Summary
该协议描述了体内和体外方法,以完全可视化和表征透明血管,小鼠眼睛血管回归的模型,使用光学相干断层扫描和荧光素血管造影进行活成像和外体成像隔离和随后的透明质的扁平安装,用于定量分析。
Abstract
在眼睛中,胚胎透明体血管滋养发育的透镜和视网膜,并在视网膜血管发育时退步。在持续性超塑性原发性性性性(PHPV)等疾病中,可看到透明体血管的持续或失败回归,导致光道受阻和视觉功能受损。了解透明体血管回归背后的机制可能导致对血管回归过程的新分子见解,以及利用持久性透明血管管理疾病的潜在新方法。在这里,我们描述了用光学相干断层扫描(OCT)和荧光素血管造影(FFA)对活小鼠的透明质成像程序,以及用于定量分析的隔离和扁平安装透明质外体的详细技术方案。低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)敲除小鼠被用作持久性透明质血管的实验模型,以说明该技术。总之,这些技术可促进对透明体血管进行彻底评估,作为血管回归的实验模型,并研究持久性透明血管的机理。
Introduction
眼睛的血液供应对于确保视网膜和周围眼部组织的正常发育以及适当的视觉功能至关重要。眼睛有三个血管病床:视网膜血管、丘风和透明血管的瞬态胚胎循环网络。眼血管的发展需要整个胚胎生成和组织成熟的空间和时间协调。在三个血管病床上,透明血管是第一个功能性的血液供应系统,为新形成的胚胎透镜和发育的视网膜提供营养和氧气。透明体血管在视网膜血管发育和成熟的同时退步1。透明血管的回归对于为视觉功能的发展提供清晰的视觉途径至关重要;因此,这种血管回归过程与视网膜血管的生长一样重要。受损的透明体回归可能导致眼睛疾病。此外,透明体血管的回归提供了一个模型系统,以研究血管回归调节所涉及的细胞和分子机制,这可能对其他器官的血管生成调节产生影响。
从透明动脉 (HA) 衍生的透明血管,由瓦萨 hyaloidea 扩张 (VHP)、 图尼卡血管纤维素 (TVL) 和阴孔膜 (PM) 组成。它在胚胎发育期间为发育的视网膜、原发性视网膜和透镜提供营养。VHP 从 HA 产生,通过透镜前向镜头分支。TVL 将透镜胶囊的后表面和麻醉剂与PM连接在一起,并连接到前动脉,覆盖透镜2、3的前表面,从而在PM形成血管网络3,4,5.有趣的是,在透明血管中没有静脉,系统利用胆囊静脉来完成静脉排水。
在人类胚胎中,在妊娠第九周时,透明血管几乎完成,并在妊娠2的第四个月出现第一视网膜血管时开始退步。从 VHP 萎缩开始,TVL、PM 的毛细管网络回归,最后,HA 随后出现2、3 。同时,原发性葡萄缩回和次生性葡萄开始形成,由细胞外基质成分组成,包括胶原纤维。到妊娠第六个月,原发性葡萄球体被简化为一条从视神经盘延伸到透镜的小透明管道,称为Cloquet的运河或透明管,次生性乙光成为后段的主要组成部分2,3.透明环流大多在妊娠35至36周消失,就在出生3周前。
与人类不同,在出生时,透明血管完全倒退,小鼠透明血管系统在出生后开始回归。由于小鼠视网膜出生时血管和视网膜在产后发育,透明血管从产后(P)4同时退步,并且大多完全由P216(图1)退位。PM首先在P10和P12之间消失,VHP在P12和P16之间消失,而少量的TVL和HA细胞甚至停留在P16,而到P21,透明血管系统回归几乎完成6。同时,视网膜血管在出生后开始发展。血管丛的表面层完全延伸到P7~P8处的外周视网膜,深层层(位于外层丛形层)从P7~P12发展,最后,内丛层中的中间丛在P12和P15 7之间发展.随着视网膜血管的发展,它逐渐取代伴随回退的透明血管的功能,为发育的眼睛提供营养和氧气。小鼠的产后透明血管回归为观察和研究透明血管血管的实验性模型提供了一个易于获取的实验模型,以及控制生理和血管回归过程的分子基础。病理条件8.
