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Medicine

चूहे में Hyaoid जहाजों का आकलन और विशेषता

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59222
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2The Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

Summary

यह प्रोटोकॉल विवो और पूर्व विवो विधियों दोनों में पूरी तरह से कल्पना और hyaloid वाहिकाओं की विशेषता के लिए वर्णन करता है, माउस आंखों में संवहनी प्रतिगमन का एक मॉडल, ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी और फंडस फ्लोरेसीइन एंजियोग्राफी का उपयोग कर लाइव इमेजिंग और पूर्व vivo के लिए मात्रात्मक विश्लेषण के लिए hyaoid के अलगाव और बाद में फ्लैट माउंट.

Abstract

आंख में, भ्रूण hyaloid वाहिकाओं विकासशील लेंस और रेटिना पोषण और पीछे हटना जब रेटिना वाहिकाओं का विकास. hyaoid वाहिकाओं के लगातार या असफल प्रतिगमन लगातार hyperplastic प्राथमिक vitreous (PHPV) जैसे रोगों में देखा जा सकता है, एक बाधित प्रकाश पथ और बिगड़ा दृश्य समारोह के लिए अग्रणी. hyaoid पोत प्रतिगमन अंतर्निहित तंत्र को समझना संवहनी प्रतिगमन प्रक्रिया और संभावित नए तरीके लगातार hyaloid वाहिकाओं के साथ रोगों का प्रबंधन करने के लिए नए आणविक अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यहाँ हम ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी (OCT) और fundus fluorcein एंजियोग्राफी (FFA) और अलग और फ्लैट-माउंटिंग hyaloid ex vivo के लिए मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विस्तृत तकनीकी प्रोटोकॉल के साथ लाइव चूहों में इमेजिंग hyaoid के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन. कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर से संबंधित प्रोटीन 5 (LRP5) नॉकआउट चूहों लगातार hyaloid वाहिकाओं के एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया, तकनीक वर्णन करने के लिए. एक साथ, इन तकनीकों संवहनी प्रतिगमन के एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में hyaloid वाहिकाओं की एक पूरी तरह से मूल्यांकन की सुविधा हो सकती है और लगातार hyaloid वाहिकाओं के तंत्र पर अध्ययन.

Introduction

आंख में रक्त की आपूर्ति रेटिना और आसपास के नेत्र ऊतकों के सामान्य विकास को सुनिश्चित करने और एक उचित दृश्य समारोह से लैस करने के लिए आवश्यक है। आंखों में तीन संवहनी बिस्तर हैं: रेटिना वाहिकाविन्यास, कोरॉइड, और hyaoid वाहिकाओं के एक क्षणिक भ्रूण संचार नेटवर्क. नेत्र वाहिका विन्यास के विकास के लिए भ्रूणजनन और ऊतक परिपक्वता में स्थानिक और लौकिक समन्वय की आवश्यकता होती है। तीन संवहनी बिस्तरों में, hyaoid vascualture नवगठित भ्रूण लेंस और विकासशील रेटिना के लिए पोषण और ऑक्सीजन प्रदान करने के लिए पहली कार्यात्मक रक्त आपूर्ति प्रणाली है। Hyaloid वाहिकाओं एक ही समय में पीछे हटना है कि रेटिना vasculatures विकसित और परिपक्व1. hyaoid vascualture के प्रतिगमन दृश्य समारोह के विकास के लिए एक स्पष्ट दृश्य मार्ग की अनुमति देने के लिए निर्णायक है; इसलिए, इस संवहनी प्रतिगमन प्रक्रिया रेटिना vasculature के विकास के रूप में के रूप में महत्वपूर्ण है. बिगड़ा हुआ hyaloid प्रतिगमन नेत्र रोगों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, hyaoid वाहिकाओं के प्रतिगमन सेलुलर और आणविक संवहनी प्रतिगमन के विनियमन में शामिल तंत्र की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रणाली प्रदान करता है, जो अन्य अंगों में angiogenic विनियमन के लिए प्रभाव हो सकता है के रूप में अच्छी तरह से.

hyaoid vasculature, hyaoid धमनी (एचए) से व्युत्पन्न, वासा hyaloidea propria (वीएचपी), tunica vasculosa lentis (TVL), और pupillary झिल्ली (पीएम) से बना है. यह भ्रूणीय विकास2के दौरान विकासशील रेटिना, प्राथमिक काचाभ और लेंस को पोषण प्रदान करता है। एचए से उत्पन्न, विहिप की शाखाएं लेंस के लिए काच के माध्यम से पूर्ववर्ती रूप से। TVL लेंस कैप्सूल के पीछे की सतह कप, और प्रधानमंत्री को anastomoses, जो पूर्वकाल पक्ष्माभी धमनियों को जोड़ता है, लेंस के पूर्वकाल की सतह को कवर2,3,प्रधानमंत्री में जहाजों के एक नेटवर्क के गठन में जिसके परिणामस्वरूप 3 , 4 , 5. दिलचस्प बात यह है कि hyaloid vasculature में कोई नसों रहे हैं, और प्रणाली शिरापरक जल निकासी को पूरा करने के लिए choroidal नसों का उपयोग करता है.

मानव भ्रूण में, गर्भकेश के लगभग नौवें सप्ताह में हयालॉयड वाहिकाललकाण्ड लगभग पूरा हो जाता है और जब प्रथम रेटिना वाहिकाओं में दिखाई देते हैं, तो गर्भावधि2के चौथे महीने के दौरान वे पीछे हटने लगते हैं। विहिप के शोष के साथ शुरू, TVL, प्रधानमंत्री के केशिका नेटवर्क के प्रतिगमन, और अंत में, हा बाद में होता है2,3. इस बीच, प्राथमिक काचालु और माध्यमिक काचा भोंच बनाने के लिए शुरू होता है, कोलेजन फाइबर सहित extracellular मैट्रिक्स घटकों से बना. गर्भ के छठे महीने तक, प्राथमिक काच एक छोटी पारदर्शी नहर के लिए प्रकाशिक्त तंत्रिका डिस्क से लेंस तक विस्तार करने के लिए कम हो जाता है, क्लोकेट नहर या hyaoid नहर कहा जाता है, और माध्यमिक vitreous पीछे खंड का मुख्य घटक बन जाता है २ , 3. जन्मसेठीक 3 सप्ताह पहले ही हयालॉयड परिसंचरण अधिकतर 35 से 36 सप्ताह के गर्भ में गायब हो जाता है .

