Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Vurdering og karakterisering av Hyaloid fartøy i mus

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59222
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2The Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

Summary

Denne protokollen beskriver både in vivo og ex vivo metoder for fullt visualisere og karakterisere hyaloid fartøy, en modell av vaskulær regresjon i muse øyne, ved hjelp av optisk sammenheng tomografi og fundus fluorescein angiografi for Live Imaging og ex vivo og påfølgende flatmontering av hyaloid for kvantitativ analyse.

Abstract

I øyet, den embryonale hyaloid fartøy ernære utvikle linsen og Retina og regress når retinal fartøy utvikle. Vedvarende eller mislykket regresjon av hyaloid fartøy kan sees i sykdommer som vedvarende hyperplastisk primære glasslegemet (PHPV), fører til en hindret lys bane og nedsatt visuell funksjon. Forstå mekanismene underliggende hyaloid fartøyet regresjon kan føre til ny molekylær innsikt i vaskulær regresjon prosessen og potensielle nye måter å håndtere sykdommer med vedvarende hyaloid fartøy. Her beskriver vi prosedyrene for Imaging hyaloid i live mus med optisk sammenheng tomografi (OCT) og fundus fluorescein angiografi (FFA) og en detaljert teknisk protokoll for å isolere og flat-montering hyaloid ex vivo for kvantitativ analyse. Lav tetthet lipoprotein reseptor-relaterte protein 5 (LRP5) knockout mus ble brukt som en eksperimentell modell av vedvarende hyaloid fartøy, for å illustrere teknikkene. Sammen, disse teknikkene kan forenkle en grundig vurdering av hyaloid fartøy som en eksperimentell modell av vaskulær regresjon og studier på mekanismen av vedvarende hyaloid fartøy.

Introduction

Blodtilførselen i øyet er avgjørende for å sikre normal utvikling av netthinnen og omkringliggende øye vev og å utstyre en riktig visuell funksjon. Det er tre vaskulære senger i øyet: retinal blodkar, akkord, og en forbigående embryonale sirkulasjons nettverk av hyaloid fartøy. Utviklingen av øye blodkar krever romlig og timelig koordinering gjennom embryogenesis og vevs modning. Blant de tre vaskulære senger, er hyaloid blodkar den første funksjonelle blodtilførsel system for å gi næring og oksygen til den nyopprettede embryonale linsen og utvikle netthinnen. Hyaloid fartøy regress på samme tid som Retina vasculatures utvikle og modne1. Den regresjon av hyaloid blodkar er avgjørende for å tillate en klar visuell vei for utvikling av visuell funksjon; Derfor er dette vaskulær regresjon prosessen like viktig som veksten av retinal blodkar. Nedsatt hyaloid regresjon kan føre til øyesykdommer. Videre gir regresjon av hyaloid fartøy en modell system for å undersøke cellulære og molekylære mekanismer involvert i regulering av vaskulær regresjon, som kan ha implikasjoner for angiogenic regulering i andre organer også.

Hyaloid blodkar, avledet fra hyaloid arterien (HA), er sammensatt av Vasa hyaloidea propria (VHP), tunika vasculosa lentis (TVL), og Pupillary membran (PM). Det gir næring til å utvikle netthinnen, den primære glasslegemet, og linsen under embryonale utviklingen2. Som følge av HA, VHP grener anteriort gjennom glasslegemet til linsen. Den TVL kopper bakre overflaten av linsen kapselen, og anastomoser til PM, som kobles til fremre ciliary arterier, som dekker den fremre overflaten av objektivet2,3, noe som resulterer i dannelsen av et nettverk av fartøy i PM 3 andre priser , 4 andre priser , 5. interessant, det er ingen årer i hyaloid blodkar, og systemet gjør bruk av koroidal årer for å oppnå venøs drenering.

I det menneskelige embryo, den hyaloid blodkar er nesten fullført på omtrent den niende uken av svangerskapet og begynner å regress når de første retinal fartøy vises, i løpet av den fjerde måneden av svangerskapet2. Begynner med atrofi av VHP, regresjon av kapillær nettverk av TVL, PM, og til slutt, det ha skjer senere2,3. I mellomtiden begynner den primære glasslegemet trekkes og den sekundære glasslegemet til å danne, sammensatt av ekstracellulære matrise komponenter, inkludert kollagen fibre. Ved den sjette måneden av svangerskapet, er den primære glasslegemet redusert til en liten gjennomsiktig kanal som strekker seg fra optisk nerve platen til linsen, kalt Cloquet kanal eller hyaloid kanalen, og den sekundære glasslegemet blir den viktigste komponenten i bakre segmentet 2 andre priser , 3. The hyaloid sirkulasjon forsvinner det meste på 35 til 36 uker av svangerskapet, like før fødselen3.

