Summary
Ce protocole décrit les méthodes in vivo et ex vivo pour visualiser et caractériser pleinement les vaisseaux hyaloïdes, un modèle de régression vasculaire dans les yeux de souris, utilisant la tomographie de cohérence optique et l'angiographie de fluorescein de fundus pour l'imagerie en direct et ex vivo l'isolement et la monture plate subséquente de hyaloid pour l'analyse quantitative.
Abstract
Dans l'œil, les vaisseaux hyaloid embryonnaires nourrissent la lentille et la rétine en développement et régressent lorsque les vaisseaux rétiniens se développent. La régression persistante ou échouée des vaisseaux hyaloïdes peut être vue dans des maladies telles que le vitré primaire hyperplastique persistant (PHPV), menant à un chemin de lumière obstrué et à la fonction visuelle altérée. Comprendre les mécanismes sous-jacents à la régression des vaisseaux hyaïdides peut conduire à de nouvelles connaissances moléculaires dans le processus de régression vasculaire et de nouvelles façons potentielles de gérer les maladies avec des vaisseaux hyaloïdes persistants. Ici nous décrivons les procédures pour l'hyaloïde d'imagerie chez les souris vivantes avec la tomographie optique de cohérence (OCT) et l'angiographie de fluorescein de fundus (FFA) et un protocole technique détaillé de l'ex vivo d'hyaloïde isolant et plat-montage pour l'analyse quantitative. Des souris knock-out de protéine 5 (LRP5) liées aux récepteurs de lipoprotéines de faible densité ont été utilisées comme modèle expérimental de vaisseaux hyaloïdes persistants, pour illustrer les techniques. Ensemble, ces techniques peuvent faciliter une évaluation approfondie des vaisseaux hyaloïdes comme modèle expérimental de régression vasculaire et des études sur le mécanisme des vaisseaux hyaloïdes persistants.
Introduction
L'approvisionnement en sang dans l'œil est essentiel pour assurer le développement normal de la rétine et des tissus oculaires environnants et pour équiper une fonction visuelle appropriée. Il y a trois lits vasculaires dans l'oeil : la vascularisation rétinienne, la choroïde, et un réseau circulatoire embryonnaire transitoire des vaisseaux hyaloïdes. Le développement de la vascularisation oculaire nécessite une coordination spatiale et temporelle tout au long de l'embryogenèse et de la maturation des tissus. Parmi les trois lits vasculaires, la vascularisation hyaloïde est le premier système fonctionnel d'approvisionnement en sang à fournir la nutrition et l'oxygène à la lentille embryonnaire nouvellement formée et à la rétine en développement. Les vaisseaux hyaïdis régressent en même temps que les vascularisations de la rétine se développent et mûrissent1. La régression de la vascularisation hyaloïde est essentielle pour permettre une voie visuelle claire pour le développement de la fonction visuelle ; par conséquent, ce processus vasculaire de régression est aussi important que la croissance de la vascularisation rétinienne. La régression hyaloïde altérée peut mener aux maladies d'oeil. En outre, la régression des vaisseaux hyaloïdes fournit un système modèle pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation de la régression vasculaire, qui peut avoir des implications pour la régulation angiogénique dans d'autres organes aussi bien.
La vascularisation hyaloïde, dérivée de l'artère hyaloïde (HA), est composée de vasa hyaloidea propria (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL), et de membrane pupillaire (PM). Il fournit la nourriture à la rétine en développement, le vitré primaire, et la lentille pendant le développement embryonnaire2. En provenance de l'HA, VHP branches antérieurement à travers le vitré à la lentille. Le TVL tasse la surface postérieure de la capsule de lentille, et anastomoses au PM, qui se connecte aux artères ciliaires antérieures, couvrant la surface antérieure de la lentille2,3, résultant en la formation d'un réseau de vaisseaux dans le PM 3 (en) , 4 ( en plus) , 5. Il est intéressant de noter qu'il n'y a pas de veines dans la vascularisation hyaloïde, et le système utilise des veines choroïdes pour accomplir le drainage veineux.
Dans l'embryon humain, la vascularisation hyaloïde est presque terminée vers la neuvième semaine de gestation et commence à régresser lorsque les premiers vaisseaux rétiniens apparaissent, au cours du quatrième mois de gestation2. Commençant par l'atrophie du VHP, la régression des réseaux capillaires de la TVL, le PM, et enfin, l'HA se produit par la suite2,3. Pendant ce temps, les rétractations vitrées primaires et le vitreux secondaire commence à se former, composé des composants de matrice extracellulaire, y compris les fibres de collagène. Au sixième mois de gestation, le vitré primaire est réduit à un petit canal transparent s'étendant du disque nerveux optique à la lentille, appelé le canal du Cloquet ou le canal hyaloïde, et le vitré secondaire devient la composante principale du segment postérieur 2 (en) , 3. La circulation hyaloïde disparaît principalement à 35 à 36 semaines de gestation, juste avant la naissance3.
