Summary
В естественных условиях млекопитающих модели критического размера костных дефектов имеют важное значение для исследователей, изучая механизмы заживления и ортопедической терапии. Здесь мы представляем собой протокол для создания воспроизводимых, сегментарный, бедренной дефектов в крыс, стабилизировалась, с использованием внешней фиксации.
Abstract
Ортопедические исследования опирается на животных моделей для изучения механизмов кости Исцеление в естественных условиях , а также исследовать новые методы лечения. Критического размера сегментарный дефекты являются сложными для лечения клинически, и исследовательские усилия могли бы извлечь пользу из надежной, амбулаторный малых животных модели сегментарный бедренной дефекта. В этом исследовании мы представляем оптимизированные хирургический протокол для создания последовательного и воспроизводимые критический дефект диафизарных 5 мм в крыса бедра, стабилизировалось с внешних фиксаторов. Диафизарных ostectomy была выполнена с использованием пользовательских джиг поставить 4 Kirschner провода bicortically, которые были стабилизированы с устройством адаптированы внешних фиксаторов. Осциллирующий пилой был использован для создания дефекта. Коллагеновая губка одиночку или коллагена губкой, смоченной в rhBMP-2 был имплантирован в дефект, и исцеление кости контролируется более 12 недель, используя рентгенограммы. После 12 недель крысы были принесены в жертву, и гистологический анализ проводился на подакцизные управления и лечить бедра. Дефектов костей, содержащие только коллагеновая губка привело к не союз, в то время как лечение rhBMP-2 принесли формирования периостальная черствым и новые костного ремоделирования. Также восстановленные после имплантации и внешней фиксации животных оказалась успешной в стабилизации бедренной дефектов более 12 недель. Этот обтекаемый хирургические модель может применяться легко изучать кости Исцеление и тестировать новые ортопедические биоматериалов и регенеративной терапии в естественных условиях.
Introduction
Ортопедической травматологии фокусируется на лечении широкого спектра сложных переломов. Критические диафизарных сегментарный кость, которую дефекты доказали трудным для лечения клинически обусловлено снижение регенерационной способности окружающие мышцы и надкостницы, а также отказ от локализованных ангиогенеза1. Современные методы включают постановляющей части фиксации с костной пластикой, задержкой подсадка кости (Masquelet), кости транспорта, фьюжн или ампутация2,3,4. У большинства пациентов, которые имеют амбулаторного функции сохранены после их травмы, с хорошо функционирующей Дистальная конечностей конечности бабло, несомненно, лучшее лечение вариант5. Эти аварийные процедуры часто требуют поэтапного хирургических вмешательств течение длительного лечения. Некоторые авторы полагают, что выше по сравнению с внутренней фиксации для этих приложений из-за повреждения снижение тканей во время имплантации, уменьшилось имплантированных площадь поверхности и увеличение послеоперационной приспособляемость этой внешней фиксации Фиксатор пластинчатый6. Однако перспективных рандомизированное контролируемое испытание ведется в настоящее время чтобы помочь прояснить этот спор внутренней против внешней фиксации в тяжелой открытых переломов голени7. К сожалению с либо лечения выбран, значительных осложнений и провал ставки сохраняются8,9. С либо метод лечения, что касается потери сегментарный кости хирург должны бороться с сегментарный диафизарных дефекты, которые представляют серьезные проблемы. Исправления сегментарный дефектов необходимо максимизировать кости стабилизации и одновременно повысить Остеогенные процесс10,11.