I motsetning til mennesker, i hvem hyaloid blodkar er helt regressed ved fødselen, begynner musen hyaloid vaskulære systemet til regress etter fødselen. Som musen Retina er født Avascular og retinal fartøy utvikle fødselen, hyaloid fartøy regress samtidig fra postnatal dag (P) 4 og er for det meste helt regressed av P216 (figur 1). Den PM forsvinner først mellom P10 og P12, og VHP forsvinner mellom P12 og P16, mens et lite antall TVL og HA celler forblir selv på P16, og ved P21 hyaloid vaskulær system regresjon er nesten komplett6. I mellomtiden begynner retinal blodkar utvikle etter fødselen. Det overfladiske laget av vaskulær plexus strekker seg helt til den perifere Retina på P7-P8, det dype laget (ligger i det ytre plexiform lag) utvikler fra P7 – P12, og til slutt, mellomliggende plexus i det indre plexiform laget utvikler mellom P12 og P157 . Som retinal blodkar utvikler, det gradvis erstatter funksjonen av samtidig regressing hyaloid fartøy, som gir næring og oksygen til å utvikle øyet. Den postnatal forekomsten av hyaloid fartøy regresjon i mus gir en lett tilgjengelig eksperimentell modell for å observere og studere hyaloid blodkar, samt molekylær grunnlaget for vaskulær regresjon prosesser under både fysiologiske og patologiske tilstander8.

Unnlatelse av hyaloid regresjon kan sees i sykdommer som PHPV, som er en sjelden medfødt utviklingsmessige anomali av øyet som følge av en mislykket eller ufullstendig regresjon av embryological, primær glasslegemet og hyaloid blodkar9. Mekanismene som regulerer regresjon prosessen av hyaloid blodkar er kompliserte og grovt studert. En stor molekylær sti avgjørende for normal regresjon av hyaloid fartøy er wnt signalering Pathway10, som genetiske mutasjoner i denne veien påvirker både wnt ligand og reseptorer har vært knyttet til PHPV i mennesker9. Eksperimentelle studier identifiserte en wnt ligand, Wnt7b, som er produsert av makrofager rundt hyaloid fartøy i utviklings øye å megle denne prosessen regresjon. Wnt7b aktiverer wnt signalering ved binding med reseptorene frizzled4 (FZD4)/LRP5 i tilstøtende endothelial celler for å initiere celle apoptose, fører til regresjon av hyaloid fartøy10. Som et resultat, Wnt7b-mangelfull mus viser en utholdenhet av hyaloid fartøy10. Tilsvarende, en uvanlige stavevariasjoner wnt ligand, Norrin (kodet av NDP Gene), binder også til FZD4/LRP5 å indusere den hyaloid fartøyet regresjon under utvikling. NDPy/-, Lrp5-/-, og Fzd4-/- mus alle skjerm utsatt hyaloid fartøy regresjon, støtte en kritisk regulatoriske rolle wnt signalering11,12, 13,14,15,16. Videre, en annen wnt coreceptor LRP6 overlapper med LRP5 i deres funksjon på modulerende den wnt signalering veien i hyaloid vaskulær endothelial celler17. Andre faktorer som også kan bidra til hyaloid regresjon inkluderer hypoksi-induserbart faktor18,19, vaskulær endothelial vekstfaktor20,21, kollagen-1822, 23, Arf24, angiopoietin-225, og bein Morfogenetiske protein-426. I denne utredningen bruker vi Lrp5-/- mus som en modell av vedvarende hyaloid fartøy for å demonstrere teknikker for vurdering og karakteriserer av hyaloid blodkar gjennom både in vivo-og ex vivo-metoder.

Visualiseringen av hyaloid blodkar in vivo og ex Vivo er avgjørende for å studere mekanismene for hyaloid fartøy regresjon. Gjeldende metoder for å observere hyaloid blodkar hovedsakelig fokusere på å visualisere og analysere VHP og HA, gjennom OCT og FFA bilder, øye kryss seksjoner, og hyaloid flat Mount. OCT og FFA er kraftige in vivo Imaging verktøy, slik at langsgående observasjon i levende dyr etter at de har åpnet øynene. Videre, isolert hyaloid flat Mount gir visualisering av hele hyaloid blodkar og et middel for å oppnå en nøyaktig kvantifisering av fartøyet tall. Men den delikate og skjøre natur hyaloid fartøy og de resulterende tekniske vanskeligheter av sin isolasjon kan ha begrenset bruken i øye forskning noe10,17,27. I denne utredningen gir vi en detaljert protokoll for visualisering av hyaloid fartøy, som kombinerer både in vivo Live Retinal Imaging og ex vivo isolert hyaloid flatt feste for å øke muligheten for disse teknikkene. Denne protokollen er tilpasset med modifisering og utvidelse fra tidligere publikasjoner på in vivo-metoden for Live fundus og OCT Imaging28 og ex vivo-metoden til isolert hyaloid flat Mount11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr ble behandlet i samsvar med foreningen for forskning i Vision og Oftalmologi (ARVO) statement for bruk av dyr i øye-og Visjons forskning for dyre eksperimenter, etter retningslinjene for National Institutes of Health ( NIH) om omsorg og bruk av dyr for eksperimentelle prosedyrer og regelverket fastsatt av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved Boston Children ' s Hospital. Lrp5-/- mus (lager nr. 005823; Jackson Laboratory) og dens vill-type (WT) kontroll C57BL/6J mus (Stock no. 000664; Jackson Laboratory) ble brukt for denne studien.