透明体回归的失败可以在诸如PHPV等疾病中看到,PHPV是一种罕见的先天性发育异常,由胚胎、原发性性视网膜和透明质血管衰竭的失败或不完全回归导致眼睛的先天性发育异常。调节透明血管回归过程的机制复杂,研究广泛。对透明体血管正常回归至关重要的一个主要分子通路是Wnt信号通路10,因为影响Wnt配体和受体的这个途径的基因突变与人类的PHPV9有关。实验研究鉴定了一种Wnt配体,Wnt7b,这是由发育眼部的透明血管周围的巨噬细胞产生的,以调解这种回归过程。Wnt7b激活Wnt信号,通过结合在相邻的内皮细胞中卷曲4(FZD4)/LRP5的受体,启动细胞凋亡,导致透明血管10的回归。结果,Wnt7b缺乏的小鼠表现出持续性透明血管10。同样,一种非常规的Wnt配体,Norrin(由Ndp基因编码),也与FZD4/LRP5结合,在发育过程中诱导透明体血管回归。Ndpy/-, Lrp5---和Fzd4-/-小鼠都显示延迟的透明血管回归, 支持 Wnt 信号11、12的临界调节作用, 13,14,15,16.此外,另一个Wnt受体LRP6与LRP5在其功能调节在透明体血管内皮细胞的Wnt信号通路17。可能也导致透明质回归的其他因素包括缺氧诱导因子18,19,血管内皮生长因子20,21,胶原蛋白-18-22, 23,Arf24,血管蛋白-225,和骨形态遗传蛋白-426。在本文中,我们使用Lrp5-/-小鼠作为持久性透明血管的模型,通过体内和体外方法来演示评估和描述透明体血管的技术。
体内和体外透明血管的可视化对于研究透明血管回归机制至关重要。目前观察透明血管的方法主要侧重于通过OCT和FFA图像、眼横截面和透明体平安装来可视化和分析VHP和HA。OCT 和 FFA 是强大的体内成像工具,允许在活体动物睁开眼睛后进行纵向观察。此外,孤立的透明体扁平安装提供了整个透明血管的可视化,并实现了容器数的精确量化。然而,透明血管的微妙和脆弱性质及其隔离造成的技术困难,可能限制了它在眼科研究中的使用。在本文中,我们提供了一个详细的方案,以显着血管的可视化,结合体内活体视网膜成像和前体分离的透明体平装,以提高这些技术的可行性。该协议已经适应了修改和扩展,从以前的出版物的活体基底和OCT成像28和分离的透明质平装11的体外方法的体内方法。
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Protocol
所有动物都按照美国国家卫生研究院的《眼科和视觉研究协会(ARVO)关于在眼科和视觉研究中使用动物进行动物实验的声明》进行治疗(NIH)关于照料和使用动物进行实验程序以及波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会(IACUC)制定的法规。Lrp5-/-小鼠(库存号005823;杰克逊实验室)及其野生型(WT)控制C57BL/6J小鼠(库存号000664;杰克逊实验室)用于这项研究。
1. 第一部分:使用啮齿动物视网膜成像系统对透明体血管进行体内成像
- 小鼠麻醉和学生扩张的准备
- 选择鼠标。
- 使用早于P12的小鼠(在睁开眼睛后)进行视网膜成像;两性都合适。
- 根据需要,图像突变小鼠与延迟的透明质回归(及其WT控制)在整个成年。超过3周的WT小鼠可能不会表现出太多可检测到的剩余透明体血管,因此P12_P21是成像保持可见WT透明体的理想选择。
- 准备氯胺酮/西拉津混合物进行麻醉。
- 服用2.3 mL的氯胺酮原料溶液(100毫克/升)和0.7 mL的木拉津库存溶液(20毫克/mL),加入20 mL无菌盐碱(0.9%氯化钠),制成氯胺酮/西气胺混合物(10毫克/mL氯胺酮和0.6毫克/mL基辛)的工作溶液。
- 通过腹内注射氯胺酮/木氨酸混合物,以小鼠体重的8倍体积麻醉小鼠(例如,20克小鼠需要160μL的氯胺酮/木氨酸工作溶液混合物,以达到氯胺酮[80毫克/千克体重]的工作剂量,木兰素 [4.8 毫克/千克体重] 混合物)。
- 在每只眼睛上涂抹一滴学生扩张药物溶液(见材料表),在麻醉后立即扩张小鼠的小学生。
- 通过踏板反射(坚定的后肢脚趾捏合)评估麻醉水平。等到鼠标充分麻醉(无踏板反射),其学生被广泛扩张。
- 选择鼠标。
- 透明血管的光学相干断层成像
- 用人工眼泪滋润老鼠的角膜,然后将鼠标放在定位台上。
- 用 OCT 探头的镜头轻轻接触鼠标的角膜。调整鼠标和探头,使视神经头位于基图图像中视场的中心,以指导OCT成像。
注:有关啮齿动物视网膜成像系统的一般设置(见材料表)和调整鼠标位置的更多细节,请参阅Gong等人28。 - 调整对焦以实现 OCT 的最佳图像。
- 调整OCT成像软件中指示线的角度(见材料表),以显示持久的透明血管,然后拍摄图像。
- 传真乌杜斯f卢鲁塞辛a恩格图透明血管成像
- 制备荧光酸溶液:在1 mL的荧光酸溶液中加入9 mL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)(库存浓度:100 mg/mL)。最终工作溶液的浓度为10mg/mL。
- 腹内注射荧光团工作溶液(5 μL/g体重)。
- 用人工眼泪滋润小鼠的角膜,然后将鼠标放在定位台上。
- 将 Micron IV 视网膜成像显微镜的透镜放置,以便与小鼠角膜直接接触。稍微调整对齐方式,将视神经头定位到视场中心。
- 将显微镜滤镜更改为绿色荧光通道。
- 专注于持续性透明血管拍摄图像。
- 注射后 1 分钟、3 分钟、5 分钟和 10 分钟(不超过 10 分钟)拍摄多张图像,以确定观察透明血管的最佳时间点(信与背景比)。在 10 分钟内完成 FFA 程序,之后荧光可能变得过于扩散,使容器不可见。
- 小鼠麻醉的恢复
- 手术后,将小鼠放在温暖的加热垫上。
- 等待,直到小鼠再次移动,将它们返回到鼠标笼。
2. 第二部分:透明血管的外体可视化
- 固定鼠标眼的准备
- 选择适龄小鼠。
注:新生儿小鼠通常在P8牺牲用于子宫体解剖。两性都合适。具有延迟性透明质回归(及其各自的 WT 对照)的突变小鼠可以在整个成年期间进行解剖和分析。 - 通过接触CO2使小鼠安乐死。
- 通过钝切除使老鼠的眼睛精闭。
- 用显微手术钳将眼睑张开,以便进入眼球。在轨道上将弯曲的显微外科钳放在地球下,以抓住视神经,而不会挤压眼球。用钳子轻轻拉取眼球并取下眼球。
- 或者,使用显微外科剪刀解剖眼球,从四面到轨道后,小心地切割平行于地球,并将地球与周围的连接组织分离。
- 在室温下将眼睛浸入4%的甲醛中,在室温下进行30分钟的固定。
- 将固定眼球转移到冰冷的 PBS 缓冲液中。
注:眼球可在4°C下储存在PBS中长达1周。
- 选择适龄小鼠。
- 使用明胶注射嵌入透明血管
- 准备 5% (w/v) 明胶溶液。
- 称量50毫克明胶。
- 将明胶溶解在1 mL的蒸馏水中。
- 在37°C水浴中孵育明胶溶液,直到完全溶解。将溶液保存在37°C水中,直到使用。
注:可以制备大批量溶液,并将其储存在4°C作为等分。每次使用前,溶液都需要在37°C水浴中加热,以实现清晰的一致性。
- 在解剖显微镜下,将50μL的明胶溶液注射到边缘部位的葡萄体中;在不同的部位重复注射3次,共进行4次注射,在边缘均匀地间隔(图2A)。
- 在 4°C 冰箱或冰上孵育眼球 30 分钟,在葡萄球空间内凝固注射的明胶。
- 准备 5% (w/v) 明胶溶液。
- 子宫内科血管的解剖和隔离
注:参见图2B-E。- 将眼球放入含有PBS的培养皿中,防止组织干燥。用显微手术剪刀在边缘切开,并切除角膜。
- 剪下并取下视神经。
- 在解剖显微镜下,使用两对钳子剥离并丢弃骨质、毛素和视网膜色素上皮 (RPE) 层,并去除虹膜。
- 随着视网膜的视神经侧朝上,镜头侧朝下,在视网膜杯下方注入 50 μL 的 PBS,以便在明胶化的视性身体和视网膜之间积累 PBS 缓冲液。
- 用显微手术钳轻轻剥离并去除视网膜杯和纤毛体。
- 使用转移移液器,将含有浸没在PBS中的透明质组织的明胶杯转移到显微镜幻灯片上
- 将组织的其余部分(镜头/透明体)转动,使镜头侧朝上。
- 抬起镜头并轻轻松开镜头/TVL 和 VHP 之间的连接,然后用显微手术剪刀切割 HA 以移除镜头-TVL。将透明杯的 VHP 部分保留为扁平安装。
- 透明血管的扁平安装和染色
- 用 PBS 在幻灯片上轻轻冲洗透明杯,以清除所有解剖碎屑。
- 确保透明杯漂浮在幻灯片上,以适当的 PBS 溶液。
- 用显微手术钳轻轻排列和调整明胶透明质杯的位置,杯的边缘朝下滑动,在熔化后达到最佳外观。
- 将浸入 PBS 中的透明质杯的滑片放在 37°C 的滑道加热器上,等待明胶融化和透明质变平,并在几乎干燥时取出滑轨(不要过度干燥)。
- (可选)免疫染色透明体血管
- 使阻塞和穿透缓冲器(例如,5%牛血清白蛋白[BSA]和0.1%Triton X-100在PBS缓冲液中)。将50 μL的阻塞缓冲液加入平装的透明体隔离,并在室温下孵育30分钟。
- 将50μL的原发抗体(例如CD31)(1:100稀释阻塞缓冲液)涂在透明质隔离的平坦安装上,然后在4°C的湿箱中孵育。
- 用PBS轻轻冲洗3次,每次5分钟。
- 将50μL的二级抗体(例如山羊抗兔子二级抗体-Alexa 488,1:100稀释)涂在透明质平安装上,并在室温下孵育1小时。
- 用PBS轻轻冲洗3次,每次5分钟。
- 加入一滴防褪色安装介质,用DAPI(4',6-二酰胺-2-phenylindole)染色透明体血管的核。
- 轻轻地将盖玻片放在透明体上,以完成扁平安装。
- 平装透明血管的成像和定量
- 用荧光显微镜成像透明体血管的DAPI染色,并确保中央HA是可见的(不包括没有HA的样品)。
- 识别直接源自 HA 的船舶分支,并手动计算要量化的容器分支的数量。
- 眼睛横截面的透明血管可视化
- 将固定眼球嵌入到合适的组织模具中的最佳切割温度化合物中,然后,将嵌入的眼睛冷冻在干冰上,或将其储存在-20°C冰柜中。
- 使用低温微托,在-20°C下将嵌入眼睛的横截面变成厚度为12微米的部分。
- 通过轻轻触摸组织部分,将眼睛横截面收集到显微镜滑动室温上,组织部分将粘附在幻灯片上。
- 空气干燥脱水组织部分约30分钟,然后可以储存在-20°C冰柜中,直到准备染色。
- 用 PBS 冲洗幻灯片 1x 以去除幻灯片上剩余的最佳切削温度化合物。
- (可选)将幻灯片浸入适当的固定缓冲液中(例如,PBS 中的 4% 甲醛),在室温下浸泡 15 分钟,以便根据需要进行额外的固定。
- 在室温下用0.1%Triton X-100在PBS中渗透组织30分钟。
- 准备等分酸-IB4染色缓冲液,用于血管染色。
- 在 50 mL 的离心管中溶解并重组与 50 mL PBS 的同步酸-IB4 (500 μg) 粉末。
- 缓慢地加入50 μL的1M CaCl2溶液,滴入50mL的PBS/等分酸-IB4混合物中。此步骤需要缓慢执行,以避免降水。CaCl2的最终浓度为 1 μM。同色-IB4 染色需要存在 Ca2+。
- 在幻灯片上的眼部横截面上涂抹 30 μL 的等分酸-IB4 染色缓冲液,并在 4°C 的湿箱中孵育过夜。
- 用 PBS 冲洗 3 次,每次 5 分钟。
- 使用 DAPI 添加一滴防褪色安装介质,以染色各部分的原子核。
- 轻轻地在组织部分放置盖玻片,以完成扁平安装。
- 检查显微镜下的组织,以可视化眼罩内是否存在透明血管。
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Representative Results
活小鼠子宫体血管的体内成像
图 3A揭示了 3 个月大的 WT 和Lrp5-/-小鼠(具有持久性透明质动物模型)中视网膜和透明体组织的 OCT 图像的横截面视图。WT 眼睛显示没有透明体组织,而Lrp5-/-眼睛显示两个从视神经头衍生的持久性透明血管。图 3B显示 6 周长Lrp5-/-小鼠在荧光场中持久性透明体血管(绿色)的 FFA 图像。WT小鼠没有显示透明体血管的残留物,Lrp5-/-小鼠显示气囊体在残奥体体内的八个分支。
透明血管的外体可视化
图 4A,B演示了在扁平坐骑中可视化的分离性透明血管,其中血管细胞和相关巨噬细胞被其核与 DAPI 染色(蓝色)染色。HA 位于每个图像的中心,并且透明血管由 DAPI 派生的不连续线显示。每行代表一个 VHP 容器。在Lrp5-/-小鼠中,在平安装的P8观察到较多的剩余透明血管(图4A)。WT小鼠在P8上平均有12个分支的透明体血管,而年龄匹配的Lrp5-/-小狗显示大约25个分支的透明体血管,显示透明体血管的显著受损(图4B. 此外,在Lrp5-/-小狗中也观察到视网膜血管发育迟缓和不完整,这是通常与持久性透明血管相关的另一个特征(图4C,D)。图 5显示了 P8 处Lrp5-/-眼睛的横截面中剩余的透明体血管,而 WT 眼睛不显示透明体血管。
图 1:描述小鼠眼睛中透明血管发育回归的原理图。透明血管和分支,包括VHP、TVL和PM,来自HA,在出生时占据透镜和不成熟视网膜之间的大部分空间(P0)。小鼠的透明质体卷积开始于PM毛细血管的回归,最早早在P4。在 P8、PM、VHP 和 TVL 层不断回归时,与视网膜表面层的完整形成同时发生。到 P12,PM 层的卷积已完成,而 VHP 和 TVL 的萎缩仍在进行中。同时,在P7~P12期间,开始形成一层视网膜血管。到P16,透明体系统的回归部分完成(剩余TVL血管和HA左),视网膜血管丛的中间层继续发展。视网膜血管完全由P21成熟,并接管了从透明血管中滋养视网膜组织的作用,而目前这些血管大多回归。在P21,在无透明血管的情况下,vitrey显示了一个清晰的视觉途径。虚线红线表示回归的容器。VHP = 瓦萨·海洛迪亚普里亚;TVL = 图尼卡瓦曲萨扁豆;PM = 小孔膜;HA = 透明动脉。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2: 描述前体异体血管分离顺序过程的原理图平安装可视化。(A) 通过四个注射点(红点)将明胶注射到胶眼中,以巩固玻璃体。(B) 切除角膜和视神经,仔细解剖虹膜,并剥离角膜-丘质-RPE复合物。(C) 用透镜翻转剩余的视网膜杯,使视网膜面朝上;然后,在视网膜和视网膜体之间注射PBS以分离它们,然后剥离视网膜层。(D) 再次翻转组织的其余部分,包含与周围透明体透镜。稍微抬起镜头以松开 TVL 和 VHP 的连接。(E) 在电视片和 VHP 之间的 HA 切割,以及拆卸镜头和 TVL。扁平安装 VHP 层。VHP = 瓦萨·海洛迪亚普里亚;TVL = 图尼卡瓦曲萨扁豆;PM = 小孔膜;HA = 透明动脉。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:用光学相干断层扫描(OCT)对透明血管进行体内成像和基金荧光血管造影(FFA)。答:代表OCT图像WT和Lrp5-/-小鼠在3个月大显示持久的透明血管在Lrp5-/-眼睛的v光状空间。B: 代表 FFA 图像 WT 和Lrp5-/-小鼠在 6 周大。麻醉后,给小鼠注射1mg荧光素钠,每只小鼠服用0.1ml盐水,注射后5分钟拍摄图像,重点在WT的Lrp5-/-小鼠或vity体中的透明体(无透明体血管)。持久性透明血管在Lrp5-/-,但不是WT眼睛中被可视化。红色箭头表示透明体血管。两个刻度柱: 100 μm (A) 。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4 :Lrp5-/-小鼠延迟性透明血管回归和视网膜血管发育延迟的可视化。(A) 在 WT 中沾染 DAPI(蓝色)的扁平式透明体容器的代表性图像,在 P8 上与Lrp5---眼睛染色。箭头(白色)表示透明动脉。(B) 从WT和Lrp5------眼睛中分枝的透明血管的数量进行量化。(C) 代表扁平安装的视网膜,在 P8 上为 WT 的血管而染上同子素-IB4(红色)的血管。 白色虚线表示视网膜边缘。黄线表示血管化区域边缘。(D) WT 和Lrp5----眼睛表面视网膜血管丛的血管覆盖量的量化。n = 8*12/组。面板A和C = 1 mm 中的刻度条。数据显示为均值 = SEM.双尾学生t测试用于统计分析。•P < 0.01。这个数字是经王等人27许可修改的。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5 :Lrp5-/-眼睛横截面的透明血管可视化。从WT和Lrp5-/-小鼠在P8分离的眼断面的代表性图像。眼睛被植入到最佳切割温度中,并且使用低温切割部分。横截面被染上DAPI(蓝色),以显示核和同子素-IB4(红色)以显示血管。白色箭头表示透明体血管。刻度条 = 500 μm。这个数字是经陈等人16日许可改编的。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