Благодаря клиническое значение, но ниже объема, критического размера диафизарных сегментарный дефектов эффективной, воспроизводимые животной модели необходимо, чтобы исследовательские группы для продвижения методов лечения и в конечном итоге улучшить клинические исходы. Исследователи должны учиться в vivo физиологическое заживление механизмов в млекопитающих животных модели. Хотя такие модели внешней фиксации уже существуют12,13,14,15, мы надеемся обеспечить более надежный метод для профсоюзов, в необработанной животных, уменьшение расходов путем выбора материалы доступные фиксатором и наброски прямой хирургический протокол для легко приложения для будущих исследований. Основная цель настоящего Протокола заключается в создание надежных и воспроизводимых модель критический дефект диафизарных крыс. Процедура оценивалась путем оценки стабилизации и кости Исцеление в крыса бедра свыше 12 недель. Вторичные цели включали: сделать доступным модель стоимости для максимально эффективной, упрощение хирургический подход и стабилизации и обеспечение этического заботу о животных. Авторы и исследовательская группа провела предварительные эксперименты с широкий спектр разных биоматериалов и потенциальных регенеративной терапии для улучшения исцеление в этой сегментарный дефекта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Крысы, используемые в данном исследовании получил ежедневного ухода в соответствии с руководящими принципами AVMA для эвтаназии животных: 2013 издания16. Институциональный уход животных использования в университете Висконсин-Мэдисон оцениваются и Комитет одобрил этот экспериментальный протокол, до начала проекта.
1. Животные
- Используйте беспородных Sprague-Dawley самцах массой около 350 г.
2. Подготовка костных морфогенетических белков-2 (rhBMP-2) смоченной губкой подмости
Примечание: Подготовка леса должно происходить только перед имплантацией в бедренной кости (см. шаг 6.14).
- Следуйте инструкциям производителя для использования комплекта трансплантата установленных кости rhBMP-2, содержащие коллаген Губка, лиофилизированные rhBMP-2 и стерильной водой для растворения17. Сохранения стерильности, воссоздания rhBMP-2 с стерильной воды до концентрации 1,5 мг/мл.
- С помощью стерильными ножницами и стерильные правителя, обрежьте rhBMP-2 пропитанной коллагеновая губка перестроить соответствовать 5 мм x 3 мм x 3 мм дефекта.
- С помощью шприца, равномерное распределение раствора rhBMP-2 над коллагеновая губка таким образом, чтобы она поглощается.
3. Подготовка пользовательских внешней фиксации устройства
Примечание: Смотрите Рисунок 1A для более полного перечня размеры.
- Вырезать алюминия тонколистового (тип 6061, 0,088" толщина) до двух штук (1.4" x 6") с использованием jigsaw или другой подходящий инструмент.
- Смонтировать один кусок в фрезерный станок и, используя мельница сверло карбид 90°-точка 1/8", пазы четыре «V» (видимая область 0,035" по глубокой) вдоль пополам. Оставьте другой кусок, без сокращений.
- Вырезать отдельные пластины шириной 0,3" из двух частей (рис. 1B). Измерить и Просверлите отверстия для винтов для потока 4-40. Нажмите плита с пазами «V» с резьбой 4-40. Просверлите пластину без канавки для дрели #4 винт тела.
- Песок оба произведения Закруглить углы и уменьшить вес (рис. 1 c).
- Винт куски вместе с 4-40, 18-8 нержавеющей стали кнопку головкой (0,25"), так что пазов заподлицо с простой пластины (рис. 1 d)
4. цистит процедуры и обезболивание
- Побудить анестезии, поместив крыса в камере индукции, обеспечивая 4 L O2мин. с 4% изофлюрановая.
Предупреждение: Исследовательский персонал должны избегать ингаляционной анестезии газов и поддержания надлежащего Худ и вентиляции в лаборатории. - Удалить крысы из камеры после того, как крыса теряет восстанавливающих рефлекс, приложите носовой конус и место в дозе поддержание анестезии через нос (O2 скорость доставки до 2-3 Л/мин и 0,8% изофлюрановая).
- Место крысы на грелку или под потепления свет для предотвращения переохлаждения.
- Подтвердите адекватной глубины анестезии, защемления ног или тестирования глазной рефлекс.
- Применение смазки для глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Доставить подкожно расширенного выпуска бупренорфин (1 мг/кг) на ствол/спинку крысы, далеко от хирургической сайта, чтобы обеспечить анальгезии на срок до 3 дней после операции.
