Summary
Vivo에서 포유류 모델의 중요 한 크기의 뼈 결함 치유 메커니즘 및 정형 외과 치료를 공부 하는 연구원을 위한 필수적입니다. 여기, 우리는 외부 고정을 사용 하 여 안정화 하는 쥐에 재현, 단편, 대 퇴 결함의 생성에 대 한 프로토콜을 소개 합니다.
Abstract
정형 외과 연구 vivo에서 치유 하는 뼈의 메커니즘을 연구 하 고 새로운 치료 기술을 조사 동물 모델에 크게 의존 합니다. 임계 크기 단편 결함 임상, 치료를 도전 그리고 연구 노력 단편 대 퇴 결함의 안정적이 고 외래 작은 동물 모델에서 혜택을 받을 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 외부 fixator를 안정화 하는 쥐 대 퇴 골에 5mm 중요 한 diaphyseal 결함의 일관 되 고 재현 가능한 창조에 대 한 최적화 된 수술 프로토콜을 제시. Diaphyseal ostectomy 4 Kirschner 전선을 bicortically를 사용자 정의 지 그를 사용 하 여 어떤 적응된 외부 fixator 장치와 안정 되었다 수행 되었다. 진동 뼈 톱 결함을 만드는 데 사용 되었다. 혼자 콜라겐 스폰지 또는 rhBMP-2에 배어 콜라겐 스폰지는 결함으로 이식 했다 하 고 치유 하는 뼈 검사를 사용 하 여 12 주 동안 모니터링 했습니다. 12 주 후 쥐 희생 했다, 그리고 조직학 분석 삭제 제어에 수행한 화관을 취급. RhBMP-2 치료 개장 periosteal 비정 하 고 새로운 뼈의 형성을 굴복 하는 동안 뼈 결함만 콜라겐 스폰지 포함 된 비-연합, 결과. 동물 이식, 후 잘 복구 하 고 외부 고정 안정화 대 퇴 결함 12 주 이상에서 성공 입증. 이 합리적인된 수술 모델 뼈 치유를 연구 하 고 새로운 정형 외과 바이오 소재 및 재생 치료 비보테스트를 쉽게 적용할 수 있습니다.
Introduction
정형 외과 외상 수술은 다양 한 복잡 한 골절 치료에 중점을 둡니다. 결함의 실패 뿐만 아니라 주변 근육과 감소 재생 능력 때문에 임상 치료 하기 어려운 입증 했다 중요 한 diaphyseal 단편 뼈 지역화 신생1. 현대 치료 기법으로 뼈 접목 수술 고정, 지연 (Masquelet) 뼈 접목, 뼈 전송, 융합, 또는 절단2,,34. 잘 작동 원심 사지와 그들의 외상 후 보존 하는 보 행 기능 대부분의 환자에서 다리 구조는 명확 하 게 더 나은 치료 옵션5입니다. 이러한 구조 치료는 종종 긴 치료 과정을 통해 단계적된 수술 개입을 필요합니다. 몇몇 저자는 외부 고정은의 증가 수술 후 조정와 내부 고정 감소 조직 손상으로 인해 이러한 응용 프로그램에 대 한 감소 하는 이식 시 이식 표면적, 우수한 제안 fixator6. 그러나, 장래 무작위로 고른된 통제 되는 예는 현재 진행이 논쟁의 경골7의 심각한 오픈 골절 외부 고정 대 내부를 명확히입니다. 불행히도, 어느 치료 선택, 중요 한 합병증 및 실패 속도 유지8,9. 단편 뼈 손실에 관하여 치료 방법 중 하나는 외과 의사 해야 합니다 중요 한 과제가 단편 diaphyseal 결함으로 다 투 다. 단편 결함의 수정 뼈 안정화를 극대화 하 고 동시에 osteogenic 과정10,11을 강화 해야 합니다.
