Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59215
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering and KI for Health Science and Technology (KIHST), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

Summary

Vi præsenterer eksperimentelle metoder til at studere RNA-interactors af dobbelt-strenget RNA bindende protein kinase RNA-aktiveret (PKR) i løbet af pattedyr celle cyklus ved hjælp af HeLa celler. Denne metode udnytter formaldehyd bitmapgenkendelse RNA-PKR komplekser og immunoprecipitation til at berige PKR-bundet RNA'er. Disse RNA'er kan analyseres yderligere gennem høj overførselshastighed sekvensering eller qRT-PCR.

Abstract

Protein kinase RNA-aktiveret (PKR) er medlem af det medfødte immunforsvar proteiner og genkender den dobbelt-strenget sekundære struktur af viral RNA'er. PKR gennemgår Hvornår bundet til viral dobbelt-strenget RNA'er (dsRNAs), dimerization og efterfølgende autophosphorylation. Fosforyleres PKR (pPKR) bliver aktivt og inducerer fosforylering af alpha subunit af eukaryote indledningen faktor 2 (eIF2α) til at undertrykke globale oversættelse. Stadig flere beviser tyder på, at PKR kan aktiveres under fysiologiske tilstande som under cellecyklus eller på forskellige stress betingelser uden infektion. Vores forståelse af RNA aktivatorer af PKR er dog begrænset på grund af manglen på en standardiseret Eksperimentel metode til at fange og analysere PKR-interaktion dsRNAs. Her præsenterer vi en eksperimentel protokol til specifikt berige og analysere PKR bundet RNA'er under celle cyklus ved hjælp af HeLa celler. Vi udnytte den effektive crosslinking aktivitet af formaldehyd til fix PKR-RNA komplekser og isolere dem via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNA'er kan derefter behandles yderligere for at generere en høj overførselshastighed sekventering bibliotek. En stor klasse af PKR-interagere cellulære dsRNAs er mitokondrie RNA'er (mtRNAs), som kan eksistere som intermolekylære dsRNAs gennem supplerende samspil mellem tunge-strand og lys-strand RNA'er. For at studere strandedness af disse duplex mtRNAs, præsentere vi også en protokol for strand-specifikke qRT-PCR. Vores protokol er optimeret til analyse af PKR-bundet RNA'er, men det kan let modificeret til at studere cellulær dsRNAs eller RNA-interactors af andre dsRNA-bindende proteiner.

Introduction

Protein kinase RNA-aktiveret (PKR), også kendt som eukaryote indledningen faktor 2-alpha kinase 2 (EIF2AK2), er et godt karakteriseret protein kinase, der overfører oplysningerne fra RNA'er. Det hører til eukaryote oversættelse indledningen 2 subunit alpha (eIF2α) kinase familie og phosphorylates eIF2α på Serin 51 som reaktion på infektion at undertrykke globale oversættelse1. I denne forbindelse er PKR aktiveret af viral dobbelt-strenget RNA'er (dsRNAs), som giver en platform til PKR dimerization og autophosphorylation2. Ud over eIF2α, kan PKR også phosphorylate p53, insulin receptor substrat 1, hæmmer κB og c-Jun N-terminale kinase (JNK) at regulere aktiviteten af talrige signaltransduktion veje3,4,5, 6.

PKR blev oprindeligt identificeret som en kinase, der fosforyleret eIF2α under poliovirus infektion ved at anerkende poliovirus' dsRNAs7,8. PKR er i stigende grad fundet for at spille mangeartede roller ud over immunrespons, og dens afvigende aktivering eller funktionsfejl er underforstået i mange menneskers sygdomme. Aktiveret/Phosphorylated PKR (pPKR) er ofte iagttaget under apoptose og er en fælles kendetegn for patienter med degenerative sygdomme, især neurodegenerative sygdomme som Huntingtons Parkinsons og Alzheimers sygdom9 ,10,11,12,13. Derudover er PKR aktiveret under forskellige stress tilstande såsom metabolisk stress og heat shock14,15,16,17. På den anden side resulterer hæmning af PKR i øget celleproliferation og selv maligne transformation18,19. PKR funktion er også vigtigt i normal hjernefunktion og under cellecyklus som niveauet af pPKR er forhøjet under M fase20,21,22. I denne forbindelse pPKR undertrykker globale oversættelse og giver stikord til centrale mitotiske signaling systemer, der er nødvendige for korrekt celledeling20. Derudover resulterede længerevarende aktivering af PKR i G2/M fase celle cyklus anholdelse i kinesisk hamster ovarie celler23. Derfor reguleres PKR fosforylering af negativ feedback loop til at sikre hurtig deaktivering under M/G1 overgang21.

Trods den brede vifte af PKR funktion er vores forståelse af PKR aktivering begrænset på grund af manglen på en standardiseret høj overførselshastighed eksperimenterende tilgang til fange og identificere dsRNAs, der kan aktivere PKR. Tidligere undersøgelser har vist, at PKR kan interagere med dsRNAs dannet af to inverteret Alu gentagelser (IRAlus)20,24, men muligheden for eksistensen af ekstra cellulære dsRNAs, der kan aktivere PKR under cellecyklus eller under stressforhold i humane celler var uudforsket. Den konventionelle tilgang til at identificere RNA-interactors af et RNA-bindende protein (RBP) bruger UV-lys til bitmapgenkendelse RNA-RBP komplekser25,26,27. En nylig undersøgelse anvendes denne UV crosslinking tilgang i en mus system og identificeret, små nucleolar RNA'er kan regulere PKR aktivering under metabolisk stress16. Ved at udnytte høj crosslinking effektivitet af formaldehyd, præsenterede vi en alternativ metode til at identificere PKR-interagere RNA'er under cellecyklus i HeLa celler28. En lignende fremgangsmåde er blevet anvendt til at undersøge andre dsRBPs såsom Staufen og Drosha29,30,31. Vi fandt, at PKR kan interagere med forskellige typer af noncoding RNA'er såsom korte spækket nukleare element (sinus), lang afbrudt nukleare element (linje), endogene retrovirus element (ERV) og endda alpha-satellit RNA'er. Endvidere viste vi, at PKR kan interagere med mitokondrie RNA'er (mtRNAs), hvilken form intermolekylære dsRNAs gennem supplerende samspil mellem tunge-strand og lyset strand RNA'er28. En nylig publikation yderligere understøttet vores data, at nogle mtRNAs findes i en duplex form og kan aktivere dsRNA sensorer som melanom differentiering-forbundet protein 5 at fremkalde Interferoner32. Endnu vigtigere, er udtryk og subcellulært lokalisering af mtRNAs moduleret under cellecyklus og af forskellige stressfaktorer, der kan være vigtige i deres evne til at regulere PKR aktivering28.

I denne artikel, vi præsenterer en detaljeret protokol for en nyligt udviklede formaldehyd crosslinking og immunoprecipitation (fCLIP) metode til at fange og analysere PKR-interagere RNA'er under celle cyklus. Vi demonstrere metoden for at forberede celle cyklus anholdelse prøver ved hjælp af thymidine og nocodazole. Derefter præsenterer vi fCLIP processen for at isolere PKR-bundet RNA'er og en metode for at forberede høj overførselshastighed sekventering bibliotek for at identificere disse RNA'er. Desuden afgrænse vi detaljerede procedurer for at analysere PKR-bundet RNA'er ved hjælp af qRT-PCR. Specifikt, præsenterer vi en strand-specifikke reverse transkription procedure for at analysere strandedness af mtRNAs. Den beskrevne protokol er optimeret til HeLa celler og PKR, men vigtige skridt som forberedelse af cellecyklus prøve, fCLIP og strand-specifikke qRT-PCR analyse kan let modificeret til at studere cellulær dsRNAs eller til at identificere RNA interactors af andre dsRBPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. løsning og celle forberedelse

  1. Løsning forberedelse
    1. For cellekulturmedium, forberede medium HeLa cellekultur ved at tilføje 50 mL føtalt bovint serum (FBS) til 500 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM).
      Bemærk: Antibiotika kan føjes til cellekulturmedium, men vi bruger ikke antibiotika.
    2. For 0,1% PARAFORMALDEHYD opløses 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD i 1 x Phosphate-Buffered saltvand (PBS) med varme på en varm tallerken og fortyndet at gøre 30 mL af 0,1% (v/v) PARAFORMALDEHYD ved at tilføje 1 x PBS.
      Forsigtig: Udføre alle trinene i et stinkskab og være omhyggelig med ikke at kog PARAFORMALDEHYD løsning. Beskytte 0,1% opløsning fra lys og opbevares ved 4 ° C. Brug løsning inden for en måned.
      Bemærk: PH-værdien af den sidste 0,1% (v/v) PARAFORMALDEHYD løsning bør være omkring 7.
    3. Forberede fCLIP lysisbuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS) og 0,1% (w/v) natrium deoxycholate. Tilføje tredobbelt destilleret vand (TDW) til 40 mL. Opbevares ved 4 ° C.
    4. Forberede fCLIP wash buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) SDS og 0,1% (w/v) natrium deoxycholate. Tilføje TDW til 40 mL. Opbevares ved 4 ° C.
    5. Forbered 4 x PK buffer: 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA og 4% (v/v) SDS. Tilføje TDW til 40 mL. Opbevares ved stuetemperatur.
    6. Forberede fCLIP eluering buffer: 20 mL af 4 x PK buffer, 21 g urea og 8,5 mL TDW. Forberede friske.
    7. Forberede RNA eluering buffer: 0.3 M NaOAc og 2% (w/v) SDS. Opbevares ved stuetemperatur.
    8. Forberede 2 x RNA lastning farvestof: 0.025% (w/v) bromophenol blå, 0.025% (w/v) xylen cyanol, 5 mM EDTA, 0,05% (w/v) SDS og 95% (v/v) formamid. Opbevares ved-20 ° C.
    9. Forberede 1 x TBE buffer: 0.089 M Tris-Borat og 0.002 M EDTA. Forberede 500 mL af TBE buffer.
  2. Forberedelse af S eller M fase-anholdt celler
    1. Frø ~ 750.000 eller ~ 1.000.000 HeLa celler for S eller M fase-anholdt prøver, henholdsvis. Vokse celler ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
    2. Behandling af celler med 2 mM thymidine og Inkuber i 18 timer ved 37 ° C.
    3. Cellerne vaskes to gange med PBS. Tilføje friske medier, og der inkuberes i 9 timer ved 37 ° C.
    4. S behandle fase-anholdt celler, celler med 2 mM thymidine. M fase-anholdt celler, behandle celler med 100 ng/mL nocodazole. Inkuber i 15 timer ved 37 ° C og høst celler.
      Bemærk: Homogeniteten af cellecyklus prøver kan blive kontrolleret ved hjælp af FACS.

2. formaldehyd cross-linking og immunoprecipitation

  1. Celle høst
    1. For en S fase prøve, indsamle celler med celle skraber og overførsel i en 15 mL konisk slange. For en M fase prøve, skal du trykke på siden af celle kultur parabol til at frigøre M fase-anholdt celler og overføre dem til en 15 mL konisk slange.
      Bemærk: For at øge homogeniteten af M fase-anholdt celler, ikke brug en celle skraber.
    2. Der centrifugeres celler på 380 x g ved stuetemperatur i 3 min. Fjern supernatanten og genopslæmmes med 1 mL koldt PBS og overførsel til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
    3. Der centrifugeres celler på 10.000 x g ved 4 ° C i 30 s. Fjern supernatanten helt.
  2. Formaldehyd crosslinking
    1. Tilføje 750 μl af 0,1% PARAFORMALDEHYD i 10 min ved stuetemperatur til at fastsætte cellerne.
    2. Tilsæt 250 μL af 1 M Glycin og inkuberes en yderligere 10 min. ved stuetemperatur til at slukke reaktionen. Der centrifugeres celler på 10.000 x g ved 4 ° C i 30 s. Fjern supernatanten helt.
    3. Genopslæmmes med 1 mL PBS. Centrifugeres celler på 10.000 x g ved 4 ° C i 30 s og Fjern supernatanten.
    4. Genopslæmmes med 400 μL fCLIP lysisbuffer suppleret med 0,2% (v/v) protease inhibitor og 2% (v/v) RNase inhibitor. Der inkuberes i isbad i 10 min og Læg instrumenterne i ultralydsbad ved hjælp af en ultrasonicator.
    5. Tilføje 11 μL af 5 M NaCl til at justere NaCl koncentration til ~ 150 mM. Vortex kort og centrifugeres ved 21,130 x g ved 4 ° C i 15 min. Overfør supernatanten til en pre kølet 1,5 mL microcentrifuge tube.
      Bemærk: Fastholde 40 μL af supernatanten i en nye centrifugerør som input prøven. Butik input prøven ved 4 ° C.
  3. Immunoprecipitation
    1. Tilsættes 20 μL Protein A perler ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør.
    2. Vask perler med 400 μL fCLIP lysisbuffer. Der centrifugeres perler på 1.000 x g ved 4 ° C i 1 min. Fjern supernatanten og tilføje 400 μL fCLIP lysisbuffer omhyggeligt. Forsigtigt genopslæmmes perlerne af invertere 3 ~ 4 gange.
    3. Gentag trinnet vaskes tre gange. Efter den sidste vask, Fjern supernatanten helt.
    4. Genopslæmmes perlerne i 300 μL af fCLIP lysisbuffer. Tilføje 8.3 μL af 5 M NaCl til at justere NaCl koncentration til ~ 150 mM. Tilsæt 10 μl af PKR antistof og Inkuber i 3 h på en rotator ved 4 ° C.
    5. Der centrifugeres perler på 1.000 x g ved 4 ° C i 1 min. Fjern supernatanten og tilføje 400 μL fCLIP wash buffer. Forsigtigt genopslæmmes perlerne af invertere 3 ~ 4 gange.
    6. Gentag trinnet vaskes to gange. Efter den sidste vask, Fjern supernatanten helt.
      Bemærk: Brug aldrig en vortex-mixer. Vend glasset forsigtigt med hænderne.
    7. Tilsæt 300 μl af lysate og inkuberes i 3 h ved 4 ° C på en rotator.
      Bemærk: Længere inkubationstiden kan resultere i øget baggrund bindende.
    8. Der centrifugeres perler på 1.000 x g ved 4 ° C i 1 min. Fjern supernatanten og tilføje 400 μL fCLIP wash buffer. Forsigtigt genopslæmmes perlerne af invertere 3 ~ 4 gange.
    9. Gentag trinnet vaskes tre gange. Efter den sidste vask, Fjern supernatanten helt.
    10. Tilsæt 300 μl fCLIP eluering buffer. Inkuber i et thermomixer i 3 timer ved 25 ° C til elueres PKR fra glasperler.
      Bemærk: Forberede fCLIP eluering buffer frisk.
    11. Der centrifugeres ved 1.000 x g ved stuetemperatur og overføre supernatanten til en ren Silikoniseret tube.
      Bemærk: Et microcentrifuge tube er også ok, men Silikoniseret tube er foretrukket at forhindre fordampning under de-crosslinking trin (trin 2.3.12).
    12. Tilsæt 300 μl proteinase K (20 mg/mL), og der inkuberes natten over ved 65 ° C.
      Bemærk: Brug et thermomixer med opvarmet dække for at undgå fordampning.
  4. RNA udvinding
    1. Tilføje 580 μL af syre-phenol chloroform og vortex for 30 s. Incubate ved 37 ° C i 1 time.
    2. Vortex for 30 s og centrifugeres ved 12.000 x g ved stuetemperatur i 10 min.
    3. Overføre det øverste lag i en ren 1,5 mL microcentrifuge rør. Tilføj 1/10 bind 3 M NaOAc, 0,5 μl af coprecipitant (f.eks. Glycoblue) og en tilsvarende mængde isopropanol. Der inkuberes natten over ved-20 ° C.
    4. Bundfald pellets ved centrifugering ved maksimal hastighed ved 4 ° C i 1 time.
      Bemærk: Hvis RNA/DNA pellets ikke blev overholdt, tilføje en ekstra 0,5 μl af coprecipitant og centrifugeres i en yderligere 1 h. fortsætte dette trin indtil RNA/DNA pellets er observeret.
    5. Fjern supernatanten og tilsættes 1 mL af 75% ethanol. Centrifuger på 12.000 x g ved 4 ° C i 5 min. Gentag trinnet vask en gang mere. Fjern supernatanten helt og tørre pellet ved stuetemperatur.
    6. Tilføje 42 μL af TDW, 5 μl af DNase jeg buffer, 1 μL af RNase hæmmer og 2 μl af DNase I. inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
    7. Tilføj 150 μL af TDW og 200 μl af syre-phenol chloroform. Vortex for 30 s. centrifuger på 12.000 x g ved stuetemperatur i 10 min.
    8. Overføre det øverste lag i en ren 1,5 mL microcentrifuge rør. Tilsæt 20 μL af 3 M NaOAc, 0,5 μl af coprecipitant og 1 mL 100% ethanol. Der inkuberes natten over ved-80 ° C.
    9. Bundfald pellets og vask med 75% ethanol, som beskrevet i trin 2.4.4 til 2.4.5.
    10. Genopslæmmes i den passende mængde TDW.

3. sekventering bibliotek forberedelse

  1. rRNA fjernelse
    1. Genopslæmmes RNA pellets fra trin 2.4.10 med 28 μL af TDW.
      Bemærk: Det maksimale beløb for total RNA skal være mindre end 5 μg.
    2. Følg fremgangsmåden ved rRNA fjernelse kit referenceguide til at fjerne rRNA.
    3. Rydde op rRNA forarmet RNA'er ved at tilføje 160 μL af magnetiske perler.
      1. Mix af pipettering ~ 15 gange og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
      2. Lægger røret på en magnetisk bar og Fjern supernatanten.
      3. Tilføje 300 μl 80% ethanol, mens perlerne er stadig tilknyttet på den magnetiske bar og Inkuber i 30 s.
      4. Erstatte ethylalkohol med en frisk 300 μL løsning. Luft tørre perler på den magnetiske bar i 12 min. ved stuetemperatur.
      5. Genopslæmmes perlerne i 12 μl af TDW og mix af pipettering 15 gange.
      6. Vedhæfte perler på den magnetiske bar og flytte supernatanten til en ren PCR rør.
    4. Nedbryder de fragmenterede ribosomale RNA'er (rRNAs) efter de procedurer, der er fastsat af rRNA udtynding Kit.
    5. Rydde op i RNA'er ved at tilføje 110 μL af magnetiske perler og gentage trin 3.1.3.1 til 3.1.3.6.
  2. RNA mærkning og adapter ligatur
    1. På rRNA-forarmet RNA'er, tilføje 2 μl af 10 x CIAP buffer, 1 μL af RNase hæmmer og 2 μl af Antarktis basisk fosfatase. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time og derefter på 65 ° C i 5 min til at inaktivere fosfatasen.
    2. Tilføje 3 μl af 10 x PNK buffer, 1,5 μL af RNase inhibitor, 1,5 μL af T4 PNK enzym, 0,8 μl af r-ATP og 1,7 μL af TDW. Der inkuberes ved 37 ° C i 50 min.
    3. Tilføj 1,5 μl af 10 mM ATP og inkuberes ved 37 ° C for yderligere 40 min.
    4. Reaktionen standses ved at tilføje 170 μL af RNA eluering buffer.
    5. Tilføje 200 μl af syre-phenol chloroform og vortex for 30 s. centrifuger på 12.000 x g ved stuetemperatur i 10 min.
    6. Overføre det øverste lag i en ren 1,5 mL microcentrifuge rør. Tilsæt 20 μL af 3 M NaOAc, 0,5 μl af coprecipitant og 1 mL 100% ethanol. Der inkuberes natten over ved-80 ° C.
    7. Bundfald RNA pellets og vask med 75% ethanol, som beskrevet i trin 2.4.4 til 2.4.5. Genopslæmmes i 4,5 μL af TDW og tilføje 9 μL af 2 x RNA lastning farvestof.
    8. Prøven ved 95 ° C i 5 min og belastningen på en 10% Urea-side gel opvarmes.
    9. Kør gelen på 370 V i 40 min.
      Bemærk: Køre pre gelen på 370 V i 90 min. før indlæsning af prøven.
    10. Skære gel på ~ 100-500 nukleotid region og bryde gel.
    11. Tilføje 700 μL af 0,3 M NaCl og der inkuberes natten over ved 4 ° C på en rotator.
    12. Opløsningen overføres til en kolonne og centrifugeres ved maksimal hastighed ved stuetemperatur i 5 min.
    13. Overføre eluatet ind i en ren 1,5 mL microcentrifuge rør. Tilføj 1/10 bind 3 M NaOAc, 0,5 μl af coprecipitant og en tilsvarende mængde isopropanol. Der inkuberes natten over ved-20 ° C.
  3. 3' adapter ligatur
    1. Bundfald RNA pellets og vask med 75% ethanol, som beskrevet i trin 2.4.4 til 2.4.5.
    2. Genopslæmmes RNA pellets i 6,5 μL af TDW og tilsættes 1 μl af 10 μM 3' adapter.
    3. Opløsningen overføres til en PCR rør og inkuberes ved 70 ° C i 2 min.
    4. Tilføj 1 μl af 10 x ligatur buffer, 0,5 μl af RNase hæmmer og 1 μL af T4 RNA ligase 2. Inkuber ved 28 ° C i 1 time, 25 ° C 6 h og 22 ° C til 6 h.
    5. Tilføj 12 μl af 2 x RNA lastning farvestof og varme ved 95 ° C i 5 min.
    6. Gel rense 3' adapter forbundet RNA'er som beskrevet i 3.2.9 til 3.2.13.
  4. 5' adapter ligatur
    1. Bundfald RNA pellets og vask med 75% ethanol, som beskrevet i trin 2.4.4 til 2.4.5.
    2. Genopslæmmes RNA pellets i 4.2 μL af TDW og tilsæt 1 μL af 5 μM 5' adapter.
    3. Opløsningen overføres til en PCR rør og inkuberes ved 70 ° C i 2 min.
    4. Tilføje 0,8 μl af 10 x ligase buffer, 0,4 μL af RNase inhibitor, 0,8 μl af 10 mM ATP, 0,8 μl af T4 RNA ligase 1. Inkuber ved 28 ° C i 1 time, 25 ° C 6 h og 22 ° C til 6 h.
  5. Reverse transkription og PCR-amplifikation
    1. På 5' adapter tilsæt sammenskrevne RNA'er, 1 μL af 4 μM reverse transkription primer. Der inkuberes ved 70 ° C i 2 min. og straks afkøles til 4 ° C.
    2. Tilføj 4 μL af 5 x FS buffer, 4 μL af 2,5 mM dNTP, 1 μl af 0,1 M DTT, 1 μL af RNase hæmmer og 1 μL af reverse transkriptase. Der inkuberes ved 50 ° C i 1 time og 70 ° C i 15 min.
    3. Forberede PCR-amplifikation
      1. Mix 1 μL af RT produkt, 1 μL af 25 μM RPI primer, 1 μL af 25 μM RP1 primer, 10 μL af 5 x HF buffer, 4 μL af 2,5 mM dNTP, 32,5 μL af TDW og 0,5 μl af Hi-Fi-polymerase.
      2. Køre PCR program for 11 ~ 13 cyklusser.
        Bemærk: Programmet for PCR er: 98 ° C i 30 s til en hot start, 98 ° C i 10 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 45 s til forstærkning og 72 ° C i 5 min. Forstærkning trin gentages for 11-13 cyklusser.
    4. Rydde op i PCR-produkter bruger 40 μL af magnetiske perler og følgende trin 3.1.3.1 til 3.1.3.6, men bruger 10 μL af TDW for at eluere DNA.
    5. Tilføj 2 μl af 10 x DNA lastning farvestof. Læg prøven på en 6% acrylamid gel og køre på 200 V i 30 min.
    6. Pletten med Sybr guld (0,01% (v/v) i 1 x TBE buffer) for 5 min ved stuetemperatur.
    7. De plet i 1 x TBE buffer for 5 min ved stuetemperatur.
    8. Skære gel på ~ 200-700 nukleotid region og bryde gel.
    9. Tilføje 700 μL af 0,3 M NaCl og der inkuberes natten over ved stuetemperatur at eluere DNA.
    10. Indlæse alt på en kolonne og centrifugeres ved maksimal hastighed ved stuetemperatur i 5 min.
    11. Overføre eluatet ind i en ren 1,5 mL microcentrifuge rør. Tilføj 1/10 bind 3 M NaOAc, 0,5 μl af coprecipitant og en tilsvarende mængde isopropanol. Der inkuberes natten over ved-20 ° C.
    12. Udfældes DNA pellets og vask med 75% ethanol, som beskrevet i trin 2.4.4 til 2.4.5. Genopslæmmes i 20 μL af TDW.
    13. Analysere prøven ved hjælp af en sequencer.

4. analyse af PKR-interagere RNA'er ved hjælp af qRT-PCR

  1. Metode 1: Tilfældige hexamer reverse transkription
    1. Genopslæmmes RNA pellets fra trin 2.4.10 med 8,5 μL af TDW og opløsningen overføres til en PCR rør.
    2. Tilsæt 0,5 μL 100 μM tilfældige hexamers og 4 μL af 2,5 mM dNTP mix.
    3. Varme løsning på 65 ° C i 5 min og straks inkuberes i isbad i mindst 1 min.
    4. Gøre reaktionen mix: 4 μL af 5 x SSIV buffer, 1 μL 100 mM DTT, 1 μL af RNase hæmmer og 1 μL af reverse transkriptase (200 U/μL). Tilføje mastermix til RNA løsning.
    5. Inkuber blanding ved 23 ° C i 10 min, 50 ° C i 10 min, og 80 ° C i 10 min.
    6. Analysere cDNA ved hjælp af en real-time PCR-system.
      Bemærk: Programmet for real-time PCR er: 95 ° C i 3 min for varm start, 95 ° C til 5 s og 60 ° C i 10 s til forstærkning og 95 ° C til 30 s, 65 ° C i 30 s og 95 ° C til 30 s for smelte. Forstærkning trin gentages for 40 cyklusser.
  2. Metode 2: Strand-specifikke reverse transkription
    1. Forberede en master mix af reverse primere: Mix lige store mængder af genet specifikke reverse transkription primere indeholdende CMV promotor sekvens efterfulgt af ~ 20 nukleotider af specifikke gensekvenser.
      Bemærk: Kombinerede koncentrationen af alle gen specifikke RT primere er 4 μM.
    2. Genopslæmmes RNA pellets fra trin 2.4.10 med 8,5 μL af TDW og opløsningen overføres til en PCR rør.
    3. Tilsæt 0,5 μL af 4 μM master mix af reverse transkription primere og 4 μL af 2,5 mM dNTP mix.
    4. Varme løsning på 65 ° C i 5 min og straks inkuberes i isbad i mindst 1 min.
    5. Forberede reaktion løsningen ved at blande 4 μL af 5 x SSIV buffer, 1 μL 100 mM DTT, 1 μL af RNase hæmmer og 1 μL af reverse transkriptase (200 U/μL). Tilføje reaktion løsning til RNA-primer mix.
    6. Inkuber løsning ved 50 ° C i 10 min og 80 ° C i 10 min.
    7. Analysere cDNA ved hjælp af real-time PCR-system.
      Bemærk: Programmet for real-time PCR er den samme som beskrevet under metode 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skematisk for processen med at arrestere HeLa celler på S eller M fase af cellecyklus er vist i figur 1. For en M fase-anholdt prøve, kan vi tydeligt visualisere runde formet celler under mikroskop (figur 2A). For at undersøge effektiviteten af celle cyklus anholdelse, kan nukleare indholdet af cellen analyseres ved hjælp af FACS (figur 2B). Figur 3 viser repræsentative data for immunoprecipitation effektivitet test, hvor D7F7 antistof viser en overlegen evne til at immunoprecipitate PKR. Denne forskel i immunoprecipitation effektivitet kan have været afspejlet i uoverensstemmelse i klasse fordelingen af høj overførselshastighed sekventering biblioteker udarbejdet ved hjælp af to forskellige PKR antistoffer (figur 4). Specificiteten af D7F7 antistof bekræftes yderligere ved hjælp af hele skamplet vestlige analyse af PKR immunoprecipitate (figur 5A) og den samlede celle lysate (figur 5B). Figur 6 viser radioisotop signal før og efter fjernelse af rRNAs under høj overførselshastighed sekventering bibliotek forberedelse. Figur 7 viser berigelse af mtRNAs i RNA'er co-immunoprecipitated med PKR, men ikke i RNA'er co-immunoprecipitated med kanin IgG eller DiGeorge syndrom kromosomale region 8 (DGCR8). Figur 8 viser den repræsentative strand specifikke qRT-PCR analyse af PKR-bundet mtRNAs i S eller M-fase anholdt prøver.

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling celle cyklus anholdelse prøverne. (A, B) Skemaer med forberedelsen af Sørensen (A) eller M (B) fase-anholdt HeLa celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: analyse af cellecyklus anholdt prøver. (A) fase kontrast billeder af S eller M fase-anholdt prøver. Angiver 250 μm. (B) FACS analyse viser det nukleare indholdet af prøverne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Immunoprecipitation effektivitet test for PKR antistoffer. For vellykket berigelse af PKR-bundet RNA'er, bør et antistof med en definitiv immunoprecipitation effektivitet som D7F7 antistof anvendes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: RNA klasse distribution af sekventering biblioteker udarbejdet ved hjælp af forskellige PKR antistoffer. Ved hjælp af forskellige PKR antistoffer for fCLIP resulterede i en anden klasse fordeling af tilknyttede sekventering læser. Uoverensstemmelsen skyldes sandsynligvis forskelle i immunoprecipitation effektivitet. Dette tal er blevet ændret fra Kim et al.28. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: D7F7 PKR-antistof, der kendetegner. (A, B) Hele skamplet vestlige analyse af PKR immunoprecipitated (A) eller samlede HeLa lysate (B) viste kun en stærk band svarende til størrelsen af PKR, der indikerer at D7F7 antistof er meget specifik i erkendelse af PKR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: radioisotop signal for PKR co-immunoprecipitated RNA'er. (A) PKR co-immunoprecipitated RNA'er kunne påvises ved mærkning deres 5' ender med r-ATP. (B) nedgangen i radioistope signal blev observeret efter vellykket rRNA udtagning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: validering af PKR-mtRNA interaktioner. Log2 fold berigelse af mtRNAs i RNA'er co-immunoprecipitated med angivne antistoffer. Kun PKR co-immunoprecipitated RNA prøven viste stærk tilsætning af mtRNAs. Kanin IgG og DGCR8 antistoffer blev brugt som negative kontroller. Dette tal er blevet ændret fra Kim et al.28. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Strand-specifikke qRT-PCR analyse af PKR-bundet mtRNAs. (A, B) Strand-specifikke reverse transkription blev brugt til at analysere strandedness af mtRNAs, der blev co-immunoprecipitated med PKR for Sørensen (A) eller M (B) fase-anholdt celler. Dette tal er blevet ændret fra Kim et al.28. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Processen med at forberede S eller M fase-anholdt prøverne er illustreret i figur 1. For at arrestere celler på S fase, brugte vi en thymidine dobbelt blok metode hvor vi behandlede celler med thymidine to gange med en 9 h udgivelse i mellem at sikre høj anholdelse effektivitet (figur 1A). For M fase anholdelse, vi behandlede celler engang med thymidine efterfulgt af et 9 h udgivelse og derefter anvendt nocodazole til blok celler på prometaphase (figur 1B). Et vigtigt skridt i udarbejdelsen af cellecyklus prøven er trinnet overgang efter den første thymidine blok. Hvis du vil helt fjerne thymidine, er det afgørende at cellerne vaskes mindst to gange med frisk PBS. Upassende vask og resterende thymidine kan resultere i øget heterogenitet og nedsat cellernes levedygtighed. Succesen med M fase anholdelse kan bekræftes visuelt baseret på stigningen i antallet af runde-formet celler (figur 2A). M fase prøven indeholder dog stadig mange interphase celler baseret på deres morfologi. For at indsamle kun M fase anholdt celler, vi har anvendt fysisk magt at løsrive M fase celler fra overfladen. Nukleare indholdet af de høstede celler blev yderligere undersøgt ved hjælp af FACS, som viste en bred peak mellem 2n og 4n for S fase og en skarp peak på 4n for M fase-anholdt prøve (figur 2B). Præsenteres protokollen er optimeret til HeLa celler, som har en fordobling tid på ca 24 timer. Tanken om dobbelt thymidine og thymidine-nocodazole blok kan anvendes til andre cellelinjer, men de nøjagtige narkotika behandling og frigivelse varigheder skal optimeres baseret på den fordobling tid af target-cellerne.

At identificere PKR-interagere RNA'er, vi crosslinked PKR-RNA komplekser med formaldehyd og beriget dem gennem immunoprecipitation. En vigtig faktor, som bestemmer rigtigheden af den efterfølgende analyse er effektiviteten af immunoprecipitation. Vi har testet mange antistoffer, der er målrettet forskellige epitoper af PKR protein for at bestemme antistof for høj overførselshastighed sekventering bibliotek forberedelse. Som vist i figur 3, fandt vi at den D7F7 antistof, der genkender linker regionen mellem dsRNA bindende domæner og den katalytiske domæne viste overlegne evne til at fange PKR. De andre antistof, vist i figur 3 (Milli) genkender den N-terminale region, men viser en dårlig evne i immunoprecipitating PKR. Derfor indeholdt høj overførselshastighed sekventering biblioteket tilberedes Milli antistof mange baggrund sekventering læsninger, der er spredt over hele genom, især i introns, uden særskilt ophobninger i specifikke regioner28 (Figur 4). Vi mener, at forskellene i de to sekventering biblioteker er for det meste på grund af forskelle i antistoffer evner til at fange PKR under trinnet immunoprecipitation. Vi undersøgt yderligere specificiteten af D7F7 PKR antistof gennem hele skamplet vestlige analyser af immunoprecipitate (figur 5A) og total HeLa lysates (figur 5B). I begge blots konstaterede vi kun én stærk band, der svarer til PKR. Dette indikerer at D7F7 antistof er meget specifikke og at sequencing data opnået med D7F7 antistof sandsynligvis afspejle sande RNA interactors af PKR.

Et kritisk trin under høj overførselshastighed sekventering bibliotek forberedelse er fjernelse af rRNAs. Da vi crosslinked RNA-RBP komplekser med formaldehyd brugte vi en ultrasonicator til komplet lysering af celler. Denne proces resulterede i opsplitning af rRNAs, som væsentligt reduceret effektiviteten af rRNA fjernelse af at bruge rRNA fjernelse Kit. Du kan løse dette problem, vi første gang brugt rRNA fjernelse Kit efterfulgt af rRNA udtynding Kit (Se Tabel af materialer), som næsten helt fjernet rRNAs og mindre end 1% af den samlede sekventering læser var knyttet til rRNAs. Vi brugte disse to kits sekventielt fordi rRNA udtynding Kit har en maksimal kapacitet på kun 1 μg mens rRNA fjernelse Kit har en maksimal kapacitet på 5 μg. Vi har oplevet, bruger mere end den anbefalede mængde af den samlede RNA resulterer i betydelig mængde af sekventering læser knyttet til rRNAs. Vellykket fjernelse af rRNA kan bekræftes efter mærkning RNA'er med r-ATP gennem PNK reaktion. Mens rRNA forarmet RNA'er viste et særskilt band omkring 150 nt, prøve før rRNA fjernelse viser stærke signal i hele regionen svarende til 50 ~ 300 nt (figur 6).

En begrænsning af formaldehyd crosslinking er faldet immunoprecipitation effektivitet. Andre anvendelser af formaldehyd crosslinking såsom immuncytokemi bruger typisk 4% PARAFORMALDEHYD løsning til fiksering. Men sådan en stærk fiksering tilstand ikke kan anvendes af fCLIP eksperiment fordi det markant nedsætter immunoprecipitation effektivitet, hvilket resulterer i en højere baggrund. Derudover formaldehyd fiksering krydsbindinger protein-protein komplekser ud over protein-RNA komplekser. Man skal således betale forsigtighed ved fortolkningen af fCLIP data.

Som rapporteret tidligere, danne mtRNAs intermolekylære dsRNAs, der er anerkendt af PKR28. Vi godkendte først vores sequencing data ved at undersøge PKR-mtRNA interaktioner gennem qRT-PCR. Vi brugte kanin IgG og DGCR8 antistoffer som negative kontroller, der ikke udviste nogen form for tilsaetning af mtRNAs (figur 7). Bemærk, blev DGCR8 brugt som en nuklear dsRNA bindende protein, der er fysisk adskilt fra mtRNAs. På samme tid viste PKR co-immunoprecipitated RNA'er stærk berigelse af mtRNAs (figur 7).

