Summary
IDBac är en öppen källkod masspektrometri-baserad bioinformatik pipeline som integrerar data från både intakt protein och specialiserade metabolitspektra, som samlats in på cell material skrapats från bakteriella kolonier. Pipelinen gör det möjligt för forskare att snabbt organisera hundratals till tusentals bakteriella kolonier till förmodade taxonomiska grupper, och ytterligare differentiera dem baserat på specialiserad metabolit produktion.
Abstract
För att visualisera sambandet mellan bakteriell fylogeni och specialiserade metabolit produktion av bakteriella kolonier som växer på näringsagar, utvecklade vi IDBac-en låg kostnad och hög genomströmning Matrix-Assisted laserdesorption/jonisering masspektrometri (MALDI-TOF MS) för bioinformatik vid tiden för flygning. IDBac programvara är utformad för icke-experter, är fritt tillgänglig, och kan analysera några till tusentals bakteriella kolonier. Här presenterar vi procedurer för beredning av bakteriekolonier för MALDI-TOF MS-analys, MS-instrumentdrift och databehandling och visualisering i IDBac. I synnerhet, vi instruera användare hur man kluster bakterier i dendrogram baserat på protein MS fingeravtryck och interaktivt skapa metabolit Association nätverk (MANs) från specialiserade metabolit data.
Introduction
Ett stort hinder för forskare som studerar bakteriell funktion är förmågan att snabbt och samtidigt bedöma den taxonomiska identiteten hos en mikroorganism och dess förmåga att producera specialiserade metaboliter. Detta har hindrat betydande framsteg i förståelsen av sambandet mellan bakteriell fylogeni och specialiserad metabolit produktion i de flesta bakterier isolerade från miljön. Även om MS-baserade metoder som använder protein fingeravtryck för att gruppera och identifiera bakterier är väl beskrivna1,2,3,4, dessa studier har i allmänhet utförts på små grupper av isolat, på ett artspecifikt sätt. Viktigt, information om specialiserad metabolit produktion, en stor drivrutin för mikrobiell funktion i miljön, har förblivit oinkorporerade i dessa studier. Silva et al.5 tillhandahöll nyligen en omfattande historia som beskriver underutnyttjandet av MALDI-TOF MS för att analysera specialiserade metaboliter och bristen på programvara för att lindra nuvarande flaskhalsar i bioinformatik. För att ta itu med dessa brister skapade vi IDBac, en pipeline för bioinformatik som integrerar både linjära och reflectron lägen av MALDI-TOF MS6. Detta gör det möjligt för användare att snabbt visualisera och differentiera bakteriella isolat baserat på både protein och specialiserade metaboliten MS fingeravtryck, respektive.
IDBac är kostnadseffektivt, högt dataflöde och utformat för den lekmanna användaren. Det är fritt tillgängligt (chasemc.github.io/IDBac), och endast kräver tillgång till en MALDI-TOF masspektrometer (reflectron läge kommer att krävas för specialiserad metabolit analys). Provberedning förlitar sig på den enkla "utökade direktöverföringen" metod7,8 och data samlas in med konsekutiva linjära och reflectron förvärv på en enda MALDI-Target spot. Med idbac, är det möjligt att analysera den förmodade fylogeni och specialiserade metabolit produktion av hundratals kolonier på under fyra timmar, inklusive provberedning, datainsamling, och datavisualisering. Detta ger en betydande tid och kostnadsfördel jämfört med traditionella metoder för att identifiera bakterier (såsom gensekvensering), och analysera metabolisk produktion (vätskekromatografi-masspektrometri [LCMS] och liknande kromatografiska metoder).
Med hjälp av data som erhållits i linjär lägesanalys använder IDBac hierarkisk klustring för att representera protein spektra. Eftersom spektra främst representerar joniserade ribosomala proteiner, ger de en representation av den fylogenetiska mångfalden som finns i ett prov. Dessutom innehåller IDBac reflectron läge data för att Visa specialiserade metabolit fingeravtryck som Metabolitassociation nätverk (MANs). MANs är tvåpartsnätverk som möjliggör enkel visualisering av delad och unik metabolit produktion mellan bakteriella isolat. IDBac-plattformen gör det möjligt för forskare att analysera både protein och specialiserade metabolitdata parallellt men också individuellt om endast en data typ förvärvas. Viktigare, IDBac processer rådata från Bruker och Xiamen instrument, samt txt, tab, CSV, mzXML, och mzML. Detta eliminerar behovet av manuell konvertering och formatering av datauppsättningar, och avsevärt minskar risken för användarfel eller misskötsel av MS-data.