임상 중요성, 아직 중요 한 크기 diaphyseal 단편 결함의 낮은 볼륨으로 인해 효과적, 재현할 수 동물 모델은 사전 처리 기술 및 궁극적으로 임상 결과 개선 연구 팀을 활성화 하는 데 필요한. 연구원은 생체 내에서 생리 치료 메커니즘 포유류 동물 모델에서 공부 해야 합니다. 외부 고정 이미의 같은 모델12,13,,1415존재, 비-조합 치료 동물의 선택을 통해 감소 비용에 대 한 더 신뢰할 수 있는 방법을 제공 하겠습니다. 저렴 한 fixator 자료, 그리고 미래의 연구를 쉽게 응용 프로그램에 대 한 간단한 수술 프로토콜 개요. 이 프로토콜의 주요 목표 쥐에서 중요 한 diaphyseal 결함의 안정적이 고 재현 가능한 모델을 확립 하는 것입니다. 절차는 안정화 및 뼈 쥐 화관에서 12 주 이상 치료를 평가 하 여 평가 되었습니다. 포함 하는 보조 목표: 윤리적인 동물 들 외과 접근 및 안정화, 단순화 하 고, 효과적인 비용으로 저렴 한 모델을 만들기. 저자와 연구 팀 다른 생체 재료 및이 단편 결함에서 치유 개선에 잠재적인 재생 치료의 범위와 예비 실험을 실시.
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Protocol
이 연구에 사용 된 쥐 동물의 안락사에 대 한 일일 케어 AVMA 지침에 따라 받은: 2013 판16. 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 위스콘신-매디슨 대학 평가 하 고 프로젝트를 시작 하기 전에이 실험 프로토콜을 승인 했다.
1입니다. 동물
- 무게 약 350 g outbred Sprague-Dawley 남성 쥐를 사용 합니다.
2. 준비의 뼈 Morphogenetic 단백질-2 (rhBMP-2) 젖은 스폰지 건설 기계
참고: 비 계 준비 대 퇴 골에 이식 직전 발생 한다 (단계 6.14 참조).
- 콜라겐 스폰지, 동결 건조 된 rhBMP-2, 및 재구성17살 균 물 포함 하는 설립된 rhBMP-2 뼈 이식 키트의 사용에 대 한 제조 업체의 지침을 따릅니다. 무 균 유지, reconstitute 1.5 mg/mL의 농도에 살 균 물과 rhBMP 2.
- 가 위 살 균 및 살 균 눈금자 using, 트림 rhBMP-2 배어 콜라겐 스폰지는 5 m m x 3 m m x 3 m m 결함에 맞게 바꿀 수 있습니다.
- 주사기를 사용 하 여 배포 rhBMP-2 솔루션 균등 하 게 콜라겐 스폰지에 흡수 되는.
3입니다. 사용자 지정 외부 고정 장치 준비
참고: 치수의 더 완전 한 목록에 대 한 1A 그림 참조.
- 2 알루미늄 시트 재고 (종류 6061, 0.088"두께)를 잘라 조각 (1.4" x 6")는 또는 다른 적절 한 도구를 사용 하 여.
- 밀링 기계에 원피스를 탑재 하 고, 4 개의 'V' 홈 (0.035 깊은)를 잘라 1/8"90 °-포인트 카바 이드 드릴 선반을 사용 하 여, 세로로. 무료 커트의 다른 조각을 두십시오.
- 두에서 0.3"폭의 개별 번호판을 잘라 조각 (그림 1B). 측정 하 고 4-40 스레드 나사 구멍을 드릴 합니다. 4-40 스레드 'V' 홈 플레이트를 누릅니다. #4 나사 신체 훈련에 대 한 홈 없이 접시 드릴.
- 모래 모서리 둥글게 줄일 무게 (그림 1C)을 두 조각.
- 그루브 일반 판 (그림 1D)에 대 한 플러시 되도록 4-40, 18-8 스테인리스 단추 머리 캡 나사 (0.25") 함께 조각을 스크류합니다
4. 마 취 절차와 진통
- 4 %isoflurane 4 L O2/min 제공 유도 실에서 쥐를 배치 하 여 마 취를 유도.
주의: 연구 요원 마 취 가스의 흡입을 방지 하 고 적절 한 후드와 실험실에서 환기를 유지 해야 합니다. - 쥐 righting 반사 손실 후 상공에서 쥐를 제거 하 고 코 콘을 첨부 코 (2-3 L/min와 0.8 %isoflurane O2 배달 속도)를 통해 마 취의 유지 보수 복용량에.
- 가 열 패드 또는 저체온증을 방지 하기 위해 지구 온난화 빛에서 쥐를 놓습니다.
- 발가락을 곤란 하 게 하거나 종을 반사를 테스트 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다.
- 윤 활 막의 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
- 트렁크/등의 수술 후 최대 3 일 동안 진통 제공 하는 외과 사이트, 멀리 쥐에서 확장 릴리스 buprenorphine (1 mg/kg)의 피하 주사를 제공 합니다.
5. 무 균 준비 및 항생제 preventatives
- Hindleg 여백으로 13번째 늑 골, 발, 등 쪽 정중 선, 그리고 복 부 중간을 사용 하 여 주변을 면도.