Contrairement aux humains, chez qui la vascularisation hyaloïde est complètement régressée à la naissance, le système vasculaire hyaloid de souris commence à régresser après la naissance. À mesure que la rétine de la souris naît avasculaire et que les vaisseaux rétiniens se développent postnatals, les vaisseaux hyaïdides régressent simultanément du jour postnatal (P) 4 et sont la plupart du temps complètement régressés par P216 (figure 1). Le PM disparaît d'abord entre P10 et P12, et le VHP disparaît entre P12 et P16, tandis qu'un petit nombre de cellules TVL et HA restent même à P16, et par P21 la régression du système vasculaire hyaloïde est presque terminée6. En attendant, la vascularisation rétinienne commence à se développer après la naissance. La couche superficielle du plexus vasculaire s'étend entièrement à la rétine périphérique à P7-P8, la couche profonde (située dans la couche plexiforme externe) se développe à partir de P7-P12, et enfin, le plexus intermédiaire dans la couche plexiforme interne se développe entre P12 et P157 . Au fur et à mesure que la vascularisation rétinienne se développe, elle remplace progressivement la fonction de la régression concomitante des vaisseaux hyaïdïdes, fournissant de la nutrition et de l'oxygène à l'œil en développement. L'occurrence postnatale de la régression des vaisseaux hyaïdïdes chez la souris fournit un modèle expérimental facilement accessible pour observer et étudier la vascularisation hyaloïde, ainsi que la base moléculaire régissant les processus de régression vasculaire sous physiologique et conditions pathologiques8.
L'échec de la régression hyaloïde peut être vu dans les maladies telles que PHPV, qui est une anomalie congénitale rare développementale de l'oeilrésultant d'une régression échouée ou incomplète de la vascularisation embryologique, primaire vitrée et hyaloïde 9. Les mécanismes régulant le processus de régression de la vascularisation hyaloïde sont compliqués et largement étudiés. Une voie moléculaire majeure essentielle pour la régression normale des vaisseaux hyaïdides est la voie de signalisation Wnt10, comme des mutations génétiques dans cette voie affectant à la fois Wnt ligand et les récepteurs ont été liés à PHPV chez l'homme9. Des études expérimentales ont identifié un Wnt ligand, Wnt7b, qui est produit par des macrophages autour des vaisseaux hyaloïdes dans l'œil en développement pour médiation de ce processus de régression. Wnt7b active la signalisation Wnt en se liant avec les récepteurs frizzled4 (FZD4)/LRP5 dans les cellules endothéliales adjacentes pour initier l'apoptose cellulaire, conduisant à la régression des vaisseaux hyaloïdes10. En conséquence, les souris Wnt7b-déficientes montrent une persistance des vaisseaux hyaloïdes10. De même, un Wnt ligand non conventionnel, Norrin (encodé par le gène du Npd), se lie également à FZD4/LRP5 pour induire la régression du vaisseau hyaloïde pendant le développement. Npdy/-, Lrp5-/-, et Fzd4-/- les souris affichent toutes la régression des vaisseaux hyaïdides reportées, soutenant un rôle réglementaire critique de Wnt signalant11,12, 13,14,15,16. En outre, un autre corécepteur Wnt LRP6 chevauche avec LRP5 dans leur fonction sur la modulation de la voie de signalisation Wnt dans les cellules endothéliales vasculaires hyaloid17. D'autres facteurs qui peuvent également contribuer à la régression hyaloid incluent le facteur hypoxia-inductible18,19, facteur de croissance endothéliale vasculaire20,21, collagène-1822, 23, Arf24, angiopoietine-225, et la protéine morphogénétique osseuse-426. Dans cet article, nous utilisons Lrp5-/- souris comme modèle des vaisseaux hyaloïdes persistants pour démontrer les techniques d'évaluation et de caractérisation de la vascularisation hyaloïde par des méthodes in vivo et ex vivo.
La visualisation de la vascularisation hyaloïde in vivo et ex vivo est essentielle pour étudier les mécanismes de la régression des vaisseaux hyaloïdes. Les méthodes actuelles pour observer la vascularisation hyaloïde se concentrent principalement sur la visualisation et l'analyse du VHP et de l'HA, à travers des images OCT et FFA, des sections transversales des yeux et la monture plate hyaloïde. L'OCT et la FFA sont de puissants outils d'imagerie in vivo, permettant l'observation longitudinale chez les animaux vivants après qu'ils ont ouvert les yeux. De plus, la monture plate hyaloïde isolée permet de visualiser l'ensemble de la vascularisation hyaloïde et de fournir une quantification précise du nombre de navires. Pourtant, la nature délicate et fragile des vaisseaux hyaloïdes et les difficultés techniques qui en résultent de son isolement peuvent avoir limité son utilisation dans la recherche oculaire quelque peu10,17,27. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé de la visualisation des vaisseaux hyaloïdes, combinant la formation image rétinienne vivante in vivo et la monture plate hyaloid isolée ex vivo pour améliorer la faisabilité de ces techniques. Ce protocole a été adapté avec la modification et l'expansion des publications précédentes sur la méthode in vivo de base en direct et d'imagerie OCT28 et la méthode ex vivo de la monture plate hyaloïde isolée11.
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Protocol
Tous les animaux ont été traités conformément à la Déclaration de l'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l'utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle pour des expériences animales, conformément aux Lignes directrices des National Institutes of Health ( NIH) concernant les soins et l'utilisation des animaux pour des procédures expérimentales et les règlements énoncés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'Hôpital pour enfants de Boston. Lrp5-/- souris (stock no 005823; Jackson Laboratory) et son type sauvage (WT) contrôlent les souris C57BL/6J (stock no 000664; Jackson Laboratory) ont été utilisés pour cette étude.
1. Partie I : Imagerie in vivo des vaisseaux hyaloïdes à l'aide d'un système d'imagerie rétinienne de rongeurs
- Préparation de l'anesthésie des souris et dilatation de la pupille
- Sélectionnez les souris.
- Utilisez des souris qui sont plus âgées que P12 (après avoir ouvert les yeux) pour l'imagerie rétinienne; les deux sexes sont appropriés.
- Comme désiré, image râper les souris mutantes avec la régression hyaloïde retardée (et leurs contrôles wT) tout au long de l'âge adulte. Les souris WT de plus de 3 semaines peuvent ne pas présenter beaucoup de vaisseaux hyaloïdes restants détectables, d'où P12-P21 est idéal pour l'imagerie restant visible WT hyaloid.
- Préparer un mélange de kétamine/xylazine pour l'anesthésie.
- Prendre 2,3 ml de récuraline (100 mg/ml) et 0,7 ml de solution de bouillon de xylazine (20 mg/mL) et ajouter 20 mL de saline stérile (0,9 % de chlorure de sodium) pour faire une solution de travail d'un mélange de kétamine/xylazine (10 mg/mL de kétamine et 0,6 mg/mll).
- Anesthésiez les souris en injectant par voie intrapéritone le mélange de kétamine/xylazine dans un volume de 8 x le poids corporel de la souris (p. ex., une souris de 20 g a besoin de 160 l de mélange de solution de travail de kétamine/xylazine pour obtenir une dose de travail de kétamine [80 mg/kg de poids corporel] et xylazine [4,8 mg/kg poids corporel] mélange).
- Appliquer une goutte de solution médicamenteuse dilatif (voir Tableau des matériaux) sur chaque œil pour dilater les pupilles de la souris immédiatement après l'anesthésie.
- Évaluer le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale (pince ferme de l'orteil postérieur). Attendez que la souris soit suffisamment anesthésiée (pas de réflexe de pédale) et que ses pupilles soient largement dilatées.
- Sélectionnez les souris.
- Imagerie de tomographie de cohérence optique des navires hyaloid
- Hydratez les cornées de la souris avec des larmes artificielles, puis placez la souris sur la scène de positionnement.
- Contactez doucement la cornée de la souris avec la lentille de la sonde OCT. Ajustez la souris et la sonde de sorte que la tête du nerf optique soit au centre du champ visuel dans l'image de fundus, pour guider l'imagerie OCT.
REMARQUE : Pour plus de détails sur la configuration générale d'un système d'imagerie rétinienne de rongeurs (voir Tableau des matériaux)et l'ajustement de la position de la souris, veuillez consulter Gong et coll.28. - Ajuster la mise au point pour obtenir les images optimales de l'OCT.
- Ajuster l'angle de la ligne indiquée dans le logiciel d'imagerie OCT (voir Tableau des matériaux) pour révéler les vaisseaux hyaloïdes persistants et, ensuite, prendre des images.
- F (en) undus (undus) f (en) la luorescéine a (en) ngiographie imagerie des vaisseaux hyaloïdes
- Préparer une solution de fluorescéine : ajouter 9 ml de salin stérilisé tamponné par le phosphate (PBS) à 1 ml de solution de fluorescéine (concentration en stock : 100 mg/mL). La concentration de la solution de travail finale est de 10 mg/mL.
- Injectez par voie intrapéritone la solution de travail à la fluorescéine (poids corporel de 5 l/g).