1. del i: in vivo Imaging av hyaloid fartøy med en gnager Retinal Imaging system

  1. Utarbeidelse av mus anestesi og elev utvidelse
    1. Velg musene.
      1. Bruk mus som er eldre enn P12 (etter at de har åpnet øynene) for Netthinne avbildning; begge kjønn er egnet.
      2. Som ønsket, bilde mutant mus med forsinket hyaloid regresjon (og deres WT kontroller) gjennom voksen alder. WT mus eldre enn 3 uker kan ikke vise mye synlig gjenværende hyaloid fartøy, derav P12-P21 er ideell for Imaging gjenværende synlige WT hyaloid.
    2. Forbered en ketamin/xylazine blanding for anestesi.
      1. Ta 2,3 mL ketamin lager oppløsning (100 mg/mL) og 0,7 mL xylazine lagerløsning (20 mg/mL) og tilsett 20 mL sterilt saltvann (0,9% natriumklorid) for å lage en fungerende løsning av en ketamin/xylazine blanding (10 mg/mL ketamin og 0,6 mg/mL xylazine).
    3. Bedøve musene ved intraperitonealt injisere ketamin/xylazine blanding i et volum på 8x musen kroppsvekt (f. eks, en 20 g musen trenger 160 μL av ketamin/xylazine arbeider løsning blanding for å oppnå en fungerende dose av ketamin [80 mg/kg kroppsvekt] og xylazine [4,8 mg/kg kroppsvekt] blanding).
    4. Påfør én dråpe elev-strekke legemiddel løsning (se tabell over materialer) for hvert øye for å dilate elevene umiddelbart etter anestesi.
    5. Vurdere nivået av anestesi ved pedal refleks (fast hindlimb bentap toe klype). Vent til musen er tilstrekkelig anesthetized (ingen pedal refleks) og dens elever er vidt utvidet.
  2. Optisk sammenheng tomografi avbildning av hyaloid fartøy
    1. Fukte musen er hornhinner med kunstige tårer, og deretter plassere musen på posisjonering scenen.
    2. Ta forsiktig kontakt med musen hornhinnen med linsen på OCT sonde. Juster musen og sonden slik at det optiske nerve hodet er i midten av det visuelle feltet i det fundus bildet, for å veilede OCT-Imaging.
      Merk: for mer informasjon om den generelle oppsett av en gnager Retinal Imaging system (se tabell over materialer) og justere musen posisjon, henvises til Gong et al.28.
    3. Juster fokus for å oppnå optimale bilder av OCT.
    4. Juster vinkelen på den angitte linjen i tilpasningsprogramvaren for OCT (se tabell over materialer) for å avdekke vedvarende hyaloid fartøy og deretter ta bilder.
  3. F undus f luorescein en egen ngiography Imaging av hyaloid fartøy
    1. Forbered en fluorescein løsning: tilsett 9 mL sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) til 1 mL fluorescein oppløsning (lager konsentrasjon: 100 mg/mL). Konsentrasjonen av den endelige arbeids løsningen er 10 mg/mL.
    2. Intraperitonealt injiserer den fluorescein arbeids løsningen (5 μL/g kroppsvekt).
    3. Fukte musen hornhinnen med kunstige tårer, og deretter plassere musen på posisjonering scenen.
    4. Plasser objektivet på mikron IV Netthinne bilde mikroskop for å gjøre direkte skånsom kontakt med muse hornhinnen. Juster justeringen litt for å plassere det optiske nerve hodet i midten av visningsfeltet.
    5. Endre mikroskop filteret til en grønn fluorescerende kanal.
    6. Fokuser på vedvarende hyaloid fartøy for å ta bilder.
    7. Ta flere bilder etter 1 min, 3 min, 5 min, og 10 min (ikke mer enn 10 min) etter injeksjon for å finne det beste tids punktet (signal-til-bakgrunn-forhold) for å observere hyaloid fartøy. Fullfør FFA prosedyren innen 10 min, hvoretter fluorescein kan bli for diffust og gjøre fartøy usynlige.
  4. Gjenoppretting av mus fra anestesi
    1. Etter prosedyrene, holde mus på en varm oppvarming pad.
    2. Vent til musene er mobile igjen for å returnere dem til muse buret.