- 10 %povidone-요오드 70% 뒤 젖은 멸 균 2 x 2 거 즈를 사용 하 여 면도 스크럽 영역 EtOH (4 회 각각, 교류).
- 관리 요원 quadriceps에 cefazolin (20 mg/kg)의 근육 주사 합니다.
- Postoperatively 지속적인된 항생제 보호를 위해 7 일 동안 식용 수에 있는 enrofloxacin (0.25 mg/ml)를 관리 합니다.
- 핀으로 감염을 방지 하기 위해 연구 기간에 대 한 치료 피드 (예: Uniprim)에 쥐를 놓으십시오.
- 적용 더블 항생제 연 고 피부 핀 인터페이스를 한 번에 매일 3 일 동안 postoperatively.
참고: 모든 외부 고정 핀을 피 하거나 감염의 발전에 기여할 수 있는 완화 클램프.
6. 수술
참고: 확인 한 공동 노력을 살 균 분야 및 작업 영역을 유지 하 고 경우의 전체에 걸쳐 메 마른 기술 따라 하.
- Fenestrated, 분명 스티커 드 레이프와 살 균 필드를 만드는 메 마른 수건에 커버 외과 벤치를 통해 면도 다리를 확장 합니다.
- 대 퇴 골을 만져 하 고 #15 블레이드를 사용 하 여 근 위 대 퇴 골에 더 중대 한 trochanter 슬 개 골에서 연장 하는 피부를 통해 anterolateral 절 개를 만듭니다.
- 조심 스럽게 분리 하는 근육의 vastus lateralis 근육 anteriorly는 근육에서 뒤로 측면 대 퇴 골 노출까지 질의 심장 따라 측면 다리 근 막 incise. 더 중대 한 trochanter에 납치범 gluteal 힘 줄 삽입을 유지 합니다.
- 주의 atraumatic 원주 연 조직 절 개를 수행 하 고 대 퇴 골의 중간 diaphysis 측면 표면에 시작에 노출. 이렇게 하려면 #15 블레이드를 사용 하 여 부드럽게 뼈 표면의 윤곽에 대 한 병렬 블레이드를 유지 하 여 기본 뼈에서 근육을 잘라. Periosteal 엘리베이터를 사용 하 여 노출 된 뼈에서 근육으로 해 부 되 고 중앙 diaphysis의 7-10 m m ostectomy에 대 한 준비를 모든 면에서 연약한 조직 삭제 될 때까지 대 퇴 샤프트 주위 진행.
참고: 내측 대 퇴 혈관 번들에 부상을 피하십시오. - 4 1.0 m m Kirschner (k) 전선 삽입: 2 근 2 수직 측면 대 퇴 골, 대 퇴 골에서 원심 감독 중간에 바로 옆. 적절 한 안정성 (그림 2A)에 대 한 두 외피가 (bicortical)을 종사 하는 모든 핀을 확인 합니다.
- 그냥 측면 뼈의 수준에서 처음, 원심 가장 핀부터 시작. 장소 지 그를 측면 원심 대 퇴 골을 1.0 스레드 끝 k-와이어를 삽입 합니다.
- 뼈에 지 그의 위치를 유지, 가장 근 위 핀 지 그 구멍에 따라 뼈를 입력 것입니다 식별 합니다. 위치 결정 되 면 신중 하 게 incise gluteal 힘 줄의 섬유에 평행으로 통과, 근 위 핀에 대 한 조직에 작은 차이 만드는 데 필요한 힘에 의원 성 손상을 최소화. 1.0 m m 비-스레드 k-와이어가이 간격에 다시 핀 종사 두 외피가 (그림 2B) 보장 드릴.
- 지 그의 위치는 뼈와 접촉을 유지 하 고 두 개의 스레드 1.0 m m k-와이어, 미래의 결함 사이트의 양쪽에 하나씩 드릴. 핀 두 외피가 (그림 2C) 참여 확인 합니다.
- 피부 위에 레벨 1 cm 바 외부 fixator를 놓고 긴밀 하 게, 자리에 바 잠금 나사. 클립 초과 핀 길이 (그림 2D).
- 앞쪽 및 후부 대 퇴 골 주위 작은, 곡선 견인을 배치 하 여 주변 연부 조직, 근육, 및 혈관 다발을 보호 하기 위해 ostectomy (결함 생성)에 대 한 준비. ~ 5 mm 화살 진동 활용 보았다 블레이드, 매우 신중 하 게 중간 diaphysis 통해 5mm 단편 결함을 만들. 빛, 불필요 한 골절 (그림 2E)을 피하기 위해 톱으로도 압력을 적용 합니다.