- Hydratez la cornée de la souris avec des larmes artificielles, puis placez la souris sur la scène de positionnement.
- Placez la lentille du microscope d'imagerie rétinienne Micron IV pour établir un contact direct avec la cornée de la souris. Ajuster légèrement l'alignement pour positionner la tête du nerf optique au centre du champ de vision.
- Changer le filtre du microscope en un canal fluorescent vert.
- Concentrez-vous sur les vaisseaux hyaloïdes persistants pour prendre des images.
- Prenez plusieurs images après 1 min, 3 min, 5 min et 10 min (pas plus de 10 min) après l'injection pour déterminer le meilleur point de temps (rapport signal-arrière) pour observer les vaisseaux hyaïdes. Terminer la procédure FFA dans un délai de 10 minutes, après quoi la fluorescéine peut devenir trop diffuse et rendre les vaisseaux invisibles.
- Récupération des souris de l'anesthésie
- Après les procédures, garder les souris sur un coussin chauffant chaud.
- Attendez que les souris soient de nouveau mobiles pour les retourner dans la cage de la souris.
2. Partie II : Visualisation ex vivo des vaisseaux hyaloïdes
- Préparation des yeux fixes de souris
- Sélectionnez des souris du bon âge.
REMARQUE : Les souris néonatales sont typiquement sacrifiées à P8 pour la dissection hyaloïde. Les deux sexes sont appropriés. Les souris mutantes avec une régression hyaloïde retardée (et leurs contrôles respectifs de WT) peuvent être disséquées et analysées tout au long de l'âge adulte. - Euthanasier les souris par exposition au CO2.
- Enucleate les yeux de la souris par dissection émoussée.
- Ouvrez les paupières larges avec des forceps de microchirurgie pour permettre l'accès au globe oculaire. Placez des forceps de microchirurgie incurvés sous le globe dans l'orbite pour saisir le nerf optique sans serrer le globe oculaire. Tirez et retirez doucement le globe oculaire avec les forceps.
- Alternativement, disséquez le globe oculaire en utilisant des ciseaux de microchirurgie pour couper soigneusement parallèlement au globe des quatre côtés vers l'arrière de l'orbite et séparer le globe des tissus conjonctifs environnants.
- Immerger les yeux dans un paraformaldéhyde de 4 % dans un tampon PBS pendant 30 min à température ambiante pour la fixation.
- Transférer les globes oculaires fixes sur un tampon PBS glacé.
REMARQUE : Les globes oculaires peuvent être stockés dans le PBS à 4 oC pendant une semaine.
- Sélectionnez des souris du bon âge.
- Intégration des vaisseaux hyaloïdes avec injection de gélatine
- Préparer une solution de gélatine de 5 % (w/v).
- Peser 50 mg de gélatine.
- Dissoudre la gélatine dans 1 ml d'eau distillée.
- Incuber la solution de gélatine dans un bain d'eau de 37 oC jusqu'à dissolution complète. Conserver la solution dans de l'eau à 37 oC jusqu'à l'utilisation.
REMARQUE : Un plus grand lot de solution peut être préparé et stocké à 4 oC comme aliquots. Chaque fois avant l'utilisation, la solution doit être réchauffée dans un bain d'eau de 37 oC pour obtenir une consistance claire.
- Sous un microscope de dissection, injecter 50 l de solution de gélatine dans le corps vitré au limbus ; répéter l'injection 3x à différents sites pour faire un total de quatre injections, uniformément espacées autour du limbus (Figure 2A).
- Incuber les globes oculaires dans un réfrigérateur à 4 oC ou sur la glace pendant 30 min pour solidifier la gélatine injectée dans l'espace vitré.
- Préparer une solution de gélatine de 5 % (w/v).
- Dissection et isolement des navires hyaloid
REMARQUE: Voir Figure 2B-E.- Placer les globes oculaires dans un plat Petri contenant du PBS pour empêcher le tissu de sécher. Faire une incision avec des ciseaux de microchirurgie au limbe et enlever la cornée.
- Couper et enlever le nerf optique.
- Sous un microscope à dissection, utilisez deux paires de forceps pour décoller et jeter les couches de scléairée, de choroïde et d'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et enlever l'iris.
- Avec le côté optique-nerf de la rétine vers le haut et le côté de la lentille vers le bas, injecter 50 L de PBS juste sous la tasse de rétine pour permettre l'accumulation du tampon PBS entre le corps vitré gélatinisé et la rétine.
- Épluchez délicatement et retirez la tasse de rétine et le corps ciliaire du corps vitré avec des forceps de microchirurgie.
- À l'aide d'une pipette de transfert, transférer la tasse de gélatine contenant le tissu hyaloïde immergé dans le PBS sur une lame de microscope
- Retourner le reste du tissu (lentille / hyaloïde) sur, de sorte que le côté de la lentille est tourné vers le haut.
- Soulevez l'objectif et desserrez doucement la connexion entre l'objectif / TVL et VHP, puis, couper l'HA avec des ciseaux de microchirurgie pour enlever la lentille-TVL. Gardez la partie VHP de la tasse hyaloid pour la monture plate.
- Montage plat et coloration des vaisseaux hyaloid
- Rincer délicatement la tasse hyaloïde avec PBS sur la glissière pour enlever tous les débris de dissection.
- Assurez-vous que la tasse hyaloïde flotte sur la glissière dans une solution PBS adéquate.
- Arrangez et ajustez doucement la position de la tasse hyaloïde gélatinisée avec des forceps de microchirurgie, avec le bord de la tasse tourné vers le bas sur la glissière, pour obtenir une apparence optimale après la fonte.
- Placez la glissière avec la tasse hyaloïde immergée dans le PBS sur un réchauffeur à 37 oC, attendez que la gélatine fond et que l'hyaloïde s'aplatisse, et retirez la glissière lorsqu'elle est à peine sèche (ne pas trop sécher).
- (Facultatif) Immunostain les vaisseaux hyaloïdes
- Faire du tampon de blocage et de pénétration (p. ex., 5 % d'albumine de sérum bovin [BSA] et 0,1 % De Triton X-100 dans le tampon PBS). Ajouter 50 l de tampon de blocage sur un isolement hyaloïde plat et l'incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Appliquer 50 l d'anticorps primaires (p. ex. CD31) (1:100 dilution dans le tampon de blocage) sur une monture plate d'isolement hyaloïde, puis, l'incuber dans une boîte humide à 4 oC pendant la nuit.
- Rincer délicatement 3x, 5 min à chaque fois, avec PBS.
- Appliquer 50 l d'anticorps secondaires (p. ex., anticorps secondaire anti-lapin de chèvre-Alexa 488, 1:100 dilution) sur la monture plate hyaloïde et l'incuber à température ambiante pendant 1 h.
- Rincer délicatement 3x, 5 min à chaque fois, avec PBS.
- Ajoutez une goutte de milieu de montage anti-fade avec DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) pour tacher les noyles dans les vaisseaux hyaloïdes.
- Placez délicatement une glissière sur le hyaloïde pour compléter la monture plate.
- Imagerie et quantification des vaisseaux hyaloïdes plats
- Imagedez la coloration DAPI des vaisseaux hyaloïdes avec un microscope fluorescent et assurez-vous que l'HA central est visible (exclure les échantillons sans l'HA).
- Identifier les branches des navires directement dérivées de l'HA et compter manuellement le nombre de branches de navire pour la quantification.
- Visualisation des vaisseaux hyaloïdes dans la section transversale des yeux
- Intégrez les globes oculaires fixes dans un composé optimal de température de coupe dans un moule de tissu approprié, puis congelez les yeux incorporés sur la glace sèche ou entreposez-les dans un congélateur de -20 oC.
- Utilisez un microtome cryostat pour faire une section transversale des yeux encastrés en sections de 12 m d'épaisseur à -20 oC.
- Recueillir les sections transversales des yeux sur une température de la pièce de toboggan microscope en touchant doucement les sections de tissu, qui adhéreront à la diapositive.
- Sécher à l'air pour déshydrater les sections de tissu pendant 30 min, qui peuvent ensuite être stockées dans un congélateur de -20 oC jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être tachées.
- Rincer la glissière 1x avec du PBS pour enlever le composé optimal restant de température de coupe sur la glissière.
- (Facultatif) Immerger la glissière dans un tampon fixatif approprié (p. ex., 4 % de paraformaldéhyde en PBS) pendant 15 minutes à température ambiante pour une fixation supplémentaire, si nécessaire.
- Perméabilize le tissu avec 0,1% Triton X-100 en PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Préparer le tampon de coloration isolectin-IB4 pour la coloration des vaisseaux sanguins.
- Dissoudre et reconstituer la poudre d'isolectin-IB4 (500 g) avec 50 ml de PBS dans un tube de centrifugeuse de 50 ml.
- Ajouter lentement 50 oL de 1 M CaCl2 solution, goutte à goutte, dans les 50 ml de PBS/ isolectin-IB4 mélange. Cette étape doit être effectuée lentement pour éviter les précipitations. La concentration finale de CaCl2 est de 1 M. La présence de Ca2 est nécessaire pour la coloration isolectin-IB4.
- Appliquer 30 ll de tampon de coloration isolectin-IB4 sur les sections transversales de l'œil sur la glissière et l'incuber dans une boîte humide à 4 oC pendant la nuit.
- Rincer 3x, pendant 5 min à chaque fois, avec PBS.
- Ajouter une goutte de milieu de montage anti-fade avec DAPI pour tacher les noyaux dans les sections.
- Placez délicatement une feuille de couverture sur les sections de tissu pour compléter la monture plate.
- Vérifiez le tissu sous un microscope pour visualiser la présence de vaisseaux hyaloïdes dans la coupe oculaire.
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Representative Results
Imagerie in vivo de vaisseaux hyaloïdes chez des souris vivantes
Figure 3 A révèle des vues transversales des images OCT pour la rétine et les tissus hyaloid chez les souris WT et Lrp5de 3 mois, un modèle animal avec hyaloïde persistant. L'oeil de WT montre l'absence de tissu hyaloïde, alors que l'oeil de Lrp5-/-montre deux vaisseaux hyaloïdes persistants dérivés de la tête de nerf optique. Figure 3 B affiche des images FFA de vaisseaux hyaloïdes persistants (verts) dans le champ fluorescent chez des souris Lrp5-/- 6 semaines. La souris WT ne montre aucun vestige de vaisseaux hyaloïdes, et la souris Lrp5-/-montre huit branches de vaisseaux hyaloïdes dans le corps vitré.
Visualisation ex vivo des vaisseaux hyaïdides
Figure 4 A,B démontre les vaisseaux hyaloïdes isolés comme visualisés dans les montages plats, où les cellules vasculaires et les macrophages associés ont été souillés par leurs noyaux avec la coloration dAPI (bleu). L'HA est au centre de chaque image, et les vaisseaux hyaloid sont révélés par les lignes discontinues dérivées du DAPI. Chaque ligne représente un navire de VHP. Chez les souris Lrp5-/-on a observé un nombre plus élevé de vaisseaux hyaloïdes restants à P8 dans des montures plates (figure4A). Les souris WT avaient en moyenne 12 branches de vaisseaux hyaloïdes à P8, tandis que les lrp5-/- chiots correspondants à l'âge présentaient environ 25 branches de vaisseaux hyaloïdes, ce qui démontrait une régression significativement altérée de la vascularisation hyaloïde (figure4 B). De plus, on a observé un développement vasculaire de la rétine retardé et incomplet, une autre caractéristique souvent associée aux vaisseaux hyaloïdes persistants, chez les lrp5-/- chiots (figure4C,D). La figure 5 montre les vaisseaux hyaloid restants dans les sections transversales de Lrp5-/-yeux à P8, tandis que les yeux de WT n'affichent pas les navires hyaloid.
Figure 1 : Diagramme schématique illustrant la régression développementale de la vascularisation hyaloïde dans les yeux de souris. Les vaisseaux et les branches hyaloid, y compris VHP, TVL, et PM, sont dérivés de l'HA, et occupent une grande partie de l'espace entre la lentille et la rétine immature à la naissance (P0). L'involution hyaloide chez la souris commence par la régression des capillaires PM dès P4. Chez P8, les particules, les VHP et les couches TVL régressent continuellement, coïncidant avec la formation complète de la couche superficielle des vaisseaux rétiniens. Par P12, l'involution de la couche PM est complète, tandis que l'atrophie de VHP et TVL est toujours en cours. Pendant ce temps, une couche profonde de vaisseaux rétiniens commence à se former au cours de P7-P12. Par P16, la régression du système hyaloïde est partiellement accomplie (avec les vaisseaux TVL restants et l'HA à gauche), et la couche intermédiaire de plexus vasculaire rétinien continue de se développer. La vascularisation rétinienne est entièrement mature par P21 et prend en charge le rôle de nourrir les tissus rétiniens des vaisseaux hyaïdides, qui sont maintenant la plupart du temps régressé. À P21, le vitré, en l'absence de vaisseaux hyaloïdes, montre une voie visuelle claire. Les lignes rouges pointillées représentent les navires qui régressent. VHP - vasa hyaloidea propria; TVL - tunica vasculosa lentis; PM et membrane pupillaire; HA et artère hyaloïde. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Diagramme schématique illustrant la procédure séquentielle de l'isolement des vaisseaux hyéloïdes pour l'ex vivo montage plat visualisation. (A) Injection de gélatine dans l'œil enucleated par quatre points d'injection (points rouges) au limbus, pour solidifier le corps vitré. (B) Enlèvement de la cornée et du nerf optique, dissection soigneuse de l'iris, et épluchage du complexe sclera-choroid-RPE. (C) Retourner la tasse rétinienne restante avec la lentille pour faire le côté de la rétine face vers le haut; puis, l'injection de PBS entre la rétine et le corps vitré pour les séparer, suivie par le décollement de la couche rétinienne. (D) Basculer à l'envers à nouveau le reste du tissu, contenant la lentille avec l'hyaloïde environnant. Soulever légèrement l'objectif pour desserrer la connexion de TVL et VHP. (E) Coupe à l'HA entre le TVL et le VHP, et la suppression de l'objectif et TVL. Couche VHP à montage plat. VHP - vasa hyaloidea propria; TVL - tunica vasculosa lentis; PM et membrane pupillaire; HA et artère hyaloïde. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Imagerie in vivo de vaisseaux hyéloïdes avec tomographie par cohérence optique (OCT) et angiographie de fluorescence de fundus (FFA). A: Images REPRÉSENTATIVEs oct de WT et Lrp5-/-souris à 3 mois-vieux montrant les vaisseaux hyaloïdes persistants dans l'espace vitreux dans Lrp5-/-yeux. B: Images ffa représentatives de WT et Lrp5-/-souris à 6 semaines.. Des souris ont été injectées avec 1mg de sodium de fluorescein dans le sal sal de 0.1ml par souris après l'anesthésie, et des images ont été prises 5 min après injection, concentrées sur des vaisseaux hyaloid dans Lrp5-/-souris ou corps vitreux dans WT (en l'absence des vaisseaux hyaloid). Des navires hyaloid persistants ont été visualisés dans Lrp5-/-mais pas les yeux de WT. Les flèches rouges indiquent les vaisseaux hyaloid. Les deux barres d'échelle : 100 m (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Visualisation de la régression retardée de vaisseau hyaloïde et du développement retardé de vascularisation rétinienne dans Lrp5-/-souris. (A) Images représentatives de navires hyaloid plats tachés de DAPI (bleu) en WT et Lrp5-/-yeux à P8. Les flèches (blanches) indiquent l'artère hyaloïde. (B) Quantification du nombre de vaisseaux hyaloïdes se ramifiant de l'artère hyaloïde dans WT et Lrp5-/-yeux. (C) Rétines à plat représentatives tachées d'isolectine-IB4 (rouge) pour la vascularisation en WT et Lrp5-/-yeux à P8. Les lignes pointillées blanches indiquent le bord de la rétine. Les lignes jaunes indiquent le bord vascularisé de la zone. (D) Quantification de la couverture vasculaire du plexus vasculaire rétinien superficiel dans WT et Lrp5-/-yeux. n - 8-12/groupe. Les barres d'échelle dans les panneaux A et C et 1 mm. Les données sont présentées comme moyennes - SEM. Le test t-de l'étudiant à deux queues a été utilisé pour l'analyse statistique. P et lt; 0,01. Ce chiffre est modifié avec la permission de Wang et coll.27. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Visualisation des vaisseaux hyaïdides en sections transversales de Lrp5-/-yeux. Images représentatives de sections transversales d'yeux isolées de WT et Lrp5-/-souris à P8. Les yeux étaient enucleated et incorporés dans la température de coupe optimale, et des sections ont été coupées utilisant le cryostat. Les sections transversales ont été tachées de DAPI (bleu) pour montrer les noyaux et l'isolétine-IB4 (rouge) pour montrer les vaisseaux sanguins. Des flèches blanches indiquent des vaisseaux hyaloïdes. La barre d'échelle de 500 m. Ce chiffre est adapté avec la permission de Chen et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les techniques d'évaluation et de caractérisation des vaisseaux hyaloïdes sont des procédures intuitives et nécessaires pour observer la régression des vaisseaux hyaloïdes dans les modèles animaux, afin de permettre des études sur les mécanismes sous-jacents à la régression vasculaire au cours du développement. Tandis que l'imagerie rétinienne in vivo permet l'observation longitudinale de la régression hyaloïde chez le même animal, l'accès à un système d'imagerie de fonds de rongeur pour OCT et FFA peut être un facteur limitant. En outre, l'imagerie in vivo chez les souris vivantes n'est pas faisable avant qu'elles n'ouvrent les yeux. Par conséquent, cette méthodologie n'est pas applicable pendant le développement d'oeil dans le stade néonatal. D'autre part, alors que l'imagerie des sections transversales des yeux isolés peuvent être utilisés pour n'importe quel âge de la souris et a une faible barrière technique, il n'est pas quantitatif quand il n'y a que quelques vaisseaux hyaloïdes visibles, et la chance d'obtenir une image idéale dépend en grande partie de la angle de sectionnement (Figure 5). En comparaison, l'isolement des vaisseaux hyaloïdes pour la visualisation à monture plate permet l'imagerie complète de l'ensemble du navire hyaloïde et une quantification précise, mais des défis techniques peuvent exister en raison de la nature délicate et fragile des vaisseaux hyaloïdes. Nous espérons que le protocole détaillé dans le présent document aidera à surmonter ces défis.