2. del II: ex vivo visualisering av hyaloid fartøy

  1. Utarbeidelse av faste muse øyne
    1. Velg mus av riktig alder.
      Merk: nyfødte mus er vanligvis ofret på P8 for hyaloid disseksjon. Begge kjønn er egnet. Mutant mus med forsinket hyaloid regresjon (og deres respektive WT-kontroller) kan bli dissekert og analysert gjennom hele voksen alder.
    2. Euthanize musene ved eksponering for CO2.
    3. Enucleate øynene med butt disseksjon.
    4. Åpne øyelokkene bredt med mikrokirurgi tang for å gi tilgang til øyeeplet. Plasser buet mikrokirurgi tang under kloden i banen for å forstå den optiske nerven uten å klemme øyeeplet. Trekk forsiktig og fjern øyeeplet med tang.
    5. Alternativt, analysere øyeeplet ved hjelp mikrokirurgi saks for å nøye kutte parallelt med kloden fra de fire sidene mot baksiden av bane og skille verden fra omkringliggende bindevev.
    6. Dypp øynene i 4% paraformaldehyde i PBS buffer i 30 min ved romtemperatur for fiksering.
    7. Overfør de faste øynene til iskaldt PBS-buffer.
      Merk: øynene kan oppbevares i PBS ved 4 ° c i opptil 1 uke.
  2. Innebygging av hyaloid fartøy med gelatin injeksjon
    1. Forbered en 5% (w/v) gelatin løsning.
      1. Veie ut 50 mg av gelatin.
      2. Løs opp gelatin i 1 mL destillert vann.
      3. Ruge gelatin oppløsningen i et vannbad på 37 ° c til den er helt oppløst. Oppbevar oppløsningen i 37 ° c vann til den brukes.
        Merk: en større gruppe med løsninger kan fremstilles og oppbevares ved 4 ° c som alikvoter. Hver gang før bruk må løsningen varmes opp i vannbadet på 37 ° c for å oppnå en klar konsistens.
    2. Under et disseksjon mikroskop, Injiser 50 μL av gelatin oppløsning i glasslegemet ved limbus; Gjenta injeksjonen 3x på forskjellige steder for å gjøre totalt fire injeksjoner, jevnt fordelt rundt limbus (figur 2a).
    3. Ruge øynene i et kjøleskap på 4 ° c eller på is i 30 minutter for å stivne den injisert gelatin i glasslegemet plass.
  3. Disseksjon og isolering av hyaloid fartøy
    Merk: se figur 2B-E.
    1. Plasser øynene i en Petri parabolen inneholder PBS å holde vevet fra tørking. Lag et snitt med mikrokirurgi saks på limbus og fjerne hornhinnen.
    2. Klipp og fjern optisk nerve.
    3. Under et disseksjon mikroskop, bruk to par tang for å skrelle av og forkaste sclera, akkord, og retinal pigment epitel (RPE) lag og fjerne Iris.
    4. Med den optiske nerve siden av netthinnen vendt opp og linsen ned, injiserer du 50 μL av PBS like under Retina-koppen for å tillate akkumulering av PBS-bufferen mellom den gelatinized glasslegemet og netthinnen.
    5. Forsiktig skrelle av og fjerne Retina koppen og ciliary kroppen fra glasslegemet med mikrokirurgi tang.
    6. Ved hjelp av en overføring pipette, overføre gelatin koppen inneholder hyaloid vevet nedsenket i PBS til et mikroskop lysbilde
    7. Drei resten av vevet (linse/hyaloid) over, slik at linse siden vender opp.
    8. Løft linsen og løsne forsiktig forbindelsen mellom Lens/TVL og VHP, og deretter, skjær HA med mikrokirurgi saks for å fjerne Lens-TVL. Oppbevar VHP-delen av hyaloid koppen for den flate braketten.
  4. Flat montering og farging av hyaloid fartøy
    1. Skyll forsiktig hyaloid koppen med PBS på lysbildet for å fjerne alt disseksjon rusk.
    2. Pass på at hyaloid koppen flyter på lysbildet i tilstrekkelig PBS-løsning.
    3. Forsiktig ordne og justere plasseringen av gelatinized hyaloid kopp med mikrokirurgi tang, med kanten av koppen vendt ned på lysbildet, for å oppnå optimalt utseende etter smelting.
    4. Plasser lysbildet med hyaloid koppen nedsenket i PBS på en sklie varmere ved 37 ° c, vent til gelatin smelter og hyaloid flater, og ta ut lysbildet når det er knapt tørt (ikke over-tørr).
    5. Valgfritt Immunostai de hyaloid fartøyene