Protocol
1. beredning av MALDI Matrix
- Förbered 10 mg/ml MALDI-grade, och/eller lokalt α-cyano-4-hydroxycinnamic syra (chca) i MS-grade lösningsmedel: 50% acetonitril (ACN), 47,5% vatten (H2O), 2,5% trifluorättiksyra (TFA). Exempel: 100 μL lösning = 50 μL ACN + 47,5 μL H2O + 2,5 μl TFA + 1 mg chca
- Förbered minst 1 μL Matrix lösning per MALDI tallrik spot och Vortex eller Sonikera tills i lösning (ca 5 min ultraljudsbehandling eller inga synliga fasta ämnen).
Varning: TFA är en stark syra som ska hanteras i en kemisk draghuv samtidigt som den bär ordentlig personlig skyddsutrustning, eftersom den kan skada hud, ögon och luftvägar med kontakt eller inandning.
Obs: CHCA är hygroskopiskt och ljuskänsligt och bör förvaras i bärnstensfärgade ampuller i en exsickator. Det finns många MALDI Matrix alternativ. CHCA är vanligast för protein profilering av bakterier, men fungerar även för specialiserad metabolit analys. Matrisens urval beror på enskilda användare/experiment behov.
- Förbered minst 1 μL Matrix lösning per MALDI tallrik spot och Vortex eller Sonikera tills i lösning (ca 5 min ultraljudsbehandling eller inga synliga fasta ämnen).
2. beredning av MALDI-målplattor
Obs: se Sauer et al.7, för mer information.
- Skölj MALDI plattan med metanol (HPLC-kvalitet eller högre) och torka torrt med mjukpapper våtservetter. Använd inte slipande borstar när du rengör mål plattorna, eftersom detta kan skada ytan på mål plattan permanent.
- Tilldela protein och specialiserade metabolit kalibrerande fläckar. Organisera kalibrerings platser jämnt över urvalet population, för att redogöra för MALDI-Plate-oegentligheter och instrument drift över tiden. Tilldela ett lämpligt antal Media/Matrix-tomma fläckar för studien; dessa fläckar kommer att innehålla endast media och matris, eller bara matris.
- Med hjälp av en steril tandpetare, överföra en liten del av en bakteriell koloni till lämplig plats på MALDI plattan. Fördela bakteriekolonin jämnt över platsen. Platsen ska visas så platt som möjligt.
Obs: det blir lättare att platta bakteriella kolonier som är mer mucoid/amorft. För mer stela/solida kolonier, Undvik att lämna synliga kluster av cellmassan på MALDI spot (figur 1).
Figur 1: MALDI-måltavla som visar två olika isolat innan du lägger till myrsyra och MALDI Matrix (topp 3 fläckar- Bacillus SP.; botten 3 fläckar- Streptomyces SP.). För båda representerar kolumn 3 överflödigt prov; kolumn 2 representerar lämplig mängd prov. kolumn 1 representerar otillräckligt prov för MALDI-analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förbered en matris/Media kontroll genom att använda en steril tandpetare för att överföra en minimal mängd av agar/media på lämplig plats (er) på MALDI plattan.
- Överlagra 1 μL 70% masspektrometri grad myrsyra på varje provplats, inklusive Matrix kontroll fläckar. Låt syra lufttorka helt i en kemisk draghuv (ca 5 min).
FÖRSIKTIGHET: myrsyra är en kaustik kemisk och bör hanteras i kemiska rök kåpor. Det kan skada luftvägarna vid inandning. - Tillsätt 1 μL av den beredda MALDI Matrix-lösningen till varje provplats, samt till Matrix/Media Control fläckar. Låt Matrix-lösningen lufttorka helt (ca 5 min).