मनुष्यों के विपरीत, जिसमें hyaoid vascualture जन्म के समय पूरी तरह से प्रतिगामी है, माउस hyaloid संवहनी प्रणाली जन्म के बाद पीछे हटना शुरू होता है. चूंकि माउस रेटिना का जन्म एक संवहनी और रेटिना वाहिकाओं के बाद होता है, hyaloid वाहिकाओं प्रसव के बाद के दिन से समवर्ती प्रतिगामी (पी) 4 और ज्यादातर पूरी तरह से P216 द्वारा पीछे हट रहे हैं (चित्र 1) . प्रधानमंत्री P10 और P12 के बीच पहले गायब हो जाता है, और विहिप P12 और P16 के बीच गायब हो जाता है, जबकि TVL और हा कोशिकाओं की एक छोटी संख्या P16 पर भी रहते हैं, और P21 द्वारा hyaoid संवहनी प्रणाली प्रतिगमन लगभग पूरा हो गया है6. इस बीच, रेटिना वाहिका जन्म के बाद विकसित होने लगती है। संवहनी जाल की सतही परत पूरी तरह से P7-P8 पर परिधीय रेटिना तक फैली हुई है, गहरी परत (बाहरी plexiform परत में स्थित) P7-P12 से विकसित होती है, और अंत में, आंतरिक plexiform परत में मध्यवर्ती जाल P12 और P15 7 के बीच विकसित होता है . के रूप में रेटिना vascualture विकसित करता है, यह धीरे-धीरे सहवर्ती hyaoid वाहिकाओं के समारोह की जगह, विकासशील आंख को पोषण और ऑक्सीजन प्रदान. चूहों में hyaoid पोत प्रतिगमन के प्रसव के बाद की घटना का निरीक्षण और hyaloid vascualture का अध्ययन करने के लिए एक आसानी से सुलभ प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है, साथ ही आणविक आधार दोनों शारीरिक और के तहत संवहनी प्रतिगमन प्रक्रियाओं को नियंत्रित रोग की स्थिति8|

hyaloid प्रतिगमन की विफलता PHPV जैसे रोगों में देखा जा सकता है, जो भ्रूण के एक असफल या अधूरा प्रतिगमन के परिणामस्वरूप आंख की एक दुर्लभ जन्मजात विकासात्मक विसंगति है, प्राथमिक काचाभ और hyaloid vasculature9. hyaloid vasculature के प्रतिगमन प्रक्रिया को विनियमित तंत्र जटिल हैं और मोटे तौर पर अध्ययन किया. Hyaloid वाहिकाओं के सामान्य प्रतिगमन के लिए आवश्यक एक प्रमुख आणविक मार्ग Wnt संकेतन मार्ग10है , के रूप में इस मार्ग में आनुवंशिक उत्परिवर्तन दोनों Wnt ligand और रिसेप्टर्स को प्रभावित करने के रूप में मानव में PHPV के साथ जोड़ा गया है9. प्रायोगिक अध्ययनों में एक Wnt ligand, Wnt7b, जो इस प्रतिगमन प्रक्रिया मध्यस्थता करने के लिए विकासशील आँख में hyaloid जहाजों के आसपास मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित है की पहचान की. Wnt7b रिसेप्टर्स frizzled4 के साथ बाध्यकारी द्वारा Wnt संकेतन को सक्रिय करता है (एफजेडडी4) / LRP5 आसन्न endothelial कोशिकाओं में सेल apoptosis आरंभ करने के लिए, hyaloid वाहिकाओं के प्रतिगमन के लिए अग्रणी10. एक परिणाम के रूप में, Wnt7bकमी चूहों hyaoid वाहिकाओं10की दृढ़ता दिखा. इसी प्रकार, एक गैर-परंपरागत वंट लिगंड, नॉरिन (एनडीपी जीन द्वारा एनकोड किया गया), विकास के दौरान हयालॉयड पोत प्रतिगमन को प्रेरित करने के लिए एफजेडडी4/एलआरपी 5 को भी बांधता है। Ndpy/-, Lrp5-/-, और Fzd4/- चूहों सभी प्रदर्शन स्थगित hyaoid पोत प्रतिगमन, Wnt संकेत11,12की एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका का समर्थन, 13,14,15,16. इसके अलावा, एक और Wnt coceptor LRP6 अपने समारोह में LRP5 के साथ ओवरलैप hyaoid संवहनी endothelial कोशिकाओं में Wnt संकेतन मार्ग नियमन पर17. अन्य कारकों है कि भी hyaloid प्रतिगमन में योगदान कर सकते हैं hypoxia-प्रेरक कारक18,19,संवहनी endothelial विकास कारक20,21, कोलेजन-1822शामिल हैं, 23, आर्फ24, एंजियोपोइटिन-225, और हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन-426. इस पेपर में, हम लगातार hyaoid वाहिकाओं के एक मॉडल के रूप में Lrp5-/- चूहों का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन और दोनों vivo और पूर्व vivo तरीकों में दोनों के माध्यम से hyaoid vascualture की विशेषता की तकनीक का प्रदर्शन.

विवो और पूर्व विवो में hyaoid vascualture के दृश्य hyaloid पोत प्रतिगमन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है. Hyaoid vasculature निरीक्षण करने के लिए वर्तमान तरीकों मुख्य रूप से VISUALizing और विहिप और हा का विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित, OCT और एफएफए छवियों के माध्यम से, आंख पार वर्गों, और hyaoid फ्लैट माउंट. OCT और FFA vivo इमेजिंग उपकरण में शक्तिशाली हैं, जीवित जानवरों में अनुदैर्घ्य अवलोकन की अनुमति के बाद वे अपनी आँखें खोल दिया है. इसके अलावा, अलग hyaloid फ्लैट माउंट पूरे hyaloid vascualture के दृश्य प्रदान करता है और पोत संख्या का एक सटीक परिमाण प्राप्त करने के लिए एक साधन. फिर भी हयालॉयड जहाजों की नाजुक और नाजुक प्रकृति और इसके अलगाव के परिणामस्वरूप तकनीकी कठिनाइयों ने नेत्र अनुसंधान में इसके उपयोग को कुछ हद तक10,17,27तक सीमित कर दिया है . इस पत्र में, हम hyaoid वाहिकाओं के दृश्य का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, दोनों में vivo लाइव रेटिना इमेजिंग और पूर्व vivo अलग hyaloid फ्लैट माउंट के संयोजन के लिए इन तकनीकों की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए. इस प्रोटोकॉल को लाइव फंडस और ओसीटी इमेजिंग28 की इन विवो विधि और पृथक hyaloid फ्लैट माउंट11के पूर्व विवो विधि पर पिछले प्रकाशनों से संशोधन और विस्तार के साथ अनुकूलित किया गया है .