      1. Gjør blokkering og gjennomtrengende buffer (f. eks, 5% storfe serum albumin [BSA] og 0,1% Triton X-100 i PBS buffer). Tilsett 50 μL av blokkerings buffer på en flat montert hyaloid isolering og ruge den ved romtemperatur i 30 minutter.
      2. Påfør 50 μL av primær antistoff (f.eks. CD31) (1:100 fortynning i blokkerings buffer) på et flatt feste av hyaloid isolasjon, og deretter ruge det i en våt boks ved 4 ° c over natten.
      3. Skyll forsiktig 3x, i 5 min hver gang, med PBS.
      4. Påfør 50 μL av sekundær antistoff (f.eks. geit anti-kanin sekundær antistoff-Alexa 488, 1:100 fortynning) på den hyaloid flate braketten og ruge den ved romtemperatur i 1 time.
      5. Skyll forsiktig 3x, i 5 min hver gang, med PBS.
    6. Legg til en dråpe anti-fade montering medium med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) for å beis kjerner i hyaloid fartøy.
    7. Plasser en dekkglass forsiktig på hyaloid for å fullføre den flate braketten.
  5. Bildebehandling og kvantifisering av hyaloid fartøy med flatmontering
    1. Bilde av DAPI farging av hyaloid fartøy med et fluorescerende mikroskop og sørg for at den sentrale HA er synlig (utelukke prøvene uten HA).
    2. Identifiser fartøy grener som er direkte avledet fra HA, og Tell antall fartøy grener for kvantifisering manuelt.
  6. Visualisering av hyaloid fartøy i kors delen av øynene
    1. Embed fast øynene til optimal skjæring temperatur sammensatte i et passende vev mold, og deretter fryse den innebygde øyne på tørr is eller lagre dem i en-20 ° c fryser.
    2. Bruk en kryostaten mikrotomen til å lage et tverrsnitt av de innebygde øynene i seksjoner på 12 μm tykkelse ved-20 ° c.
    3. Samle øye tverrsnitt på et lysbilde romtemperatur ved å forsiktig berøre vevet seksjoner, som vil følge lysbildet.
    4. Luft-tørr å tørke vevet seksjoner for ~ 30 min, som deretter kan oppbevares i en-20 ° c fryser til klar for farging.
    5. Skyll lysbildet 1x med PBS for å fjerne den gjenværende optimale skjære temperatur forbindelsen på lysbildet.
    6. Valgfritt Senk glidebryteren inn i en passende bindemiddel buffer (f.eks. 4% paraformaldehyde i PBS) i 15 minutter ved romtemperatur for ytterligere fiksering, om nødvendig.
    7. Permeabilize vevet med 0,1% Triton X-100 i PBS i 30 min ved romtemperatur.
    8. Forbered isolectin-IB4 farge buffer for farging av blodkar.
    9. Oppløsning og Rekonstituer isolectin-IB4 (500 mikrogram) pulver med 50 mL PBS i et 50 mL sentrifugerør.
    10. Sakte tilsett 50 μL av 1 M CaCl2 -løsning, dråpe for dråpe, inn i 50 ml PBS/ISOLECTIN-IB4 blanding. Dette trinnet må utføres langsomt for å unngå nedbør. Den endelige konsentrasjonen av CaCl2 er 1 μM. Tilstedeværelsen av ca2 + er nødvendig for ISOLECTIN-IB4 farging.
    11. Påfør 30 μL av isolectin-IB4 farge buffer på øye kors seksjonene på lysbildet, og ruge den i en våt boks ved 4 ° c over natten.
    12. Skyll 3x, i 5 min hver gang, med PBS.
    13. Legg en dråpe anti-fade montering medium med DAPI å flekken kjerner i seksjonene.
    14. Plasser en dekkglass forsiktig på vevs delene for å fullføre den flate braketten.
    15. Kontroller vevet under et mikroskop for å visualisere tilstedeværelsen av hyaloid fartøy innenfor eyecup.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vivo Imaging av hyaloid fartøy i levende mus
Figur 3 A avslører tverrsnittvisninger av Oct bilder for netthinnen og hyaloid vev i 3 måneder gamle WT og Lrp5-/-mus, en dyr modell med vedvarende hyaloid. WT øyet viser fraværet av hyaloid vev, mens Lrp5-/-Eye viser to vedvarende hyaloid fartøy avledet fra det optiske nerve hodet. Figur 3 B viser FFA bilder av vedvarende hyaloid fartøy (grønn) i fluorescerende felt i 6-ukers gamle Lrp5-/- mus. WT-musen viser ingen rester av hyaloid fartøy, og Lrp5-/-Mouse viser åtte grener av hyaloid fartøy i glasslegemet.