5. асептический подготовка и антибактериальной профилактики
- Бритье вокруг hindleg, используя 13го ребра, ноги, спинной срединной и брюшной срединной линии в качестве поля.
- Скраб брился области с помощью стерильные марлевые 2 x 2, пропитанной с 10% повидон йод следуют 70% EtOH (4 раза каждый, чередуя).
- Администрировать внутримышечной инъекции цефазолина (20 мг/кг), в постановляющей части четырехглавой мышцы.
- Администрировать Энрофлоксацин (0,25 мг/мл) в питьевой воде для 7 дней после операции для продолжения антибактериальной защиты.
- Место крыс на лечебные корма (например, Uniprim) в течение всего исследования для предотвращения инфекции тракта PIN-код.
- Обратиться двойной мазь с антибиотиком кожи контактный интерфейс раз ежедневно в течение 3 дней после операции.
Примечание: Во избежание любой внешней фиксации ПИН или зажим, разрыхление, которая может способствовать развитию инфекции.
6. хирургическая процедура
Примечание: Сделать согласованные усилия, чтобы поддерживать стерильные области и область и следовать стерильных во всем объеме дела.
- Расширить бритая ноги через перфорированную, ясно липкой Пелерина и покрытия хирургических скамейке в стерильных полотенца для создания поля, стерильный.
- Ощупывайте бедренной кости и использовать #15 лезвие для создания передне-боковой разрез через кожу, простирающейся от надколенника к большей вертела в проксимального отдела бедренной кости.
- Тщательно надрезать поперечной ножки фасции вдоль межмышечной перегородки для разделения lateralis мышц мышц четырехглавой кпереди от бедра кзади до боковой бедренной подвергается. Сохраните похититель ягодичной сухожилие вставки на более вертела.
- Выполните тщательного, рассечение продольных мягких тканей атравматической и разоблачить бедренной кости в его середине диафиза, начиная на боковой поверхности. Для этого используйте лезвие #15 аккуратно вырезать мышцы от основной кости, сохраняя лезвие параллельное против контура поверхности кости. Используйте периостальная Лифт поднимать мышцы от подвергаются кости, как она рассекается и перейти вокруг оси бедра до 7-10 мм Центральной диафиза была очищена от мягких тканей со всех сторон для подготовки к ostectomy.
Примечание: Во избежание повреждения медиального бедренной кости сосудисто-нервного пучка. - Вставьте четыре провода 1,0 мм Киршнер (k): 2 проксимальных и дистальных в бедра перпендикулярно боковой бедренной кости, 2 направлен прямо бокового к медиальному. Убедитесь, что все контакты участвовать оба коре (bicortical) для надлежащей стабильности (рис. 2A).
- Начните с дистальной большинство ПИН во-первых, просто на уровне боковой надмыщелок. Место джиг заподлицо боковыми дистальной бедренной кости и k-проволоку 1.0 резьбовой наконечник.
- Сохранение позиции джиг на кости, определите, где наиболее проксимальный контакт войдет кости, основанный на джиг отверстия. После того, как определяется позиция, тщательно надрезать параллельно волокна ягодичной сухожилия, необходимые для создания небольшой разрыв в ткани для проксимальной контактный пройти через, таким образом минимизируя ятрогенные повреждения сухожилия. Дрель 1,0 мм беспотоковая k провод в этот разрыв, опять таки гарантируя, что ПИН привлекает обе коре (рис. 2B).
- Сохранять позицию джиг в контакте с костью и просверлить два k-1,0 мм резьбовые провода, один на обе стороны дефекта будущего сайта. Убедитесь, что контакты участвовать оба коре (рис. 2 c).
- Место внешних фиксаторов бар уровня 1 см выше кожи и плотно, винт блокировки панели на месте. Обрезать излишки ПИН длины (Рисунок 2D).
- Подготовиться ostectomy (дефект создание), поместив небольшой, изогнутые втягивающего вокруг передней и задней бедренной кости для защиты окружающих мягких тканей, мышц и сосудисто-нервного пучка. Используя ~ 5 мм сагиттальной осциллирующие пилы, очень осторожно создать сегментарный дефект 5 мм через середину диафиза. Примените, свет, даже давление с пилой, чтобы избежать ненужных перелом (Рисунок 2E).
- Примените небольшое количество орошения (комнатной температуре 0.9% стерильный физиологический (NS)) по мере необходимости при создании дефекта во избежание теплового некроз кости.
- Промойте рану, используя 10 мл NS после создания дефекта.
- Администрировать 0,1 мл 0,25% бупивакаин с эпинефрина (1: 200, 000) в рану как болеутоляющее и сосудосуживающие.
- Вставить леску (5 x 3 x 3 мм) коллагеновая губка или rhBMP-2 смоченной губкой (из шага 2) в дефект. Каждый леску следует надлежащим образом размера занимаемых длину и объем дефекта, помогая Губка оставаться в положении.
Примечание: на данный момент, мРНК комплексов может быть подготовлен и вводят изложенные в шагах 7.1-7.3 ниже при выполнении визуализации биолюминесценции. - Закройте плоскости мышцы с помощью простого Прерванный шаблона с рассасывающиеся шовные 4-0. Закройте слой кожи с помощью шаблона работает subcuticular с 4-0 рассасывающиеся шовные и кожи клей, чтобы закрыть пробелы вокруг выступающие штифты.
- Удаление крысы из носовой конус, оставаясь на грелке и мониторинга непрерывно до тех пор, пока крыса способна постоянно сохранять вертикальное положение. На данный момент место в чистой клетке для восстановления.
7. Подготовка complexed мРНК и биолюминесценции изображений
Примечание: Transfection с мРНК комплексы должны выполняться во время операции за 1 день до изображений свечения. Используйте стерильные приемы при обработке мРНК.
- Смесь 10 мкл мРНК кодировки для Gaussia Люцифераза (фондовых концентрация составляет 1 мкг/мкл) с 30 мкл липидный transfecting агента.
- Разрешите для мРНК липидных комплексов к форме, инкубации по крайней мере 5 минут при комнатной температуре. Липидный transfecting агент будет конденсируются молекулы мРНК, их стабилизации и повышения эффективности transfection.
Примечание: Если сразу не используются комплексы, храните их в ice для максимум 1 час. - С помощью 20 мкл пипетки с отфильтрованной советы, придать половина объема мРНК комплексов в проксимальном и дистальном концы дефекта, соответственно.
- Следующий день, 3 мин до изображений, анестезировать крыса, используя вдыхаемого изофлюрановая как описано в шаге 4.1.
- Расположите крыса в в естественных условиях imaging камеры оснащены носовой конус, обеспечивая техническое обслуживание изофлюрановая (0,8% изофлюрановая, скорость доставки2 O 2-3 Л/мин).
- Придать целентеразин высокомобильна в физиологического раствора в дозе 4 мг/кг веса тела в непосредственной близости от дефекта.
- Приобрести биолюминесценции изображения с в vivo imaging системы (ИВИС) согласно инструкциям производителя18.
8. изображений протокол
- После калибровки равнина радиографический машина, рентгеновские системы19, анестезировать крыс с помощью вдыхаемого изофлюрановая как описано выше (см. Шаг 4.1) и положение крыса в носовой конус с вдыхаемого изофлюрановая (0,8% изофлюрановая, O2 скорость доставки 2-3 Л/мин) на рентгенограмме бедренной переднезаднем (AP).
- В то время как крыса в грудной recumbency, заранее хирургические задних конечностей вперед, сгибание на бедра и задушить сустава. Flex коленному суставу до приблизительно 90°. Лента с лапой подошвенной стороны вниз, недалеко от стенки тела. Положение голени вперед от бедра, чтобы исключить возможность наложения кости. Предоставлять небольшие похищения бедра, место полупрозрачный губкой (примерно 15 мм толщиной) в районе паха. Затем получите изображение (черепно хвостового) передней задней бедренной кости.