Obs: det är möjligt att förvara plattan i en exsickator, i mörker, tills den kan analyseras på en MALDI-TOF-masspektrometer. Tillåtna lagringstider kan variera beroende på prov stabiliteten. - Tillsätt 0,5 – 1,0 μL kalibrant till de tilldelade kalibrerings fläckarna, följt av 1 μL MALDI Matrix-lösning. Pipettera den resulterande lösningen uppåt och nedåt för att blanda. Låt alla fläckar lufttorka helt innan de förs in i MALDI-TOF-masspektrometern.
Anmärkning: den protein och specialiserade metabolit kalibranter bör tillsättas inom 30 min av MALDI analys, eftersom båda är mottagliga för nedbrytning.
3. data insamling
Obs: de allmänna parametrarna för datainsamling listas i tabell 1.
| Parametern | Protein | Specialiserad metabolit |
| Masstart (da) | 1920 | 60 |
| Massan (da) | 21000 | 2700 |
| Mass avböjning (da) | 1900 | 50 |
| Skott | 500 | 1000 |
| Frekvens (Hz) | 2000 | 2000 |
| Laser storlek | Stora | Medium |
| MaxStdDev (ppm) | 300 | 30 |
Tabell 1.
- Efter de protokoll som är specifika för det instrument som används, ställa in både protein och specialiserade metabolit kalibreringar.
- Testa några separata mål fläckar för att bestämma optimal lasereffekt och detektor förstärkning att använda när du förvärvar Spectra (detta varierar från dag till dag och efter instrument).
Anm.: figur 2A och figur 3a visar optimala spektra, medan figur 2D och figur 3D är exempel på spektra av dålig kvalitet.
Figur 2: Exempel protein spektra som visar effekten av att modifiera lasereffekt och detektor förstärkning. Spectra kvalitet är bäst i panel A, och minskar tills otillräcklig Spectra kvalitet i paneler C och D. Medan spektrumet i panel B kan resultera i användbara toppar, visar panel A optimala data. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Exempel specialiserade metabolit spektra som visar effekten av att modifiera lasereffekt och detektor förstärkning. Spectra kvalitet är bäst i panel A och minskar tills otillräcklig Spectra kvalitet i paneler C och D. Medan spektrumet i panel B kan resultera i användbara toppar, visar panel A optimala data. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förvärva Spectra, spara protein Spectra i en mapp och specialiserade metaboliten Spectra i en andra, separat mapp.
4. rengöring av MALDI-målplattan (anpassad från Sauer et al.7)
- Ta bort MALDI-målplattan från hållaren och skölj med aceton.
- Tvätta med en icke-slipande flytande tvål för att ta bort spår proteiner och lipider, och mjukpapper våtservetter/Soft-bristled tandborste.
- Skölj med avjoniserat vatten i ca 2 min för att helt ta bort tvål.
- Sonikera mål plattan i vatten (HPLC-kvalitet eller högre) i 5 min.
- Skölj mål plattan med vatten (HPLC-kvalitet eller högre).
- Skölj mål plattan med metanol (HPLC-kvalitet eller högre).
5. Installera IDBac programvara
- Ladda ner IDBac programvara.
Obs: permanenta, ny version säkerhetskopior finns också tillgängliga för nedladdning (se tabell över material). - Dubbelklicka på den hämtade "Install_IDBac. exe" för att initiera installationsprogrammet och följ instruktionerna på skärmen.
6. börja med rå data
Obs: detaljerade förklaringar och instruktioner för varje databehandling steg är inbäddade i IDBac, men de viktigaste analyserna och interaktiva ingångar beskrivs nedan.
- Dubbelklicka på genvägen till IDBac Desktop för att starta IDBac. IDBac öppnas på fliken Introduktion som standard.
- Använd knappen Sök efter uppdateringar för att se till att den senaste versionen av idbac används (kräver Internetåtkomst). Om en nyare version är tillgänglig, kommer IDBac automatiskt ladda ner och installera uppdateringen, varefter IDBac kommer att begära att startas om.
- Klick på det startande med rå datan tab och välja från menyn typen av datan till vara Använd med idbac; Fortsätt genom att följa instruktionerna i appen.
- När du konfigurerar konvertering och bearbetning av datafiler, ange ett beskrivande namn för experimentet där det behövs (se figur 4). Experiment kommer senare att visas alfabetiskt, så en användbar strategi är att starta experiment namn med ett grupp-attribut (t. ex., "Bacillus-trials_experiment-1"; "Bacillus-trials_experiment-2").