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Protocol

सभी जानवरों के अनुसार दृष्टि और नेत्र विज्ञान में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के अनुसार (ARVO) पशु प्रयोगों के लिए नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए वक्तव्य, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के दिशा निर्देशों का पालन ( NIH) प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और बोस्टन बच्चों के अस्पताल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACU) द्वारा निर्धारित विनियमों के लिए जानवरों की देखभाल और उपयोग के बारे में. Lrp5-/- चूहों (स्टॉक नंबर 005823; जैक्सन प्रयोगशाला) और उसके जंगली प्रकार (WT) नियंत्रण C57BL/6J चूहों (स्टॉक नंबर 000664; जैक्सन प्रयोगशाला) इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया.

1. भाग I: एक कृंतक रेटिना इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर hyaoid वाहिकाओं के विवो इमेजिंग में

  1. चूहों संज्ञाहरण और पुतली फैलाव की तैयारी
    1. चूहों का चयन करें.
      1. उन चूहों का उपयोग करें जो P12 से बड़े हैं (जब वे अपनी आंखें खोल चुके हैं) रेटिना इमेजिंग के लिए; दोनों लिंग उपयुक्त हैं।
      2. के रूप में वांछित, देरी hyaoid प्रतिगमन के साथ छवि उत्परिवर्ती चूहों (और उनके WT नियंत्रण) वयस्कता भर में. WT चूहों से पुराने 3 सप्ताह ज्यादा डिटेक्टेबल शेष hyaloid वाहिकाओं का प्रदर्शन नहीं हो सकता है, इसलिए P12-P21 दिखाई दे रहा है डब्ल्यूटी hyaloid शेष इमेजिंग के लिए आदर्श है.
    2. संज्ञाहरण के लिए एक केटामाइन/xylazine मिश्रण तैयार करें।
      1. केटामाइन स्टॉक समाधान (100 मिलीग्राम/एमएल) और 0.7 एमएल xylazine स्टॉक समाधान (20 मिलीग्राम/एमएल) के 2.3 एमएल लें और 20 एमएल बाँझ सैलिन (0.9% सोडियम क्लोराइड) जोड़ें ताकि केटामाइन/सिलाज़ीन मिश्रण (10/एमएल केटामाइन और 0.6 एमजीएल) का कार्य समाधान किया जा सके।
    3. चूहों को इंट्रापेरिटोनली द्वारा 8x माउस के शरीर के वजन की मात्रा में केटामाइन/xylazine मिश्रण इंजेक्शन द्वारा एनेस्थेटाइज करें (जैसे, 20 ग्राम माउस को केटामाइन/xylazine कार्य समाधान मिश्रण की 160 डिग्री सेल्सियस की आवश्यकता होती है ताकि केटामाइन की कार्यशील खुराक प्राप्त की जा सके [80 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन] और xylazine [4.8 mg/kg शरीर का वजन] मिश्रण).
    4. एक संज्ञाहरण के तुरंत बाद माउस के विद्यार्थियों को फैलाने के लिए प्रत्येक आंख के लिए पुतली-विक्षिप्त दवा समाधान की एक बूंद लागू करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    5. पेडल प्रतिवर्त (फर्म हिंडम टो चुटकी) द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करें। रुको जब तक माउस पर्याप्त anesthetized है (कोई पेडल पलटा) और उसके विद्यार्थियों को व्यापक रूप से फैला रहे हैं.
  2. हयालॉयड वाहिकाओं के ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी इमेजिंग
    1. कृत्रिम आँसू के साथ माउस के कॉर्निया moisturize, और फिर, स्थिति चरण पर माउस जगह है.
    2. OCT जांच के लेंस के साथ माउस की कॉर्निया से धीरे से संपर्क करें। माउस और जांच समायोजित करें ताकि ऑप्टिक तंत्रिका सिर fundus छवि में दृश्य क्षेत्र के केंद्र में है, OCT इमेजिंग मार्गदर्शन करने के लिए.
      नोट: एक कृंतक रेटिना इमेजिंग प्रणाली के सामान्य सेटअप पर अधिक जानकारी के लिए (सामग्री की तालिकादेखें) और माउस की स्थिति का समायोजन, कृपया घंटा एट अल28को देखें.
    3. OCT के इष्टतम छवियों को प्राप्त करने के लिए ध्यान समायोजित करें.
    4. OCT इमेजिंग सॉफ्टवेयर में संकेत लाइन के कोण को समायोजित करें (सामग्री की तालिकादेखें) लगातार hyaloid वाहिकाओं प्रकट करने के लिए और, फिर, छवियों ले.
  3. एफ तरंग च ल्यूरेसीन एक एनजीओग्राफी हायलॉयड वाहिकाओं का इमेजिंग
    1. एक फ्लोरेसिइन समाधान तैयार करें: फ्लोरेसीन समाधान के 1 एमएल (स्टॉक सांद्रता: 100 मिलीग्राम/एमएल) में बाँझ फॉस्फेट-बफर ेड लवण (पीबीएस) के 9 एमएल जोड़ें। अंतिम कार्य समाधान की सांद्रता 10 मिलीग्राम/एमएल है।
    2. अंतरापरिक्षेपण रूप से फ्लोरेसीन कार्य समाधान (5 डिग्री एल/जी शरीर के वजन) को इंजेक्ट करते हैं।
    3. कृत्रिम आँसू के साथ माउस की कॉर्निया moisturize, और फिर, स्थिति चरण पर माउस जगह है.
    4. माउस कॉर्निया के साथ सीधे कोमल संपर्क बनाने के लिए माइक्रोन चतुर्थ रेटिना इमेजिंग माइक्रोस्कोप के लेंस को स्थिति. दृश्य क्षेत्र के केंद्र में ऑप्टिक तंत्रिका सिर की स्थिति के लिए संरेखण थोड़ा समायोजित करें।
    5. एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट चैनल के लिए माइक्रोस्कोप फिल्टर बदलें.
    6. छवियों को लेने के लिए लगातार hyaoid जहाजों पर ध्यान केंद्रित.
    7. hyaloid वाहिकाओं को देखने के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु (संकेत-से-पृष्ठभूमि अनुपात) निर्धारित करने के लिए इंजेक्शन के बाद 1 मिनट, 3 मिनट, 5 मिनट, और 10 मिनट (कोई अधिक से अधिक 10 मिनट) के बाद कई छवियों ले लो। 10 मिनट के भीतर एफएफए प्रक्रिया को पूरा करें, जिसके बाद फ्लोरेसिन भी फैलाना हो सकता है और जहाजों को अदृश्य बना सकता है।
  4. संज्ञाहरण से चूहों की वसूली
    1. प्रक्रियाओं के बाद, एक गर्म हीटिंग पैड पर चूहों रखें.
    2. चूहों उन्हें माउस पिंजरे में वापस करने के लिए फिर से मोबाइल रहे हैं जब तक प्रतीक्षा करें।