- Повторите это мнение радиографический бедренной AP, сразу же после операции, 4 недели, а 12 недель. Использовать ленту и марля надлежащим образом позиционировать конечности животного для качества и последовательного изображений.
- Удаление крысы из носовой конус и мониторинга непрерывно до тех пор, пока крыса способна постоянно сохранять вертикальное положение. Затем место обратно в клетке.
9. гистологические процедура
- Усыпить крыс в камере с ингаляционных CO2 согласно AVMA этических стандартов16.
- После эвтаназии брить задних конечностей, удалить кожу из постановляющей части конечности и disarticulate бедра на бедра. Тщательно удалите все мягкие ткани из постановляющей части бедра (включая все мышцы, сухожилия и связки). Оставьте только тонкий слой мышц, окружающих дефект сайт для защиты регионе исцеления от случайного повреждения во время вскрытия.
- Место бедренной кости в 10% нейтральных буферизуются формалин при комнатной температуре 3-4 дней для фиксации. Держите формалина 15:1 соотношение объема тканей. Измените решение, как только на полпути через процесс фиксации.
- Известь бедренной кости в раствор рН 6,5 15% Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) для 3-4 недели. Собирайте серийный рентгенограммы, чтобы определить конечную точку декальцинации.
- Пополам бедренной продольно с разрубки от кзади в середине сагиттальной плоскости. Представить ткани для встраивания Стандартный парафин и гематоксилином и эозином (H & E).
- Отправьте H & E слайды патологоанатом для гистологической оценки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Операции были проведены в приблизительно один час один хирург с помощью одного помощника. После хирургической оптимизации интра - и послеоперационных осложнений значительно были сведены к минимуму и использовать джиг аппарата обеспечивается постоянный размер (5 x 3 x 3 мм) и локализации бедренной дефектов. Крысы были амбулаторного сразу после восстановления от анестезии и не иметь любые изменения поведенческих моделей; их походка была не болеутоляющие, и они, по всей видимости, не беспокоили внешних фиксаторов.
Non резьбовой k провода были выбраны для самых проксимальной pin (Рисунок 2Б), как проксимальный контакт имел высокий риск взлома когда резьбовые провода были использованы. В некоторых случаях особенно в управления животных без rhBMP-2 или подмостей, чьи дефекты показали никаких признаков формирования исцеления/костей, один или более советов k провод сломал примерно через 8 недель, как видно в губки только контролировать рентгенограмме подакцизным бедренной кости ( Рисунок 3).
Для оценки уровня заживления кости были проанализированы рентгенограммы и гистологии (H & E пятно). Отрицательный контроль дефектов, содержащие только коллагеновая губка показал никаких доказательств преодоление Остеогенез между краями проксимальных и дистальных костей (рис. 3, рис. 4). Небольшое количество новых костного ремоделирования можно увидеть непосредственно прилегающих к краю резки бедра; дефект, сама показывает отсутствие костного материала, наличие хряща и некоторые остаточные гематомы (рис. 4). Дефекты, содержащие rhBMP-2 пропитанной губкой продемонстрировал значительные кости Исцеление как 4 недели после операции, как показано рентгеноконтрастных черствым мост через дефект в рисунке 3. В 12 недель, значительные новые осаждения минеральных (Рисунок 4, NB: Новая кость, PC: периостальной расчетливому) сложился на протяжении всего дефект. Значительные новые периостальная кости можно увидеть в черствым простирается от края резки бедра, и спикулы тканые и пластинчатая кости разработали во всем дефекта. Хрящ осаждения не видно (рис. 4).
Гистология (H & E пятно) также была исполнена для неинфицированных управления и пример зараженного бедренной кости (рис. 5). Инфицированных бедренной значительно увеличивается, признаки endosteal реакции, проникнув кости коры. Стрелки указывают области остеокластов опосредованной патологического костную резорбцию. Неинфицированным бедренной кости коры остается компактной и с четко определенной пластинчатые коры. Антибиотик дозирования был оптимизирован для включать максимальное освещение послеоперационные сутки. В то время как инфекции вокруг дефекта сайта может произойти, продолжение введение антибиотиков местно вокруг ПИН сайтов и в воде и диета оказалась успешной в сведении к минимуму послеоперационные инфекции.
Далее, обработки изображений, с помощью системы визуализации In Vivo (ИВИС) иллюстрирует биолюминесцентных клеток способность быть визуализированы в дефект после имплантации внешних фиксаторов (рис. 6). Внешние пластины могут быть легко удалены для воображения и заменены после завершения. Клетки в полости мозгового светиться после трансфекции с complexed мРНК кодировки Люцифераза Gaussia. Самый высокий уровень свечения ориентирован на сайте бедренной дефекта и сигнал не препятствует фиксации булавками устройства. Это перспективно для будущих исследований, полагаясь на биолюминесценции или флуоресценции для измерения биологических изменений, таких как выражение гена или белков во время процесса заживления.
Рисунок 1: Изготовление внешних фиксаторов. A: CAD схемы собрал внешних фиксаторов с аннотированной размеры для правильного изготовления. Каждый фиксатор состоит из двух алюминиевых пластин, удерживаемых вместе два винта. B: плиты, вырезанные из 1.4 "x 6" алюминиевых листов с «V» канавки разрезать на нижнем листе. C: винтовые отверстия просверлены в пластины (резьбовые в тарелку с пазами «V») и все края и углы шлифуются раунд и снижения веса. D: собранный внешних фиксаторов стягивается винтами (4-40 x 0,25", 18-8 нержавеющей стали кнопки головы колпачок) как только контакты в место в «V» канавки на внутренности алюминиевых пластин. Левый штифт беспотоковая и наиболее проксимальный на бедренной кости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схема размещения ПИН, фиксатором размещения и создание дефект. A: дистальной pin (1,0 мм резьбовые k провод) помещается в регионе метафиза надмыщелок, используя джиг (синий прямоугольник) для ввода правильного ПИН-кода. Кондуктор помещается на переднебоковой поверхности бедренной кости. B: проксимальный контакт (1,0 мм беспотоковая k провод) размещается с помощью джиг после внесения небольшой надрез в ягодичной сухожилия. C: средний булавки (1,0 мм резьбовые k провод) вставляются с помощью джиг. D: джиг удаляется и 2 пластины крепятся к контактам с помощью 2 винтов для обеспечения пластины. Пластины затянуты 1 см над уровнем кожи, чтобы избежать давления на коже. E: сагиттальной осциллируя пила используется для создания дефектом 5 мм между двумя закреплениями среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель высокого разрешения рентгенограммы Показать кости Исцеление с лечением rhBMP-2. Изображения для отрицательного контроля коллагеновая губка и rhBMP-2 пропитанной губкой групп отображаются на 0, 4 и 12 недель после операции. Лечение rhBMP-2 Группа экспонатов, значительные исцеления после 4 недель с черствым охватывающих дефекта. Концы бедренной кости отрицательного контроля не заживают с преодоление кости и дефект остается не входящих в союз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Значительные новые формирования костей рассматривается с лечением rhBMP-2. Представитель 4 x увеличенное H & E гистологические изображений для отрицательного контроля коллагеновая губка и rhBMP-2, пропитанной губки групп как на краю резки бедра, так и в рамках дефекта. Новые кости формируется вокруг края элемента бедра, но значительного расширения новых Трабекулярная кость, а также периостальная черствым проекта от обработанной бедренной кости. Костлявые материал не рассматривается в рамках управления дефект, в то время как формирования значительных костей можно наблюдать во всем rhBMP-2 лечение дефектов. NB: новые кости, F: бедра, C: хряща, H: кровоизлияния, PC: периостальной расчетливому. Линейки: 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Зараженные бедренной экспонатов гипертрофии и воспалительных клеток маркеров. H & E гистологические образы неинфицированных бедренной кости, по сравнению с зараженных бедренной кости, в полноэкранном режиме и при 4-кратном штучной мест. Неинфицированным бедренной кости коры остается организованной и разграничены, с мало признаков воспаления. Инфицированных бедренной увеличивается значительно, как видно в полноэкранном режиме, и коры головного мозга нарушается области резорбцию и некроз (кластеры фиолетовый ячейки обозначаются черными стрелками). F: бедренной кости. Линейки: 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Gaussia Люцифераза сигнал обнаружен дефект. Transfected люминесценции клеток с Gaussia Люцифераза, которую мРНК образы с ИВИС после удаления наружной пластиной. Красный цвет означает высокие интенсивности свечения на сайте бедренной дефекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Малые животные модели ортопедических травм, таких как полный переломов включить исследования, который исследует механизмы остеогенез и оценки терапевтический потенциал биоматериалов20. Это исследование представляет крыса сегментарный дефект модель стабилизировать посредством пользовательских внешних фиксаторов, что лаборатории и биомедицинская инженерия команда может легко воспроизвести для дальнейших исследований-несущей osteosynthetic кости ремонт.
Предыдущие исследования, с помощью критических размеров дефектов в крыса модели обычно полагаются на внутренней фиксации пластины21,,2223,24. Хотя любой метод фиксации клинически приемлемым, внешней фиксации имеет явные преимущества причинения менее мягких тканей срыв и потери крови, уменьшается площадь имплантированных поверхности для сведения к минимуму возможностей для бактериальной колонизации, и позволяет для послеоперационного Настраиваемость и поставил хирургических вмешательств6. Предыдущие модели внешней фиксации животных перелом использовали различные плитных материалов, Штифт крепления или кости резка методы12,,1314. Потому что внешних фиксаторов в этом протоколе была выполнена в лаборатории мастерской с дешевой алюминиевые и могут быть легко переоборудованы, расходы были сведены к минимуму. Это обеспечивает экономичное внешних фиксаторов позволяет исследователям для выполнения экспериментов с несколькими группами животных не ограничиваясь финансово. По сравнению с внутренней фиксации модель мы считаем, что эта система является технически проще и более воспроизводимые в небольшой модели на животных. В нашем опыте с этими моделями внутренней фиксации является значительно более сложным технически и может требовать обычай обработанные имплантатов. Для авторов знаний этот общий протокол является уникальным в его использования специально разработанных джиг, в сочетании с дизайн адаптирован металла внешних фиксаторов15, так как его использование осциллируя кости видел лучше представляют общие клинические сценарий Периостальный зачистки выполнена подготовить для фиксации переломов сайтов. Последнее замечание по использованию осциллируя увидел в этой модели является, что тепла и периостальной нарушение, которое происходит обеспечивает последний элемент управления в формировании модели не входящих в союз. Наш опыт был, что с другими методами, в этих моделях животных, следователи рискуют исцеление элементов управления.
Для обеспечения успеха хирургической, следует проявлять осторожность в нескольких важных шагов: когда промо и выполнении продольных рассечение подвергать бедренной кости от окружающих мышц, избежать тревожной седалищного нерва каудально, бедренных сосудов медиально, и ягодичные сухожилие проксимально. Позаботьтесь, чтобы позиционировать параллельно аппарат джиг и flush против плоские лица передне-боковой бедренной кости, так, что все контакты точно перпендикулярно кости. Это подтвердит надлежащему применению внешних фиксаторов и снизить вероятность обрыва PIN-код. Порядок размещения ПИН нашли наиболее простыми впервые дистальных, следуют проксимальный и затем оба средние контакты. Это позволило меньшим ущербом ягодичной сухожилия, проксимальной PIN-код. Наконец важно, что каждый штырь находится bicortically, проникающего оба коре, так что это не обратно из кости или переносят в полость медуллярного.