Figur 4: IDBac data konvertering och förbehandling steg. IDBac omvandlar RAW-spektra till det öppna mzML-formatet och lagrar mzML, topplistor och exempel information i en databas för varje experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. arbeta med tidigare experiment
- Efter att konvertera filer och bearbeta dem med IDBac, eller när som helst man vill omanalysera ett experiment, navigera till arbetet med tidigare experiment sidan och Välj ett experiment att arbeta med (figur 5).
Figur 5: sidan "arbeta med tidigare experiment". Använd IDBac: s "arbeta med tidigare experiment" sidan för att välja ett experiment för att analysera eller ändra. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Valfritt Lägg till information om exempel med hjälp av menyn Klicka här om du vill ändra det valda experimentet. Mata in information i det automatiskt ifyllda kalkylarket och tryck på Spara (bild 6). Med det här alternativet kan användaren färgkoda data under analyser.
Bild 6: ange exempel information. I sidan "arbeta med tidigare experiment" kan användare mata in information om exempel på taxonomisk identitet, insamlingsplats, isolerings villkor etc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Valfritt Överför alla eller en delmängd av exemplen till ett nytt eller annat experiment genom att klicka på överför prover från tidigare experiment till nya/andra experiment och följa de medföljande instruktionerna (figur 7).
Figur 7: överför data. Sidan "arbeta med tidigare experiment" innehåller alternativet att överföra data mellan befintliga experiment och nya experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- När du är klar att påbörja analysen kontrollerar du att experimentet fungerar med är markerat. Välj antingen protein dataanalys eller liten molekyl dataanalys.
8. ställa in protein dataanalys och skapa spegel tomter
- Om du analyserar protein data, först navigera till protein dataanalys sidan. Välj Peak-picking inställningar och utvärdera proteinspektra av prover via de visade spegel tomterna (figur 8).
Obs: i spegeln tomter, betecknar en röd topp närvaron av denna topp endast i det övre spektrumet, medan blå toppar representerar de som förekommer i båda spektra.
Figur 8: Välj hur toppar behålls för analys. Efter att ha valt ett experiment för att analysera, besöka "protein data analys" sidan och därefter öppna "Välj hur toppar bevaras för analys" menyn tillåter användare att välja inställningar som signal-brus-förhållande för att behålla toppar. Den visade speglings tomten (eller dendrogram) uppdateras automatiskt för att återspegla de valda inställningarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Justera procentandelen av replikat där en topp måste finnas för att den ska inkluderas för analyser (t. ex. om tröskelvärdet är inställt på 70% och en topp inträffar i minst 7 av 10 replikat, kommer den att inkluderas).
- Använda spegeln tomter som visuell vägledning, justera signalen till brus cutoff som behåller de mest "äkta" toppar och minst brus, notera att fler replikat och en högre "procentsats Peak Presence" värde kommer att tillåta val av en lägre signal till brus cutoff.
- Ange de nedre och övre m/z- cutoffs, diktera intervallet av Massavärden inom varje spektrum som ska användas i ytterligare analyser av idbac.
9. klustring prover med protein data
- På sidan protein data analys väljer du fliken dendrogram . Detta gör det möjligt att gruppera prover i ett dendrogram enligt användarvalda avståndsmått och klusteralgoritmer.
- Klicka på Välj exempel på menyn och följ anvisningarna för att välja exempel som ska inkluderas i analyserna. Endast prover som innehåller protein spektra kommer att visas i rutan tillgängliga prover (figur 9).
Figur 9: Välj prover från det valda experimentet som ska inkluderas i det visade dendrogrammet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Använd standardvärdena eller Välj önskade avstånds -och klusteralgoritmer som ska användas för generering av Dendrogram under Välj kluster inställningar.
- Välj närvaro/frånvaro som indata. Alternativt, om du är säker på de högsta höjderna av proverna (t. ex. efter att ha utfört en studie för att bedöma variabilitet av toppintensitet), Välj intensiteter som indata.
Obs: vid tidpunkten för publiceringen, IDBac ger flexibilitet i inställningar för kluster, förlitar sig på användare att välja lämpliga kombinationer. Om du inte är bekant med dessa alternativ, föreslås det att para antingen A: "Cosine" avstånd, och "Average (UPGMA)" klustring; eller B: "Euclidean" avstånd, och "Ward. D2" klustring. - För att Visa bootstrap värden på dendrogram, ange ett nummer mellan 2 och 1000 under Bootstraps.
- När du rapporterar resultat kopierar du texten i stycket förslag för rapportering av protein analys . Detta ger de användardefinierade inställningar som genererade det specifika dendrogram.
10. anpassa proteinet dendrogram
- För att börja anpassa dendrogram, öppna menyn Justera dendrogram (Bild 10).
Figur 10: Justera dendrogram. IDBac ger några alternativ för att ändra hur dendrogram ser ut, kan dessa hittas i menyn "justera Dendrogram". Detta inkluderar färgning grenar och etiketter av k-medel, eller genom att "skära" den dendrogram på en User-förutsatt höjd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- För att färga dendrograms linjer och/eller etiketter Välj lämplig knapp: Klicka för att ändra rader eller Klicka för att ändra etiketter och välj önskade alternativ.
- Om du vill rita information från kalkylbladet bredvid dendrogram (se steg 7,2) väljer du knappen införliva information om exempel. Då öppnas en panel där en kategori (kolumn i kalkylbladet) självbefolkar baserat på de inmatade värdena (figur 11).
Figur 11: infoga information om exempel. I "justera Dendrogram" menyn är alternativet "införliva info om prover". Om du väljer det här kan du plotta information om prover bredvid dendrogram. Exempel information matas in i sidan "arbeta med tidigare experiment". Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
11. sätt in prover från ett separat experiment i dendrogram
- Om du vill infoga exempel från ett annat experiment väljer du menyknappen Infoga exempel från ett annat experiment. Följ anvisningarna i den nyligen öppnade panelen (figur 12).
Figur 12: Infoga prover från en annan experiment meny. Ibland är det bra att jämföra prover från ett annat experiment. Använd menyn "Infoga prov från ett annat experiment" för att välja vilka prover som ska inkluderas i det aktuella dendrogram som visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
12. analysera specialiserade metabolit data och metaboliska Associations nätverk (MANs)
- Gå vidare till sidan för metabolitens Associations nätverk (liten molekyl) . Denna sida möjliggör datavisualisering av princip komponenter analys (PCA) och MANs, som använder tvåpartsnätverk för att Visa sambandet mellan små molekyl m/z -värden med prover.
- Om ett protein dendrogram skapades (avsnitt 9), kommer det att visas på denna sida också. Klicka och dra på dendrogram för att markera utvalda prover av intresse som ska analyseras. Om inga Prover är markerade eller inget protein dendrogram skapades, en MAN av en antingen en slumpmässig delmängd eller alla prover kommer att visas, respektfullt (figur 13).
Figur 13: sidan för analys av små molekyl data. Om ett dendrogram skapades från protein Spectra, kommer det att visas på sidan "små molekyl data analys". Denna sida kommer också att Visa metaboliten associera nätverk (MANs) och princip komponenter analys (PCA) för små molekyl data. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- För att subtrahera en matris/ett medium tomt i mannen, öppna menyn Välj ett exempel för att subtrahera och välj lämpligt prov att använda som en tom.
- Öppna menyn Visa/Dölj man-inställningar för att välja önskade värden för procent av topp närvaro i replikat, signal till brus och övre och undre Mass cutoffs, vilket gjordes för protein spektra i avsnitt 9. Använd den lilla molekylen spegel tomter för att vägleda valet av dessa inställningar.
- Välj "hämta aktuella nätverksdata" för att spara data för den MAN som för närvarande visas. Dessa data kan användas i andra nätverksanalys program än IDBac.
- Om du vill rapportera resultat kopierar du texten i stycket förslag för rapportering av man-analys . Detta ger de användardefinierade inställningar som används för att generera den skapade mannen.
13. dela data
- Varje IDBac "experiment" sparas som en enda SQLite databas. Den innehåller de konverterade mzML RAW-spektrat, upptäckta toppar och all användar inmatningsinformation om samplingar. Därför att dela en IDBac experiment helt enkelt dela SQlite-filen som har samma namn som experimentet (filens plats visas på arbeta med tidigare experiment sida).
Representative Results
Vi analyserade sex stammar av Micromonospora chokoriensis och två stammar av Bacillus subtilis, som tidigare karakteriserades6, med hjälp av data som finns på Doi: 10.5281/zenodo. 2574096. Följande riktningar i början med RAW-data fliken, vi valde alternativet Klicka här för att konvertera Bruker filer och följde idbac-förutsatt instruktioner för varje dataset (figur 14).
Efter automatiserad omvandling och förbehandling/Peak-Peaking steg slutfördes, vi fortsatte att skapa en ny kombinerad IDBac experiment genom att överföra prover från de två experimenten till ett enda experiment som innehåller både Bacillus och Prover från micromonosopora (figur 15). Den resulterande analysen innebar att man jämförde protein spektra med spegel tomter, som bilden i figur 16, vilket var användbart för att utvärdera spektra kvalitet och justera inställningar för topp plockning. Figur 17 visar en skärmbild av resultaten av proteinklustring med standardinställningarna valda. Den dendrogram färgas genom att justera tröskeln på tomten (visas som en prickad linje). Notera är den tydliga separationen mellan släkten, med både M. chokoriensis och B. subtilis isolat klustring separat.
Figur 18, figur 19, och figur 20 Markera förmågan att generera mans av användarvalda regioner genom att klicka och dra över proteinet dendrogram. Med detta kunde vi snabbt skapa MANs att jämföra endast B. subtilis stammar (figur 18), endast M. chokoriensis stammar (figur 19), och alla stammar samtidigt (figur 20). Den primära funktionen hos dessa nätverk är att ge forskarna en bred överblick av graden av specialiserad metabolit överlappning mellan bakterier. Med dessa data i handen, har forskarna nu kapacitet att fatta välgrundade beslut från endast en liten mängd material skrapats från en bakteriell koloni.
Figur 14: Spectra-bearbetning. Hämtade Bruker autoFlex Spectra konverterades och bearbetades med hjälp av IDBac. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 15: kombinerat IDBac-experiment. Eftersom Micromonospora och Bacillus Spectra samlades på olika MALDI mål plattor, var de två experiment därefter kombineras till ett enda experiment-"Bacillus_Micromonsopora". Detta gjordes inom "arbeta med tidigare experiment" fliken, följande riktningar i menyn "överföra prover från tidigare experiment till nya/andra experiment". Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 16: jämförelse. Micromonspora och Bacillus Spectra jämfördes med spegeln tomter inom "protein data analys" sida. I slutändan valdes förvalda topp inställningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 17: hierarkisk klustring. Hierarkisk klustring, med standardinställningarna, korrekt grupperade Bacillus och Micromonospora isolat. Den dendrogram var färgad av "skära" den dendrogram på en godtycklig höjd (visas som en streckad linje) och 100 Bootstraps används för att visa förtroende för förgrening. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 18: man som skapats genom att välja Bacillus SP. stammar från proteinet dendrogram visade differentiell produktion av specialiserade metaboliter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 19: man som skapats genom att välja de sex Micromonospora SP. stammar från proteinet dendrogram visade differentiell produktion av specialiserade metaboliter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 20: man av Bacillus SP. och Micromonospora SP. stammar som visar en differentiell produktion av specialiserade metaboliter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den IDBac protokoll Detaljer bakteriella protein och specialiserade metabolit datainsamling och analys av upp till 384 bakteriella isolat i 4 h av en enda forskare. Med IDBac finns det ingen anledning att extrahera DNA från bakteriella isolat eller generera specialiserade metabolitextrakt från flytande fermenterings buljonger och analysera dem med hjälp av kromatografiska metoder. Istället, protein och specialiserade metabolit data samlas genom att helt enkelt sprida material från bakteriella kolonier direkt på en MALDI måltavla. Detta minskar kraftigt tiden och kostnaden i samband med alternativa tekniker såsom 16S rRNA Gene sekvensering och LCMS9.
Det är viktigt att lägga till en matris blank och kalibreringspunkter till MALDI plattan, och vi rekommenderar att du använder ett lämpligt antal replikat för att säkerställa reproducerbarhet och statistiskt förtroende. Antalet replikat kommer att vara experiment beroende. Till exempel, om en användare avser att skilja tusentals kolonier från en samling av miljö mångfald plattor, kan färre replikat vara nödvändigt (vårt labb samlar in tre tekniska replikat per koloni). Alternativt, om en användare vill skapa en anpassad databas av stammar från specifika bakteriella taxa för att snabbt fastställa underarter klassificeringar av okända isolat, då fler replikat är lämpliga (vårt labb samlar in åtta biologiska replikat per stam).
IDBac är ett verktyg för att snabbt differentiera mycket relaterade bakteriella isolat baserat på förmodade taxonomisk information och specialiserad metabolit produktion. Det kan komplettera eller fungera som en föregångare till ortogonala metoder såsom djupgående genetiska analyser, studier med metabolit produktion och funktion, eller karakterisering av specialiserad metabolit struktur med kärnmagnetisk resonans-spektroskopi och/eller LC-MS/MS.
Specialiserade metabolitproduktion (IDBac MANs) är mycket mottagliga för bakterietillväxt villkor, särskilt med hjälp av olika medier, vilket är en potentiell begränsning av metoden. Men dessa egenskaper kan utnyttjas av användaren, som IDBac kan lätt generera MANs visar skillnaderna i specialiserade metabolit produktion under en mängd olika tillväxtförhållanden. Det är viktigt att notera att medan specialiserade metabolit fingeravtryck kan variera beroende på tillväxt, har vi tidigare visat att protein fingeravtryck förblir relativt stabila över dessa variabler (se Clark et al.6). När man arbetar med miljö mångfald plattor, rekommenderar vi rening av bakteriella isolat före analys för att minska eventuella bidrag från angränsande bakteriell Cross-Talk.
Slutligen, avsaknaden av en sökbar offentlig databas med protein MS fingeravtryck är en stor brist i användningen av denna metod för att klassificera okända miljö bakterier. Vi skapade idbac med detta i åtanke, och inkluderade automatiserad omvandling av data till ett community-accepterat Open-Source format (mzml)10,11,12 och utformat programvaran för att möjliggöra sökning, delning och skapandet av anpassade databaser. Vi håller på att skapa en stor offentlig databas (> 10000 fullt karakteriserade stammar), som kommer att möjliggöra klassificering av vissa isolat på Art-nivå, inklusive länkar till GenBank anslutningsnummer när de är tillgängliga.
IDBac är öppen källkod och koden är tillgänglig för alla att anpassa sina dataanalys och visualisering behov. Vi rekommenderar att användare konsultera en omfattande litteratur (Sauer et al.7, Silva et al.5) för att hjälpa till att stödja och utforma sina experimentella mål. Vi är värd för ett diskussionsforum på: https://groups.Google.com/forum/#!forum/idbac och ett sätt att rapportera problem med programvaran på: https://github.com/chasemc/IDBacApp/Issues.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av nationella institutet för allmän medicinsk vetenskap Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Isländska forskningsfonden Grant 152336-051; och University of Illinois at Chicago Startup Funds. Dessutom tackar vi följande bidragsgivare: Dr Amanda Bulman för hjälp med MALDI-TOF MS protein förvärvs parametrar; Dr Terry Moore och Dr Atul Jain för recrystallizing alfa-cyano-4-hydroxycinnamic Acid Matrix (CHCA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher | 60-002-65 | LC-MS Ultra CHROMASOLV |
| Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
| Bruker Daltonics Bacterial test standard | Fisher | NC0884024 | Bruker Daltonics 8604530 |
| Bruker Peptide Calibration standard | Fisher | NC9846988 | Bruker Daltonics 8206195 |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | 99.5+%, Optima LC/MS Grade |
| MALDI-TOF target Plate | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemical | A456-500 | Optima LC/MS Grade |
| Toothpicks | any is ok | ||
| Trifluoroacetic acid | Fisher | AC293810010 | 99.5%, for biochemistry, ACROS Organics |
| Water | VWR | 7732-18-5 | LC-MS |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | (C2020-25G) ≥98% (TLC), powder |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).
- Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).
- Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists. Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).
- Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis. Planta Medica. 82, 671-689 (2016).
- Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).
- Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., Böttger, E. C., Hombach, M. Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).
- Schumann, P., Maier, T. MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria. Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).
- Chambers, M. C., Maclean, B., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).
- Martens, L., Chambers, M., et al. mzML-a community standard for mass spectrometry data. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).