- 뼈의 열 괴 사를 방지 하는 결함을 만드는 동안 필요한으로 관개 (실내 온도 0.9% 메 마른 정상적인 염 분 (NS))의 작은 금액을 적용 합니다.
- 결함을 만든 후 10ml의 NS 사용 하 여 상처를 플러시.
- 진통제와 vasoconstrictor 상처에 피 네 프 린 (1: 200, 000)와 0.25 %bupivacaine 0.1 mL를 관리 합니다.
- 삽입의 콜라겐 스폰지 또는 rhBMP-2 (3 mm x 3 mm x 5) 비 계 ( 2 단계)에서 결함으로 스폰지 젖 었. 각 비 계 스팬 길이 위치에 유지 하는 스폰지를 돕는 결함의 볼륨을 적절 하 게 크기 한다.
참고:이 시점에서, mRNA 단지 수 될 준비 하 고 수행 하는 생물 발광 영상 경우 7.1-7.3 아래 단계에 설명 된 대로 주입. - 4-0 흡수 봉합과 간단한 중단 된 패턴을 사용 하 여 근육 비행기를 닫습니다. 4-0 흡수 봉합 사로 실행 중인 subcuticular 패턴을 사용 하 여 피부 레이어 닫고 피부 접착제를 튀어나온 핀 주위 간격을 닫습니다.
- 난방 패드에 남아 있는 코 콘에서 쥐를 제거 하 고 쥐 지속적으로 직 립 자세를 유지할 수 있게 될 때까지 지속적으로 모니터링 합니다. 이 시점에서 복구 하려면 깨끗 한 장에 배치 합니다.
7. 준비 complexed mRNA 및 생물 발광 영상
참고: mRNA 단지와 Transfection 수술 발광 영상 전에 1 일 동안 수행 되어야 합니다. 무 균 기법을 사용 하 여 mRNA를 처리할 때.
- 혼합 10 µ L mRNA lipidic transfecting 에이전트의 30 µ L 함께 Gaussia luciferase (1 µ g / µ L의 재고 농도)에 대 한 인코딩.
- 실 온에서 적어도 5 분 동안 배양 하 여 mRNA 지질 단지 형태를 허용 합니다. 그들을 안정 시키고 transfection 효율 향상 lipidic transfecting 에이전트 mRNA 분자를 응축 됩니다.
참고: 복합물을 즉시 사용 하지 않는 그들에 저장할 최대 1 시간에 대 한 얼음. - 각각의 결함, 원심 및 인접 끝에 mRNA 단지의 볼륨의 절반을 주사 필터링된 팁을 갖춘 20 µ L 피 펫을 사용 하 여.
- 다음 날, 이미징, 전에 3 분 흡입된 isoflurane 이전 단계 4.1에 설명 된 대로 사용 하 여 쥐를 anesthetize.
- Vivo에서 이미징 챔버 장착 유지 보수 isoflurane (0.8 %isoflurane, 2-3 L/min의 O2 배달 속도)를 제공 하는 코 콘 쥐를 놓습니다.
- 결함의 근접에 4 mg/kg 몸 무게의 복용량에 염 분에서 resuspended coelenterazine 주사.
- Vivo에서 이미징 시스템 (IVIS) 제조 업체의 지침18에 따라 생물 발광 이미지를 취득 합니다.
8. 이미징 프로토콜
- 일반 방사선 기계는 x 선 시스템19, 보정 후 anesthetize 흡입된 isoflurane를 사용 하 여 앞에서 설명한 ( 단계 4.1참조)으로 쥐 및 쥐 흡입된 isoflurane (0.8 %isoflurane, O2 와 코 콘에 2-3 L/min의 배달 속도) anteroposterior (AP) 대 퇴 골 방사선 사진에 대 한.
- Sternal recumbency에 쥐를 실행 하는 동안 수술 hindlimb 앞으로 엉덩이에 flexing 사전 및 공동 억압. 약 90 °를 억압 조인트 플렉스. 체 벽에 가까운, 발 발바닥 쪽을 테이프. 뼈도 랑의 가능성을 제거 하기 위해 대 퇴 골에서 경골 앞으로 배치 합니다. 엉덩이의 약간의 납치를 제공, 사 타 구니 지역에서 반투명 스폰지 (약 15 m m 두께)을 배치 합니다. 그런 다음 대 퇴 골의 앞쪽 후부 (두개골 꼬리) 이미지를 얻을.
- 바로 수술, 4 주, 12 주 뒤이 AP 대 퇴 골 방사선 보기를 반복 합니다. 거 즈와 테이프를 사용 하 여 적절 하 게 품질과 일관 된 이미징에 대 한 동물의 말단 위치.
- 코 콘에서 쥐를 제거 하 고 쥐 지속적으로 직 립 자세를 유지할 수 있게 될 때까지 지속적으로 모니터링 합니다. 다음으로 다시 장소입니다.
9. 조직학 절차
- AVMA 윤리 기준16에 따라 흡입 공동2 챔버에 쥐 안락사
- 다음 안락사는 hindlimb를 면도, 요원 말단에서 피부를 제거 하 고 disarticulate 엉덩이에 대 퇴 골. 조심 스럽게 수술 대 퇴 골 (를 포함 하 여 모든 근육, 힘 줄, 인 대)에서 모든 연 조직 제거. 만 해 부 동안 실수로 손상에서 치유 영역을 보호 하기 위해 결함 사이트를 둘러싼 근육의 얇은 레이어를 남겨 주세요.
- 10%는 대 퇴 골 에서도 중립 버퍼링 말린 3-4 일 동안 실내 온도에 고정을 위한 수 있도록. 조직 볼륨 비율 15:1 포 르 말린을 유지. 일단 정착 과정을 통해 중간 솔루션을 변경 합니다.
- 3-4 주 동안 15 %Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 6.5 솔루션에서 대 퇴 골을 알려줍니다. Decalcification 끝점을 확인 하기 위해 직렬 검사를 수집 합니다.
- 중반-화살 평면에서 후부 앞쪽에서 커트로 경도 대 퇴 골 이등분 조직 표준 파라핀 포함 되며 고 오신 (H & E) 얼룩에 대 한 제출.
- 조직학 평가 대 한 병리학 자 H & E 슬라이드 보내기.
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Representative Results
수술 한 조 수의 도움으로 한 외과 의사에 의해 약 1 시간에 수행 되었습니다. 수술 최적화 후 내부-수술 후 합병증 크게 최소화 했다 고 일관성 있는 크기 (5 x 3 x 3 m m) 및 대 퇴 결함의 지역화 보장 지 그 장치를 사용. 쥐 마 취에서 외래 즉시 다음 복구 되었고 어떤 변경 된 행동 패턴;는 나타나지 않았다 그들의 걸음 걸이, antalgic 되었고 그들은 외부 fixator에 의해 방해 하 고 나타나지 않았다.
비-스레드 k-전선 근 위 핀 때 스레드 와이어 사용 되었다 끊기의 위험을 했다 (그림 2B), 가장 근 위 핀에 대 한 선정 됐다. 어떤 경우에, 특히 컨트롤에서에서 rhBMP-2 또는 누구의 결함 보였다 치유/뼈 형성의 증거가 하나 이상의 k-와이어 팁 스펀지에서 본 약 8 주 후 파산 하는 건설 기계 없이 동물만 제어 ( 삭제 대 퇴 골의 방사선 사진 그림 3).
방사선 및 조직학 (H & E 얼룩) 뼈 치유의 수준을 평가 하기 위해 분석 했다. 네거티브 제어만 골 근과 원심 뼈 가장자리 (, 그림 3 그림 4) 브리지의 증거를 보여 콜라겐 스폰지 포함 된 결함. 개장 하는 새로운 뼈의 작은 금액을 직접 잘라 대 퇴 골 가장자리;에 인접 한 볼 수 있습니다. 자체 결함은 뼈, 연골의 존재 소재와 일부 잔여 혈 종 (그림 4)의 부족을 보여줍니다. 결함이 포함 된 rhBMP-2 배어 스폰지 시연 중요 한 뼈 그림3에서 결함에 걸쳐 방사선 불 투과성 딱딱하고 메워와 같이 수술 후 4 주 일찍 치유. 12 주, 중요 한 새로운 광물 증 착 (그림 4, 주의: 새로운 뼈, PC: periosteal 냉담 한) 결함에 걸쳐 형성 했다. 중요 한 새로운 periosteal 뼈 컷된 대 퇴 골 가장자리에서 딱딱하고 연장에서 볼 수 있습니다 및 spicules 짠 하 고 플레이트 뼈의 결함을 통해 개발 했습니다. 연골 증 착 하지 않습니다 (그림 4) 본.
조직학 (H & E 얼룩) 감염된 제어와는 감염 된 대 퇴 골 (그림 5)의 예에 대 한 또한 수행 되었다. 감염 된 대 퇴 골은 크게 확대 침투 하는 뼈 외피 endosteal 반응의 흔적을 보여주는. 화살표는 osteoclast 중재 pathologic 뼈 재흡수의 영역을 나타냅니다. 감염 되지 않은 대 퇴 골 피 질 콤팩트 하 고 명확 하 게 delineated 플레이트 피와 함께 남아 있습니다. 항생제 투약 postoperatively 최대 범위를 포함 하도록 최적화 되었다. 결함 사이트 감염, 를 발생할 수 있습니다 핀 주위에 몸에 붙이기도 항생제의 지속적인된 관리 사이트 고 물과 다이어트에서 수술 후 감염을 최소화 성공을 증명 했다.
Vivo에서 이미징 시스템 (IVIS)를 사용 하 여 이미징 추가 외부 fixator (그림 6)의 주입 후 결함 내 시각 발광 셀 수를 보여 줍니다. 외부 플레이트를 쉽게 이미징에 대 한 제거 하 고 완료 되 면 대체 될 수 있습니다. 골 수 구멍에 셀 complexed mRNA 인코딩 Gaussia luciferase transfection 후 빛을 발 하죠. 발광의 최고 수준의 대 퇴 결함의 사이트에 집중 하 고 신호는 고정 장치 핀에 의해 방해 하지. 이것은 생물 발광 또는 치유 과정 동안 유전자 또는 단백질 식 같은 생물 학적 변화를 측정 하는 형광에 의존 하는 미래 연구에 대 한 약속 이다.
그림 1: 외부 fixator 제조. A: 적절 한 제작에 대 한 주석된 치수와 조립된 외부 fixator의 CAD 회로도. 각 fixator 함께 2 개의 나사에 의해 개최 되는 두 알루미늄 판의 구성 이다. B: 번호판 아래쪽 시트를 잘라 'V' 홈 1.4 "x 6" 알루미늄 시트에서 잘립니다. C: ('V' 홈 플레이트에서 스레드) 접시에 나사 구멍을 뚫고는 및 모든 가장자리와 모서리는 모래를 뿌려 장식 라운드 및 체중 감소. D: 조립된 외부 fixator 나사 (4-40 x 0.25", 18-8 스테인리스 단추 머리 모자)와 강화 알루미늄 플레이트의 내부에 'V' 홈에서 자리에 핀은 일단. 왼쪽된 핀 비 스레드 이며 가장 근 위 대 퇴 골에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 핀 배치, fixator 배치 및 결함 창조의 도식. A: 원심 핀 (1.0 m m 스레드 k-선) 지 그 (파랑 사각형)을 사용 하 여 적절 한 핀 삽입 가이드 뼈 metaphyseal 지역에 배치 됩니다. 지 그 anterolateral 퇴 표면에 배치 됩니다. B: 근 위 핀 (1.0 m m 비-스레드 k-선) gluteal 힘 줄에 작은 절 개 후 지 그를 사용 하 여 배치 됩니다. C: 가운데 핀 (1.0 m m 스레드 k-선) 지 그를 사용 하 여 삽입 됩니다. D: 치 구 제거 되 고 2 접시 접시를 확보 하는 2 개의 나사를 사용 하 여 핀에 연결 됩니다. 번호판을 피부에 압력을 피하기 위해 피부 수준 위에 1 ㎝ 강화 됩니다. E: 화살 진동 톱 2 개의 중간 핀 사이 5mm 결함을 만드는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 고해상도 검사 rhBMP-2 치료로 치유 하는 뼈를 보여. RhBMP-2 젖은 스펀지 그룹에 대 한 부정적인 제어 콜라겐 스폰지 이미지 postoperatively 0, 4, 12 주에 표시 됩니다. RhBMP-2 치료 그룹 딱딱하고 스패닝 결함으로 4 주 후 치료 하는 중요 한 전시. 부정적인 통제 대 퇴 골 끝 다리 뼈를 치료 하지 고 결함 남아 비-연합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 중요 한 새로운 뼈 형성 rhBMP-2 치료와 함께 볼 수 있다. 부정적인 통제 콜라겐 스폰지와 rhBMP-2에 대 한 확대 H & E 조직학 이미지 대표 4 컷된 대 퇴 골 가장자리에 및 결함 내 스폰지 그룹을 젖 었. 새로운 뼈 형성 제어 대 퇴 골 가장자리, 있지만 새로운 배수 뼈 뿐만 아니라 치료 대 퇴 골에서 periosteal 딱딱하고 프로젝트의 중요 한 확장. RhBMP-2 대우 결함에 걸쳐 중요 한 뼈 형성을 관찰할 수 있다 하는 동안 아무 뼈 소재 제어 결함 내에서 볼 수 있다. 주의: 새로운 뼈, f: 대 퇴 골, c: 연골, h: 출혈, PC: periosteal 냉담 한. 눈금 막대: 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 비 대와 염증 세포 마커를 전시 하는 감염 된 대 퇴 골. 감염된 된 감염 된 대 퇴 골, 박스형된 위치의 4 배 확대와 전체 보기에서에 비해 대 퇴 골의 조직학 이미지 H & E 감염 되지 않은 대 퇴 피 질 조직과 염증의 작은 기호로 delineated 남아 있습니다. 감염 된 대 퇴 골 전체 보기에서 볼 수 있듯이 크게 확대 하 고 피 질 재흡수와 괴 (보라색 셀 클러스터 검은 화살표 표시)의 영역으로 나누어진다. F: 대 퇴 골입니다. 눈금 막대: 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: Gaussia luciferase 신호 결함 발견. 셀의 발광 Gaussia luciferase mRNA IVIS와 외부 판 제거 후 몇 군데와 페. 레드는 대 퇴의 사이트에서 가장 높은 발광 강도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
완전 한 뼈 골절 등 정형 외과 상해의 작은 동물 모델 바이오20의 치료 가능성을 평가 하 고 골의 메커니즘을 탐구 하는 연구를 사용 합니다. 이 연구에서는 쥐 단편 결함 모델 연구소와 생명 공학 팀 로드 베어링 osteosynthetic 뼈 수리의 추가 연구에 대 한 쉽게 재현할 수 있는 사용자 지정 외부 fixator에 의해 안정.
일반적으로 쥐 모델에서 중요 한 크기의 결함을 사용 하 여 이전 연구는 내부 고정 플레이트21,,2223,24에 의존 합니다. 외부 고정 적은 연 조직 장애 및 혈액 손실, 세균성 식민을 위한 기회를 최소화 하기 위해 총 이식된 면적 감소를 일으키는 원인이 되기의 뚜렷한 장점이 고정 방법 중 하나는 임상 허용, 그리고 수술 후 조정 및 단계적된 수술 개입6. 다른 판 재료, 안전 핀, 또는 뼈 절단 방법12,,1314이전 외부 고정 동물 골절 모델 사용. 이 프로토콜에서 외부 fixator 저가 알루미늄 랩의 워크숍에서 쉽게 개조 될 수 있다 때문에 비용 최소화 했다. 이 제공 하는 경제적인 외부 fixator 있습니다 재정적으로 제한 되지 않고 여러 동물 단체와 실험을 수행 하는 연구자. 내부 고정 모델에 비해 우리는이 시스템은 기술적으로 간단 하 고 더 작은 동물 모델에서 재현할 수 다는 것을 믿는다. 우리의 경험과 이러한 모델에서에서 내부 고정 기술적으로 훨씬 더 많은 요구 하 고 사용자 정의 가공 임 플 란 트를 요구할 수 있습니다. 저자의 지식,이 전체 프로토콜 적응된 금속 외부 fixator 디자인15와 함께 사용자 정의 설계 된 지 그의 사용에서 유일 하다, 뿐만 아니라 더 나은 진동 뼈의 사용 본의 일반적인 임상 시나리오를 대표 periosteal 스트립 골절 사이트 고정을 위한 준비를 수행 합니다. 이 모델에는 진동 톱의 사용에 마지막 참고는 생성 열과 발생 periosteal 중단 비 연합 모델 형성에 컨트롤의 마지막 요소를 제공 합니다. 우리의 경험을 다른 방법으로, 이러한 동물 모델에서 수 사관의 위험을 실행 치유 컨트롤 되었습니다.
수술 성공을 위해 몇 가지 중요 한 단계에 배려를가지고: incising 및 근육, 주변에서 대 퇴 골 노출 완곡 해 부를 수행 하지 않도록 방해 하는 경우는 좌 골 신경 caudally, 대 퇴 혈관 medially, 그리고 gluteal 힘 줄 proximally. 알아서 지 그 장치 병렬 배치 하 고 있도록 모든 핀은 뼈에 정확 하 게 수직 평면, 대 퇴 골의 anterolateral 얼굴에 대 한 플러시. 이 외부 fixator의 적절 한 맞춤을 확인 하 고 핀 파손의 가능성을 줄일 것입니다. 핀 배치의 순서 가장 간단한 것 처음 원심, 인접 다음 다음 모두 핀 중간 발견. 이 근 위 핀 gluteal 힘 줄의 중단을 최소화에 대 한 허용. 마지막으로, 그것은 중요 한 각 핀 bicortically 배치는, 뼈의 철회 또는 골 수 구멍으로 이동 하지 않습니다 있도록 두 외피가 관통.
X 선 기계 고해상도 방사선의 질적 변화 구상 될 수 있다 쉽게 및 비 접촉 시간이 지남에 뼈 치유 상태를 모니터링 하는 데 사용 되었다. 그러나, 일관 된 다리 위치 차이 위치에 오해의 소지가 있을 수 있습니다 정확한 방사선 해석을 위해 결정적 이다. 이 연구 결과 이전 작품 시연 5mm 대 퇴 결함 자발적 뼈 치유 정상적인 쥐25방지와. 따라서, 즉 모든 치유와 함께 언급 추가 치료 rhBMP-2 배어 같은 스폰지를 확실히 각각 치료 (그림 3)에 표시 될 수 있습니다.
이 기술에 대 한 가능한 문제 등 핀 파손, 완화, 감염. 예비 테스트에서 근 위 핀 파손 문제가 아닌 스레드 스레드 k-와이어에서 스위치를 메시지가 나타납니다. 비-스레드 핀 기계적으로 강한 하지만 피 지지의 더 많은 위험이 포즈. 특히 빈 뼈 결함에에서 k-전선 수 있습니다. 나 장기간된 순환 핀 로드 (유사 하 게 자전거/절곡 클립) 치유의 부족으로 약 8 주 난민 수 있습니다. 엄격한 항생제 처방은 즉시 cefazolin 주입, 식 수, 그리고 치료 피드를 추가 하는 enrofloxacin의 7 일 매일 활용 절 개 사이트에 항생제 연 고를 포함 하도록 이용 되었다. 위에 명시 된 적절 한 수술 기술 함께 항생제이 프로토콜 최소화 감염 (그림 5).
외부 고정을 사용 하 여 동물 모델에서의 추가 장점 중 하나는 결함 및 이미징 후 교체의 가리지 보기에 대 한 쉬운 제거 이다. 더 효과적인 vivo에서 이미징 기술을 형광 또는 발광 변화 유전자 또는 단백질 식 등을 평가 하기 위해 의존 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 셀 complexed mRNA 인코딩 Gaussia luciferase 페 골 수 구멍에 IVIS로 구상 될 수 나타났습니다. 그림 6 에서는 내부 플레이트, 나사, 함께 있을 수 있습니다 또는 intramedullary21,,2223 손톱 발광 신호 탐지 능력이 외부 고정 접근 하지 방해 하는 , 24.이 비용 효과적이 고 재현 가능한 수술 프로토콜 일관 된 창조와 크기의 중요 한 대 퇴 결함, 이러한 복잡 한 골절의 초기 임상 관리를 모방의 안정화에 대 한 허용. 신뢰할 수 있는 동물 모델 설립은 최후 임상 사용을 위한 어떤 실험적 치료 중요 합니다. 우리의 모델은 예측 가능한 결과 최소한의 행동 변화 나 동물에 불편 함 보여 주었다. 이 모델 미래 변환 테스트 목적을 위해이 문서에서 사용 하는 이미징 기술을와 함께에서 소재 기반 장비의 다양 한 사용할 수 있습니다. 그것은 우리의 희망이이 모델, 작업에 연구원은 외상 환자에서 중요 한 뼈 다 귀 결함을 치료 하는 새로운 방법을 고안 수 있을 것입니다. 이 병 적 상태를 피하기 위해 현재 긴 치료에서 비용 및 사지의 수를 줄일 가능성이 도울 수 있었다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 혜택을 선언합니다. 이 문서의 저자에 의해 직접 또는 간접적으로 받은 아무 혜택 되었습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 장비 그랜트 1S10OD023676-01 위스콘신 대학 정형 외과 부서와 재활 및의 대학 및 공중 보건을 통해 제공 하는 추가 지원에 지원 됩니다. UW의 Carbone 암 센터 지원 보조금 P30 CA014520 헤 마틴의 지원에 대 한 그들의 작은 동물 영상 시설, 뿐만 아니라 국립 보건원 훈련 그랜트 5T35OD011078-08의 사용을 인정 하 길. 우리 또한 Musculoskeletal 재생 파트너십의 그들의 지원에 대 한 마이클 및 메리 수 섀 넌을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
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