评估和描述透明血管的技术是观察动物模型中的透明血管回归的直观和必要的程序,以便研究发育过程中血管回归背后的机制。虽然体内视网膜成像允许对同一动物的透明体回归进行纵向观察,但获得OCT和FFA的啮齿动物基质成像系统可能是一个限制因素。此外,活小鼠在睁开眼睛之前进行体内成像是不可行的。因此,这种方法不适用于新生儿期眼部发育。另一方面,虽然孤立眼睛的成像横截面可用于小鼠的任何年龄,并且技术障碍较低,但当只有几个可见的透明血管时,它不是定量的,而获得理想图像的机会很大程度上取决于截面角度(图5)。相比之下,为平装可视化而隔离透明血管可以完整成像整个透明体血管并精确定量,但由于透明血管的微妙和脆弱特性,技术挑战可能存在。我们希望本文中详述的协议有助于克服这些挑战。
透明体隔离协议中的几个关键步骤包括注射明胶溶液、去除视网膜和最终扁平安装。处理透明血管的技术难点在于其细腻的性质,几乎液体状的气囊状态,其中透明体血管居住,并与相邻的透镜和视网膜的密切联系。注射明胶溶液在静脉内是巩固含有透明血管的葡萄体的关键,从而使其纹理更牢固,便于解剖和处理。明胶是一种形成透明弹性热逆凝胶的凝胶剂。通过将明胶的液体形式(在室温或37°C)注入葡萄空间并将其冷却至较低温度(4°C),葡萄体转化为更牢固的凝胶杯。对眼睛进行多次明胶注射,使足够量的明胶完全分散到葡萄空间,形成均匀和圆形的明胶透明质组织杯。另一个技术难题是在不损害透明体组织的情况下去除视网膜。与相对容易解剖的丘风样不同,含透明血管的明胶性葡萄球体很难在不损害透明体的情况下与附近的视网膜分离。我们发现,将PBS注入视网膜体和视网膜之间的空间会产生液体缓冲层,使得分离这两个组织变得容易得多。这有点像白内障手术中用于分离胶囊和白内障皮层的水解技术。最后的扁平安装是协议在技术上最困难的最后一步。在滑道加热器上的 PBS 液滴中加热明胶化透明体组织可将其转换回更类似液体的形式,以便更容易的扁平安装。适当的安排和方向的透明凝胶杯仍然是必不可少的,以确保其熔化和干燥后均匀扁平。
分离透明血管的协议可以通过多种方式进一步修改。我们使用的明胶溶液的浓度为 5%,但浓度较高或较低也可能起作用,具体取决于研究人员对处理而言实现更坚固或更柔软的纹理的偏好。细胞核的DAPI染色也可以用异化素IB4或其他内皮细胞或巨噬细胞标记进行修饰,以更好地区分血管内皮细胞和巨噬细胞。警告:平装的透明容器非常细腻,只有松散地粘在滑动上;因此,在染色过程中需要进行染色时,需要非常温和小心地处理透明滑片。这种隔离协议也有其局限性,包括进行精细解剖的复杂性和由于脆弱组织的性质而难以长期保存样品。然而,隔离和平装透明血管仍然是研究透明血管的最全面和最直观的方法,以促进眼和血管生成研究10,17,27 29,30,31.
透明体血管为研究发育血管生长和回归提供了一个极好的实验模型,与眼科、血管生成和程序细胞死亡研究领域相关,本文旨在协助研究这些研究领域。今后对隔离协议的修改可能旨在改进技术解剖程序的可行性。总体而言,在体内结合成像和体外分离的透明血管是一种有利的方法,使小鼠的透明血管充分评估和表征,作为血管回归的有用模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院(NIH)对J.C.Z.W.的助学金(R01 EY024963和EY028100)的支持,并得到了圣殿骑士眼基金会职业启动补助金的支持。本研究中描述的透明体隔离程序,经过修改,修改了理查德·朗博士、东史德·库里哈拉博士和洛伊斯·史密斯博士慷慨分享的协议,作者对此表示感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
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