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Biochemistry

स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान सक्रिय प्रोटीन काइनेज आरएनए के आरएनए इंटरएक्टर्स का अध्ययन

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59215
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering and KI for Health Science and Technology (KIHST), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

Summary

हम आरएनए-डबल-असहाय आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन काइनेज आरएनए के interactors-सक्रिय (pkr) स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान हेला कोशिकाओं का उपयोग कर के अध्ययन के लिए प्रायोगिक दृष्टिकोण मौजूद हैं । इस विधि के लिए formaldehyde crosslink आरएनए-pkr परिसरों और immunopरेसिपिटेशन pkr-बाउंड rna को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल करता है । इन rnas आगे उच्च throughput अनुक्रमण या qrt-पीसीआर के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है ।

Abstract

प्रोटीन काइनेज आरएनए-एक्टिवेट (pkr) जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रोटीन का एक सदस्य है और वायरल rna के दोहरे असहाय द्वितीयक संरचना को पहचानता है । जब वायरल डबल-असहाय rnas (dsrnas) के लिए बाध्य, pkr dimerization और बाद ऑटोफॉस्फोरिलेशन से गुजरती है । फ़ॉस्फ़ाइलेटेड pkr (ppkr) सक्रिय हो जाता है और वैश्विक अनुवाद को दबाने के लिए यूकार्योटिक दीक्षा फैक्टर 2 (eIF2α) के अल्फा सबयूनिट के फॉस्लिलेशन को प्रेरित करता है । बढ़ती सबूत पता चलता है कि pkr जैसे कोशिका चक्र के दौरान या संक्रमण के बिना विभिंन तनाव की स्थिति के तहत शारीरिक स्थितियों के तहत सक्रिय किया जा सकता है । हालांकि, pkr के आरएनए activators के बारे में हमारी समझ एक मानकीकृत प्रयोगात्मक विधि की कमी के कारण सीमित है पर कब्जा करने और pkr-बातचीत dsrnas का विश्लेषण । यहां, हम एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए विशेष रूप से समृद्ध और विश्लेषण कक्ष चक्र के दौरान pkr बाध्य rnas HeLa कोशिकाओं का उपयोग कर । हम formaldehyde के कुशल क्रॉसलिंकिंग गतिविधि pkr-आरएनए परिसरों को ठीक करने और immunopरेसिपिटेशन के माध्यम से उन्हें अलग करने के लिए उपयोग । pkr सह immunoprecipitated rnas फिर एक उच्च throughput अनुक्रमण पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है । pkr-इंटरैक्ट सेलुलर dsrnas का एक प्रमुख वर्ग mitochondrial rnas (mtrnas) है, जो भारी-किनारा और प्रकाश-किनारा rnas के बीच पूरक बातचीत के माध्यम से अंतराआण्विक dsrnas के रूप में मौजूद कर सकते हैं. इन द्वैध mtrnas के strandedness का अध्ययन करने के लिए, हम भी strand-विशिष्ट qrt-पीसीआर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हमारा प्रोटोकॉल pkr-बाउंड rnas के विश्लेषण के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है, लेकिन यह अन्य dsrnas बाइंडिंग प्रोटीन के सेलुलर dsrnas या rnas-interactors का अध्ययन करने के लिए आसानी से संशोधित कर सकते हैं ।

Introduction

प्रोटीन काइनेज आरएनए-एक्टिवेट (pkr), जिसे यूकार्योटिक दीक्षा फैक्टर 2-अल्फा काइनेज 2 (EIF2AK2) के रूप में भी जाना जाता है, एक अच्छी तरह से विशेषता वाला प्रोटीन काइनेज है जो rna द्वारा प्रदान की गई जानकारी पहुंचाता है । यह यूकर्योटिक अनुवाद दीक्षा 2 सबयूनिट अल्फा (eIF2α) काइनेज परिवार और फॉस्फारिलेट के अंतर्गत आता है eIF2α सेरीन ५१ में संक्रमण के जवाब में वैश्विक अनुवाद को दबाने के लिए1. इस संदर्भ में, pkr वायरल डबल-असहाय rnas (dsrnas), जो pkr dimerization और ऑटोफॉस्फोरिलेशन2के लिए एक मंच प्रदान द्वारा सक्रिय है । eIF2α के अलावा, pkr भी p53 फॉस्फ़ायलेट कर सकते हैं, इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट 1, अवरोधक κb, और सी-जून N-टर्मिनल काइनेज (jnk) कई संकेत पारक्रमण रास्ते की गतिविधि को विनियमित करने के लिए3,4,5, 6.

pkr मूल रूप से एक कळेनासे के रूप में पहचान की थी कि पोलियो वायरस संक्रमण के दौरान eIF2α ' पोलियो वायरस ' dsrnas7,8पहचानने से । pkr तेजी से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से परे बहुमुखी भूमिकाओं खेलने पाया है, और इसके ंयायपालिका सक्रियण या खराबी कई मानव रोगों में निहित है । सक्रिय/फॉसफोरिलेटेड pkr (ppkr) अक्सर एपोप्टोसिस के दौरान देखा जाता है और अपक्षयी रोगों, विशेष रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे कि हंटिंगटन, पार्किंसंस, और अल्जाइमर रोग 9 के साथ रोगियों की एक आम विशेषता है । ,10,11,12,13. इसके अलावा, pkr चयापचय तनाव और गर्मी सदमे के रूप में विभिंन तनाव की स्थिति के तहत सक्रिय है14,15,16,17। दूसरी ओर, वृद्धि हुई कोशिका प्रसार और यहां तक कि घातक परिवर्तन में pkr परिणाम के निषेध18,19। pkr समारोह भी सामांय मस्तिष्क समारोह में महत्वपूर्ण है और कोशिका चक्र के दौरान के रूप में ppkr के स्तर एम चरण20,21,22के दौरान ऊंचा है । इस संदर्भ में, ppkr वैश्विक अनुवाद को रोकता है और कुंजी समसूत्री संकेतन प्रणालियों के लिए cues प्रदान करता है कि उचित सेल प्रभाग20के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, pkr के लंबे समय तक सक्रियण के परिणामस्वरूप G2 में चीनी हंसटर अंडाशय सेल23/ नतीजतन, pkr फ़ॉस्फायलीकरण को नकारात्मक प्रतिक्रिया लूप द्वारा विनियमित किया जाता है जिससे M/G1 संक्रमण21के दौरान तेजी से निष्क्रियण सुनिश्चित होता है ।

pkr समारोह की विस्तृत श्रृंखला के बावजूद, pkr सक्रियण की हमारी समझ एक मानकीकृत उच्च throughput प्रयोगात्मक दृष्टिकोण पर कब्जा करने के लिए और dsrnas कि pkr सक्रिय कर सकते है की पहचान की कमी के कारण सीमित है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि pkr दो उल्टे Alu दोहराता द्वारा गठित dsrnas के साथ बातचीत कर सकते हैं (iralus)20,24, लेकिन अतिरिक्त सेलुलर dsrnas के अस्तित्व की संभावना है कि सेल चक्र के दौरान या के तहत pkr सक्रिय कर सकते हैं मानव कोशिकाओं में तनाव की स्थिति बेरोज़गारी थी । एक आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) के आरएनए-इंटरएक्टरों की पहचान करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण यूवी प्रकाश का उपयोग करता है आरएनए-आरबीपी कॉम्प्लेक्स25,26,27। एक ताजा अध्ययन इस यूवी crosslinking दृष्टिकोण एक माउस प्रणाली में लागू किया है और पहचान की है कि छोटे nucleolar rnas चयापचय तनाव16के दौरान pkr सक्रियण को विनियमित कर सकते हैं । formaldehyde के उच्च crosslinking दक्षता का उपयोग करके, हम एक वैकल्पिक विधि हेला कोशिकाओं28में सेल चक्र के दौरान pkr बातचीत rnas की पहचान करने के लिए प्रस्तुत किया । एक समान दृष्टिकोण अन्य dsrbps जैसे staufen और drosha29,30,31का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है. हमने पाया है कि pkr noncoding rnas के विभिंन प्रकार के साथ बातचीत कर सकते है जैसे लघु interspersed परमाणु तत्व (ज्या), लंबी interspersed परमाणु तत्व (रेखा), अंतर्जात retrovirus तत्व (ERV), और यहां तक कि अल्फा उपग्रह rnas । इसके अलावा, हमने दिखाया है कि pkr mitochondrial rnas (mtrnas), जो भारी-किनारा और प्रकाश कतरा rnas28के बीच पूरक बातचीत के माध्यम से अंतराआण्विक dsrnas फार्म के साथ बातचीत कर सकते हैं । हाल ही में एक प्रकाशन आगे हमारे डेटा है कि कुछ mtrnas एक द्वैध रूप में मौजूद है और इस तरह के मेलेनोमा भेदभाव के रूप में dsrna सेंसर सक्रिय कर सकते है समर्थन किया-जुड़े प्रोटीन 5 इंटरपोरों३२प्रेरित करने के लिए । इससे भी महत्वपूर्ण बात, अभिव्यक्ति और mtrnas के subcellular स्थानीयकरण सेल चक्र के दौरान और विभिन्न तनाव, जो उनके pkr सक्रियण28को विनियमित करने की क्षमता में महत्वपूर्ण हो सकता है द्वारा संग्राहक रहे हैं ।

इस अनुच्छेद में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए एक हाल ही में विकसित formaldehyde crosslinking और immunopरेसिसिटेशन (fclip) विधि को पकड़ने और विश्लेषण pkr-बातचीत rnas सेल चक्र के दौरान । हम कोशिका चक्र गिरफ्तारी के नमूनों को थाइमिडीन और नोकोडाज़ोल का उपयोग कर तैयार करने के लिए विधि का प्रदर्शन करते हैं । हम फिर fclip प्रक्रिया pkr-बाउंड rnas और इन rnas की पहचान करने के लिए उच्च-थ्रौपुट अनुक्रमण लायब्रेरी को तैयार करने के लिए एक विधि को अलग करने के लिए प्रस्तुत है । इसके अलावा, हम qrt-पीसीआर का उपयोग कर pkr-बाउंड rnas का विश्लेषण करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को चित्रित । विशेष रूप से, हम एक कतरा-विशिष्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया के लिए mtrnas के strandedness का विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं । वर्णित प्रोटोकॉल HeLa कोशिकाओं और pkr के लिए अनुकूलित है, लेकिन इस तरह के सेल चक्र नमूना, fclip, और कतरा-विशिष्ट qrt-पीसीआर विश्लेषण की तैयारी के रूप में महत्वपूर्ण कदम आसानी से सेलुलर dsrnas अध्ययन करने के लिए या अंय dsrnas के आरएनए interactors की पहचान संशोधित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. समाधान और सेल की तैयारी

  1. समाधान तैयारी
    1. सेल कल्चर मीडियम के लिए, ५० मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को डलबेको के संशोधित ईगल के मध्यम (dmem) के ५०० एमएल जोड़कर हेला सेल संस्कृति के लिए माध्यम तैयार करें ।
      नोट: एंटीबायोटिक्स को सेल कल्चर मीडियम में जोड़ा जा सकता है, लेकिन हम एंटीबायोटिक्स का इस्तेमाल नहीं करते ।
    2. ०.१% पैराफॉर्मालडिहाइड के लिए, 4% (w/v) पैराफॉर्मालडिहाइड में 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) को गर्म प्लेट पर हीटिंग के साथ भंग करें और 30 मिलीलीटर को ०.१% (v. v) पैराफॉर्मालडिहाइड को जोड़कर 1x पीबीएस बनाएं ।
      चेतावनी: एक धूआं हुड में सभी कदम प्रदर्शन और paraformaldehyde समाधान फोड़ा नहीं सावधान रहना । प्रकाश और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर से ०.१% समाधान को सुरक्षित रखें । एक महीने के भीतर समाधान का उपयोग करें ।
      नोट: अंतिम ०.१% (v/v) पैराफॉर्मालडिहाइड समाधान का पीएच 7 के आसपास होना चाहिए ।
    3. तैयार करें fclip lysis बफर: 20 मिमी Tris-HCl (पीएच ७.५), 15 मिमी nacl, 10 मिमी edta, ०.५% (v/v) nonidet-p40 (NP-४०), ०.१% (v/v) ट्राइटन एक्स-१००, ०.१% (v/v) सोडियम डोडेसिल सल्फेट (sds), और ०.१% (w/ ४० मिलीलीटर के लिए ट्रिपल आसुत जल (tdw) जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    4. तैयार fclip धोने बफर: 20 मिमी Tris-HCl (पीएच ७.५), १५० मिमी nacl, 10 मिमी edta, ०.१% (v/v) NP-४०, ०.१% (v/v) ट्राइटन एक्स-१००, ०.१% (v/v) एसडीएस, और ०.१% (w/ ४० मिलीलीटर के लिए tdw जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    5. तैयार 4x पीके बफर: ४०० मिमी Tris-HCl (पीएच ७.५), २०० मिमी nacl, ४० मिमी edta, और 4% (v/ ४० मिलीलीटर के लिए tdw जोड़ें । कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    6. fclip रेफरेंस बफर तैयार करें: 4x पीके बफर की 20 मिलीलीटर, यूरिया की 21 ग्राम, और tdw की ८.५ मिलीलीटर । ताजा तैयार करें ।
    7. आरएनए रेफरेंस बफर तैयार करें: ०.३ एम naoac और 2% (w/ कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    8. तैयार 2x आरएनए लोड हो रहा है डाई: ०.०२५% (w/ब्रोमोफीनॉल नीला, ०.०२५% (w/v) जाइलीन cyanol, 5 मिमी edta, ०.०५% (w/v) sds, और ९५% (v/ -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    9. 1x tbe बफर तैयार: ०.०८९ m Tris-बोरेट और ०.००२ मीटर edta । tbe बफर की ५०० मिलीलीटर तैयार करें ।
  2. एस या एम चरण-गिरफ्तार कोशिकाओं की तैयारी
    1. बीज ~ ७५०,००० या ~ एस या एम चरण के लिए १,०००,००० HeLa कोशिकाओं-गिरफ्तार नमूनों, क्रमशः । ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित और 5% सीओ2 के लिए 24 ज.
    2. 2 मिमी के साथ कोशिकाओं का इलाज थाइमिडीन और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 18 एच के लिए सेते हैं ।
    3. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोएं । ताजा मीडिया जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 9 एच के लिए सेते हैं ।
    4. S चरण के लिए गिरफ्तार कोशिकाओं, 2 मिमी थाइमिडीन के साथ कोशिकाओं का इलाज । एम चरण-गिरफ्तार कोशिकाओं के लिए, १०० एनजी/एमएल nocodazole के साथ कोशिकाओं का इलाज । ३७ डिग्री सेल्सियस और फसल कोशिकाओं पर 15 एच के लिए सेते ।
      नोट: सेल चक्र के नमूनों की एकरूपता facs का उपयोग कर जाँच की जा सकती है.

2. formaldehyde पार जोड़ने और immunopरेसिपिटेशन

  1. कोशिका फसल
    1. एक एस चरण नमूने के लिए, सेल स्क्रैपर के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरण । एक एम चरण नमूना के लिए, एम चरण गिरफ्तार कोशिकाओं को अलग करने और उन्हें एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए सेल संस्कृति पकवान की ओर नल ।
      नोट: M चरण-गिरफ्तार कक्षों की एकरूपता बढ़ाने के लिए, किसी कक्ष स्क्रैपर का उपयोग न करें ।
    2. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ३८० एक्स जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रिकृत करें । सतह पर तैरनेवाला निकालें और ठंडे pbs के 1 मिलीलीटर के साथ फिर से निलंबित और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण ।
    3. 30 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० एक्स जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्री करना । सुपरनेटंट को पूरी तरह से हटा दें ।
  2. फॉर्मालडिहाइड क्रॉसलिंकिंग
    1. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ०.१% पैराफॉर्मालडिहाइड के ७५० μl जोड़ें ।
    2. 1 मीटर ग्लाइसिन के २५० μl जोड़ें और प्रतिक्रिया बुझाने के लिए कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 10 मिनट सेते हैं । 30 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० एक्स जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्री करना । सुपरनेटंट को पूरी तरह से हटा दें ।
    3. pbs के 1 मिलीलीटर के साथ फिर से निलंबित । 30 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० एक्स जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्री और supernatant हटा दें ।
    4. फिर से निलंबित ४०० μl के साथ fclip lysis बफ़र ०.२% (v/v) प्रोटीज अवरोध करनेवाला और 2% (v/v) rnase अवरोध करनेवाला के साथ पूरक । 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते और एक ultrasonicator का उपयोग कर sonicate ।
    5. १५० मिमी के लिए nacl एकाग्रता को समायोजित करने के लिए 5 मीटर nacl के 11 μl जोड़ें । भंवर संक्षेप और अपकेंद्रिका में २१,१३० एक्स जी पर 15 मिनट के लिए 4 ° c. एक पूर्व ठंडा १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण ।
      नोट: इनपुट नमूना के रूप में एक नया अपकेंद्री ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के ४० μl बनाए रखें । 4 डिग्री सेल्सियस पर इनपुट नमूना स्टोर ।
  3. Immunoprecipitation
    1. प्रोटीन के 20 μl एक मोती एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जोड़ें ।
    2. fclip lysis बफर के ४०० μl के साथ मोती धो लें । 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,००० एक्स जी में मोतियों को अपकेंद्रिप करें । सतह पर तैरनेवाला निकालें और ४०० μl fclip lysis बफ़र ध्यान से जोड़ें । धीरे 3 ~ 4 बार उलटा करके मोती फिर से निलंबित ।
    3. धो चरण तीन बार दोहराएं । अंतिम धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से हटा दें ।
    4. fclip lysis बफर के ३०० μl में मोती फिर से निलंबित । जोड़ें ८.३ μl की 5 M nacl को समायोजित करने के लिए nacl एकाग्रता ~ १५० mM. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर 3 एच के लिए pkr एंटीबॉडी और सेते के 10 μl जोड़ें ।
    5. 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,००० एक्स जी में मोतियों को अपकेंद्रिप करें । सतह पर तैरनेवाला निकालें और fclip वॉश बफर के ४०० μl जोड़ें । धीरे 3 ~ 4 बार उलटा करके मोती फिर से निलंबित ।
    6. धो दो बार कदम दोहराएं । अंतिम धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से हटा दें ।
      नोट: कभी एक भंवर मिक्सर का उपयोग करें । ट्यूब को हाथों से धीरे से पलटे ।
    7. एक rotator पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए lysate के ३०० μl और सेते जोड़ें ।
      नोट: अब ऊष्मायन समय बढ़ी हुई पृष्ठभूमि बाइंडिंग में परिणाम हो सकता है ।
    8. 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,००० एक्स जी में मोतियों को अपकेंद्रिप करें । सतह पर तैरनेवाला निकालें और fclip वॉश बफर के ४०० μl जोड़ें । धीरे 3 ~ 4 बार उलटा करके मोती फिर से निलंबित ।
    9. धो चरण तीन बार दोहराएं । अंतिम धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से हटा दें ।
    10. fclip रेफरेंस बफर के ३०० μl जोड़ें । मोतियों से pkr को उत्तेजित करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए एक थर्मोमिक्सर में सेते हैं ।
      नोट: fclip रेफरेंस बफर फ्रेश तैयार करें ।
    11. कमरे के तापमान पर १,००० एक्स जी में सेंट्रेसेज और एक साफ सिलिकोनीकृत ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण ।
      नोट: एक microcentrifuge ट्यूब भी ठीक है, लेकिन siliconized ट्यूब को de-crosslinking कदम (चरण 2.3.12) के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए पसंद है ।
    12. proteinase K (20 मिलीग्राम/एमएल) के ३०० μl जोड़ें और ६५ डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं ।
      नोट: वाष्पीकरण से बचने के लिए गर्म कवर के साथ थर्मोमिक्सर का उपयोग करें ।
  4. आरएनए निष्कर्षण
    1. एसिड के ५८० μl जोड़ें-phenol क्लोरोफॉर्म और भंवर के लिए 30 s. सेते के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज.
    2. 30 एस के लिए भंवर और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १२,००० एक्स जी पर सेंट्रेसेज ।
    3. एक साफ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में शीर्ष परत स्थानांतरण । 3 एम naoac की 1/10 मात्रा जोड़ें, ०.५ (जैसे, ग्लाइकोब्लू), और isopropanol की एक समान मात्रा. -20 ° c पर रात भर सेते हैं ।
    4. 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम गति पर अपकेंद्रितरूप से छर्रों हाला ।
      नोट: यदि आरएनए/डीएनए छर्रों का अवलोकन नहीं किया गया, तो अतिरिक्त 1 एच के लिए एक अतिरिक्त ०.५ μl का copरेसिपीटेंट और अपकेंद्रीज जोड़ें । इस चरण को जारी रखें जब तक आरएनए/डीएनए छर्रों को मनाया जाता है ।
    5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और ७५% एथिल अल्कोहल की 1 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० एक्स जी में अपकेंद्रिका । वॉश स्टेप को एक और बार दोहराएं । सुपरनेटंट को पूरी तरह से निकालें और कमरे के तापमान पर गोली को सुखा दें ।
    6. tdw के ४२ μl, dnase i बफर के 5 μl, rnase अवरोधक के 1 μl, और dnase i. 1 h के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इंसेबेट के 2 μl जोड़ें ।
    7. tdw के १५० μl और एसिड-फीनॉल क्लोरोफॉर्म के २०० μl जोड़ें । 30 एस के लिए भंवर १२,००० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर centrifuge ।
    8. एक साफ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में शीर्ष परत स्थानांतरण । 3 मीटर naoac के 20 μl, coprecipitant के ०.५ μl, और १००% एथिल अल्कोहल की 1 मिलीलीटर जोड़ें । -८० डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते ।
    9. छर्रों के वेग और ७५% एथिल अल्कोहल के साथ धोने के रूप में कदम में वर्णित है 2.4.4 से 2.4.5.
    10. tdw की उचित मात्रा में पुन: निलंबित ।

3. अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी

  1. rrna हटाने
    1. tdw के 28 μl के साथ चरण 2.4.10 से आरएनए छर्रों को पुन: निलंबित ।
      नोट: कुल आरएनए की अधिकतम मात्रा 5 μg से कम होनी चाहिए ।
    2. rrna हटाने किट के संदर्भ गाइड द्वारा प्रदान की गई प्रक्रियाओं का पालन करें आरआरएनए हटाने के लिए ।
    3. चुंबकीय मोती के १६० μl जोड़कर rrna घट rnas को साफ ।
      1. 15 मिनट के लिए और कमरे के तापमान पर सेते ~ 15 बार pipetting द्वारा मिक्स ।
      2. एक चुंबकीय पट्टी पर ट्यूब संलग्न और supernatant हटा दें ।
      3. ८०% एथिल अल्कोहल का ३०० μl जोड़ें जबकि मोती अभी भी चुंबकीय पट्टी पर संलग्न हैं और 30 एस के लिए सेते हैं ।
      4. एक ताजा ३०० μl समाधान के साथ एथिल अल्कोहल बदलें । हवा कमरे के तापमान पर 12 मिनट के लिए चुंबकीय पट्टी पर मोती सूखी ।
      5. tdw के 12 μl में मोतियों को फिर से निलंबित करें और 15 बार पाइपटेटिंग द्वारा मिलाएं ।
      6. मोतियों को चुंबकीय पट्टी पर लगायें और सुपरनेटंट को क्लीन पीसीआर ट्यूब पर ले जाएं ।
    4. rrna रिक्शन किट द्वारा प्रदान की गई प्रक्रियाओं के बाद खंडित राइबोसोमल rnas (rrnas) को गिरेगा ।
    5. चुंबकीय मोती के ११० μl जोड़कर rnas को साफ और 3.1.3.6 के लिए 3.1.3.1 कदम दोहरा ।
  2. आरएनए लेबलिंग और अडैप्टर लिगेशन
    1. rrna-घट rnas पर, 10x ciap बफर, 1 μl के rnase अवरोधक, और अंटार्कटिक alkaline फॉस्फोटेस के 2 μl के 2 μl जोड़ें । 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इंसेबेट और फिर फॉस्फाटेस को निष्क्रिय करने के लिए 5 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. 3 μl का 10x pnk बफर, १.५ μl का rnase अवरोधक, १.५ μl T4 pnk एंजाइम, आर-एटीपी के ०.८ μl, और tdw के १.७ μl जोड़ें । ५० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    3. अतिरिक्त ४० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिमी एटीपी और सेते के १.५ μl जोड़ें ।
    4. आरएनए रेफरेंस बफर के १७० μl जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें ।
    5. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १२,००० एक्स जी पर 30 एस के लिए २०० μl-phenol क्लोरोफॉर्म और भंवर के जोड़ें ।
    6. एक साफ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में शीर्ष परत स्थानांतरण । 3 मीटर naoac के 20 μl, coprecipitant के ०.५ μl, और १००% एथिल अल्कोहल की 1 मिलीलीटर जोड़ें । -८० डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते ।
    7. हाला rna छर्रों और धो के साथ ७५% एथिल अल्कोहल के रूप में कदम में वर्णित है 2.4.4 से 2.4.5. tdw के ४.५ μl में फिर से निलंबित और 2x आरएनए लोड हो रहा है डाई के 9 μl जोड़ें ।
    8. 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर नमूना गर्मी और एक 10% यूरिया पृष्ठ जेल पर लोड ।
    9. ४० मिनट के लिए ३७० V पर जेल चलाते हैं ।
      नोट: नमूना लोड करने से पहले ९० मिनट के लिए ३७० V पर जेल चलाने के पूर्व ।
    10. में जेल काट ~ १०० – ५०० न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र और जेल तोड़ने.
    11. ०.३ मीटर nacl का ७०० μl जोड़ें और रोटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते रहें ।
    12. एक कॉलम के लिए समाधान स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अधिकतम गति पर अपकेंद्रितकरें ।
    13. एक साफ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में eluate स्थानांतरण । 3 एम naoac की 1/10 मात्रा, copरेसिपैंट के ०.५ μl, और isopropanol की एक समान मात्रा जोड़ें । -20 ° c पर रात भर सेते हैं ।
  3. 3 ' अडैप्टर लिगेशन
    1. हाला rna छर्रों और धो के साथ ७५% एथिल अल्कोहल के रूप में कदम में वर्णित है 2.4.4 से 2.4.5.
    2. टीडीडब्ल्यू के ६.५ μl में आरएनए छर्रों को फिर से निलंबित करें और 10 μm 3 ' अनुकूलक के 1 μl जोड़ें ।
    3. एक पीसीआर ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण और 2 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    4. 10x लिगेशन बफर, ०.५ μl के rnase अवरोधक के 1 μl जोड़ें, और 1 μl के T4 आरएनए बंधाव 2. 28 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 ज, 25 डिग्री सेल्सियस के लिए 6 एच के लिए, और 22 डिग्री सेल्सियस के लिए 6 एच के लिए सेते ।
    5. 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर 2x आरएनए लोडिंग डाई और हीट के 12 μl जोड़ें ।
    6. जेल 3 ' अनुकूलक ligated rnas शुद्ध के रूप में 3.2.9 में 3.2.13 के लिए वर्णित है ।
  4. 5 ' अडैप्टर लिगेशन
    1. हाला rna छर्रों और धो के साथ ७५% एथिल अल्कोहल के रूप में कदम में वर्णित है 2.4.4 से 2.4.5.
    2. टीडीडब्ल्यू के ४.२ μl में आरएनए छर्रों को फिर से निलंबित करें और 5 μm 5 ' अनुकूलक का 1 μl जोड़ें ।
    3. एक पीसीआर ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण और 2 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    4. 10x ligase बफर, ०.४ μl के rnase अवरोधक, ०.८ μl के 10 मिमी एटीपी, ०.८ μl के T4 आरएनए ligase 1 के ०.८ μl जोड़ें । 28 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 ज, 25 डिग्री सेल्सियस के लिए 6 एच के लिए, और 22 डिग्री सेल्सियस के लिए 6 एच के लिए सेते ।
  5. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर प्रवर्धन
    1. 5 ' अनुकूलक ligated rnas पर, 4 μm रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के 1 μl जोड़ें । 2 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर सेते और तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत ।
    2. 5x एफएस बफर के 4 μl, २.५ मिमी dntp के 4 μl, ०.१ एम डीटीटी, 1 μl के rnase अवरोधक, और रिवर्स transcriptase के 1 μl की 1 μl जोड़ें । 15 मिनट के लिए 1 ज और ७० डिग्री सेल्सियस के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    3. पीसीआर प्रवर्धन तैयार करें
      1. 1 μl का आरटी उत्पाद, 1 μl का 25 μm rpi प्राइमरी, 25 μm RP1 प्राइमर, 10 μl का 5x एचएफ बफर, 4 μl of २.५ एमएम dntp, ३२.५ μl of tdw, और ०.५ μl उच्च-निष्ठा पॉलीमरेज़ का मिश्रण ।
      2. 11 ~ 13 चक्र के लिए पीसीआर कार्यक्रम चलाते हैं ।
        नोट: पीसीआर के लिए कार्यक्रम है: ९८ ° c के लिए 30 s एक गर्म शुरू करने के लिए, ९८ ° c के लिए 10 s, ६० डिग्री सेल्सियस के लिए 30 s और ७२ ° c के लिए ४५ s के लिए प्रवर्धन, और ७२ ° c के लिए 5 min. प्रवर्धन कदम 11-13 चक्र के लिए दोहराया है.
    4. चुंबकीय मोती के ४० μl का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों को साफ करें और 3.1.3.6 करने के लिए 3.1.3.1 चरणों का पालन करें लेकिन डीएनए को एलाटे करने के लिए tdw के 10 μl का उपयोग करना ।
    5. 10x डीएनए लोड हो रहा है डाई के 2 μl जोड़ें । एक 6% ऐक्रिल एमाइड जेल पर नमूना लोड और 30 मिनट के लिए २०० V पर चला रहे हैं ।
    6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए sybr सोने (1x tbe बफर में ०.०१% (v/
    7. De-कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1x tbe बफर में दाग ।
    8. में जेल काट ~ २०० – ७०० न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र और जेल तोड़ने.
    9. ०.३ मीटर nacl का ७०० μl जोड़ें और डीएनए को उत्तेजित करने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर सेते रहें ।
    10. एक कॉलम पर सब कुछ लोड और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अधिकतम गति से सेंटोरेज ।
    11. एक साफ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में eluate स्थानांतरण । 3 एम naoac की 1/10 मात्रा, copरेसिपैंट के ०.५ μl, और isopropanol की एक समान मात्रा जोड़ें । -20 ° c पर रात भर सेते हैं ।
    12. डीएनए छर्रों हाला और ७५% एथिल शराब के साथ धोने के रूप में कदम में वर्णित है 2.4.4 से 2.4.5. tdw के 20 μl में पुन: निलंबित ।
    13. एक sequencer का उपयोग कर नमूना का विश्लेषण.

4. qrt का उपयोग करके pkr-सहभागिता rnas का विश्लेषण-पीसीआर

  1. विधि 1: रैंडम hexamer रिवर्स प्रतिलेखन
    1. tdw के ८.५ μl के साथ चरण 2.4.10 से आरएनए छर्रों को फिर से निलंबित करें और एक पीसीआर ट्यूब के समाधान को स्थानांतरित करें ।
    2. १०० μm यादृच्छिक hexamers के ०.५ μl और २.५ मिमी dntp मिश्रण के 4 μl जोड़ें ।
    3. 5 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर समाधान हीट करें और तुरंत कम 1 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं ।
    4. अभिक्रिया मिश्रण बनाओ: 5x ssiv बफर के 4 μl, १०० मिमी डीटीटी, 1 μl के rnase अवरोधक, और रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ के 1 μl (२०० U/μl) । प्रतिक्रिया मिश्रण को आरएनए समाधान में जोड़ें ।
    5. 10 मिनट के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते, 10 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस, और 10 मिनट के लिए ८० डिग्री सेल्सियस ।
    6. एक रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम का उपयोग कर cdna का विश्लेषण करें ।
      नोट: रीयल-टाइम पीसीआर के लिए कार्यक्रम है: ९५ ° c गर्म शुरू करने के लिए 3 मिनट के लिए, ९५ ° c के लिए 5 s और ६० ° c के लिए 10 s प्रवर्धन के लिए, और ९५ ° c के लिए 30 s के लिए, ६५ ° c के लिए 30 s, और ९५ ° c के लिए 30 s के लिए पिघल । प्रवर्धन कदम ४० चक्र के लिए दोहराया है.
  2. विधि 2: किनारा-विशिष्ट रिवर्स प्रतिलेखन
    1. रिवर्स प्राइमर्स के एक मास्टर मिश्रण तैयार करें: जीन विशिष्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर्स के बराबर मात्रा में मिक्स सीएमवी प्रमोटर अनुक्रम जिसमें जीन विशिष्ट दृश्यों के ~ 20 न्यूक्लियोटाइड के बाद ।
      नोट: सभी जीन विशिष्ट आरटी प्राइमर्स की संयुक्त एकाग्रता 4 μm है ।
    2. tdw के ८.५ μl के साथ चरण 2.4.10 से आरएनए छर्रों को फिर से निलंबित करें और एक पीसीआर ट्यूब के समाधान को स्थानांतरित करें ।
    3. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर्स के 4 μm मास्टर मिश्रण और २.५ मिमी dntp मिश्रण के 4 μl के ०.५ μl जोड़ें ।
    4. 5 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर समाधान हीट करें और तुरंत कम 1 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं ।
    5. 5x ssiv बफर के 4 μl, १०० मिमी डीटीटी, 1 μl के rnase अवरोधक, और रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ (२०० U/μl) के 1 μl के मिश्रण से रिएक्शन समाधान तैयार करें । आरएनए-प्राइमरी मिक्स में रिएक्शन सॉल्यूशन जोड़ें ।
    6. 10 मिनट के लिए 10 मिनट और ८० डिग्री सेल्सियस के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते हैं ।
    7. वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम का उपयोग कर cdna का विश्लेषण करें ।
      नोट: रीयल-टाइम पीसीआर के लिए प्रोग्राम विधि 1 में वर्णित एक के समान है ।

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Representative Results

सेल चक्र के एस या एम चरण में HeLa कोशिकाओं को गिरफ्तार करने की प्रक्रिया के लिए एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है । एक एम चरण-गिरफ्तार नमूना के लिए, हम स्पष्ट रूप से सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 2a) के तहत गोल आकार की कोशिकाओं की कल्पना कर सकते हैं । सेल चक्र की गिरफ्तारी की दक्षता की जांच करने के लिए, कोशिका के परमाणु सामग्री facs का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है (चित्रा 2b). चित्रा 3 immunopरेसिसिटेशन दक्षता परीक्षण के लिए प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है, जहां D7F7 एंटीबॉडी pkr immunoprecipitation करने के लिए एक बेहतर क्षमता से पता चलता है. इम्यूनोरेसिसिटेशन दक्षता में यह अंतर दो भिन्न pkr एंटीबॉडी (चित्र 4) का उपयोग करके तैयार उच्च-थ्रौपुट अनुक्रमण लायब्रेरी का वर्ग वितरण में विसंगति में प्रतिबिंबित किया गया हो सकता है । D7F7 एंटीबॉडी की विशिष्टता आगे pkr immunoprecipitate (चित्रा 5a) और कुल सेल lysate (चित्रा 5a) के पूरे दाग पश्चिमी विश्लेषण का उपयोग कर पुष्टि की है । चित्रा 6 रेडियोसोटॉप संकेत से पहले और निकालने के बाद rrnas के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण लायब्रेरी तैयारी के दौरान दिखाता है । चित्रा 7 rnas सह में mtrnas के संवर्धन से पता चलता है pkr साथ immunoprecipitated, लेकिन rnas सह में नहीं खरगोश आईजी या digeorge सिंड्रोम गुणसूत्र क्षेत्र 8 (DGCR8) के साथ immunoprecipitated । चित्र 8 S या M-चरण में pkr-बाउंड mtrnas के प्रतिनिधि भूग्रस्त विशिष्ट qrt-पीसीआर विश्लेषण से पता चलता है कि नमूने गिरफ्तार किए गए हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: तैयारी सेल चक्र गिरफ्तारी के नमूने के लिए योजनाबद्ध. (क, ख) एस (ए) या एम (बी) चरण-गिरफ्तार HeLa कोशिकाओं की तैयारी की schematics । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल चक्र के विश्लेषण के नमूने गिरफ्तार. (A) S या M चरण-गिरफ्तार नमूनों की चरण कंट्रास्ट छवियां । सलाखों के संकेत २५० μm । (ख) नमूनों की नाभिकीय सामग्री दर्शाने वाले फैस विश्लेषण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: pkr एंटीबॉडी के लिए इम्यूनोरेसिसिटेशन दक्षता परीक्षण । pkr-बाउंड rnas के सफल संवर्धन के लिए, एक निश्चित इम्यूनोरेसिसिटेशन दक्षता के साथ एक एंटीबॉडी जैसे D7F7 एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: अलग pkr एंटीबॉडी का उपयोग कर तैयार अनुक्रमण पुस्तकालयों का आरएनए वर्ग वितरण । fclip के लिए भिन्न pkr एंटीबॉडी का उपयोग कर मैप किए गए अनुक्रमण पढ़ता का एक भिन्न वर्ग वितरण में हुई । विसंगति की संभावना इम्यूनोरेसिपिटेशन दक्षता में मतभेद के कारण है । यह आंकड़ा किम एट अल.28से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: D7F7 pkr एंटीबॉडी की विशिष्टता। (क, ख) pkr immunoprecipitated (एक) या कुल HeLa lysate (बी) के पूरे ब्लाटर पश्चिमी विश्लेषण केवल एक मजबूत pkr के आकार के अनुरूप बैंड दिखाया, यह दर्शाता है कि D7F7 एंटीबॉडी उच्च pkr पहचानने में विशिष्ट है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: के लिए रेडियोआइसोटोप संकेत pkr सह-immunoprecipitated rnas. (A) pkr सह-immunoprecipitated rnas का पता लगाया जा सकता है लेबलिंग द्वारा उनके 5 ' एंड्स आर-एटीपी के साथ । (ख) सफल rrna हटाने पर रेडियोइस्टोप संकेत में कमी देखी गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: pkr-mtrna बातचीत का सत्यापन। संकेत एंटीबॉडी के साथ rnas सह-immunoprecipitated में mtrnas के2 गुना संवर्धन लॉग इन करें । केवल pkr सह immunoprecipitated आरएनए नमूना mtrnas के मजबूत संवर्धन से पता चला । खरगोश igg और DGCR8 एंटीबॉडी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । यह आंकड़ा किम एट अल.28से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: कतरास-विशिष्ट qrt-पीसीआर pkr के विश्लेषण-बाध्य mtrnas । (क, ख) स्ट्रैट-विशिष्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का उपयोग mtrnas की प्रभ्रंश का विश्लेषण करने के लिए किया गया था जो कि एस (ए) या एम (बी) चरण-गिरफ्तार कोशिकाओं के लिए pkr के साथ सह-प्रतिरक्षा की गई थी । यह आंकड़ा किम एट अल.28से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

एस या एम चरण-गिरफ्तार नमूनों को तैयार करने की प्रक्रिया चित्रा 1में सचित्र है । एस चरण में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए, हम एक थाइमिडीन डबल ब्लॉक विधि का इस्तेमाल किया, जहां हम के बीच में एक 9 एच रिहाई के साथ दो बार थाइमिडीन के साथ कोशिकाओं का इलाज उच्च गिरफ्तारी दक्षता (चित्र 1a) सुनिश्चित करने के लिए । एम चरण गिरफ्तारी के लिए, हम एक बार थाइमिडीन के साथ एक 9 एच रिहाई के बाद कोशिकाओं का इलाज किया और फिर prometaphase (चित्रा 1b) में कोशिकाओं को ब्लॉक करने के लिए nocodazole लागू । सेल साइकिल नमूना तैयार करने में एक महत्वपूर्ण कदम पहली thymidine ब्लॉक के बाद जारी कदम है । थाइमिडीन को पूरी तरह से हटाने के लिए, ताजा पीबीएस के साथ कम से दो बार कोशिकाओं को धोना महत्वपूर्ण है । अनुचित धोने और अवशिष्ट थाइमिडीन वृद्धि की विविधता में परिणाम कर सकते है और सेल व्यवहार्यता में कमी आई है । एम चरण गिरफ्तारी की सफलता की पुष्टि की जा सकती है नेत्रहीन गोल आकार की कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि के आधार पर (चित्रा 2a) । हालांकि, एम चरण नमूना अभी भी कई इंटरफेज कोशिकाओं उनके morphology के आधार पर होता है । केवल एम चरण गिरफ्तार कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, हम सतह से मीटर चरण कोशिकाओं को अलग करने के लिए शारीरिक बल लागू. काटा कोशिकाओं की परमाणु सामग्री आगे facs का उपयोग कर जांच की थी, जो 2n और 4n के बीच एक व्यापक शिखर एस चरण के लिए और 4n पर एक तेज चोटी के लिए एम चरण-गिरफ्तार नमूना (चित्रा 2 बी) दिखाया । प्रस्तुत प्रोटोकॉल HeLa कोशिकाओं है, जो लगभग 24 एच के एक दोहरीकरण समय है के लिए अनुकूलित है । डबल थाइमिडीन और थाइमिडीन-nocodazole ब्लॉक के विचार अन्य सेल लाइनों के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन सटीक दवा उपचार और रिलीज durations लक्ष्य कोशिकाओं के दोहरीकरण समय के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता.

pkr-बातचीत rnas की पहचान करने के लिए, हम formaldehyde साथ pkr-आरएनए परिसरों crosslinked और immunopरेसिपिटेशन के माध्यम से उन्हें समृद्ध किया । एक प्रमुख कारक है कि बाद में विश्लेषण की सटीकता निर्धारित करता है immunopरेसिपिटेशन की दक्षता है । हम कई एंटीबॉडी है कि pkr प्रोटीन के विभिंन epitopes लक्ष्य के लिए उच्च throughput अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी के लिए एंटीबॉडी निर्धारित करने का परीक्षण किया है । जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, हमने पाया है कि D7F7 एंटीबॉडी कि dsrna बाध्यकारी डोमेन और उत्प्रेरक डोमेन के बीच linker क्षेत्र पहचानता है pkr कैप्चरिंग में बेहतर क्षमता दिखाई । अन्य एंटीबॉडी चित्रा में दिखाया गया 3 (milli) एन टर्मिनल क्षेत्र को पहचानता है, लेकिन immunopरेसिपेटिंग pkr में एक गरीब की क्षमता से पता चलता है. फलस्वरूप, उच्च throughput अनुक्रमण पुस्तकालय milli एंटीबॉडी का उपयोग कर तैयार कई पृष्ठभूमि अनुक्रमण पढ़ता है कि जीनोम भर में बिखरे हुए हैं, विशेष रूप से introns में, विशिष्ट क्षेत्रों में अलग गर्द बिना28 (चित्रा 4). हम मानते हैं कि दो अनुक्रमण पुस्तकालयों में विसंगतियों ज्यादातर एंटीबॉडी की क्षमताओं में मतभेद के कारण pkr पर कब्जा करने में immunopरेसिपिटेशन कदम के दौरान कर रहे हैं. हम आगे की विशिष्टता की जांच की D7F7 pkr एंटीबॉडी के माध्यम से पूरे दाग पश्चिमी विश्लेषण के immunoprecipitate (चित्रा 5a) और कुल HeLa lysates (चित्रा 5a) । दोनों blots में, हम केवल एक मजबूत बैंड है कि pkr से मेल खाती है मनाया । यह इंगित करता है कि D7F7 एंटीबॉडी अत्यधिक विशिष्ट है और कि अनुक्रमण डेटा D7F7 एंटीबॉडी की संभावना का उपयोग करके प्राप्त pkr के सच rna interactors प्रतिबिंबित ।

उच्च-थ्रॅपुट अनुक्रमण लायब्रेरी की तैयारी के दौरान एक महत्वपूर्ण चरण rrnas का निष्कासन है । चूंकि हम आरएनए-आरबीपी परिसरों को formaldehyde के साथ क्रॉसलिंक करते हैं, हमने कोशिकाओं के पूर्ण lysis के लिए एक ultrasonicator का इस्तेमाल किया । इस प्रक्रिया में rrnas के विखंडन, जो rrnas हटाने किट का उपयोग कर rrnas हटाने की क्षमता काफी कम हो गई । इस समस्या को हल करने के लिए, हम पहली बार rrna रिक्शन किट ( सामग्री की तालिका), जो लगभग पूरी तरह से हटा rrna और कुल अनुक्रमण पढ़ता का 1% से कम rrna करने के लिए मैप किए गए थे द्वारा पीछा किया आरआरएनए हटाने किट का उपयोग करें । rrna कमी किट केवल 1 μg की अधिकतम क्षमता है, जबकि rrna हटाने किट 5 μg की अधिकतम क्षमता है क्योंकि हम इन दो किट क्रमिक रूप से इस्तेमाल किया । हम अनुभव किया है कि की सिफारिश की राशि से अधिक का उपयोग करते हुए कुल rna अनुक्रमण की महत्वपूर्ण राशि में परिणाम rrnas करने के लिए मैप किए गए पढ़ता है । rrna के सफल हटाने pnk प्रतिक्रिया के माध्यम से आर एटीपी के साथ rnas लेबलिंग के बाद पुष्टि की जा सकती है । जबकि rrna घट rnas १५० nt के आसपास एक विशिष्ट बैंड दिखाया, rrna हटाने से पहले नमूना ५० ~ ३०० nt (चित्रा 6) के लिए इसी क्षेत्र भर में मजबूत संकेत से पता चलता है ।

formaldehyde क्रॉसलिंकिंग की एक सीमा कमी इम्यूनोरेसिपिटेशन दक्षता है । इस तरह के immunocytochemistry के रूप में formaldehyde क्रॉसलिंकिंग के अन्य अनुप्रयोगों आमतौर पर निर्धारण के लिए 4% paraformaldehyde समाधान का उपयोग करें । हालांकि, इस तरह के एक मजबूत निर्धारण हालत fclip प्रयोग के लिए लागू नहीं किया जा सकता है क्योंकि यह काफी immunopरेसिसिटेशन दक्षता, जो एक उच्च पृष्ठभूमि में परिणाम कम हो जाती है । इसके अलावा, formaldehyde निर्धारण crosslinks प्रोटीन-आरएनए परिसरों के अलावा प्रोटीन-प्रोटीन परिसरों । इसलिए, एक को fclip डेटा की व्याख्या में सावधानी बरतने की जरूरत है ।

पहले रिपोर्ट के रूप में, mtrnas प्रपत्र अंतराआण्विक dsrnas pkr28द्वारा पहचाना गया है । हम पहले qrt-पीसीआर के माध्यम से pkr-mtrna बातचीत का परीक्षण करके हमारे अनुक्रमण डेटा सत्यापित । हम खरगोश igg और नकारात्मक नियंत्रण है, जो mtrnas के किसी भी संवर्धन (चित्रा 7) नहीं दिखा था के रूप में DGCR8 एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया । नोट की, DGCR8 एक परमाणु dsrna बाध्यकारी प्रोटीन है कि शारीरिक रूप से mtrnas से अलग है के रूप में इस्तेमाल किया गया था । एक ही समय में, pkr सह immunoprecipitated rnas mtrnas के मजबूत संवर्धन दिखाया (चित्रा 7) ।

आगे pkr-mtrna बातचीत का विश्लेषण करने के लिए, हम हल्के-किनारा mtrna (चित्रा 8) से भारी-किनारा mtrna भेद करने के लिए भूग्रस्त-विशिष्ट रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन किया । हम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमरों कि एक cmv प्रमोटर अनुक्रम एक जीन विशिष्ट अनुक्रम के बाद किया है और फिर बाईं प्राइमरी और जीन के लिए विशिष्ट सही प्राइमरों के रूप में एक सीएमवी प्रवर्तक अनुक्रम इस्तेमाल किया डिजाइन qpcr विश्लेषण के लिए । हम भी SP6 प्रवर्तक और pgex अनुक्रमण प्राइमर अनुक्रम के बजाय सीएमवी प्रमोटर क्रम का परीक्षण किया है । हमने पाया है कि जबकि cmv प्रवर्तक और pgex अनुक्रमण प्राइमर अनुक्रम अच्छा परिणाम दिखाया, SP6 प्रवर्तक अनुक्रम का उपयोग नहीं किया. अंतर SP6 प्रमोटर अनुक्रम की कम GC सामग्री के कारण है (~ ३३%) की तुलना में उन के सीएमवी प्रवर्तक (~ ६७%) और pgex अनुक्रमण प्राइमर (~ ६५%) दृश्यों. strand-विशिष्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए प्रस्तावित योजना आसानी से अन्य अंतराआण्विक dsrnas करने के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन जब रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर्स डिजाइनिंग, जीसी सामग्री को ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

कुल मिलाकर, हम सेल चक्र की तैयारी का प्रदर्शन नमूनों को गिरफ्तार किया और pkr के संवर्धन-formaldehyde crosslinking और immunopरेसिपीटेशन के माध्यम से rnas बातचीत । एक अत्यधिक कुशल D7F7 एंटीबॉडी का उपयोग कर, हम सफलतापूर्वक pkr-बाउंड rnas अलग है और जनरेट कर रहा है और एक उच्च-थ्रौपुट अनुक्रमण लायब्रेरी का विश्लेषण करके इन rnas पहचाना । इसके अलावा, pkr के लिए बाध्य mtrnas की strandedness का विश्लेषण करने के लिए, हम एक भूग्रस्त विशिष्ट रिवर्स प्रतिलेखन दृष्टिकोण प्रस्तुत किया । हमें उंमीद है कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल आसानी से अंय dsrbps और interactors dsrbps कि भावना और antisense टेप के बीच पूरक बातचीत के माध्यम से गठन कर रहे है की strandedness के आरएनए interactors अध्ययन अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन के माध्यम से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (nrf) विज्ञान और आईसीटी के कोरियाई सरकार के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित (nrf-2016r1c1b2009886).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
1 M Tris, pH 7.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1 M Tris, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
1.7 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40) Biosolution BN015
10X DNA loading buffer TaKaRa 9157
15 mL conical tube SPL 50015
3' adaptor 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5 Thermo Fisher Scientific AM9740
5' adaptor 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaCl Thermo Fisher Scientific AM9760G
50 mL conical tube SPL 50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5 Thermo Fisher Scientific AM9722
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphatase New England Biolabs M0289S
Anti-DGCR8 Made in house
Anti-PKR (D7F7) Cell signaling technology 12297S
Anti-PKR (Milli) Millipore EMD 07-151
ATP (100 mM) GE Healthcare GE27-2056-01
Bromophenol blue sodium salt Sigma-aldrich B5525
Calf intestinal alkaline phosphatase TaKaRa 2250A
Cell scraper 25 cm 2-position Sarstedt 83.183
CMV promoter sequence 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle medium Welgene LM001-05
dNTP mixture (2.5 mM) TaKaRa 4030
Ethanol, Absolute, ACS Grade Alfa-Aesar A9951
Fetal bovine serum Merck M-TMS-013-BKR
Formamide Merck 104008
Glycine Bio-basic GB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) Thermo Fisher Scientific AM9516
Isopropanol Merck 8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion Kit New England Biolabs E6318 rRNA Depletion Kit
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Normal rabbit IgG Cell signaling technology 2729S
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 6148
PCR forward primer (RP1) 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI) 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mL Axygen PCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) Tablet TaKaRa T9181
Phusion high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530 High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor Benchmark c2000
Polynucleotide kinase (PNK) TaKaRa 2021A
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma-Aldrich 3115879001
qPCR primer sequence: CO1 Heavy Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 Light Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 Light Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Heavy Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 Light Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Heavy Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB Light Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDH Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 Light Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 Light Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Heavy Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND5 Light Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Heavy Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND6 Light Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Random hexamer Thermo Fisher Scientific SO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) TaKaRa 2270A
Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) TaKaRa 2313A
Ribo-Zero rRNA Removal Kit Illumina MRZH116 rRNA Removal Kit
Rotator FINEPCR, ROTATOR AG D1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT primer sequence: CO1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT primer sequence: CO2 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT primer sequence: CO2 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT primer sequence: CO3 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT primer sequence: CO3 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT primer sequence: CYTB Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT primer sequence: CYTB Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer sequence: GAPDH 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT primer sequence: ND1 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT primer sequence: ND1 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RT primer sequence: ND4 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT primer sequence: ND4 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RT primer sequence: ND5 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RT primer sequence: ND5 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT primer sequence: ND6 Heavy 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT primer sequence: ND6 Light 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube Bio Plas 4167SLS50
Sodium dedecyl sulfate Biosesang S1010
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
SUPERase In Rnase inhibitor Thermo Fisher Scientific AM2694
SuperScript III reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18080093 Reverse transcriptase for library preparation
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific 18090010 Reverse transcriptase for qRT-PCR
SYBR gold nucleic acid gl stain Thermo Fisher Scientific S11494
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204
T4 RNA ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373
Thermomixer Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
Thymidine Sigma-Aldrich T9250
Tris-borate-EDTA buffer (TBE) TaKara T9122
Triton X-100 Promega H5142
Ultralink Protein A sepharose beads Thermo Fisher Scientific 22810 Protein A beads
Ultrasonicator Bioruptor
Urea Bio-basic UB0148
Vortex mixer DAIHAN Scientific VM-10
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) PerkinElmer BLU502A100UC

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References

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स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान सक्रिय प्रोटीन काइनेज आरएनए के आरएनए इंटरएक्टर्स का अध्ययन
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Kim, S., Kang, M., Kim, Y. Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle. J. Vis. Exp. (145), e59215, doi:10.3791/59215 (2019).

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