwickeln können. Dies könnte helfen, vermeiden die Morbidität und Kosten in langwierige Behandlungen derzeit beschäftigt und möglicherweise verringern die Zahl der Amputationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Vorteile. Es wurden keine Leistungen erhalten direkt oder indirekt von den Autoren dieses Artikels.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem NIH Ausrüstung Grant 1S10OD023676-01 mit zusätzlicher Unterstützung durch die University of Wisconsin Abteilungen für Orthopädie und Rehabilitation und School of Medicine und öffentliche Gesundheit unterstützt. Wir möchten die UW Carbone Cancer Center unterstützt Grant P30 CA014520 und Verwendung von deren Small Animal Imaging Facility sowie NIH Ausbildung Grant 5T35OD011078-08 für die Unterstützung von H. Martin anerkennen. Wir danken auch Michael und Mary Sue Shannon für ihre Unterstützung der Muskel-Skelett-Regeneration-Partnerschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