Ex vivo visualisering av hyaloid fartøy
Figur 4 A, B demonstrerer isolerte hyaloid fartøy som vist i flatt mounts, der vaskulære celler og tilhørende makrofager ble farget av KJERNENE med DAPI farging (blå). HA er i midten av hvert bilde, og hyaloid fartøy er avslørt av DAPI-avledet usammenhengende linjer. Hver linje representerer ett fartøy av VHP. I Lrp5-/-mus ble det observert et høyere antall gjenværende hyaloid fartøy ved P8 i flate monteringer (Figur 4A). WT musene hadde i gjennomsnitt 12 grener av hyaloid fartøy ved P8, mens de aldersgruppen Lrp5-/- pups viste rundt 25 grener av hyaloid fartøy, demonstrere en signifikant svekket regresjon av hyaloid blodkar (Figur 4 B). i tillegg ble forsinket og ufullstendig Retina vaskulær utvikling, en annen karakteristikk ofte forbundet med vedvarende hyaloid fartøy, også observert i Lrp5-/- valper (Figur 4C, D). Figur 5 viser de resterende hyaloid fartøyene i tverrsnitt av Lrp5-/-Eyes på P8, mens WT øynene ikke viser hyaloid fartøy.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk diagram som viser utviklingsmessige regresjon av hyaloid blodkar i muse øyne. Hyaloid fartøy og grener, inkludert VHP, TVL, og PM, er avledet fra HA, og opptar mye av mellomrommet mellom linsen og den umodne Retina ved fødselen (p0). Hyaloid involution i mus starter med regresjon av PM blodkar så tidlig som P4. Ved P8, PM, VHP, og TVL lag er kontinuerlig regressing, samtidig med fullstendig dannelse av overfladisk lag av retinal fartøy. Av P12, involution av PM laget er fullført, mens atrofi av VHP og TVL er fortsatt pågår. I mellomtiden begynner et dypt lag av Netthinne fartøy å dannes under P7 – P12. Ved P16, er regresjon av hyaloid systemet delvis fullført (med de resterende TVL fartøy og HA venstre), og det mellomliggende laget av retinal vaskulær plexus fortsetter å utvikle seg. Den retinal blodkar er fullt moden av P21 og overtar rollen som nærende retinal vev fra hyaloid fartøy, som nå er for det meste regressed. På P21, glasslegemet, i fravær av hyaloid fartøy, viser en klar visuell sti. Stiplede, røde linjer representerer de regressing fartøyene. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = tunika vasculosa lentis; PM = Pupillary membran; HA = hyaloid arterie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Skjematisk diagram som viser den sekvensielle prosedyren for hyaloid fartøy isolasjon for ex vivo flatmontering visualisering. (A) injeksjon av gelatin i enucleated øyet gjennom fire injeksjons punkter (røde prikker) på limbus, for å stivne i glasslegemet. (B) fjerning av hornhinnen og optisk nerve, forsiktig Disseksjon av Iris, og peeling av sclera-AKKORD-RPE kompleks. (C) blar de resterende retinal koppen med linsen for å gjøre Retina side med forsiden opp; deretter sprøytebruk PBS mellom Retina og glasslegemet for å skille dem, etterfulgt av peeling av retinal laget. (D) blar opp ned igjen resten av vevet, som inneholder linsen med de omkringliggende hyaloid. Løft linsen litt for å løsne forbindelsen mellom TVL og VHP. (E) SKJÆRING ved ha mellom TVL og VHP, og fjerning av linsen og TVL. Flat-montering VHP lag. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = tunika vasculosa lentis; PM = Pupillary membran; HA = hyaloid arterie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : In vivo Imaging av hyaloid fartøy med optisk sammenheng tomografi (Oct) og fundus fluorescens angiografi (FFA). A: representative okt bilder av WT og Lrp5-/-mus på 3-måneders gammel viser vedvarende hyaloid fartøy i glasslegemet plass i Lrp5-/-øyne. B: representative FFA bilder av WT og Lrp5-/-mus på 6-uker gammel. Mus ble injisert med 1mg fluorescein natrium i 0,1 ml saltvann per mus etter anestesi, og bildene ble tatt 5 min etter injeksjon, fokusert på hyaloid fartøy i Lrp5-/-mus eller glasslegemet i WT (i fravær av hyaloid fartøy). Vedvarende hyaloid fartøy ble visualisere i Lrp5-/-men ikke WT øyne. Røde piler indikerer hyaloid fartøy. Begge skala stolper: 100 μm (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Visualisering av forsinket hyaloid fartøy regresjon og forsinket retinal blodkar utvikling i Lrp5-/-mus. (A) representative bilder av flat-montert hyaloid fartøy beiset med DAPI (blå) i WT og Lrp5-/-øyne på P8. Piler (hvit) indikerer hyaloid arterien. (B) kvantifisering av antall hyaloid fartøy forgrening fra hyaloid arterien i WT og Lrp5-/-øyne. (C) representative flat-montert Netthinne beiset med isolectin-IB4 (rød) for blodkar i WT og Lrp5-/-øyne på P8. Hvite stiplede linjer indikerer Retina-kanten. Gule linjer angir vascularized område kant. (D) kvantifisering av vaskulær dekning av overfladisk retinal vaskulær plexus i WT og Lrp5-/-øyne. n = 8 – 12/gruppe. Skala stolpene i panelene A og C = 1 mm. data vises som gjennomsnittet ± SEM. to-hale student t-test ble brukt til statistisk analyse. * *P < 0,01. Dette tallet er modifisert med tillatelse fra Wang et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Visualisering av hyaloid fartøy i tverrsnitt av Lrp5-/-øyne. Representative bilder av tverrsnitt av øynene isolert fra WT og Lrp5-/-mus ved P8. Øynene var enucleated og innebygd i optimal skjæring temperatur, og seksjoner ble kuttet med kryostaten. Korset seksjonene var farget med DAPI (blå) for å vise kjerner og isolectin-IB4 (rød) for å vise blodkarene. Hvite piler indikerer hyaloid fartøy. Skalaen bar = 500 μm. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Chen et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Teknikker for å vurdere og karakterisere hyaloid fartøy er intuitive og nødvendige prosedyrer for å observere hyaloid fartøyet regresjon i dyremodeller, for å tillate studier på mekanismene underliggende vaskulær regresjon under utvikling. Mens in vivo Retinal Imaging tillater langsgående observasjon av hyaloid regresjon i samme dyr, tilgang til en gnager fundus Imaging system for OCT og FFA kan være en begrensende faktor. I tillegg er in vivo Imaging i levende mus ikke gjennomførbart før de åpner øynene. Derfor er denne metoden ikke tilgjengelig under øye utvikling i nyfødt fasen. På den annen side, mens Imaging tverrsnitt av isolerte øyne kan brukes til enhver alder av musen og har en lav teknisk barriere, er det ikke kvantitative når det er bare noen få synlige hyaloid fartøy, og sjansen for å oppnå et ideelt bilde avhenger i stor grad på skjære vinkelen (figur 5). Til sammenligning, isolering av hyaloid fartøy for flat Mount visualisering tillater fullstendig avbildning av hele hyaloid fartøyet og nøyaktig kvantifisering, men tekniske utfordringer kan eksistere på grunn av den delikate og skjøre natur hyaloid fartøy. Vi håper protokollen beskrevet i dette papiret bidrar til å overvinne disse utfordringene.