2. भाग द्वितीय: hyaoid वाहिकाओं के पूर्व vivo दृश्य

  1. निश्चित माउस आंखों की तैयारी
    1. सही उम्र के चूहों का चयन करें।
      नोट: नवजात चूहों आम तौर पर hyaoid विच्छेदन के लिए P8 पर बलिदान कर रहे हैं. दोनों लिंग उपयुक्त हैं। एक देरी hyaoid प्रतिगमन के साथ उत्परिवर्ती चूहों (और उनके संबंधित WT नियंत्रण) विच्छेदन और वयस्कता भर में विश्लेषण किया जा सकता है.
    2. सीओ2के संपर्क में आने से चूहों का यूथानाइज करें।
    3. कुंद विच्छेदन द्वारा माउस की आँखों को यून्यूक्लिएट करें।
    4. आंखों के लिए उपयोग की अनुमति देने के लिए माइक्रोसर्जरी बल के साथ व्यापक पलकें खोलें। नेत्रगोलक को निचोड़े बिना ऑप्टिक तंत्रिका को समझने के लिए कक्षा में घुमावदार माइक्रोसर्जरी बलको नोंक को कक्षा में रखें। धीरे से खींच और forceps के साथ नेत्रगोलक को हटा दें.
    5. वैकल्पिक रूप से, माइक्रोसर्जरी कैंची का उपयोग करके नेत्रगोलक को कक्षा के पीछे की ओर चार पक्षों से समानांतर काटने और संयोजी ऊतकों के आसपास से ग्लोब को अलग करने के लिए विच्छेदन करें।
    6. निर्धारण के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस बफर में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में आंखों को विसर्जित करें।
    7. बर्फ ठंडा पीबीएस बफर करने के लिए निश्चित eyeballs स्थानांतरण.
      नोट: आंखों के गोले 1 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. जिलेटिन इंजेक्शन के साथ hyaoid वाहिकाओं के एम्बेडिंग
    1. 5% (w/v) जिलेटिन समाधान तैयार करें।
      1. जिलेटिन के 50 मिलीग्राम वजन.
      2. आसुत जल के 1 एमएल में जिलेटिन को भंग करें।
      3. पूरी तरह से भंग जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जिलेटिन समाधान इनक्यूबेट। उपयोग होने तक विलयन को 37 डिग्री सेल्सियस जल में रखें।
        नोट: समाधान का एक बड़ा बैच तैयार किया जा सकता है और aliquots के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। हर बार उपयोग करने से पहले, समाधान एक स्पष्ट स्थिरता प्राप्त करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म करने की जरूरत है।
    2. विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत, अंगमों में काचाभ शरीर में जिलेटिन के 50 डिग्री सेल्सियस घोल को इंजेक्ट करें; विभिन्न स्थलों पर इंजेक्शन 3x दोहराने के लिए चार इंजेक्शन की कुल बनाने के लिए, समान रूप से limbus के आसपास स्थान (चित्र 2ए) .
    3. एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में या 30 मिनट के लिए बर्फ पर आंखों के गोले इनक्यूबेट करने के लिए काचाभ अंतरिक्ष में इंजेक्शन जिलेटिन ठोस.
  3. hyaloid वाहिकाओं का विच्छेदन और अलगाव
    नोट: चित्र ांवथा २ब-ईदेखें.
    1. ऊतक को सुखाने से रखने के लिए पीबीएस युक्त पेट्री डिश में आंखों को रखें। लिम्बस पर माइक्रोसर्जरी कैंची के साथ एक चीरा बनाओ और कॉर्निया को हटा दें।
    2. सूंघना और ऑप्टिक तंत्रिका को हटा दें।
    3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, दो जोड़े बलप्स का उपयोग करने के लिए बंद छील और sclera, choroid, और रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) परतों को त्याग और आईरिस हटा दें.
    4. रेटिना के ऑप्टिक-नेर नेर साइड के साथ ऊपर का सामना करना पड़ रहा है और लेंस की ओर नीचे, रेटिना कप के ठीक नीचे पीबीएस के 50 डिग्री सेल्सियस इंजेक्ट करें ताकि जिलेटिनयुक्त काचाभ शरीर और रेटिना के बीच पीबीएस बफर के संचय की अनुमति मिल सके।
    5. सूक्ष्म शल्य चिकित्सा संदंश के साथ काचाभ शरीर से रेटिना कप और पक्ष्माभी शरीर को धीरे-धीरे छील कर हटा दें।
    6. एक हस्तांतरण pipette का उपयोग करना, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए पीबीएस में डूबे hyaoid ऊतक युक्त जिलेटिन कप हस्तांतरण
    7. बाकी ऊतक (लेंस/हाइलॉयड) को चालू करें, इसलिए लेंस की ओर का सामना करना पड़ रहा है।
    8. लेंस लिफ्ट और धीरे लेंस / टीवीएल और विहिप के बीच संबंध ढीला, और फिर, माइक्रोसर्जरी कैंची के साथ हा कटौती लेंस-TVL को दूर करने के लिए. विहिप फ्लैट माउंट के लिए hyaoid कप का हिस्सा रखें.
  4. फ्लैट बढ़ते और hyaoid वाहिकाओं के धुंधला
    1. सभी विच्छेदन मलबे को हटाने के लिए स्लाइड पर पीबीएस के साथ hyaoid कप धीरे कुल्ला.
    2. सुनिश्चित करें कि hyaoid कप पर्याप्त पीबीएस समाधान में स्लाइड पर चल रहा है.
    3. धीरे से व्यवस्था और माइक्रोसर्जरी बल के साथ जिलेटिनाइज्ड hyaloid कप की स्थिति को समायोजित, स्लाइड पर नीचे का सामना करना पड़ कप के रिम के साथ, पिघलने के बाद इष्टतम उपस्थिति को प्राप्त करने के लिए.