Plusieurs étapes critiques dans le protocole d'isolement hyaloïde incluent l'injection de la solution de gélatine, l'enlèvement de la rétine, et le montage plat final. La difficulté technique de manipuler la vascularisation hyaloïde réside dans sa nature délicate, l'état presque liquide de vitré où les vaisseaux hyaloïdes résident, et sa connexion étroite avec la lentille adjacente et la rétine. L'injection de la solution de gélatine intravitréence est la clé pour solidifier le corps vitré contenant des vaisseaux hyaloïdes et, par conséquent, rendre leur texture plus ferme pour faciliter la dissection et la manipulation. La gélatine est un agent gélifiant formant des gels thermoréversibles élastiques transparents. En injectant la forme liquide de gélatine (à température ambiante ou à 37 oC) dans l'espace vitré et en le refroidissant à une température plus basse (4 oC), le corps vitré se transforme en une tasse de gel plus ferme. L'exécution d'injections multiples de gélatine dans l'œil permet la dispersion complète d'une quantité suffisante de la gélatine dans l'espace vitré, pour former une tasse de tissu hyaloïde gélatinisée uniforme et ronde. Une autre difficulté technique consiste à enlever la rétine sans endommager les tissus hyaloïdes. Contrairement à la choroïde, qui est relativement facile à disséquer, le corps vitré gélatinisé contenant des vaisseaux hyaloïdes est difficile de se séparer de la rétine voisine sans endommager le hyaloïde. Nous avons constaté que l'injection de PBS dans l'espace entre le corps vitré et la rétine a généré une couche tampon liquide, ce qui rend beaucoup plus facile de séparer ces deux tissus. Ceci est un peu semblable à la technique d'hydrodissection utilisée dans la chirurgie de cataracte pour séparer la capsule et le cortex de cataracte. Le montage plat final est la dernière étape techniquement difficile du protocole. Le réchauffement du tissu hyaloïde gélatinisé dans une gouttelette de PBS sur un chauffe-glissière le convertit de nouveau à une forme plus liquide-comme pour permettre le montage plat plus facile. Un bon arrangement et une bonne orientation de la tasse de gel hyaloïde est toujours essentiel pour assurer son aplatissement égal après la fonte et le séchage.
Le protocole d'isoler les vaisseaux hyaïdides peut être modifié de plusieurs façons. La concentration de la solution de gélatine que nous avons utilisée est de 5%, mais des concentrations plus élevées ou plus faibles peuvent également fonctionner, selon la préférence du chercheur pour obtenir une texture plus ferme ou plus douce pour la manipulation. La coloration DAPI des noyaux cellulaires peut également être modifiée avec l'isolectin-IB4 ou d'autres marqueurs de cellules endothéliales ou de macrophage, pour mieux distinguer les cellules endothéliales vasculaires des macrophages. Un mot d'avertissement : les navires hyaloïdes plats sont très délicats et n'adhèrent que vaguement à la glissière ; par conséquent, les glissières hyaloid doivent être manipulées très doucement et soigneusement si le rinçant est nécessaire pendant la coloration. Ce protocole d'isolement a également ses limites, y compris la complexité de l'exécution de la dissection fine et la difficulté de la conservation à long terme des échantillons en raison de la nature du tissu fragile. Néanmoins, l'isolat et le montage plat des vaisseaux hyaloïdes est toujours le moyen le plus complet et intuitif d'étudier la vascularisation hyaloïde, pour promouvoir les études oculaires et d'angiogenèse10,17,27, 29,30,31.
La vascularisation hyaloïde fournit un excellent modèle expérimental d'étude de la croissance et de la régression des vaisseaux développementaux, pertinent pour les domaines de recherche en ophtalmologie, angiogenèse et mort cellulaire programmée, avec lequel cet article vise à aider. Les modifications futures du protocole d'isolement peuvent être orientées vers l'amélioration de la faisabilité d'une procédure de dissection technique. Dans l'ensemble, la formation image in vivo combinée et l'isolement ex vivo des vaisseaux hyaloïdes est une méthode avantageuse pour permettre l'évaluation complète et la caractérisation des vaisseaux hyaloïdes chez la souris comme modèle utile de régression vasculaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 et EY028100) à J.C. Z.W. a été soutenu par une subvention de démarrage de carrière de la Fondation des Templiers. La procédure d'isolement hyaloïde décrite dans cette étude a été adaptée avec une modification des protocoles généreusement partagés par les Drs Richard Lang, Toshihide Kurihara et Lois Smith, à qui les auteurs sont reconnaissants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. Besharse, J., Bok, D. , Academic Press. Oxford, UK. (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. Hartnett, M. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2013).
- Fruttiger, M.
- Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