Рентгеновский аппарат, способный разрешением рентгенография был использован для мониторинга состояния костей исцеление, как качественные изменения могут быть визуализированы легко и неинвазивным со временем. Однако последовательной ноги позиционирования имеет решающее значение для точной интерпретации радиографический, как различия в позиционирование может ввести в заблуждение. Результаты этого исследования находятся в согласии с предыдущей работы, демонстрируя, что дефект бедренной 5 мм предотвращает спонтанное кости Исцеление в нормальных крыс25. Таким образом любой исцеление это отметили с дополнительной терапии такие, как rhBMP-2 пропитанной атрибутированных Губка может быть окончательно соответствующие обращения (рис. 3).
Возможные проблемы для этой техники включают поломки ПИН, разрыхление и инфекции. Проблемы с обрыва проксимальный контакт во время предварительного тестирования побудило переключатель с резьбовой беспотоковая k проволоки. Non Резьбовые штифты механически сильнее, но также создают больше риск бэк коры. Особенно в пустой костных дефектов k провода может сломаться или быть перемещены около 8 недель из-за длительных циклических ПИН погрузки и отсутствие исцеления (аналогично Велоспорт/гибка скрепки). Строгой схемы антибиотикотерапии был использован для включать немедленное Цефазолин инъекции, ежедневное применение мазь с антибиотиком в месте разреза, 7 дней Энрофлоксацин, добавлены к питьевой воде и лечебные корма. Этот антибиотик протокола, наряду с надлежащей хирургические методы, описанные выше, свести к минимуму инфекции (рис. 5).
Одним из дополнительных преимуществ использования внешней фиксации в животной модели является легкого удаления для беспрепятственный вид дефекта и замена после съемки. Это позволяет более эффективным в vivo методы полагаясь на флуоресценции или люминесценция оценить изменения, такие как выражение гена белка или визуализации. Например мы показали, что клетки в полости мозгового transfected с complexed мРНК кодировки Gaussia Люцифераза могут быть визуализированы с Ивис. Рисунок 6 иллюстрирует, что возможность обнаружения сигнал люминесценции ничто не мешает этой внешней фиксации подход, как это может быть с внутренней пластины, винты, или интрамедуллярные гвозди21,,2223 , 24. Этот экономически эффективным и воспроизводимые хирургический протокол позволяет для последовательного создания и стабилизации критического размера бедренной дефекта, который имитирует первоначального клинического управления этих сложных переломов. Создание надежной модели животных имеет решающее значение для любого экспериментальное лечение, предназначенных для последующего клинического использования. Наша модель показывает предсказуемые результаты и минимальные изменения в поведении или дискомфорта в наших животных. Эта модель может использоваться с различными на основе биоматериала леса в сочетании с методы обработки изображений, используемых в настоящем документе для будущих трансляционного тестирования. Это наша надежда, что в работе с этой моделью, исследователи смогут разработать новые способы лечения критических костных дефектов в пациентов с травмами. Это могло бы помочь избежать заболеваемости и расходов в длительные процедуры в настоящее время работают и возможно уменьшить количество ампутаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что без финансовых интересов или выгоды. Там было никаких выгод, полученных прямо или косвенно авторы этой статьи.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH оборудование Грант 1S10OD023676-01 с дополнительной поддержки, предоставляемой через университет Висконсин отделения ортопедии и реабилитации и школа медицины и общественного здравоохранения. Мы хотим отметить UW Карбоне рака центр поддержки Грант Р30 CA014520 и использования их маленький животное визуализации объекта, а также NIH обучения Грант 5T35OD011078-08 для поддержки H. Мартина. Мы также благодарим Майкла и Мэри Сью Шеннон за их поддержку опорно регенерации партнерства.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