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म स्लाइड पर पीबीएस में डूबे hyaoid कप के साथ स्लाइड प्लेस, जिलेटिन पिघला देता है और hyaoid समतल जब तक प्रतीक्षा करें, और स्लाइड को हटा दें जब यह मुश्किल से सूखा है (अधिक सूखी नहीं है).
    5. (वैकल्पिक) hyaloid वाहिकाओं को इम्यूनोस्टेन करें
      1. अवरुद्ध और मर्मज्ञ बफर (उदा., 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [BSA] और 0.1% Triton X-100 PBS बफर में) बनाओ. एक फ्लैट पर चढ़कर hyaloid अलगाव पर बफर अवरुद्ध के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर यह इनक्यूबेट.
      2. प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 डिग्री सेल्सियस (उदा., CD31) (1:100 बफर को अवरुद्ध करने में कमजोर पड़ने) को hyaloid अलगाव के एक फ्लैट माउंट पर लागू करें, और फिर, इसे रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक गीला बॉक्स में इनक्यूबेट करें।
      3. धीरे से 3x कुल्ला, 5 मिनट के लिए हर बार, PBS के साथ.
      4. माध्यमिक एंटीबॉडी के 50 $L लागू करें (उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी rabbit माध्यमिक एंटीबॉडी-एलेक्सा 488, 1:100 कमजोर पड़ने) hyaloid फ्लैट माउंट पर और यह 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर incubate.
      5. धीरे से 3x कुल्ला, 5 मिनट के लिए हर बार, PBS के साथ.
    6. Hyaoid वाहिकाओं में नाभिक दाग करने के लिए DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) के साथ विरोधी फीका बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें.
    7. फ्लैट माउंट को पूरा करने के लिए हायलॉयड पर धीरे से एक कवरस्लिप रखें।
  5. फ्लैट-माउंटेड हायलॉयड जहाजों की इमेजिंग और परिमाणीकरण
    1. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ hyaoid वाहिकाओं के DAPI धुंधला छवि और सुनिश्चित करें कि केंद्रीय हा दिखाई दे रहा है (एचए के बिना नमूने को छोड़कर).
    2. पोत शाखाओं की पहचान करें जो सीधे एचए से प्राप्त होती हैं और परिमाणीकरण के लिए पोत शाखाओं की संख्या की मैन्युअल रूप से गणना करती हैं।
  6. आंखों के क्रॉस सेक्शन में hyaloid वाहिकाओं का दृश्य
    1. एक उपयुक्त ऊतक मोल्ड में इष्टतम काटने तापमान परिसर में निश्चित आंखों एम्बेड, और फिर, सूखी बर्फ पर एम्बेडेड आँखें फ्रीज या उन्हें एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर.
    2. -20 डिग्री सेल्सियस पर 12 डिग्री मीटर मोटाई के वर्गों में एम्बेडेड आंखों के एक क्रॉस सेक्शन बनाने के लिए एक cryostat microtome का प्रयोग करें।
    3. धीरे स्लाइड का पालन करेंगे, जो ऊतक वर्गों को छूकर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड कमरे के तापमान पर आंख पार वर्गों लीजिए।
    4. एयर-सूखी $ 30 मिनट के लिए ऊतक वर्गों निर्जलित करने के लिए, जो तब एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है जब तक धुंधला के लिए तैयार है.
    5. स्लाइड पर शेष इष्टतम काटने तापमान यौगिक को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड 1x कुल्ला।
    6. (वैकल्पिक) यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त निर्धारण के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक उपयुक्त स्थिर बफर (उदाहरण के लिए, पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड) में स्लाइड विसर्जित करें।
    7. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% Triton एक्स-100 के साथ ऊतक permebilize.
    8. रक्त वाहिका धुंधला करने के लिए आइसोलेटिन-IB4 धुंधला बफर तैयार करें।
    9. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीबीएस के 50 एमएल के साथ आइसोलेटिन-आईबी4 (500 ग्राम) पाउडर को भंग और पुनर्गठित करें।
    10. धीरे-धीरे 1 एम CaCl2 समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, PBS/isolectin-IB4 मिश्रण के 50 एमएल में. यह चरण वर्षा से बचने के लिए धीरे-धीरे किया जाना चाहिए। CaCl2 की अंतिम सांद्रता 1 डिग्री सेल्सियस है। Ca 2+ की उपस्थिति isolectin-IB4 धुंधला के लिए आवश्यक है.
    11. स्लाइड पर आंख पार वर्गों पर आइसोलेक्टिन-आईबी4 धुंधला बफर के 30 डिग्री एल लागू करें और इसे रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक गीले बॉक्स में इनक्यूबेट करें।
    12. कुल्ला 3x, 5 मिनट के लिए हर बार, PBS के साथ.
    13. वर्गों में नाभिक दाग करने के लिए DAPI के साथ विरोधी फीका बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें.
    14. फ्लैट माउंट को पूरा करने के लिए धीरे से ऊतक वर्गों पर एक कवरस्लिप रखें।
    15. आंखों के भीतर hyaloid वाहिकाओं की उपस्थिति कल्पना करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत ऊतक की जाँच करें।

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Representative Results

लाइव चूहों में hyaoid वाहिकाओं के विवो इमेजिंग में
चित्र 3 एक 3 महीने पुराने WT और Lrp5मेंरेटिना और hyaoid ऊतकों के लिए OCT छवियों के पार अनुभागीय विचारों का पता चलता है - चूहों, लगातार hyaloid के साथ एक पशु मॉडल. WT आंख hyaloid ऊतक की अनुपस्थिति से पता चलता है, जबकि Lrp5-/-आंख ऑप्टिक तंत्रिका सिर से प्राप्त दो लगातार hyaloid वाहिकाओं से पता चलता है. चित्र 3 बी 6 सप्ताह पुराने Lrp5में फ्लोरोसेंट क्षेत्र में लगातार hyaoid वाहिकाओं (हरा) के एफएफए छवियों को प्रदर्शित करता है - / WT माउस hyaloid वाहिकाओं का कोई अवशेष से पता चलता है, और Lrp5-/-माउस काचाभ शरीर में hyaloid वाहिकाओं की आठ शाखाओं से पता चलता है.

hyaoid वाहिकाओं के पूर्व vivo दृश्य
चित्र 4 ए,बी फ्लैट mounts में कल्पना के रूप में अलग hyaloid वाहिकाओं को दर्शाता है, जहां संवहनी कोशिकाओं और जुड़े मैक्रोफेज DAPI धुंधला (नीले) के साथ उनके नाभिक द्वारा दाग रहे थे. हा प्रत्येक छवि के केंद्र में है, और hyaoid वाहिकाओं DAPI व्युत्पन्न discontinuous लाइनों द्वारा पता चला रहे हैं. प्रत्येक पंक्ति विहिप के एक पोत का प्रतिनिधित्व करती है। Lrp5-/-चूहों में, शेष hyaoid वाहिकाओं की उच्च संख्या फ्लैट mounts में P8 पर मनाया गया (चित्र 4ए). WT चूहों P8 में hyaloid जहाजों की 12 शाखाओं के एक औसत था, जबकि उम्र से मेल खाता Lrp5-/- पिल्ले hyaloid वाहिकाओं के 25 शाखाओं के आसपास दिखाया, hyaloid vasculature के एक काफी बिगड़ा प्रतिगमन का प्रदर्शन (चित्र 4) बी) इसके अलावा, देरी और अपूर्ण रेटिना संवहनी विकास, एक अन्य विशेषता अक्सर लगातार hyaloid वाहिकाओं के साथ जुड़े, भी Lrp5में मनाया गया - / चित्र ााालक 5 में Lrp5 के क्रॉस सेक्शनों में शेष hyaloid वाहिकाओं को दिखाया गया है -/-आँखें P8 पर, जबकि WT आँखें hyaoid वाहिकाओं को प्रदर्शित नहीं करते.

Figure 1
चित्र 1 : Schematic आरेख माउस आँखों में hyaoid vasculature के विकास प्रतिगमन का चित्रण. HYAoid जहाजों और शाखाओं, विहिप, TVL, और प्रधानमंत्री सहित, हा से प्राप्त कर रहे हैं, और जन्म के समय लेंस और अपरिपक्व रेटिना के बीच अंतरिक्ष के बहुत पर कब्जा (पी0). चूहों में Hyaoid involution के रूप में जल्दी P4 के रूप में प्रधानमंत्री केशिकाओं के प्रतिगमन के साथ शुरू होता है. पी 8 में, प्रधानमंत्री, विहिप, और TVL परतों लगातार पीछे हटना, रेटिना जहाजों की सतही परत के पूर्ण गठन के साथ coinciding. पी 12 तक, पीएम परत का अंतर्वलन पूरा हो गया है, जबकि विहिप और टीवीएल का शोष अभी भी प्रगति पर है। इस बीच, रेटिना वाहिकाओं की एक गहरी परत P7-P12 के दौरान बनाने के लिए शुरू होता है. P16 तक, hyaoid प्रणाली के प्रतिगमन आंशिक रूप से पूरा हो गया है (शेष TVL जहाजों और हा छोड़ दिया के साथ), और रेटिना संवहनी जाल की मध्यवर्ती परत विकसित करने के लिए जारी है. रेटिना वाहिका P21 द्वारा पूरी तरह से परिपक्व है और hyaloid वाहिकाओं, जो अब ज्यादातर प्रतिगामी हैं से पौष्टिक रेटिना ऊतकों की भूमिका पर ले जाता है. च21 में, काचाभ, hyaloid वाहिकाओं की अनुपस्थिति में, एक स्पष्ट दृश्य मार्ग से पता चलता है. डैश्ड लाल रेखाएं प्रतिगामी वाहिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं। VHP [ वासा hyaloidea propria; टी.वी.एल. - ट्यूनिका वास्कुलोसा लेन्टिस; प्रधानमंत्री - pupilary झिल्ली; हा एक मोठा धमनी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : पूर्व विवो के लिए hyaloid पोत अलगाव की अनुक्रमिक प्रक्रिया का चित्रण Schematic आरेख सपाट-माउंटिंग दृश्य. (क) अंगों पर चार इंजेक्शन बिंदुओं (लाल बिंदु) के माध्यम से एनन्यूक्लियड नेत्र में जिलेटिन का इंजेक्शन, काष्ठीय शरीर को ठोस बनाने के लिए। (बी) कॉर्निया और ऑप्टिक तंत्रिका को हटाना, आईरिस का सावधान विच्छेदन, और स्क्लेरा-कोरोइड-आरपीई परिसर को छीलना। (सी) शेष रेटिना कप को लेंस के साथ फ़्लिप करके रेटिना पक्ष का सामना करना पड़ता है; फिर, उन्हें अलग करने के लिए रेटिना और काचाभ शरीर के बीच पीबीएस इंजेक्शन, रेटिना परत बंद छीलने के बाद। (घ) शेष ऊतक को फिर से उल्टा करते हुए, जिसमें लेंस को आस-पास के hyaloid के साथ रखा जाता है. लेंस थोड़ा उठाने के लिए TVL और विहिप के कनेक्शन ढीला. (ई) टीवीएल और विहिप के बीच एचए में काटना, और लेंस और TVL को हटाने. सपाट-बढ़ते विहिप परत. VHP [ वासा hyaloidea propria; टी.वी.एल. - ट्यूनिका वास्कुलोसा लेन्टिस; प्रधानमंत्री - pupilary झिल्ली; हा एक मोठा धमनी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी (OCT) के साथ hyaloid जहाजों के vivo इमेजिंग में और फंडस फ्लोरोसेंट एंजियोग्राफी (एफएफए)। एक:WT और Lrp5 के प्रतिनिधि OCT छवियों - /-चूहों 3 महीने की उम्र में Lrp5मेंकाचाभ अंतरिक्ष में लगातार hyaoid वाहिकाओं दिखा - / बी:डब्ल्यूटी और Lrp5के प्रतिनिधि एफएफए छवियों - / चूहे संज्ञाहरण के बाद माउस प्रति 0.1ml saline में 1mg fluorescein सोडियम के साथ इंजेक्शन थे, और छवियों इंजेक्शन के बाद 5 मिनट लिया गया, Lrp5में hyaoid वाहिकाओं पर ध्यान केंद्रित - / लगातार hyaoid वाहिकाओं Lrp5में कल्पना की गई - / लेकिन WT आँखें नहीं. लाल तीर hyaoid वाहिकाओं का संकेत मिलता है. दोनों पैमाने पर सलाखों: 100 डिग्री मी (एक)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : देरी hyaoid पोत प्रतिगमन और Lrp5मेंदेरी रेटिना vasculature विकास का दृश्य - / (ए) डब्ल्यूटी और Lrp5 में DAPI (नीले) के साथदाग फ्लैट घुड़सवार hyaloid जहाजों के प्रतिनिधि छवियों - P8 पर आँखें. तीर (सफेद) hyaoid धमनी का संकेत. (बी) डब्ल्यूटी और Lrp5मेंhyaoid धमनी से शाखा hyaloid वाहिकाओं की संख्या का परिमाणीकरण / (ग) प्रतिनिधि फ्लैट पर चढ़कर रेटिना WT और Lrp5मेंvascualture के लिए आइसोलेटिन-IB4 (लाल) के साथ दाग - P8 पर आँखें. सफेद डैश्ड रेखाएं रेटिना किनारे को इंगित करती हैं। पीली रेखाएं संवहनी क्षेत्र के किनारे को इंगित करती हैं। (घ) डब्ल्यूटी और एलआरपी5 में सतही रेटिना संवहनी जाल के संवहनी कवरेज का परिमाणीकरण-/-आंखें। द 8ण्12/समूह। पैनल ए और सी में स्केल बार्स - 1 मिमी. डेटा को मतलब के रूप में दिखाया गया है - SEM. दो पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया गया था। ** पी एंड एलटी; 0.01. यह आंकड़ा वांग एट अल27से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : Lrp5 के पार वर्गों में hyaoid वाहिकाओं का दृश्य - / WT और Lrp5 से अलग आँखों के पार वर्गों के प्रतिनिधि छवियों -/-P8 पर चूहों. आँखें enucleated और इष्टतम काटने के तापमान में एम्बेडेड थे, और वर्गों cryostat का उपयोग कर काट रहे थे. रक्त वाहिकाओं को दिखाने के लिए नाभिक और आइसोलेक्टिन-आईबी4 (लाल) को दिखाने के लिए क्रॉस सेक्शन को डीएपीआई (नीले) से दागा गया था। सफेद तीर hyaoid वाहिकाओं से संकेत मिलता है. स्केल बार - 500 डिग्री मी. यह आंकड़ा चेन एट अल16से अनुमति के साथ अनुकूलित है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

तकनीक का आकलन करने और hyaoid वाहिकाओं की विशेषता के लिए पशु मॉडल में hyaoid पोत प्रतिगमन का निरीक्षण करने के लिए सहज और आवश्यक प्रक्रियाओं रहे हैं, विकास के दौरान संवहनी प्रतिगमन अंतर्निहित तंत्र पर अध्ययन की अनुमति देने के लिए. जबकि में विवो रेटिना इमेजिंग एक ही जानवर में hyaloid प्रतिगमन के अनुदैर्घ्य अवलोकन की अनुमति देता है, OCT और FFA के लिए एक कृंतक fundus इमेजिंग प्रणाली के लिए उपयोग एक सीमित कारक हो सकता है. इसके अलावा, लाइव चूहों में विवो इमेजिंग में संभव नहीं है इससे पहले कि वे अपनी आँखें खोलो. इसलिए, यह पद्धति नवजात अवस्था में नेत्र विकास के दौरान लागू नहीं होती है। दूसरी ओर, जबकि अलग आँखों के इमेजिंग पार वर्गों माउस के किसी भी उम्र के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक कम तकनीकी बाधा है, यह मात्रात्मक नहीं है जब वहाँ केवल कुछ ही दिखाई hyaloid वाहिकाओं रहे हैं, और एक आदर्श छवि प्राप्त करने का मौका काफी हद तक पर निर्भर करता है अनुभागन कोण (चित्र 5) इसकी तुलना में, फ्लैट माउंट दृश्य के लिए hyaloid जहाजों के अलगाव पूरे hyaloid पोत और सटीक परिमाणीकरण की पूरी इमेजिंग की अनुमति देता है, अभी तक तकनीकी चुनौतियों hyaloid वाहिकाओं के नाजुक और नाजुक प्रकृति के कारण मौजूद हो सकता है. हमें उम्मीद है कि इस पत्र में विस्तृत प्रोटोकॉल इन चुनौतियों पर काबू पाने में मदद करता है।

hyaoid अलगाव प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम जिलेटिन समाधान के इंजेक्शन, रेटिना को हटाने, और अंतिम फ्लैट बढ़ते शामिल हैं. hyaoid vascualture से निपटने की तकनीकी कठिनाई अपने नाजुक प्रकृति में निहित है, लगभग तरल की तरह की स्थिति काचाभ जहां hyaoid वाहिकाओं रहते हैं, और आसन्न लेंस और रेटिना के साथ अपने करीबी संबंध. जिलेटिन समाधान इंट्राविटल रूप से hyaloid वाहिकाओं युक्त काचाभ शरीर को मजबूत करने के लिए महत्वपूर्ण है और, इस तरह, आसान विच्छेदन और हैंडलिंग के लिए उनकी बनावट मजबूत बनाने। जिलेटिन एक जेलिंग एजेंट है जो पारदर्शी लोचदार तापक्रमी जैल का निर्माण करता है। जिलेटिन के तरल रूप (कमरे के तापमान पर या 37 डिग्री सेल्सियस पर) को काचाभ अंतरिक्ष में इंजेक्शन लगाकर और इसे कम तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) में ठंडा करके, काचाभ शरीर एक मजबूत जेल कप में बदल जाता है। आंख में कई जिलेटिन इंजेक्शन प्रदर्शन एक वर्दी और गोल जिलेटिन hyaloid ऊतक कप के रूप में, vitreous अंतरिक्ष में जिलेटिन की एक पर्याप्त राशि का पूरा फैलाव की अनुमति देता है। एक अन्य तकनीकी कठिनाई hyaoid ऊतक को नुकसान पहुँचाए बिना रेटिना को हटाने में निहित है. कोरॉइड के विपरीत, जो अलग-अलग विच्छेदन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, hyaloid वाहिकाओं युक्त जिलेटिनयुक्त काचाभ शरीर hyaoid को नुकसान पहुँचाए बिना पास के रेटिना से अलग करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। हमने पाया कि काचा भोंडेके शरीर और रेटिना के बीच के स्थान में पीबीएस का इंजेक्शन लगाने से एक तरल बफर परत उत्पन्न होती है, जिससे इन दोनों ऊतकों को अलग करना बहुत आसान हो जाता है। यह कुछ हद तक कैप्सूल और मोतियाबिंद प्रांतस्था को अलग करने के लिए मोतियाबिंद सर्जरी में इस्तेमाल hydrodissection तकनीक के समान है। अंतिम फ्लैट बढ़ते प्रोटोकॉल के अंतिम तकनीकी रूप से मुश्किल कदम है. एक स्लाइड गर्म पर एक पीबीएस बूंद में जिलेटिनाकृत hyaloid ऊतक वार्मिंग यह एक और अधिक तरल की तरह फार्म को वापस धर्मान्तरित आसान फ्लैट बढ़ते अनुमति देने के लिए. उचित व्यवस्था और hyaoid जेल कप के उन्मुखीकरण अभी भी पिघलने और सुखाने के बाद अपने भी समतल सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है.

hyaoid जहाजों को अलग करने के प्रोटोकॉल आगे कई मायनों में संशोधित किया जा सकता है. जिलेटिन समाधान हम इस्तेमाल की एकाग्रता 5% है, अभी तक उच्च या कम सांद्रता भी काम कर सकते हैं, से निपटने के लिए एक मजबूत या नरम बनावट को प्राप्त करने के लिए शोधकर्ता की वरीयता के आधार पर. सेलुलर नाभिक के डीएपीआई दाग भी आइसोलेक्टिन-IB4 या अन्य endothelial सेल या मैक्रोफेज मार्करों के साथ संशोधित किया जा सकता है, बेहतर मैक्रोफेज से संवहनी endothelial कोशिकाओं भेद करने के लिए. सावधानी का एक शब्द: फ्लैट घुड़सवार hyaloid जहाजों बहुत नाजुक हैं और केवल ढीला स्लाइड का पालन किया; इसलिए, hyaoid स्लाइड बहुत धीरे से संभाला और ध्यान से अगर दाग के दौरान rinsing की जरूरत है की जरूरत है. इस अलगाव प्रोटोकॉल भी ठीक विच्छेदन प्रदर्शन की जटिलता और नाजुक ऊतक की प्रकृति के कारण नमूनों की लंबी अवधि के संरक्षण की कठिनाई सहित अपनी सीमाएं हैं. फिर भी, अलग और फ्लैट-माउंटिंग hyaloid वाहिकाओं अभी भी hyaoid vasculateका अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक और सहज तरीका है, नेत्र और एंजियोजेनेसिस अध्ययन को बढ़ावा देने केलिए 10,17,27, 29,30,31.

hyaoid vascualture विकास पोत विकास और प्रतिगमन, नेत्र विज्ञान, एंजियोजेनेसिस में अनुसंधान क्षेत्रों के लिए प्रासंगिक अध्ययन का एक उत्कृष्ट प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है, और क्रमादेशित सेल मौत, जिसके साथ इस कागज की सहायता करना है. अलगाव प्रोटोकॉल के भविष्य के संशोधनों को एक तकनीकी विच्छेदन प्रक्रिया की व्यवहार्यता में सुधार लाने के लिए निर्देशित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, विवो इमेजिंग और hyaloid वाहिकाओं के पूर्व vivo अलगाव में संयुक्त संवहनी प्रतिगमन का एक उपयोगी मॉडल के रूप में चूहों में पूर्ण मूल्यांकन और hyaloid वाहिकाओं की विशेषता की अनुमति देने के लिए एक लाभप्रद तरीका है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान (R01 EY024963 और EY028100) द्वारा जे.सी. जेडडब्ल्यू को समर्थित किया गया था एक शूरवीरों टेम्पलर नेत्र फाउंडेशन कैरियर स्टार्टर अनुदान द्वारा समर्थित था। hyaoid अलगाव प्रक्रिया इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल से संशोधन के साथ अनुकूलित किया गया था उदारता से Drs. रिचर्ड लैंग, Toshihide Kurihara, और लोइस स्मिथ, जिसे लेखक आभारी हैं द्वारा साझा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AK-Fluor (fluorescein injection, USP) Akorn 17478-253-10
Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
Antifade mounting medium Thermo Fisher S2828
Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Artificial tear eyedrop Systane N/A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2058
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory Stock NO: 000664
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016
Cryostat Leica CM3050S
Cryostat Leica CM3050 S
Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop Cyclomydril N/A
Gelatin  Sigma-Aldrich G9382
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008
Heating board Lab-Line Instruments Inc. N/A
Isolectin GS-IB4, 594 conjugate ThermoFisher Scientific I21413
Ketamine hydrochloride injection KetaVed NDC 50989-996-06
Lrp5-/- mice The Jackson Laboratory Stock NO. 005823 Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA
Micron IV and OCT Phoenix Research Labs N/A Imaging software: InSight
Microscope Zeiss discovery v8
Microsurgery forceps Scanlan International 4004-05
Microsurgery scissors Scanlan International 6006-44
Optimal cutting temperature compound Tissue-Tek 4583
Optimal cutting temperature compound Agar Scientific AGR1180
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) Fisher Scientific 12-20
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) Teknova P0496
Slide cover glass Premiere 94-2222-10
Superfrost microscope slides  Fisherbrand 12-550-15
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Xylazine sterile solution Akorn: AnaSed NDC: 59399-110-20

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References

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चिकित्सा अंक 147 आंख hyaoid वाहिकाओं संवहनी प्रतिगमन फ्लैट माउंट विकास LRP5 Wnt
चूहे में Hyaoid जहाजों का आकलन और विशेषता
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Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice. J. Vis. Exp. (147), e59222, doi:10.3791/59222 (2019).

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