Flere kritiske trinn i hyaloid isolasjon protokollen inkluderer injeksjon av gelatin løsning, fjerning av Retina, og den endelige flatmontering. De tekniske vanskelighetene med å håndtere hyaloid blodkar ligger i sin delikate natur, den nesten væske-lignende tilstand av glasslegemet der hyaloid fartøy bor, og dens nære forbindelse med tilstøtende linse og Retina. Sprøytebruk gelatin løsning intravitreally er nøkkelen til å solidifying glasslegemet som inneholder hyaloid fartøy og dermed, slik at deres tekstur fastere for enklere disseksjon og håndtering. Gelatin er en gelling agent forming gjennomsiktig elastisk thermoreversible gels. Ved å injisere den flytende formen av gelatin (ved romtemperatur eller ved 37 ° c) i glasslegemet og kjøle den ned til en lavere temperatur (4 ° c), forvandles glasslegemet til en fastere gel-kopp. Utføre flere gelatin injeksjoner i øyet tillater full spredning av en tilstrekkelig mengde av gelatin i glasslegemet plass, for å danne en uniform og rund gelatinized hyaloid vev kopp. En annen teknisk vanskelighet ligger i å fjerne netthinnen uten å skade hyaloid vev. I motsetning til akkord, hvilke er relativt lett å analysere et stykke unna, det gelatinized glasslegemet kropp inneholder hyaloid fartøy er utfordrende å separat fra det nærliggende Retina uten skadelige det hyaloid. Vi fant at sprøytebruk PBS i rommet mellom glasslegemet og netthinnen genererte en væske buffer lag, noe som gjør det mye lettere å skille disse to vev. Dette er noe lik den hydrodissection teknikken som brukes i katarakt kirurgi for å skille kapselen og katarakt cortex. Den endelige flatmontering er det siste teknisk vanskelig trinn i protokollen. Oppvarming av gelatinized hyaloid vev i en PBS dråpe på en lysbilde varmere konverterer den tilbake til en mer flytende-lignende form for å tillate enklere flatmontering. Riktig ordning og orientering av hyaloid gel koppen er fortsatt avgjørende for å sikre dens selv flatere etter smelting og tørking.

Protokollen for å isolere hyaloid fartøy kan bli ytterligere modifisert på flere måter. Konsentrasjonen av gelatin løsningen vi brukte er 5%, men høyere eller lavere konsentrasjoner kan også fungere, avhengig av preferanse for forskeren å oppnå en fastere eller mykere tekstur for håndtering. Den DAPI farging av cellulære kjerner kan også modifiseres med isolectin-IB4 eller andre endothelial celle eller macrophage markører, for bedre å skille vaskulær endothelial celler fra makrofager. Et ord av forsiktighet: den flate montert hyaloid fartøy er svært delikat og bare løst overholdt lysbildet; Herav, det hyaloid lysbilder nød å bli håndterte meget mildt og forsiktig hvis skylling er behøvde i løpet av flekk. Denne isolasjons protokollen har også sine begrensninger, inkludert kompleksiteten ved å utføre de fine disseksjon og vanskeligheten av den langsiktige bevaring av prøvene på grunn av innholdet i det skjøre vevet. Likevel, isolere og flat-montering hyaloid fartøy er fortsatt den mest omfattende og intuitiv måte å studere hyaloid blodkar, å fremme øye og angiogenese studier10,17,27, 29,30,31.

Den hyaloid blodkar gir en utmerket eksperimentell modell for å studere utviklingsmessige fartøy vekst og regresjon, relevant for forskning felt i Oftalmologi, angiogenese, og programmert celle død, som denne utredningen har som mål å bistå. Fremtidige modifikasjoner av isolasjons protokollen kan rettes mot å forbedre muligheten for en teknisk disseksjon prosedyre. Samlet sett er kombinert in vivo Imaging og ex vivo isolering av hyaloid fartøy en fordelaktig metode for å tillate full vurdering og karakterisering av hyaloid fartøy i mus som en nyttig modell av vaskulær regresjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd (R01 EY024963 og EY028100) til JC Z.W. ble støttet av Knights Templar Eye Foundation Career starter Grant. Den hyaloid isolasjons prosedyren som er beskrevet i denne studien, er tilpasset endringer fra protokoller som er sjenerøst delt av DRS. Richard lang, Toshihide Kurihara, og Lois Smith, som forfatterne er takknemlig for.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AK-Fluor (fluorescein injection, USP) Akorn 17478-253-10
Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
Antifade mounting medium Thermo Fisher S2828
Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Artificial tear eyedrop Systane N/A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2058
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory Stock NO: 000664
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016
Cryostat Leica CM3050S
Cryostat Leica CM3050 S
Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop Cyclomydril N/A
Gelatin  Sigma-Aldrich G9382
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008
Heating board Lab-Line Instruments Inc. N/A
Isolectin GS-IB4, 594 conjugate ThermoFisher Scientific I21413
Ketamine hydrochloride injection KetaVed NDC 50989-996-06
Lrp5-/- mice The Jackson Laboratory Stock NO. 005823 Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA
Micron IV and OCT Phoenix Research Labs N/A Imaging software: InSight
Microscope Zeiss discovery v8
Microsurgery forceps Scanlan International 4004-05
Microsurgery scissors Scanlan International 6006-44
Optimal cutting temperature compound Tissue-Tek 4583
Optimal cutting temperature compound Agar Scientific AGR1180
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) Fisher Scientific 12-20
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) Teknova P0496
Slide cover glass Premiere 94-2222-10
Superfrost microscope slides  Fisherbrand 12-550-15
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Xylazine sterile solution Akorn: AnaSed NDC: 59399-110-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  2. Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. Besharse, J., Bok, D. , Academic Press. Oxford, UK. (2011).
  3. Hobbs, R. P., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. Hartnett, M. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2013).
  4. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
  5. Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
  6. Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
  7. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  8. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  9. Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
  10. Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
  11. Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
  12. Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
  13. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  14. Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
  15. Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
  16. Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
  17. Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
  18. Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
  19. Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
  20. Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
  21. Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
  22. Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
  23. Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
  24. McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
  25. Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
  26. Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
  27. Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
  28. Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
  29. Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
  30. Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
  31. Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).

Tags

Medisin øye hyaloid fartøy vaskulær regresjon flatt feste utvikling LRP5 wnt
Vurdering og karakterisering av Hyaloid fartøy i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S.,… More

Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Assessment and Characterization of Hyaloid Vessels in Mice. J. Vis. Exp. (147), e59222, doi:10.3791/59222 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter