Summary
Vi presenterar experimentella metoder för att studera RNA-interactmedlemmar dubbelsträngat RNA-bindande protein Kinas RNA-aktiverat (PKR) under mammalian cell cykel använder HeLa cells. Denna metod använder tredjeparts formaldehyd crosslink RNA-PKR komplex och immunoprecipitation att berika PKR-bundna RNAs. Dessa RNAs kan analyseras vidare genom hög genomströmning sekvensering eller qRT-PCR.
Abstract
Proteinkinas RNA-aktiverat (PKR) är medlem i de medfödda immunförsvaret proteinerna och erkänner det dubbelsträngat sekundära strukturerar av viral RNAs. PKR när bunden till viral dubbelsträngat RNA (dsRNAs), och genomgår dimerization och efterföljande autophosphorylation. Fosforyleras PKR (pPKR) blir aktiv och inducerar fosforylering av den alfa subuniten av eukaryota inledande faktor 2 (eIF2α) att undertrycka globala översättning. Ökande bevis föreslår att PKR kan aktiveras under fysiologiska betingelser såsom under cellcykeln eller olika stress villkor utan infektion. Vår förståelse av de RNA aktivatorer av PKR är dock begränsad på grund av en standardiserad experimentell metod att fånga och analysera PKR-interagera dsRNAs. Här presenterar vi en experimentell protokollet att specifikt berika och analysera PKR bundet RNAs under cellcykeln använder HeLa cells. Vi använder effektiv crosslinking aktiviteten av formaldehyd att fixa PKR-RNA komplex och isolera dem via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs kan sedan bearbetas vidare för att generera en hög genomströmning sekvensering bibliotek. En stor klass av PKR-interagera cellulär dsRNAs är mitokondriell RNAs (mtRNAs), som kan existera som intermolekylära dsRNAs genom kompletterande interaktion mellan de tunga-strand och ljus-strand RNASEN. För att studera strandedness av dessa duplex mtRNAs, presenterar vi också ett protokoll för strand-specifika qRT-PCR. Våra protokoll är optimerad för analys av PKR-bundna RNAs, men det kan enkelt modifieras för att studera cellulära dsRNAs eller RNA-interactmedlemmar av andra dsRNA bindande proteiner.
Introduction
Proteinkinas RNA-aktiverat (PKR), även känd som eukaryota inledande faktor 2-alpha kinase 2 (EIF2AK2), är en välkarakteriserad proteinkinas som överför information från RNAs. Det hör hemma till den eukaryota översättning inledande 2 subenhet alpha (eIF2α) Kinas familj och phosphorylates eIF2α på Serin 51 svar på infektion att undertrycka globala översättning1. I detta sammanhang aktiveras PKR genom viral dubbelsträngat RNA (dsRNAs), som tillhandahåller en plattform för PKR dimerization och autophosphorylation2. Förutom eIF2α, kan PKR också fosforylera p53, insulin receptor substrate 1, hämmare κB och c-Jun N-terminal kinase (JNK) att reglera aktiviteten hos många signaltransduktion vägar3,4,5, 6.
PKR identifierades ursprungligen som en Kinas som fosforyleras eIF2α under poliovirus infektion genom att erkänna poliovirus' dsRNAs7,8. PKR är alltmer hittade för att spela mångfacetterade roller utöver immunsvar och dess avvikande aktivering eller funktionsfel är underförstått i talrika mänskliga sjukdomar. Aktiveras/Phosphorylated PKR (pPKR) observeras ofta under apoptos och är ett gemensamt kännetecken för patienter med degenerativa sjukdomar, särskilt neurodegenerativa sjukdomar som Huntingtons, Parkinsonss och Alzheimers sjukdom9 ,10,11,12,13. Dessutom aktiveras PKR villkor olika stress såsom metabol stress och värme chock14,15,16,17. Däremot, resulterar hämning av PKR i ökad cellproliferation och även elakartad omformning18,19. PKR funktion är också viktigt för normal hjärnfunktion och under cellcykeln som nivån på pPKR är förhöjd under M fas20,21,22. I detta sammanhang pPKR dämpar globala översättning och ger ledtrådar till viktiga mitotiska signalering system som krävs för korrekt celldelningen20. Dessutom resulterade långvarig aktivering av PKR i G2/M fas cellcykelarrest i Chinese hamster ovary cells23. PKR fosforylering regleras följaktligen den negativ feedback-slingan för att säkerställa snabb inaktivering under M/G1 övergången21.