For yderligere at analysere PKR-mtRNA interaktioner, udførte vi strand-specifikke reverse transkription for at skelne heavy-strand mtRNAs fra lys-strand mtRNAs (figur 8). Vi designede reverse transkription primere, der har en CMV promotor sekvens efterfulgt af en gen-specifikke sekvens og derefter brugte en CMV promotor sekvens som venstre primer og gen-specifikke rigtige primere for qPCR analyse. Vi har også testet SP6 promotor og pGEX-sekventering primer sekvenser i stedet for CMV promotor sekvens. Vi fandt, at mens CMV promotor og pGEX sekventering primer sekvenser viste godt resultat, ved hjælp af SP6 promotor sekvens ikke gjorde. Forskellen skyldes det lave GC indhold af SP6 promotor sekvens (~ 33%) i forhold til de af CMV promoter (~ 67%) og pGEX-sekventering primer (~ 65%) sekvenser. Den foreslåede ordning for strand-specifikke reverse transkription kan let anvendes på andre intermolekylære dsRNAs, men når du udformer reverse transkription primere, GC indhold skal tages i betragtning.

Samlet set demonstreret forberedelse af cellecyklus anholdt prøver og berigelse af PKR-interagere RNA'er gennem formaldehyd crosslinking og immunoprecipitation. Ved hjælp af en yderst effektiv D7F7 antistof, har vi med succes isoleret PKR-bundet RNA'er og identificeret disse RNA'er ved at generere og analysere en høj overførselshastighed sekventering bibliotek. Desuden, for at analysere strandedness af mtRNAs bundet til PKR, præsenterede vi en strand-specifikke reverse transkription tilgang. Vi forventer, at den præsenterede protokol nemt kan optimeres for at studere RNA interactors af andre dsRBPs og strandedness af intermolekylære dsRNAs, der er dannet via komplementære samspil mellem fornuft og antisense udskrifter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af den koreanske regering Ministeriet for videnskab og IKT (NRF-2016R1C1B2009886).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
1 M Tris, pH 7.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1 M Tris, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1.7 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40) Biosolution BN015
10X DNA loading buffer TaKaRa 9157
15 mL conical tube SPL 50015
3' adaptor 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5 Thermo Fisher Scientific AM9740
5' adaptor 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaCl Thermo Fisher Scientific AM9760G
50 mL conical tube SPL 50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5 Thermo Fisher Scientific AM9722
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphatase New England Biolabs M0289S
Anti-DGCR8 Made in house
Anti-PKR (D7F7) Cell signaling technology 12297S
Anti-PKR (Milli) Millipore EMD 07-151
ATP (100 mM) GE Healthcare GE27-2056-01
Bromophenol blue sodium salt Sigma-aldrich B5525
Calf intestinal alkaline phosphatase TaKaRa 2250A
Cell scraper 25 cm 2-position Sarstedt 83.183
CMV promoter sequence 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle medium Welgene LM001-05
dNTP mixture (2.5 mM) TaKaRa 4030
Ethanol, Absolute, ACS Grade Alfa-Aesar A9951
Fetal bovine serum Merck M-TMS-013-BKR
Formamide Merck 104008
Glycine Bio-basic GB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) Thermo Fisher Scientific AM9516
Isopropanol Merck 8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion Kit New England Biolabs E6318 rRNA Depletion Kit
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Normal rabbit IgG Cell signaling technology 2729S
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 6148
PCR forward primer (RP1) 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI) 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL Axygen PCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet TaKaRa T9181
Phusion high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530 High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor Benchmark c2000
Polynucleotide kinase (PNK) TaKaRa 2021A
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma-Aldrich 3115879001
qPCR primer sequence: CO1 Heavy Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 Light Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Light Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Heavy Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Light Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Heavy Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Light Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDH Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Light Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Light Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Light Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Light Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamer Thermo Fisher Scientific SO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) TaKaRa 2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) TaKaRa 2313A
Ribo-Zero rRNA Removal Kit Illumina MRZH116 rRNA Removal Kit
Rotator FINEPCR, ROTATOR AG D1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube Bio Plas 4167SLS50
Sodium dedecyl sulfate Biosesang S1010
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
SUPERase In Rnase inhibitor Thermo Fisher Scientific AM2694
SuperScript III reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18080093 Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18090010 Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stain Thermo Fisher Scientific S11494
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373
Thermomixer Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
Thymidine Sigma-Aldrich T9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE) TaKara T9122
Triton X-100 Promega H5142
Ultralink Protein A sepharose beads Thermo Fisher Scientific 22810 Protein A beads
Ultrasonicator Bioruptor
Urea Bio-basic UB0148
Vortex mixer DAIHAN Scientific VM-10
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) PerkinElmer BLU502A100UC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
  2. Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
  3. Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
  4. Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
  5. Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
  6. Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
  7. Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
  8. Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
  9. Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
  10. Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
  11. Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
  12. Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
  13. Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
  14. Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
  15. Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
  16. Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
  17. Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
  18. Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
  19. Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
  20. Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
  21. Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
  22. Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
  23. Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
  24. Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
  25. Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
  26. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  27. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  28. Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
  29. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  30. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  31. Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
  32. Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).

Tags

Biokemi sag 145 dobbelt-strenget RNA mitokondrier RNA RNA bindende protein RNA-RBP interaktion protein kinase RNA-aktiveret formaldehyd crosslinking celle cyklus strand-specifikke qRT-PCR
At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Kang, M., Kim, Y. Studying… More

Kim, S., Kang, M., Kim, Y. Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle. J. Vis. Exp. (145), e59215, doi:10.3791/59215 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter