Summary
Modelli di mammiferi in vivo di difetti ossei critici dimensioni sono essenziali per i ricercatori che studiano i meccanismi di guarigione e terapie ortopediche. Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di difetti riproducibile, segmentale, femorale in ratti stabilizzati con fissatore esterno.
Abstract
Ricerca ortopedica si basa pesantemente su modelli animali per lo studio dei meccanismi dell'osso che guarisce in vivo , nonché di studiare le nuove tecniche di trattamento. Critica e medie difetti segmentali sono difficili da trattare clinicamente, e gli sforzi di ricerca potrebbero beneficiare di un affidabile, ambulatorio modello piccolo animale di un difetto segmentale femorale. In questo studio, presentiamo un protocollo chirurgico ottimizzato per la creazione di costante e riproducibile di un difetto della diafisi critico di 5 mm in un femore di ratto stabilizzato con un fixator esterno. L'ostectomia della diafisi è stato effettuato usando una maschera personalizzata per posizionare i 4 fili di Kirschner bicortically, che sono stati stabilizzati con un dispositivo adattato fixator esterno. Una sega oscillante dell'osso è stata utilizzata per creare il difetto. O una spugna di collagene da solo o una spugna di collagene con rhBMP-2 è stata impiantata nel difetto, e la guarigione ossea è stata monitorata per 12 settimane con le radiografie. Dopo 12 settimane, i ratti sono stati sacrificati, e l'analisi istologica è stata effettuata sul controllo asportato e trattati femori. I difetti ossei contenenti solo spugna di collagene provocato non-Unione, mentre rhBMP-2 trattamento ha reso la formazione di un rimodellamento dell'osso periostale insensibile e nuovo. Fissazione di animali ben recuperata dopo l'impianto ed esterna ha avuto successo nella stabilizzazione dei difetti femorali per 12 settimane. Questo modello semplificato chirurgico potrebbe essere applicato facilmente per studiare la guarigione ossea e testare nuovi biomateriali ortopedici e terapie rigenerative in vivo.
Introduction
Chirurgia ortopedica traumatologica si concentra sul trattamento di una vasta gamma di fratture complesse. Critica diafisarie segmentale difetti hanno dimostrato difficili da trattare clinicamente a causa la diminuita capacità rigenerativa del muscolo circostante e periostio, nonché il fallimento di localizzato l'angiogenesi1. Tecniche di trattamento moderno includono fissaggio operatorio con l'innesto dell'osso, in ritardo l'innesto dell'osso (Masquelet), trasporto di osso, fusione o amputazione2,3,4. Nella maggior parte dei pazienti che presentano una funzione ambulatoria conservato dopo il loro trauma, con ben funzionanti distale degli arti, salvataggio dell'arto è chiaramente un migliore trattamento opzione5. Questi trattamenti di salvataggio spesso richiedono interventi chirurgici in fasi sopra un corso del trattamento a lungo. Alcuni autori hanno suggerito che la fissazione esterna è superiore rispetto alla superficie di fissazione interna per queste applicazioni a causa del danno in diminuzione del tessuto durante l'impianto, è diminuito impiantata e maggiore regolabilità postoperatoria del il fixator6. Tuttavia, una prova controllata randomizzata futura è attualmente in corso per aiutare a chiarire questa polemica interna versus fissazione esterna in gravi fratture aperte della tibia7. Purtroppo, con qualsiasi trattamento selezionato, significativi tassi di complicazione e fallimento persistono8,9. Con uno dei due metodi di trattamento, rispetto alla perdita segmentale dell'osso, il chirurgo deve vedersela con difetti segmentali della diafisi che presentano sfide significative. Correzioni di difetti segmentali devono massimizzare la stabilizzazione dell'osso e contemporaneamente migliorare il processo osteogenico10,11.
A causa dell'importanza clinica, eppure il volume più basso, di dimensioni critiche della diafisi difetti segmentali, un modello animale efficace, riproducibile è necessario abilitare gruppi di ricerca per far avanzare di tecniche di trattamento e, in definitiva, migliorare gli esiti clinici. I ricercatori hanno bisogno di studiare in vivo meccanismi di guarigione fisiologici in un modello animale mammifero. Mentre tali modelli di fissazione esterna già esistono12,13,14,15, speriamo di fornire un metodo più affidabile per non-unioni negli animali non trattati, diminuzione dei costi attraverso la scelta di Affordable fixator materiali e struttura un semplice protocollo chirurgico per l'applicazione facile per gli studi futuri. L'obiettivo primario del presente protocollo è quello di stabilire un modello affidabile e riproducibile di un difetto critico della diafisi in ratti. La procedura è stata valutata valutando la stabilizzazione e l'osso che guarisce in femori di ratto per 12 settimane. Gli obiettivi secondari inclusi: facendo un modello accessibile come costo efficace possibile, semplificando l'approccio chirurgico e la stabilizzazione e garantendo etico cura degli animali. Gli autori e il team di ricerca ha condotto esperimenti preliminari con una gamma di diversi biomateriali e potenziali terapie rigenerative per migliorare la guarigione in questo difetto segmentale.
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Protocol
I ratti utilizzati in questo studio ha ricevuto la cura quotidiana conformemente agli orientamenti AVMA per l'eutanasia degli animali: 2013 edizione16. Il Comitato di impiego presso l'Università di Wisconsin-Madison e istituzionali Animal Care valutato e approvato questo protocollo sperimentale prima di inizio del progetto.
1. gli animali
- Utilizzare i ratti maschii di Sprague-Dawley nazionali pesa circa 350 g.
2. preparazione di Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2) imbevuto di spugna ponteggi
Nota: Preparazione di Scaffold dovrebbe verificarsi solo prima dell'impianto nel femore (vedi passo 6.14).
- Seguire le istruzioni del produttore per l'uso di un kit di innesto stabilito rhBMP-2 osso contenente una spugna di collagene liofilizzato rhBMP-2 e acqua sterile per la ricostituzione17. Mantenere la sterilità, ricostituire la rhBMP-2 con l'acqua sterile ad una concentrazione di 1,5 mg/mL.
- Utilizzando un righello sterile e forbici sterili, tagliare la spugna di collagene bagnato rhBMP-2 per rimodellare per adattare una 5 mm x 3 mm x 3 difetto di mm.
- Usando una siringa, distribuire la soluzione di rhBMP-2 uniformemente sopra la spugna di collagene che viene assorbito.
3. preparazione del dispositivo di fissazione esterno personalizzato
Nota: Per l'elenco più completo delle dimensioni, vedere Figura 1A .
- Taglio di alluminio azione dello strato (tipo 6061, 0,088" spessore) a due pezzi (1,4 x 6 poll.) utilizzando un seghetto o altro strumento appropriato.
- Montare un pezzo in macchina fresatrice e, utilizzando un mulino di trivello del carburo di 90°-punto di 1/8", tagliare quattro scanalature di «V» (0.035" profondo) nel senso della lunghezza. Lasciare l'altro pezzo libero dei tagli.
- Tagliare i singoli piatti di 0.3" larghezza dalle due pezzi (Figura 1B). Misurare e fori vite per thread 4-40. Toccare la piastra con scanalature a "V" con il filo 4-40. Forare la piastra senza scanalature per un trapano di corpo #4 vite.
- Sabbia di entrambi i pezzi per arrotondare angoli e ridurre il peso (Figura 1).
- Avvitare i pezzi insieme 4-40, 18-8 acciaio inox pulsante viti a testa cilindrica (0,25") affinché scanalature sono a filo contro la piastra normale (Figura 1)
4. procedura anestesia e analgesia
- Inducono anestesia inserendo il ratto nella camera di induzione consegna L 4 O2/min con 4% isoflurane.
Attenzione: Ricerca personale deve evitare l'inalazione di gas anestetico e mantenere la cappa adeguata e ventilazione in laboratorio. - Rimuovere il ratto dalla camera dopo il ratto perde il riflesso di raddrizzamento, allegare un cono di naso e posizionare la dose di mantenimento dell'anestesia attraverso il naso (tasso di consegna di2 O di 2-3 L/min e 0,8% isoflurano).
- Posto il ratto il dissipatore di calore o sotto la luce riscaldante per prevenire l'ipotermia.
- Confermare la profondità adeguata dell'anestesia di pizzicare la punta o il test il riflesso palpebrale.
- Applicare lubrificazione agli occhi per evitare l'essiccazione fuori la cornea.
- Consegnare un'iniezione sottocutanea di rilascio prolungato buprenorfina (1 mg/kg) sul tronco/dorsum del ratto, lontano dal sito chirurgico, per fornire l'analgesia per fino a 3 giorni dopo la chirurgia.
5. asettica preparazione e antibiotici preventivi
- Radere la zona intorno a hindleg usando la costola dith 13, il piede, la linea mediana dorsale e la linea mediana ventrale come margini.
- Area di macchia Depilata utilizzando 2x2 garza sterile imbevuta con 10% povidone-iodio seguito da 70% EtOH (4 volte ciascuno, alternati).
- Somministrare un'iniezione intramuscolare di cefazolina (20 mg/kg) il quadricipite operativa.
- Amministrare enrofloxacina (0,25 mg/ml) in acqua potabile per 7 giorni postoperatorio per una costante protezione antibiotica.
- Posto ratti su mangimi medicati (ad es., Uniprim) per tutta la durata dello studio per prevenire le infezioni del tratto di pin.
- Applicare pomata antibiotica doppia all'interfaccia pelle-pin una volta al giorno per 3 giorni postoperatorio.
Nota: Evitare qualsiasi pin di fissazione esterna o il morsetto allentato che possono contribuire allo sviluppo di un'infezione.
6. intervento chirurgico
Nota: Assicurarsi un concertato sforzo per mantenere un campo sterile e area di lavoro e seguire una tecnica sterile in tutta l'interezza del caso.
- Estendere la gamba rasato attraverso fenestrata, chiaro appiccicoso drappeggio e copertura chirurgica panca in teli sterili per creare un campo sterile.
- Palpare il femore e utilizzare una lama #15 per creare un'incisione di anterolateral attraverso la pelle che si estende da patella per il grande trocantere al femore prossimale.
- Accuratamente incise la fascia gamba laterale lungo il setto intramuscolare per separare il muscolo vasto laterale del quadricipite anteriormente da muscoli posteriori della coscia posteriormente fino a quando il femore laterale è esposto. Preservare l'inserimento di gluteal del tendine abduttore sul grande trocantere.
- Eseguire un'attenta, dissezione dei tessuti molli della circonferenza atraumatic ed esporre il femore alla sua metà diafisi a partire sulla superficie laterale. Per effettuare questa operazione, è necessario utilizzare una lama #15 delicatamente tagliare il muscolo dall'osso sottostante mantenendo la lama parallela contro il contorno della superficie dell'osso. Utilizzare un scollaperiostio per sollevare il muscolo dall'osso esposto come che viene sezionato e procedere intorno al pozzo femorale fino a 7-10 mm della diafisi centrale è stata cancellata di tessuti molli su tutti i lati per prepararsi ostectomia.
Nota: Per evitare lesioni al pacco neurovascular femorale mediale. - Inserire i quattro fili di Kirschner (k) 1.0 mm: 2 prossimale e distale nel femore perpendicolare al femore laterale, 2 diretto dritto laterale a mediale. Assicurarsi che tutti i perni innesti entrambi cortecce (bicorticale) per un'adeguata stabilità (Figura 2A).
- Prima di avviare con il perno più distale, solo a livello dell'epicondilo laterale. Posto jig svuotare il femore distale laterale e inserire un 1,0 punta filettata k-wire.
- Mantenimento della posizione del jig sull'osso, identificare dove il perno più prossimale entrerà l'osso basato sui fori jig. Una volta che la posizione è determinata, accuratamente incise parallelo alle fibre del tendine del gluteo come necessario per creare un piccolo spazio nel tessuto per il pin prossimale di passare attraverso, riducendo così al minimo il danno iatrogenico al tendine. Praticare un 1,0 mm non filettati k-wire in questo divario, assicurando nuovamente che il pin si impegna entrambi cortecce (Figura 2B).
- Mantenere la posizione di jig a contatto con l'osso e forare due 1.0 mm filettato k-legare, uno su entrambi i lati del difetto futuro sito. Garantire perni impegnano entrambi cortecce (Figura 2).
- Posizionare il fixator esterno bar livello 1 cm sopra pelle e avvitare bene, il bar al posto di blocco. Tagliare le lunghezze in eccesso perno (Figura 2D).
- Preparare per l'ostectomia (creazione di difetto) inserendo un retrattore piccolo, curvo intorno al femore anteriore e posteriore per proteggere il tessuto molle circostante, il muscolo e il fascio neurovascolare. Utilizzando un oscillante sagittale di ~ 5 mm lama, con molta cautela creare un difetto segmentale di 5 mm attraverso la metà diafisi. Applicare una luce, pressione uniforme con la sega per evitare inutile frattura (Figura 2E).
- Applicare piccole quantità di irrigazione (temperatura ambiente 0,9% sterile salino normale (NS)) come stato necessario durante la creazione di difetto per evitare necrosi termica dell'osso.
- Lavare la ferita con 10 mL di NS dopo aver creato il difetto.
- Somministrare 0,1 mL di un bupivacaina 0,25% con epinefrina (1: 200, 000) per la ferita come un analgesico e vasocostrittore.
- Inserto sul patibolo (5 x 3 x 3 mm) di spugna di collagene o rhBMP-2 imbevuto di spugna (dal passaggio 2) nel difetto. Ogni ponteggio deve essere dimensionato in modo appropriato per estendersi sulla lunghezza ed il volume del difetto, aiutando la spugna a rimanere in posizione.
Nota: A questo punto, complessi di mRNA possono essere preparati e iniettate come descritto nei passaggi 7.1-7.3 qui sotto se eseguendo imaging di bioluminescenza. - Chiudere il piano muscolare utilizzando il semplice modello interrotto con sutura assorbibile 4-0. Chiudere lo strato della pelle utilizzando un modello di subcuticular in esecuzione con 4-0 suturare assorbibile e pelle colla per colmare le lacune intorno i perni sporgenti.
- Togliere il cono di naso, rimanendo il termocuscino, ratto e monitorare continuamente fino a quando il ratto è in grado di mantenere costantemente una postura eretta. A questo punto, posto in una gabbia pulita per recuperare.
7. preparazione di mRNA complessato e bioluminescenza imaging
Nota: Transfezione con complessi di mRNA deve essere eseguita durante la chirurgia 1 giorno prima imaging luminescenza. Utilizzare tecniche sterili durante la manipolazione di mRNA.
- Miscelare 10 µ l di mRNA codifica per Gaussia luciferasi (stock concentrazione di 1 µ g / µ l) con 30 µ l dell'agente trasfettando lipidico.
- Consentire per i complessi di mRNA-lipidico per formare incubando per almeno 5 min a temperatura ambiente. L'agente trasfettando lipidico si condensa le molecole di mRNA, stabilizzando li e aumentando l'efficienza di trasfezione.
Nota: Se i complessi non vengono utilizzati immediatamente, memorizzarli in ghiaccio per un massimo di 1 h. - Utilizzando una pipetta µ l 20 dotato di punte filtrate, iniettare metà del volume dei complessi di mRNA per l'estremità distale e prossimale del difetto, rispettivamente.
- Il giorno seguente, 3 min prima di formazione immagine, anestetizzare il ratto utilizzando isoflurano inalato come precedentemente descritto al punto 4.1.
- Posizionare il ratto in un in vivo imaging camera attrezzata con un cono di naso offrendo manutenzione isoflurano (0,8% isoflurane, tasso di consegna di2 O di 2-3 L/min).
- Iniettare coelenterazine risospese in soluzione fisiologica ad una dose di 4 mg/kg di peso corporeo nella prossimità del difetto.
- Acquisire immagini di bioluminescenza con lo in vivo imaging system (IVIS) secondo istruzioni18 del produttore.
8. imaging Protocol
- Dopo aver calibrato la macchina radiografica normale, un sistema di raggi x19, anestetizzare ratto usando isoflurano inalato come descritto in precedenza (Vedi punto 4.1) e posizionare il ratto in un cono di naso con isoflurano inalato (0,8% isoflurane, O2 tasso di consegna di 2-3 L/min) per una radiografia di femore antero-posteriore (AP).
- Mentre il topo è in decubito sternale, avanzare la chirurgica hindlimb avanti, flessione dell'anca e soffocare il giunto. Flettere l'articolazione di ginocchio di circa 90°. Nastro sul lato plantare zampa giù, vicino alla parete del corpo. Posizione in avanti la tibia dal femore per eliminare la possibilità di sovrapporre le ossa. Per fornire lieve abduzione dell'anca, posizionare una spugna traslucida (circa 15 mm di spessore) in regione inguinale. Quindi ottenere un'immagine (cranio-caudale) antero-posteriore del femore.
- Ripetere questa visualizzazione radiografica del femore AP immediatamente dopo la chirurgia, settimane 4 e 12 settimane. Utilizzare nastro e garza per posizionare in modo appropriato dell'estremità dell'animale per la qualità e la formazione immagine coerenza.
- Rimuovere il ratto dal cono di naso e monitorare continuamente fino a quando il ratto è in grado di mantenere costantemente una postura eretta. Quindi, inserire nuovamente la gabbia.
9. istologico procedura
- Eutanasia ratti in una camera con inalato CO2 secondo AVMA standard etici16.
- A seguito di eutanasia, radere il hindlimb, togliere la pelle dalle estremità più operativa e disarticulate femore a livello dell'anca. Rimuovere accuratamente tutti i tessuti molli dal femore operativo (compresi tutti i muscoli, tendini e legamenti). Lasciare solo un sottile strato di muscolo che circonda il sito di difetto per proteggere la regione di guarigione da danni accidentali durante la dissezione.
- Posizionare il femore in 10% formalina tamponata neutra a temperatura ambiente per 3-4 giorni per consentire la fissazione. Mantenere un 15:1 formalina tessuto in rapporto al volume. Cambiare la soluzione una volta durante il processo di fissazione.
- Decalcificare il femore in una soluzione di pH 6.5 15% acido etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) per 3-4 settimane. Raccogliere le radiografie di serie per determinare decalcificazione dell'endpoint.
- Bisecare il femore longitudinalmente con un taglio dall'anteriore al posteriore nel piano sagittale. Presentare il tessuto per inclusione in paraffina standard ed ematossilina ed eosina (H & E).
- Inviare le diapositive di H & E ad un patologo per la valutazione istologica.
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Representative Results
Gli ambulatori sono stati effettuati in circa un'ora da un chirurgo con l'aiuto di un assistente. Dopo l'ottimizzazione chirurgica, complicazioni intra - e postoperatorie sono stati notevolmente ridotti al minimo e utilizzano dell'apparato jig assicurata dimensione consistente (5 x 3 x 3 mm) e la localizzazione dei difetti femorali. Ratti sono stati ambulatorio immediatamente dopo il recupero dall'anestesia e non sembrano avere alcun alterato pattern comportamentali; loro andatura non era antalgica, e non sembrano essere disturbati dal fixator esterno.
Non filettati k-legare sono stati scelti per il perno più prossimale (Figura 2B), come il perno prossimale ha avuto il più alto rischio di rottura quando sono stati utilizzati cavi filettati. In alcuni casi, in particolare nel controllo animali senza rhBMP-2 o ponteggi i cui difetti non ha mostrato prova di formazione di guarigione / dell'osso, uno o più consigli di k-filo rotto dopo circa 8 settimane come si vede nella spugna solo controllano radiografia del femore asportato ( Figura 3).
Le radiografie e l'istologia (macchia di H & E) sono stati analizzati per valutare i livelli di guarigione ossea. Controllo negativo difetti contenente solo una spugna di collagene non ha mostrata prova del collegamento di osteogenesi tra i bordi di prossimale e distale dell'osso (Figura 3, , Figura 4). Una piccola quantità di nuovo osso che ritocca può essere visto direttamente adiacente al bordo di taglio femore; il difetto si dimostra una mancanza di materiale osseo, la presenza di cartilagine e qualche ematoma residuo (Figura 4). Difetti che contiene rhBMP-2 imbevuto spugna dimostrato significativa dell'osso guarigione fin da 4 settimane dopo la chirurgia, come mostrato da radiopaco insensibile gettante un ponte attraverso il difetto nella Figura 3. Di 12 settimane, significativa deposizione minerale nuovo (Figura 4, NB: nuovo osso, PC: periosteal insensibile) ha formato in tutto il difetto. Significativo nuovo osso periostale può essere visto nell'insensibile che si estende dal bordo taglio femore e spicole di osso lamellare e tessuto hanno sviluppato in tutto il difetto. Deposizione di cartilagine non è visto (Figura 4).
Istologia (macchia di H & E) inoltre è stata effettuata per un controllo non infetto e per un esempio di un femore infetti (Figura 5). Il femore infetto è notevolmente ampliato, mostrando segni di una reazione endostale infiltrante la corteccia ossea. Le frecce indicano le aree di riassorbimento osteoclasto-mediato dell'osso patologica. La corteccia del femore non infetti rimane compatto e con una corteccia lamellare ben delineata. Dosaggio di antibiotico è stato ottimizzato per includere la copertura massima postoperatorio. Mentre l'infezione intorno al sito di difetto può verificarsi, somministrazione continua di antibiotici per via topica intorno pin siti e in acqua e la dieta ha avuto successo nel ridurre al minimo l'infezione postoperatoria.
Ulteriori imaging mediante sistema di Imaging In Vivo (IVIS) illustra la capacità delle cellule bioluminescenti possano essere visualizzati all'interno del difetto dopo l'impianto del fissatore esterno (Figura 6). Lamiera esterna può essere facilmente rimosso per l'imaging e sostituito al completamento. Le cellule nella cavità midollare luminesce dopo trasfezione con complessato mRNA codifica per Gaussia luciferasi. Il massimo livello di luminescenza è focalizzato nel sito del difetto femorale e il segnale non sia ostruito dai perni del dispositivo di fissaggio. Questo è promettente per gli studi futuri basandosi su bioluminescenza o fluorescenza per misurare i cambiamenti biologici come espressione di un gene o una proteina durante il processo di guarigione.
Figura 1: Fabbricazione di fixator esterno. A: schema CAD del fissatore esterno assemblato con dimensioni con annotazioni per il corretto montaggio. Ogni fixator è composto da due piastre di alluminio tenuti insieme da due viti. B: piastre sono tagliati da fogli di alluminio di 1,4 x 6 poll. con 'V' scanalature tagliate il foglio di fondo. C: vite i fori nelle piastre (filettate della piastra con scanalature a "V") e tutti i bordi e gli angoli vengono carteggiati per turno e ridurre il peso. D: fissatore esterno montato è stretto con viti (4-40 x 0,25", 18-8 acciaio inox pulsante tappo di testa) una volta inserite nelle scanalature 'V' sulle parti interne delle piastre in alluminio perni. Il perno sinistro è non filettata ed è più prossimale sul femore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schematica del posizionamento del perno, il posizionamento di fissatore e difetto creazione. A: il pin distale (1,0 mm filettato k-wire) è collocato presso la regione metaphyseal epicondilo utilizzando la dima (rettangolo blu) per guidare l'inserimento corretto dei piedini. Il jig è posizionato sulla superficie femorale anterolateral. B: il perno prossimale (1,0 mm non filettati k-wire) viene inserito utilizzando la dima dopo aver fatto una piccola incisione nel tendine gluteal. C: pin centrali (1,0 mm filettato k-wire) vengono inseriti utilizzando la dima. D: la dima viene rimossa e le 2 lamiere sono collegate ai pin con 2 viti per fissare le piastre. Le piastre sono stretti 1 cm sopra il livello della pelle per evitare una pressione sulla pelle. E: una sega oscillante sagittale viene utilizzata per creare un difetto di 5 mm tra i due pin centrali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentante radiografie ad alta risoluzione Visualizza con rhBMP-2 trattamento di guarigione ossea. Immagini per la spugna di collagene di controllo negativo e i gruppi di spugna imbevuta di rhBMP-2 sono mostrati alle settimane 0, 4 e 12 postoperatorio. Il gruppo di rhBMP-2 trattamento esibisce guarigione significativa dopo 4 settimane con insensibile che abbracciano il difetto. Le estremità del femore di controllo negativo non guariscono con gettare un ponte osseo e il difetto rimane un non sindacale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Significativa nuova formazione dell'osso è veduta con il trattamento di rhBMP-2. Rappresentante 4 x immagini ingrandite H & E istologici per la spugna di collagene di controllo negativo e rhBMP-2 intrisa spugna gruppi sia al bordo di taglio femore e all'interno del difetto. Nuovo osso formata intorno al bordo del femore di controllo, ma estensioni significative di nuovo osso trabecular, nonché il progetto periosteal insensibile dal femore trattato. Nessun materiale ossuto è visto all'interno del difetto di controllo, mentre la formazione significativa dell'osso può essere osservata in tutto il difetto di trattati di rhBMP-2. NB: nuovo osso, cartilagine di c:, f: femore, h: emorragia, PC: periosteal insensibile. Barra della scala: 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Infected femore presenta ipertrofia e gli indicatori delle cellule infiammatorie. H & E immagini istologiche di un femore non infetti rispetto ad un femore infetti, in piena vista e 4 ingrandimenti delle posizioni "in box". La corteccia femorale non infetta rimane organizzato e delineati, con piccolo segno di infiammazione. Il femore infetto si allarga notevolmente, come si è visto in piena vista, e la corteccia è interrotta da aree di riassorbimento e di necrosi (aggregati di cellule viola indicati da frecce nere). F: femore. Barra della scala: 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Rilevato nel difetto del segnale di luciferasi Gaussia. Luminescenza delle cellule transfected con Gaussia luciferasi che mRNA è imaged con IVIS dopo la rimozione di placca esterna. Rosso indica la massima intensità di luminescenza nel sito del difetto femorale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Piccoli modelli animali di lesioni ortopediche quali fratture ossee completa attivare ricerca che Esplora i meccanismi di osteogenesi e di valutare il potenziale terapeutico di biomateriali20. Questo studio presenta un topo difetto segmentale modello stabilizzato da un fixator esterno personalizzato che un team lab e ingegneria biomedica può facilmente riprodurre per ulteriori studi di portante osteosynthetic riparazione ossea.
Gli studi precedenti usando comunemente difetti critici dimensioni nei modelli del ratto si basano su fissazione interna piastre21,22,23,24. Anche se uno dei due metodi di fissazione sono clinicamente accettabili, fissazione esterna presenta i vantaggi distinti di causare meno molli rottura e perdita di sangue, diminuendo la superficie totale impiantata per ridurre al minimo le opportunità per la colonizzazione batterica, e permettendo di regolabilità postoperatorio e gli interventi chirurgici in scena6. Modelli precedenti di frattura animale fissazione esterna hanno utilizzato materiali diversi piastre, perno di ritenuta e/o osso taglio metodi12,13,14. Perché il fixator esterno in questo protocollo è stato realizzato nel laboratorio del laboratorio con alluminio di basso costo e possa essere facilmente rinnovato, le spese sono stati ridotti al minimo. Questo fornisce che un fixator esterno economico permette ai ricercatori di effettuare esperimenti con più gruppi di animali senza essere limitato finanziariamente. Rispetto ad un modello di fissazione interna, crediamo che questo sistema è tecnicamente più semplice e più riproducibili in un modello animale piccolo. Nella nostra esperienza con questi modelli, fissazione interna è significativamente più tecnicamente impegnativo e può richiedere impianti custom-lavorati. Alla conoscenza authors', questo protocollo generale è unico nel relativo uso di un jig appositamente combinato con un fixator esterno metallo adattato design15, così come l'uso di un osso oscillante visto per meglio rappresentare lo scenario clinico comune di stripping periosteal eseguita per preparare i siti di frattura per il fissaggio. Una nota finale sull'uso di una sega oscillante in questo modello è che il calore generato e la perturbazione periosteal che si verifica fornisce un elemento finale di controllo nella formazione di un modello di non-Unione. La nostra esperienza è stata che con altri metodi, in questi modelli animali, gli investigatori corrono il rischio dei controlli guarigione.
Per garantire il successo chirurgico, si dovrebbe prestare attenzione a parecchi punti critici: quando pungere ed eseguire la dissezione della circonferenza per esporre il femore dai circostanti muscolare, evitare inquietante il nervo sciatico nervo caudalmente, vasi femorali mediale, e il tendine gluteal prossimalmente. Fare attenzione a posizionare il parallelo di apparato di jig e filo contro il piatto, anterolateral faccia del femore in modo che tutti i perni sono esattamente perpendicolari all'osso. Questo confermerà il corretto allineamento del fissatore esterno e ridurre la probabilità di rottura del perno. L'ordine di posizionamento del perno trovato per essere più semplice era distale in primo luogo, seguito da prossimale e quindi entrambi middle perni. Questo ha permesso per meno rottura del tendine del gluteo con il perno di prossimale. Infine, è importante che ciascun pin è posizionato bicortically, penetrante entrambi cortecce affinché non lo fa fuori l'osso o spostare nella cavità midollare.
Una macchina a raggi x in grado di radiografia ad alta risoluzione è stata utilizzata per monitorare lo stato di guarigione ossea come cambiamenti qualitativi possono essere visualizzati facilmente e in modo non invasivo nel corso del tempo. Tuttavia, gamba coerenza posizionamento è cruciale per interpretazione radiografica accurata come differenze di posizionamento possono essere fuorviante. I risultati di questo studio sono in accordo con precedenti lavori che dimostrano che un difetto femorale 5 mm impedisce la guarigione spontanea dell'osso in ratti normali25. Pertanto, qualsiasi guarigione che è notato con terapie aggiunta come imbevuto di rhBMP-2 spugna può essere definitivamente attribuito al rispettivo trattamento (Figura 3).
Eventuali preoccupazioni per questa tecnica includono perno rottura, allentamento e infezione. Problemi con rottura prossimale pin in fase di test preliminare richiesto un interruttore da k-fi lettato a non filettata. Perni non filettati sono meccanicamente più forte ma anche più rischi di tirarsi indietro della corteccia. Specialmente in difetti ossei vuoti, k-legare potrebbero rompersi o essere spostati circa 8 settimane a causa del caricamento ciclico prolungato di pin e la mancanza di guarigione (analogamente al ciclismo di piegatura una graffetta). Un rigoroso regime antibiotico è stato utilizzato per includere un iniezione di cefazolina immediata, applicazione quotidiana di pomata antibiotica al sito di incisione, 7 giorni di enrofloxacina aggiunto all'acqua potabile e un mangime medicato. Questo protocollo antibiotico, insieme con le tecniche chirurgiche adeguate, descritte sopra, ridotta a icona infezione (Figura 5).
Uno dei vantaggi aggiuntivi di utilizzo di fissazione esterna in un modello animale è di facile rimozione per una visuale del difetto e sostituzione dopo formazione immagine. In questo modo più efficace in vivo imaging tecniche affidarsi a fluorescenza o luminescenza per valutare i cambiamenti come l'espressione di gene o una proteina. Per esempio, abbiamo dimostrato che le cellule nella cavità midollare transfettate con complessato mRNA codifica per Gaussia luciferasi potrebbero essere visualizzate con IVIS. Figura 6 illustra che capacità di rilevamento segnale di luminescenza non sia ostruita da questo approccio di fissazione esterna come può essere con interni placche, viti o chiodi intramidollari21,22,23 , 24. questo protocollo chirurgico costo efficace e riproducibile permette creazione coerente e stabilizzazione di un difetto femorale dimensioni critiche che imita l'amministrazione clinica iniziale di queste fratture complesse. L'istituzione di un modello animale affidabile è fondamentale per qualsiasi trattamenti sperimentali destinati ad eventuale uso clinico. Il nostro modello ha dimostrato risultati prevedibili e minimi cambiamenti comportamentali o disagio nei nostri animali. Questo modello può essere utilizzato con una varietà di base di biomateriale ponteggi in combinazione con le tecniche di imaging utilizzate in questo documento per scopi di testing traslazionali futuri. È nostra speranza che nel lavoro con questo modello, i ricercatori saranno in grado di escogitare nuovi modi per trattare i difetti ossuti critici nei pazienti di trauma. Questo potrebbe aiutare evitare la morbosità e costo in lunghi trattamenti attualmente impiegati e possibilmente ridurre il numero delle amputazioni.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari o vantaggi. Non ci sono stati nessun benefici ricevuti direttamente o indirettamente dagli autori di questo articolo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un Grant attrezzature NIH 1S10OD023676-01 supporto aggiuntivo fornito attraverso reparti di Ortopedia e riabilitazione dell'Università del Wisconsin e la facoltà di medicina e sanità pubblica. Vogliamo riconoscere la UW Carbone Cancer Center Support Grant P30 CA014520 e uso del loro piccolo Animal Imaging Facility, nonché NIH Training Grant 5T35OD011078-08 per il supporto di H. Martin. Ringraziamo anche Michael e Mary Sue Shannon per il loro supporto del partenariato rigenerazione muscolo-scheletrico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