Trots den breda utbud av PKR funktionen är vår förståelse av PKR aktiveringen begränsad på grund av avsaknaden av en standardiserad hög genomströmning experimentell metod att fånga och identifiera dsRNAs kan aktivera PKR. Tidigare studier har visat att PKR kan interagera med dsRNAs bildas av två inverterad Alu repetitioner (IRAlus)20,24, men möjligheten att förekomsten av ytterligare cellulära dsRNAs kan aktivera PKR under cellcykeln eller under stress villkor i mänskliga celler var outforskat. Den konventionella metoden att identifiera RNA-interactmedlemmar av en RNA-bindande protein (RBP) använder UV-ljus till crosslink RNA-RBP komplex25,26,27. En nyligen genomförd studie tillämpas detta UV crosslinking tillvägagångssätt i ett mus-system och identifierat att små nukleolära RNAs kan reglera PKR aktivering under metabol stress16. Genom att utnyttja hög crosslinking effektivitet av formaldehyd, presenterade vi en alternativ metod för att identifiera PKR-interagera RNAs under cellcykeln i HeLa celler28. En liknande metod har tillämpats för att studera andra dsRBPs såsom Staufen och Drosha29,30,31. Vi hittade att PKR kan interagera med olika typer av icke-kodande RNAs såsom kort interspersed nukleära element (sinus), lång interspersed nukleära element (linje), endogena retrovirus element (ERV) och även alpha-satellit RNAs. Dessutom visade vi att PKR kan interagera med mitokondriell RNAs (mtRNAs), vilken form intermolekylära dsRNAs genom kompletterande interaktion mellan de tunga-strand och ljuset strand RNAs28. En ny publikation stöds ytterligare våra data att vissa mtRNAs finns i en dubbelsidig form och kan aktivera dsRNA sensorer såsom melanom differentiering-associerade protein 5 att inducera interferoner32. Viktigare, moduleras uttryck och subcellulär lokalisering av mtRNAs under cellcykeln och av olika stressfaktorer, som kan vara viktiga i deras förmåga att reglera PKR aktiveringen28.
I denna artikel presenterar vi ett detaljerat protokoll för en nyligen utvecklad formaldehyd crosslinking och immunoprecipitation (fCLIP) metod för att fånga och analysera PKR-interagera RNAs under cellcykeln. Vi visar metoden för att förbereda cellcykeln gripandet prover med tymidin och nocodazole. Vi presenterar sedan fCLIP processen för att isolera PKR-bundna RNAs och en metod för att förbereda hög genomströmning sekvensering bibliotek för att identifiera dessa RNAs. Dessutom avgränsa vi detaljerade förfaranden för att analysera PKR-bundna RNAs med qRT-PCR. Specifikt, presenterar vi en strand-specifika omvänd transkription procedur för att analysera strandedness av mtRNAs. Protokollet beskrivs är optimerad för HeLa cells och PKR, men viktiga steg såsom utarbetandet av cellcykeln prov, fCLIP och strand-specifika qRT-PCR-analys kan enkelt modifieras att studera cellulära dsRNAs eller för att identifiera RNA interactmedlemmar av andra dsRBPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lösning och cell förberedelse
- Lösning förberedelse
- För cellodlingsmedium, förbereda medium för HeLa cellodling genom att lägga till 50 mL fetalt bovint serum (FBS) till 500 mL av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM).
Obs: Antibiotika kan läggas till i cellodlingsmedium, men vi använder inte antibiotika. - För den 0,1% paraformaldehyd, lös 4% (w/v) paraformaldehyd i 1 x Phosphate-Buffered saltlösning (PBS) med uppvärmning på en värmeplatta och späd att göra 30 mL 0,1% (v/v) paraformaldehyd genom att lägga till 1 x PBS.
FÖRSIKTIGHET: Utföra alla steg i ett dragskåp och vara noga med att inte koka paraformaldehyd lösningen. Skydda en 0,1% lösning från ljus och lagras vid 4 ° C. Använd lösning inom en månad.
Obs: Den sista 0,1% (v/v) paraformaldehyd lösningen pH bör vara runt 7. - Förbereda fCLIP lyseringsbuffert: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton x-100, 0,1% (v/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) och 0,1% (w/v) natriumdeoxikolat. Lägga till trippel destillerat vatten (TDW) 40 mL. Förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda fCLIP tvättbuffert: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton x-100, 0,1% (v/v) SDS och 0,1% (w/v) natriumdeoxikolat. Tillsätt TDW till 40 mL. Förvaras vid 4 ° C.
- Förbered 4 x PK buffert: 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA och 4% (v/v) SDS. Tillsätt TDW till 40 mL. Förvara i rumstemperatur.
- Förbereda fCLIP eluering buffert: 20 mL av 4 x PK buffert, 21 g urea och 8,5 mL TDW. Förbereda färska.
- Förbereda RNA eluering buffert: 0.3 M NaOAc och 2% (w/v) SDS. Förvara i rumstemperatur.
- Förbered 2 x RNA lastning färgämne: 0,025% (w/v) bromophenol blå, 0.025% (w/v) xylen cyanol, 5 mM EDTA, 0,05% (w/v) SDS och 95% (v/v) formamid. Förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 1 x TBE buffert: 0.089 M Tris-Borat och 0,002 M EDTA. Förbereda 500 mL TBE buffert.
- För cellodlingsmedium, förbereda medium för HeLa cellodling genom att lägga till 50 mL fetalt bovint serum (FBS) till 500 mL av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM).
- Beredning av S eller M fas-arresterade celler
- Utsäde ~ 750.000 eller ~ 1.000.000 HeLa celler för S eller M fas-greps prover, respektive. Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h.
- Behandla cellerna med 2 mM tymidin och inkubera i 18 timmar vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS. Lägga till färska media och inkubera i 9 h vid 37 ° C.
- För S behandla fas-arresterade celler, celler med 2 mM tymidin. För M fas-arresterade celler, behandla celler med 100 ng/mL nocodazole. Inkubera i 15 timmar vid 37 ° C och skörd celler.
Obs: Homogenitet av cellcykeln proverna kan kontrolleras med hjälp av FACS.
2. formaldehyd cross-linking och immunoprecipitation
- Cellen skörd
- För en S fas prov, samla celler med en cell skrapan och överföring till en 15 mL koniska rör. Tryck på sidan av cell kultur skålen att lossa M fas-arresterade celler och överföra dem till en 15 mL koniska rör för en M fas prov.
Obs: För att öka enhetligheten av M fas-arresterade celler, Använd inte en cell skrapa. - Centrifugera cellerna vid 380 x g i rumstemperatur i 3 min. ta bort supernatanten och slamma med 1 mL kall PBS och överföring i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Centrifugera cellerna vid 10 000 x g vid 4 ° C i 30 s. ta bort supernatanten helt.
- För en S fas prov, samla celler med en cell skrapan och överföring till en 15 mL koniska rör. Tryck på sidan av cell kultur skålen att lossa M fas-arresterade celler och överföra dem till en 15 mL koniska rör för en M fas prov.
- Formaldehyd crosslinking
- Tillsätt 750 μL av 0,1% paraformaldehyd under 10 minuter vid rumstemperatur fixar cellerna.
- Tillsätt 250 μl av 1 M glycin och inkubera en ytterligare 10 min i rumstemperatur att släcka reaktionen. Centrifugera cellerna vid 10 000 x g vid 4 ° C i 30 s. ta bort supernatanten helt.
- Återsuspendering med 1 mL PBS. Centrifugera cellerna på 10.000 x g vid 4 ° C i 30 s och ta bort supernatanten.
- Återsuspendering med 400 μL fCLIP lyseringsbuffert kompletteras med 0,2% (v/v) proteashämmare och 2% (v/v) RNase inhibitor. Inkubera på is i 10 min och sonikera använder en ultrasonicator.
- Tillsätt 11 μl 5 M NaCl justera NaCl koncentrationen till ~ 150 mM. Vortex kort och centrifugera vid 21,130 x g vid 4 ° C i 15 min. överför supernatanten till ett pre kylda 1,5 mL mikrocentrifug rör.
Obs: Behålla 40 μL av supernatanten i en ny centrifugrör som ingång provet. Lagra ingång provet vid 4 ° C.
- Immunoprecipitation
- Tillsätt 20 μL av Protein A pärlor i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tvätta pärlorna med 400 μL lyseringsbuffert fCLIP. Centrifugera pärlorna på 1 000 x g vid 4 ° C i 1 min. ta bort supernatanten och tillsätt 400 μL lyseringsbuffert fCLIP noggrant. Försiktigt återsuspendering pärlorna genom att Invertera 3 ~ 4 gånger.
- Upprepa tvättningen tre gånger. Efter den sista tvättningen, avlägsna supernatanten helt.
- Återsuspendering pärlorna i 300 μL lyseringsbuffert fCLIP. Tillsätt 8,3 μL av 5 M NaCl justera NaCl koncentrationen till ~ 150 mM. Tillsätt 10 μL av PKR antikropp och inkubera i 3 h på en rotator vid 4 ° C.
- Centrifugera pärlorna på 1 000 x g vid 4 ° C i 1 min. ta bort supernatanten och tillsätt 400 μL fCLIP tvättbuffert. Försiktigt återsuspendering pärlorna genom att Invertera 3 ~ 4 gånger.
- Upprepa tvättningen två gånger. Efter den sista tvättningen, avlägsna supernatanten helt.
Obs: Använd aldrig en vortex mixer. Vänd röret försiktigt med händerna. - Tillsätt 300 μL av lysat och Inkubera under 3 h vid 4 ° C på en rotator.
Obs: Längre inkubationstid kan resultera i ökad bakgrund bindande. - Centrifugera pärlorna på 1 000 x g vid 4 ° C i 1 min. ta bort supernatanten och tillsätt 400 μL fCLIP tvättbuffert. Försiktigt återsuspendering pärlorna genom att Invertera 3 ~ 4 gånger.
- Upprepa tvättningen tre gånger. Efter den sista tvättningen, avlägsna supernatanten helt.
- Tillsätt 300 μL av fCLIP eluering buffert. Inkubera i en thermomixer för 3 h vid 25 ° C till eluera PKR från pärlorna.
Obs: Förbered fCLIP eluering buffert färska. - Centrifugera vid 1 000 x g i rumstemperatur och överför supernatanten till en ren silikoniserat tube.
Obs: En mikrocentrifug rör är också ok, men silikoniserat tube föredras att förhindra avdunstning under de-crosslinking steget (steg 2.3.12). - Tillsätt 300 μL av proteinas K (20 mg/mL) och inkubera över natten vid 65 ° C.
Obs: Använd en thermomixer med uppvärmd täcka för att undvika avdunstning.
- RNA-extraktion
- Tillsätt 580 μL av syra-fenol kloroform och vortex för 30 s. Inkubera vid 37 ° C i 1 h.
- Virvel för 30 s och centrifugera vid 12 000 x g i rumstemperatur i 10 min.
- Överföra det översta lagret i en ren 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 1/10 volym 3 M NaOAc, 0,5 μL av coprecipitant (t.ex. Glycoblue) och en lika stor volym av isopropanol. Inkubera över natten vid-20 ° C.
- Fällningen pellets genom centrifugering med maximal hastighet vid 4 ° C för 1 h.
Obs: Om RNA/DNA pellets inte observerades, lägga till en ytterligare 0,5 μL av coprecipitant och centrifug för en ytterligare 1 h. Fortsätt detta steg tills RNA/DNA pellets observeras. - Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 mL 75% etylalkohol. Centrifugera vid 12 000 x g vid 4 ° C i 5 min. Upprepa tvättningen en gång. Ta bort supernatanten helt och torka pelleten i rumstemperatur.
- Tillsätt 42 μL av TDW, 5 μL av DNAS jag buffert, 1 μL av RNase Inhibitor och 2 μL av DNAS I. Inkubera vid 37 ° C i 1 h.
- Tillsätt 150 μl av TDW och 200 μL syra-fenol kloroform. Virvel för 30 s. Centrifugera vid 12 000 x g i rumstemperatur i 10 min.
- Överföra det översta lagret i en ren 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 20 μL av 3 M NaOAc, 0,5 μL av coprecipitant, och 1 mL 100% etanol. Inkubera över natten vid-80 ° C.
- Fällningen pellets och tvätta med 75% etylalkohol som beskrivs i steg 2.4.4 till 2.4.5.
- Återsuspendering i lämplig mängd TDW.
3. sekvensering bibliotek förberedelse
- rRNA borttagning
- Återsuspendering RNA pellets från steg 2.4.10 med 28 μL av TDW.
Obs: Det maximala beloppet för total-RNA bör vara mindre än 5 μg. - Följ procedurerna som av rRNA borttagning kit's referensguide till ta bort rRNA.
- Städa upp rRNA utarmat RNAs genom att lägga till 160 μL av magnetiska pärlor.
- Blanda genom pipettering ~ 15 gånger och odla i rumstemperatur i 15 min.
- Anslut röret på en magnetisk bar och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 300 μL 80% etylalkohol medan pärlorna är fortfarande sitter i magnetiska fältet och inkubera i 30 s.
- Ersätta etylalkohol med en färsk 300 μL lösning. Luften torr pärlorna på magnetiska baren för 12 min i rumstemperatur.
- Återsuspendering pärlorna i 12 μL TDW och blanda genom pipettering 15 gånger.
- Fäst pärlorna i magnetiska fältet och flytta supernatanten till en ren PCR-röret.
- Bryter ned fragmenterade ribosomalt RNASEN (rRNAs) följa de förfaranden som föreskrivs av rRNA utarmning Kit.
- Städa upp RNASEN genom att lägga till 110 μl av magnetiska pärlor och upprepande steg 3.1.3.1 till 3.1.3.6.
- Återsuspendering RNA pellets från steg 2.4.10 med 28 μL av TDW.
- RNA märkning och adapter ligatur
- Lägg till 2 μL 10 x CIAP buffert, 1 μL av RNase inhibitor och 2 μL av Antarktis alkaliskt fosfatas på rRNA-utarmat RNAs. Inkubera vid 37 ° C i 1 h och sedan vid 65 ° C i 5 min för att inaktivera fosfatas.
- Lägg 3 μL 10 x PNK buffert, 1,5 μL av RNase inhibitor, 1,5 μL av T4 PNK enzym, 0.8 μL av r-ATP och 1.7 μL av TDW. Inkubera vid 37 ° C i 50 min.
- Tillsätt 1,5 μL 10 mm ATP och inkubera vid 37 ° C för ytterligare 40 min.
- Stoppa reaktionen genom att lägga till 170 μL av RNA eluering bufferten.
- Tillsätt 200 μl av syra-fenol kloroform och vortex för 30 s. Centrifugera vid 12 000 x g i rumstemperatur i 10 min.
- Överföra det översta lagret i en ren 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 20 μL av 3 M NaOAc, 0,5 μL av coprecipitant, och 1 mL 100% etanol. Inkubera över natten vid-80 ° C.
- Fällningen RNA pellets och tvätta med 75% etylalkohol som beskrivs i steg 2.4.4 till 2.4.5. Återsuspendering i 4,5 μL av TDW och tillsätt 9 μL av 2 x RNA lastning färgämne.
- Värm provet vid 95 ° C i 5 min och belastningen på en 10% Urea-PAGE gel.
- Kör gelen vid 370 V för 40 min.
Obs: Kör före gelen på 370 V för 90 min före lastning provet. - Klipp gelen på ~ 100 – 500 nukleotid regionen och bryta gelen.
- Lägg till 700 μL av 0,3 M NaCl och inkubera över natten vid 4 ° C på en rotator.
- Överför lösningen till en kolumn och centrifugera vid maximal hastighet vid rumstemperatur under 5 minuter.
- Överföra eluatet till en ren 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 1/10 volym 3 M NaOAc, 0,5 μL av coprecipitant och en lika stor volym av isopropanol. Inkubera över natten vid-20 ° C.
- 3' adapter ligatur
- Fällningen RNA pellets och tvätta med 75% etylalkohol som beskrivs i steg 2.4.4 till 2.4.5.
- Återsuspendering RNA pellets i 6,5 μL av TDW och tillsätt 1 μL av 10 μM 3' adapter.
- Överför lösningen till en PCR-röret och inkubera vid 70 ° C i 2 min.
- Tillsätt 1 μL 10 x ligering buffert, 0,5 μL av RNase inhibitor och 1 μL av T4 RNA ligase 2. Inkubera vid 28 ° C under 1 h, 25 ° C i 6 h och 22 ° C i 6 h.
- Tillsätt 12 μL av 2 x RNA lastning färgämne och värme vid 95 ° C i 5 min.
- Gel rena 3na ' adapter sammanskrivna RNAs som beskrivs i 3.2.9 till 3.2.13.
- 5' adapter ligatur
- Fällningen RNA pellets och tvätta med 75% etylalkohol som beskrivs i steg 2.4.4 till 2.4.5.
- Återsuspendering RNA pellets i 4.2 μL av TDW och tillsätt 1 μL av 5 μM 5' adapter.
- Överför lösningen till en PCR-röret och inkubera vid 70 ° C i 2 min.
- Tillsätt 0,8 μL 10 x ligase buffert, 0.4 μL av RNase inhibitor, 0.8 μL 10 mm ATP, 0.8 μL av T4 RNA ligase 1. Inkubera vid 28 ° C under 1 h, 25 ° C i 6 h och 22 ° C i 6 h.
- Omvänd transkription och PCR-amplifiering
- Sammanskrivna RNAs, Lägg till 1 μL av 4 μM omvänd transkription primer på 5' adapter. Inkubera vid 70 ° C i 2 min och omedelbart svalna till 4 ° C.
- Lägg 4 μL av 5 x FS buffert, 4 μL av 2,5 mM dNTP, 1 μL av 0,1 M DTT, 1 μL av RNase inhibitor och 1 μL av omvänt transkriptas. Inkubera vid 50 ° C för 1 h och 70 ° C i 15 min.
- Förbered PCR-amplifiering
- Blanda 1 μL av RT produkt, 1 μL av 25 μM RPI primer, 1 μL av 25 μM RP1 primer, 10 μL av 5 x HF buffert, 4 μL av 2,5 mM dNTP, 32,5 μL av TDW och 0,5 μL av HiFi-polymeras.
- Kör PCR för 11 ~ 13 cykler.
Obs: Programmet för PCR är: 98 ° C i 30 s för varmstart 98 ° C för 10 s, 60 ° C under 30 s och 72 ° C för 45 s för amplifiering, och 72 ° C i 5 min. Förstärkning steget upprepas för 11-13 cykler.
- Städa upp PCR-produkterna använder 40 μl av magnetiska pärlor och följande steg 3.1.3.1 till 3.1.3.6 men med 10 μL av TDW för att eluera DNA.
- Tillsätt 2 μL 10 x DNA lastning färgämne. Ladda provet på en 6% akrylamid gel och köra på 200 V för 30 min.
- Fläcken med Sybr guld (0,01% (v/v) i 1 x TBE buffert) för 5 min i rumstemperatur.
- De fläcken i 1 x TBE buffert för 5 min i rumstemperatur.
- Klipp gelen på ~ 200 – 700 nukleotid regionen och bryta gelen.
- Lägg till 700 μL av 0,3 M NaCl och inkubera över natten vid rumstemperatur för att eluera DNA.
- Lasta allt på en kolumn och centrifugera vid maximal hastighet vid rumstemperatur under 5 minuter.
- Överföra eluatet till en ren 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 1/10 volym 3 M NaOAc, 0,5 μL av coprecipitant och en lika stor volym av isopropanol. Inkubera över natten vid-20 ° C.
- Fällningen DNA pellets och tvätta med 75% etylalkohol som beskrivs i steg 2.4.4 till 2.4.5. Återsuspendering i 20 μL av TDW.
- Analysera provet med en sequencer.
4. analys av PKR-interagera RNAs med qRT-PCR
- Metod 1: Random hexamer omvänd transkription
- Återsuspendering RNA pellets från steg 2.4.10 med 8,5 μl TDW och överför lösningen till en PCR-röret.
- Lägg till 0,5 μL av 100 μM slumpmässiga hexamers och 4 μL av 2,5 mM dNTP mix.
- Värme lösningen vid 65 ° C i 5 min och omedelbart Inkubera på is för minst 1 min.
- Se reaktionen blanda: 4 μL av 5 x SSIV buffert, 1 μL av 100 mM DTT, 1 μL av RNase Inhibitor och 1 μL av omvänt transkriptas (200 U/μL). Lägger till reaktionsblandning i RNA-lösningen.
- Inkubera blandningen vid 23 ° C i 10 min, 50 ° C i 10 minuter och 80 ° C i 10 min.
- Analysera det cDNA som använder en realtids PCR-system.
Obs: Programmet för realtids PCR är: 95 ° C under 3 min för varmstart, 95 ° C i 5 s och 60 ° C under 10 s för förstärkning och 95 ° C i 30 s, 65 ° C i 30 s och 95 ° C i 30 s för smälta. Förstärkning steget upprepas för 40 cykler.
- Metod 2: Strand-specifika omvänd transkription
- Förbereda en master mix av omvänd grundfärger: blanda lika mängder gen specifika omvänd transkription primers innehållande CMV arrangören sekvens följt av ~ 20 nukleotider av specifika gensekvenser.
Obs: Den kombinera koncentrationen av alla gen specifika RT grundfärger är 4 μM. - Återsuspendering RNA pellets från steg 2.4.10 med 8,5 μl TDW och överför lösningen till en PCR-röret.
- Tillsätt 0,5 μL av 4 μM master mix av omvänd transkription primers och 4 μL av 2,5 mM dNTP mix.
- Värme lösningen vid 65 ° C i 5 min och omedelbart Inkubera på is för minst 1 min.
- Bered den reaktion genom att blanda 4 μL av 5 x SSIV buffert, 1 μL av 100 mM DTT, 1 μL av RNase Inhibitor och 1 μL av omvänt transkriptas (200 U/μL). Lägg till reaktion lösningen till RNA-primer mixen.
- Inkubera lösningen vid 50 ° C i 10 min och 80 ° C i 10 min.
- Analysera det cDNA som med hjälp av realtids PCR-systemet.
Obs: Programmet för realtids PCR är samma som det som beskrivs i metod 1.
- Förbereda en master mix av omvänd grundfärger: blanda lika mängder gen specifika omvänd transkription primers innehållande CMV arrangören sekvens följt av ~ 20 nukleotider av specifika gensekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk att arrestera HeLa cells på S eller M fasen i cellcykeln processen visas i figur 1. För en M fas-greps prov, kan vi tydligt visualisera runda formade celler i Mikroskop (figur 2A). För att undersöka effektiviteten av cellcykelarrest, kan nukleära innehållet i cellen analyseras med hjälp FACS (figur 2B). Figur 3 visar representativa uppgifter för immunoprecipitation effektivitet test, där D7F7 antikroppen visar en överlägsen förmåga att immunoprecipitate PKR. Denna skillnad i immunoprecipitation effektivitet kan har återspeglats i skillnaderna i klass fördelningen av hög genomströmning sekvensering biblioteken tillagas med två olika PKR antikroppar (figur 4). D7F7 antikroppens specificitet bekräftas ytterligare använder hela blot västra analys av den PKR immunoprecipitate (figur 5A) och cellen summa lysate (figur 5B). Figur 6 visar radioisotop signalen före och efter borttagning av rRNAs under hög genomströmning sekvensering bibliotek beredning. Figur 7 visar anrikningen av mtRNAs i RNAs co-immunoprecipitated med PKR, men inte i RNAs co-immunoprecipitated med kanin IgG eller DiGeorge syndrom kromosomal region 8 (DGCR8). Figur 8 visar den representativa strand specifika qRT-PCR-analys av PKR-bundna mtRNAs i S eller M-fas greps prover.
Figur 1: Schematisk för beredning cellcykeln gripandet prover. (A, B) Scheman över utarbetandet av S (A) eller M (B) fas-arresterades HeLa cells. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: analys av cellcykeln greps prover. (A) fas kontrast bilder av S eller M fas-greps prover. Staplarna anger 250 μm. (B), FACS analys visar nukleära innehållet i proven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunoprecipitation effektivitet test för PKR antikroppar. För framgångsrika anrikning av PKR-bundna RNAs användas en antikropp med en slutgiltig immunoprecipitation effektivitet såsom D7F7 antikroppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: RNA klass distribution av sekvensering bibliotek tillagas med olika PKR antikroppar. Använda olika PKR antikroppar för fCLIP resulterade i en annan klass fördelning av mappade sekvensering läsningar. Skillnaden beror sannolikt på skillnaderna i immunoprecipitation effektivitet. Denna siffra har ändrats från Kim et al.28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: D7F7 PKR antikroppens specificitet. (A, B) Hela blot västra analys av PKR immunoprecipitated (A) eller totala HeLa lysate (B) visade endast en starkt band som motsvarar storleken på PKR, vilket indikerar att D7F7 antikroppen är mycket specifika i igenkännande PKR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: radioisotop signal för PKR co-immunoprecipitated RNAs. (A) PKR co-immunoprecipitated RNAs kunde ha upptäckts av märkning sin 5' slutar med r-ATP. (B) minskning av radioistope signal observerades efter framgångsrika rRNA borttagning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: validering av PKR-mtRNA interaktioner. 2 vik anrikningen av mtRNAs inloggning RNAs co-immunoprecipitated med angivna antikroppar. Endast PKR co-immunoprecipitated RNA provet visade stark anrikningen av mtRNAs. Kanin IgG och DGCR8 antikroppar användes som negativa kontroller. Denna siffra har ändrats från Kim et al.28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Strand-specifika qRT-PCR-analys av PKR-bundna mtRNAs. (A, B) Strand-specifika omvänd transkription användes för att analysera strandedness av mtRNAs som var co-immunoprecipitated med PKR för S (A) eller M (B) fas-arresterade celler. Denna siffra har ändrats från Kim et al.28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Processen att förbereda S eller M fas-greps prover illustreras i figur 1. För att arrestera celler på S fasen, använde vi en tymidinanalog dubbel block metod där vi behandlade celler med tymidin två gånger med en 9 h release emellan för att säkerställa hög gripandet effektivitet (figur 1A). För M fas gripande, vi behandlade celler en gång med tymidin följt av en 9 h release och sedan tillämpas nocodazole block celler på metafasen (figur 1B). Ett viktigt steg i att förbereda cellcykeln provet är det release steget efter det första tymidinanalog-blocket. Att helt ta bort tymidin, är det viktigt att tvätta cellerna minst två gånger med färska PBS. Felaktig tvätt och kvarstående tymidin kan resultera i ökad heterogenitet och minskad cellernas viabilitet. Framgången av M fas gripande kan bekräftas visuellt baserad på ökningen i antalet runda celler (figur 2A). M fas provet innehåller emellertid fortfarande många interphase celler baserat på deras morfologi. Samla in bara fasen M arresterade celler, tillämpat vi fysisk kraft att lösgöra M fas celler från ytan. Nukleära innehållet i de skördade cellerna undersöktes ytterligare använder FACS, som visade en bred topp mellan 2n och 4n för fasen S och en skarp topp vid 4n för M fas-greps provet (figur 2B). Presenterade protokollet är optimerad för HeLa celler, som har en fördubbling tid av ungefärligt 24 h. Idén om dubbel tymidin och tymidin-nocodazole block kan tillämpas på andra cellinjer, men de exakta läkemedel behandling och release varaktigheterna behöver optimeras utifrån fördubbling tid av målceller.
Att identifiera PKR-interagera RNAs, vi tvärbundna PKR-RNA komplex med formaldehyd och berikat dem genom immunoprecipitation. En viktig faktor som bestämmer riktigheten i den efterföljande analysen är effektiviteten i immunoprecipitation. Vi har testat många antikroppar som är riktade till olika epitoper av PKR protein för att fastställa antikroppen för hög genomströmning sekvensering bibliotek beredning. Som visas i figur 3, fann vi att D7F7 antikroppen som erkänner linker regionen mellan dsRNA bindande domänerna och den katalytiska domänen visade överlägsen förmåga att fånga PKR. Den andra antikropp som visas i figur 3 (Milli) erkänner regionen N-terminal, men visar en dålig förmåga i immunoprecipitating PKR. Därför innehöll hög genomströmning sekvensering biblioteket tillagas med Milli antikroppen många bakgrund sekvensering läsningar som är spridda över hela genomet, särskilt i introner, utan distinkt ansamlingar på specifika regioner28 (Figur 4). Vi anser att skillnaderna i de två sekvensering biblioteken är främst på grund av skillnaderna i de antikroppens förmåga att fånga PKR under immunoprecipitation steg. Vi undersökte kommissionen vidare specificitet D7F7 PKR antikroppen genom hela blot västra analyser av immunoprecipitate (figur 5A) och totalt HeLa lysates (figur 5B). I båda blotting observerade vi bara ett starkt band som motsvarar PKR. Detta indikerar att D7F7 antikroppen är mycket specifika och att sekvensering data som erhållits med den D7F7 antikroppen sannolikt återspeglar verkliga RNA interactmedlemmar av PKR.
Ett avgörande steg under hög genomströmning sekvensering bibliotek förberedelsen är avlägsnande av rRNAs. Sedan vi tvärbundna RNA-RBP komplex med formaldehyd använde vi en ultrasonicator för komplett lysering av cellerna. Denna process resulterade i fragmentering av rRNAs, vilket avsevärt minskat effektiviteten i rRNA borttagning med hjälp av rRNA borttagning Kit. Lös problemet, vi först använde rRNA borttagning Kit följt av rRNA utarmning Kit (se Tabell för material), som nästan helt borttagna rRNAs och mindre än 1% av den totala sekvensering läser karterades till rRNAs. Vi använde dessa två kit sekventiellt eftersom rRNA utarmning Kit har en maximal kapacitet på endast 1 μg medan rRNA borttagning Kit har en maximal kapacitet på 5 μg. Vi har upplevt som använder mer än den rekommenderade mängden totalt RNA resulterar i betydande mängd sekvensering läsningar mappas till rRNAs. Framgångsrika avlägsnande av rRNA kan bekräftas efter märkning RNASEN med r-ATP genom PNK reaktion. Medan rRNA utarmat RNAs visade ett distinkt band runt 150 nt, provet innan rRNA borttagning visar stark signal i hela regionen motsvarar 50 ~ 300 nt (figur 6).
En begränsning av formaldehyd crosslinking är minskningen immunoprecipitation effektivitet. Andra tillämpningar av formaldehyd crosslinking såsom immuncytokemi använder vanligtvis 4% paraformaldehyd lösning för fixering. Men kan sådant stark fixering villkor inte tillämpas för fCLIP experiment eftersom det minskar avsevärt den immunoprecipitation effektivitet, vilket resulterar i en högre bakgrund. Dessutom formaldehyd fixering antipyridinantikropp protein-protein komplex förutom protein-RNA komplex. Därför behöver man betala försiktighet i tolkningen av fCLIP data.
Som rapporterats tidigare, bildar mtRNAs intermolekylära dsRNAs som identifieras av PKR28. Vi validerade först vår sekvensering data genom att undersöka PKR-mtRNA interaktioner genom qRT-PCR. Vi använde kanin IgG och DGCR8 antikroppar som negativa kontroller, som inte visade någon anrikning av mtRNAs (figur 7). Notera användes DGCR8 som en nukleär dsRNA bindande protein som är fysiskt åtskilda från mtRNAs. Samtidigt visade PKR co-immunoprecipitated RNAs stark anrikningen av mtRNAs (figur 7).
För att ytterligare analysera PKR-mtRNA interaktioner, utfört vi strand-specifika omvänd transkription för att skilja den tunga-strand mtRNAs från den ljus-strand mtRNAs (figur 8). Vi designade omvänd transkription primers som har en CMV arrangören sekvens följt av en gen-specifika sekvens och sedan används en CMV arrangören sekvens som vänster primer och gen-specifika rätt primers för qPCR analysen. Vi har också testat SP6 arrangören och pGEX sekvensering primer sekvenser i stället för CMV arrangören sekvensen. Vi fann att medan CMV arrangören och pGEX sekvensering primer sekvenser visade bra resultat, med den SP6 arrangör sekvensen inte. Skillnaden beror på lågt GC innehåll av SP6 arrangören ordnar (~ 33%) jämfört med de av promotorn CMV (~ 67%) och pGEX sekvensering primer (~ 65%) sekvenser. Den föreslagna ordningen för strand-specifika omvänd transkription kan enkelt appliceras på andra intermolekylära dsRNAs, men när du utformar omvänd transkription primers, GC innehållet behöver beaktas.
Sammantaget visade vi beredning av cellcykeln greps prover och berikning av PKR-interagera RNAs genom formaldehyd crosslinking och immunoprecipitation. Använda en mycket effektiv D7F7 antikropp, har vi framgångsrikt isolerade PKR-bundna RNAs och identifierat dessa RNAs genom att generera och analysera en hög genomströmning sekvensering bibliotek. Dessutom för att analysera strandedness av mtRNAs bunden till PKR, presenterade vi en strand-specifika omvänd transkription strategi. Vi förväntar oss att protokollet presenteras enkelt kan optimeras för att studera RNA interactmedlemmar av andra dsRBPs och strandedness av intermolekylära dsRNAs som bildas genom kompletterande interaktion mellan förnuft och antisense avskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av grundläggande vetenskap forskningsprogram genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av den koreanska regeringen ministeriet för vetenskap och IKT (NRF-2016R1C1B2009886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
- Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
- Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
- Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
- Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
- Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
- Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
- Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
- Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
- Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
- Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
- Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
- Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
- Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
- Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
- Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
- Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
- Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
- Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
- Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
- Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
- Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
- Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
- Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
- Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).
