Summary
Этот протокол описывает как in vivo, так и ex vivo методы полной визуализации и характеристики гиалоидных сосудов, модель сосудистой регрессии в глазах мышей, используя оптическую комппореную томографию и флоуресцейну для живой визуализации и ex vivo изоляции и последующего плоского крепления гиалоида для количественного анализа.
Abstract
В глазу эмбриональные гиалоидные сосуды питают развивающуюся линзу и сетчатку и регресс, когда сосуды сетчатки развиваются. Стойкие или неудачные регрессии гиалоидных сосудов можно увидеть при таких заболеваниях, как стойкий гиперпластический первичный стекловид (PHPV), что приводит к затруднению светового пути и нарушению функции зрения. Понимание механизмов, лежащих в основе регрессии гиалоидных сосудов, может привести к новым молекулярным знаниям в процессе регрессии сосудов и потенциальным новым способам управления заболеваниями с помощью стойких гиалоидных сосудов. Здесь мы описываем процедуры визуализации гиалоида у живых мышей с оптической когеренционной томографией (OCT) и фундусийской ангиографией (FFA) и подробный технический протокол изоляции и плоскомонтажа гиалоид ex vivo для количественного анализа. Низкой плотности липопротеинов рецепторов, связанных с протеином 5 (LRP5) нокаут мышей были использованы в качестве экспериментальной модели стойких гиалоидных сосудов, чтобы проиллюстрировать методы. Вместе эти методы могут способствовать тщательной оценке гиалоидных сосудов в качестве экспериментальной модели сосудистой регрессии и исследований механизма стойких гиалоидных сосудов.
Introduction
Кровоснабжение глаз имеет важное значение для обеспечения нормального развития сетчатки и окружающих глазных тканей и оснащения надлежащей зрительной функции. В глазу три сосудистые кровати: сосуды сетчатого глаза, сосуды и переходные эмбриональные кровообращения. Развитие глазной сосуды требует пространственной и временной координации на протяжении всего эмбриогенеза и созревания тканей. Среди трех сосудистых кроватей, гиалоидная сосудоза является первой функциональной системой кровоснабжения для обеспечения питания и кислорода для вновь сформированной эмбриональной линзы и развивающейся сетчатки. Гиалоидные сосуды регрессируют в то жевремя, что сосуды сетчатки развиваются и созревают 1. Регрессия гиалоидной сосуды имеет решающее значение для обеспечения четкого визуального пути для развития зрительной функции; следовательно, этот процесс сосудистой регрессии так же важен, как и рост сосудов в области сосуды. Нарушение гиалоидной регрессии может привести к заболеваниям глаз. Кроме того, регрессия гиалоидных сосудов обеспечивает модельсистемы для исследования клеточных и молекулярных механизмов, участвующих в регрессии сосудов, что может иметь последствия для ангиогенной регуляции и в других органах.
Гиалоидная сосуда, полученная из гиалоидной артерии (HA), состоит из ваза гиалоидеи проприии (VHP), туника васкулоза лентиса (TVL) и мембраны зрачков (PM). Он обеспечивает питание развивающейся сетчатки, первичного стекловидного тела, и хрусталика во время эмбрионального развития2. В результате HA, VHP ветви передняя через стекловидное тело к объективу. TVL чашки задней поверхности капсулы объектива, и анастомоза хм, который соединяется с передней цилиарных артерий, охватывающих переднюю поверхность объектива2,3, в результате формирования сети судов в PM 3 , 4 , 5. Интересно, что в сваске гиалоида нет вен, и система использует сосуды для выполнения венозного дренажа.
В человеческом эмбрионе, гиалоид сосуды почти завершена примерно на девятой неделе беременности и начинает регрессировать, когда первые сосуды женевки появляются, в течение четвертого месяца беременности2. Начиная с атрофии VHP, регрессии капиллярных сетей TVL, PM, и, наконец, HA происходит впоследствии2,3. Между тем, первичные стекловидного втягивания и вторичного стекловидного начинает формироваться, состоящий из внеклеточных компонентов матрицы, в том числе коллагеновых волокон. К шестому месяцу беременности первичный стекловид превращаета сводится к небольшому прозрачному каналу, простираясь от диска зрительного нерва до объектива, называемого каналом Cloquet или гиалоидным каналом, а вторичный стекловидный становится основным компонентом заднего сегмента 2 , 3. Циркуляция гиалоида исчезает в основном на 35 до 36 недель беременности, незадолго до рождения3.
В отличие от людей, у которых гиалоидная сосудистая полностью регрессирует при рождении, мышь гиалоидная сосудистая система начинает регрессировать после рождения. Как мышь сетчатки рождается сосудистой и сетчатки сосудов развиваться послеродовой, гиалоидные сосуды регресс одновременно с послеродового дня (P) 4 и в основном полностью регрессируется P216 (Рисунок 1). PM исчезает сначала между P10 и P12, и VHP исчезает между P12 и P16, в то время как небольшое количество ТВЗ и HA клеток остаются даже на P16, и P21 регрессии гиалоидной сосудистой системы почти завершена6. В то же время, сосуды для стыковки с ы ветвей на гриле начинают развиваться после рождения. Поверхностный слой сосудистого сплетения полностью распространяется на периферийную сетчатку при P7-P8, глубокий слой (расположенный во внешнем плексиформном слое) развивается из P7-P12, и, наконец, промежуточное сплетение во внутреннем плексиформном слое развивается между P12 и P157 . По мере развития сосудов сосудов сосудов сосудов соты, она постепенно заменяет функцию сопутствующего регрессирования гиалоидных сосудов, обеспечивая питание и кислород развивающемуся глазу. Послеродовое возникновение регрессии гиалоидных сосудов у мышей обеспечивает легко доступную экспериментальную модель для наблюдения и изучения гиалоидной сосуды, а также молекулярную основу, регулирующую процессы сосудистой регрессии в рамках как физиологических, так и физиологических и патологические состояния8.
Отказ гиалоидной регрессии можно увидеть при таких заболеваниях, как PHPV, который является редкой врожденной аномалией развития глаза в результате неудачной илинеполной регрессии эмбриональной, первичной стекловидной и гиалоидной сосуды 9. Механизмы, регулирующие регрессионный процесс гиалоидных сосуд, являются сложными и широко изучены. Один из основных молекулярный путь, необходимый для нормальной регрессии гиалоидных сосудов является Wnt сигнализации пути10, как генетические мутации в этом пути, затрагивающих как Wnt лиганда и рецепторы были связаны с PHPV у людей9. Экспериментальные исследования определили Wnt лиганд, Wnt7b, который производится макрофагами вокруг гиалоидных сосудов в развивающемся глазу, чтобы опосреднить этот процесс регрессии. Wnt7b активирует Wnt сигнализации путем связывания с рецепторами frizzled4 (F'D4)/LRP5 в соседних эндотелиальных клеток, чтобы инициировать апоптоз клетки, что приводит к регрессии гиалоидных сосудов10. В результате, Wnt7b-дефицитных мышей показать стойкость гиалоидных сосудов10. Аналогичным образом, нетрадиционный лиганд Wnt, Норрин (кодируется геном Ndp), также связывается с F'D4/LRP5, чтобы вызвать регрессию гиалоидных сосудов во время разработки. Ndpy/- , Lrp5-/-, и Fzd4-/- мышей все отображения отложено гиалоидной регрессии судна, поддерживая важную регулятивную роль Wnt сигнализации11,12, 13,14,15,16. Кроме того, другой Wnt coreceptor LRP6 перекрывает сярприг с LRP5 в своей функции по модуляции сигнального пути Wnt в гиалоидных сосудистых эндотелиальных клетках17. Другие факторы, которые также могут способствовать гиалоидной регрессии включают гипоксия-индуцируемый фактор18,19, сосудистый эндотелиальный фактор роста20,21, коллаген-1822, 23, Arf24, ангиопоэтин-225, и костной морфогенетический белок-426. В этой работе мы используем Lrp5-/- мышей в качестве модели стойких гиалоидных сосудов, чтобы продемонстрировать методы оценки и характеристики гиалоидных сосудов с помощью методов in vivo и ex vivo.
Визуализация гиалоидных сосудов in vivo и ex vivo необходима для изучения механизмов регрессии гиалоидных сосудов. Современные методы наблюдения гиалоидных сосудок в основном сосредоточены на визуализации и анализе VHP и HA, с помощью изображений OCT и FFA, секций поперечных сечений глаз и плоского крепления гиалоидов. OCT и FFA являются мощными инструментами визуализации in vivo, позволяющими проводить продольные наблюдения у живых животных после того, как они открыли глаза. Кроме того, изолированное гиалоидное плоское крепление обеспечивает визуализацию всей гиалоидной сосуды и средство для достижения точной количественной оценки числа сосудов. Тем не менее, тонкий и хрупкий характер гиалоидных сосудов и в результате технические трудности его изоляции, возможно, ограничили его использование в исследованиях глаз несколько10,17,27. В этой работе мы предоставляем подробный протокол визуализации гиалоидных сосудов, сочетая как in vivo живую визуализацию жевийной корыстной полости, так и ex vivo изолированные гиалоидные плоские крепления для повышения осуществимости этих методов. Этот протокол был адаптирован с модификацией и расширением от предыдущих публикаций на in vivo метод живой fundus и OCT изображений28 и ex vivo метод изолированных гиалоид плоский монтаж11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были обработаны в соответствии с Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) Заявление об использовании животных в офтальмологических и видение исследований для экспериментов на животных, в соответствии с Руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения ( NIH) в отношении ухода и использования животных для экспериментальных процедур и правил, установленных Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Бостонской детской больнице. Lrp5-/- мыши (запас No 005823; Лаборатория Джексона) и ее дикий тип (WT) управления C57BL/6J мышей (фонд No 000664; Лаборатория Джексона) были использованы для этого исследования.
1. Часть I: In vivo изображение гиалоидных сосудов с помощью системы визуализации ретины
- Препарат анестезии мышей и расширение зрачка
- Выберите мышей.
- Используйте мышей, которые старше P12 (после того, как они открыли глаза) для визуализации глаза глаза; оба пола подходят.
- По желанию, изображение мышей-мутантов с задержкой гиалоидной регрессии (и их контроля WT) на протяжении всей взрослой жизни. WT мышей старше 3 недель не может проявлять много обнаруживаемых оставшихся гиалоидных сосудов, следовательно, P12-P21 идеально подходит для визуализации оставшихся видимых WT гиалоид.
- Приготовьте смесь кетамина/ксилазина для анестезии.
- Возьмите 2,3 мл раствора кетаминового бульона (100 мг/мл) и 0,7 мл ксилазинового бульонного раствора (20 мг/мл) и добавьте 20 мл стерильной са линии (0,9% хлорида натрия) для изготовления рабочего раствора смеси кетамин/ксилазин (10 мг/мл кетамина и 0,6 мг/мл ксилазина).
- Анестезия мышей путем интраперитоно инъекционных кетамина / ксилазина смеси в объеме 8x веса тела мыши (например, 20 г мыши необходимо 160 л кетамина / ксилазина рабочего раствора смеси для достижения рабочей дозы кетамина (80 мг/кг тела) вес и ксилазин (смесь 4,8 мг/кг массы тела).
- Нанесите одну каплю раствора препарата для зрачков (см. Таблицуматериалов) к каждому глазу, чтобы раздвить зрачки мыши сразу же после анестезии.
- Оцените уровень анестезии с помощью педали рефлекса (твердый задний нос. Подождите, пока мышь достаточно анестезируется (без педалей рефлекс) и ее зрачки широко расширены.
- Выберите мышей.
- Оптическая когеренционная томография гиалоидных сосудов
- Увлажняй роговицы мыши искусственными слезами, а затем поместите мышь на сцену позиционирования.
- Аккуратно свяжитесь с роговицей мыши с помощью объектива зонда OCT. Отрегулируйте мышь и зонд так, чтобы головка зрительного нерва находилась в центре поля зрения в изображении fundus, чтобы направлять oct изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации об общей установке системы визуализации сетчаточной сетки грызунов (см. Таблицаматериалов) и корректировки положения мыши, пожалуйста, обратитесь к Гонг и др.28. - Отрегулируйте фокус для достижения оптимальных изображений OCT.
- Отрегулируйте угол указанной линии в программном обеспечении OCT imaging (см. ТаблицаМатериалов), чтобы выявить стойкие гиалоидные сосуды, а затем сделать снимки.
- F undus f luorescein a нгиография изображение гиалоидных сосудов
- Приготовьте раствор флуоресцеина: добавьте 9 мл стерильного фосфатно-буферного солей (PBS) к 1 мл раствора флуоресцеина (концентрация запасов: 100 мг/мл). Концентрация конечного рабочего раствора составляет 10 мг/мл.
- Интраперитонеально вводят флуоресцеин рабочий раствор (5 л/г массы тела).
- Увлажняй роговицу мыши искусственными слезами, а затем поместите мышь на сцену позиционирования.
- Расположите объектив микроскопа визуализации сычаткой для ретье реляной Micron IV, чтобы сделать прямой нежный контакт с роговицой мыши. Отрегулируйте выравнивание немного, чтобы положение головы зрительного нерва в центре поля зрения.
- Измените фильтр микроскопа на зеленый флуоресцентный канал.
- Сосредоточьтесь на стойких гиалоидных сосудах, чтобы делать снимки.
- Возьмите несколько изображений после 1 мин, 3 мин, 5 мин, и 10 мин (не более 10 мин) после инъекции, чтобы определить лучшую точку времени (сигнал к фону соотношение) для наблюдения гиалоидных сосудов. Завершите процедуру FFA в течение 10 минут, после чего флуоресцеин может стать слишком рассеянным и сделать сосуды невидимыми.
- Восстановление мышей от наркоза
- После процедур держите мышей на теплой грелке.
- Подождите, пока мыши мобильны снова, чтобы вернуть их в клетку мыши.
2. Часть II: Ex vivo визуализация гиалоидных сосудов
- Подготовка неподвижных мыжельных глаз
- Выберите мышей нужного возраста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неонатальные мыши, как правило, жертвуют в P8 для вскрытия гиалоидов. Оба пола подходят. Мутантмы с задержкой гиалоидной регрессии (и их соответствующих элементов управления ВТ) могут быть вскрыты и проанализированы на протяжении всей взрослой жизни. - Эвтаназия мышей при воздействии CO2.
- Enucleate глаза мыши тупым вскрытием.
- Откройте веки широко с микрохирургии щипцы, чтобы обеспечить доступ к глазу. Поместите изогнутые щипцы микрохирургии под земной шар на орбиту, чтобы схватить зрительный нерв, не сжимая глазное яблоко. Аккуратно потяните и удалите глазное яблоко с помощью щипков.
- Кроме того, вскрыть глазное яблоко с помощью микрохирургии ножницы тщательно сократить параллельно земного шара с четырех сторон к задней части орбиты и отделяя земной шар от окружающих соединительных тканей.
- Погрузите глаза в 4% параформальдегида в буфере PBS в течение 30 минут при комнатной температуре для фиксации.
- Перенесите фиксированные глазные яблоки в ледяной буфер PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глазные яблоки могут храниться в PBS при 4 градусах По Цельсию в течение 1 недели.
- Выберите мышей нужного возраста.
- Встраивание гиалоидных сосудов с инъекцией желатина
- Подготовьте 5% (w/v) желатиновый раствор.
- Взвесить 50 мг желатина.
- Растворите желатин в 1 мл дистиллированной воды.
- Инкубировать раствор желатина на водяной бане 37 градусов до полного растворения. Храните раствор в воде 37 градусов до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большая партия раствора может быть подготовлена и храниться при 4 градусах По Цельсию в качестве aliquots. Каждый раз перед использованием раствор необходимо нагревать в водяной бане 37 градусов по Цельсию, чтобы достичь четкой консистенции.
- Под микроскопом вскрытия вводят 50 л желатина в стекловидное тело в лимбу; повторить инъекции 3x в разных местах, чтобы сделать в общей сложности четыре инъекции, равномерно расположенных вокруг лимба(Рисунок 2A).
- Инкубировать глазные яблоки в холодильнике 4 градусов или на льду в течение 30 минут, чтобы укрепить впрыскиваемый желатин в стекловидном пространстве.
- Подготовьте 5% (w/v) желатиновый раствор.
- Рассечение и изоляция гиалоидных сосудов
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 2B-E.- Поместите глазные яблоки в чашку Петри, содержащую PBS, чтобы сохранить ткани от высыхания. Сделайте разрез ножницами микрохирургии на лимбу и удалите роговицу.
- Вырезать и удалить зрительный нерв.
- Под микроскопом вскрытия, используйте две пары щипцы, чтобы снять и отказаться от склеры, сосудистой и пигментной эпителии реликты (RPE) слоев и удалить радужную оболочку.
- С оптически-нервной стороны сетчатки вверх и объектив стороны вниз, вводить 50 Зл ПБС чуть ниже чашки сетчатки, чтобы позволить накопление буфера PBS между желатинированной стекловидного тела и сетчатки.
- Аккуратно снимите и удалите чашку сетчатки и цилиарное тело из стекловидного тела с помощью щипц.
- Используя передачу пипетки, перенесите желатиновую чашку, содержащую гиалоидную ткань, погруженную в PBS, на слайд микроскопа
- Поверните остальную часть ткани (линзы / гиалоид) более, так что сторона объектива обращена вверх.
- Поднимите объектив и осторожно ослабить связь между объективом / TVL и VHP, а затем, вырезать HA с микрохирургии ножницами, чтобы удалить объектив-TVL. Держите VHP-часть чашки гиалоида для плоского крепления.
- Плоское монтаж и окрашивание гиалоидных сосудов
- Аккуратно промыть гиалоидную чашку с PBS на слайде, чтобы удалить все вскрытия мусора.
- Убедитесь, что гиалоидная чашка плавает на слайде в адекватном решении PBS.
- Аккуратно расположите и отрегулируйте положение желатинированной гиалоидной чашки с помощью щипкания микрохирургии, с ободком чашки, обращенной вниз на горку, для достижения оптимального внешнего вида после плавления.
- Поместите слайд с гиалоидной чашкой, погруженной в PBS, на слайд теплее при температуре 37 градусов по Цельсию, подождите, пока желатин растает и гиалоид сглаживается, и удалите слайд, когда он едва сухой (не слишком сухой).
- (Необязательно) Иммунопятно гиалоидных сосудов
- Сделать блокирующий и проникающий буфер (например, 5% бычьего сывороточки альбумина (BSA) и 0,1% Triton X-100 в буфере PBS). Добавьте 50 зл блокирующий буфер на плоский гиалоидизоляцию и инкубизируете его при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Нанесите 50 зл первичных антител (например, CD31) (1:100 разбавления в блокирующем буфере) на плоское крепление изоляции гиалоидов, а затем инкубировать его во влажной коробке при 4 градусах Цельсия за одну ночь.
- Аккуратно промыть 3x, в течение 5 минут каждый раз, с PBS.
- Нанесите 50 кл вторичных антител (например, коза анти-кроличья вторичное антитело-Alexa 488, 1:100 разбавления) на гиалоидное плоское крепление и инкубировать его при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Аккуратно промыть 3x, в течение 5 минут каждый раз, с PBS.
- Добавьте каплю анти-увядающей монтажной среды с DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиноле) для окрашивания ядер в гиалоидных сосудах.
- Аккуратно поместите крышку на гиалоид, чтобы завершить плоское крепление.
- Изображение и количественная оценка плоскоустановленных гиалоидных сосудов
- Изображение DAPI окрашивания гиалоидных сосудов с флуоресцентным микроскопом и убедитесь, что центральный HA виден (исключить образцы без HA).
- Определите ветви судов, непосредственно полученные из HA, и вручную подсчитайте количество ветвей судов для количественной оценки.
- Визуализация гиалоидных сосудов в поперечном сечении глаз
- Встраивайтесь в фиксированные глазные яблоки в оптимальное соединение температуры резки в подходящей ткани формы, а затем, заморозить встроенные глаза на сухой лед или хранить их в морозильной камере -20 градусов.
- Используйте микротом криостата, чтобы сделать поперечное сечение встроенных глаз в секции толщиной 12 мкм при -20 градусов по Цельсию.
- Соберите поперечные секции глаз на микроскоп слайд комнатной температуры, нежно касаясь тканей разделов, которые будут придерживаться слайда.
- Воздушно-сухой обезвоживать секции тканей в течение 30 минут, которые затем могут храниться в морозильной камере -20 градусов до готовности к окрашиванию.
- Промыть слайд 1x с PBS, чтобы удалить оставшиеся оптимальные соединения температуры резки на слайде.
- (Необязательно) Погрузите слайд в соответствующий фиксаторный буфер (например, 4% параформальдегида в PBS) в течение 15 минут при комнатной температуре для дополнительной фиксации, если это необходимо.
- Пермяки ткани с 0,1% Тритон X-100 в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Подготовка изолектин-IB4 окрашивающий буфер для окрашивания кровеносных сосудов.
- Растворите и восстановите изолектин-IB4 (500 мкг) порошок с 50 мл PBS в 50 мл центрифугной трубки.
- Медленно добавляйте 50 qL раствора 1 M CaCl2, капля за каплей, в 50 мл смеси PBS/isolectin-IB4. Этот шаг должен быть выполнен медленно, чтобы избежать осадков. Окончательная концентрация CaCl2 составляет 1 мкм. Наличие Ca2 "требуется для изолектин-IB4 окрашивания.
- Нанесите 30 зл изолектин-IB4 окрашивающий буфер на поперечные секции глаз на слайде и инкубировать его в мокром ящике при 4 градусах Цельсия за одну ночь.
- Промыть 3x, в течение 5 минут каждый раз, с PBS.
- Добавьте каплю анти-увядающей монтажной среды с DAPI, чтобы запятнать ядра в секциях.
- Аккуратно поместите покрывало на секции тканей, чтобы завершить плоское крепление.
- Проверьте ткани под микроскопом, чтобы визуализировать наличие гиалоидных сосудов в глазной чаше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo изображение гиалоидных сосудов у живых мышей
Рисунок 3 A показывает поперечные виды OCT изображений для сетчатки и гиалоидных тканей в 3-месячного WT и Lrp5-/-мышей, животной модели с стойкими гиалоидными. Глаз WT показывает отсутствие гиалоидной ткани, в то время как Lrp5-/-глаз показывает два стойких гиалоидных сосудов, полученных из головы зрительного нерва. Рисунок 3 B отображает FFA изображения стойких гиалоидных сосудов (зеленый) в флуоресцентном поле в 6-недельный Lrp5-/- мышей. Мышь WT не показывает остатков гиалоидных сосудов, а Lrp5-/-мышь показывает восемь ветвей гиалоидных сосудов в стекловидном теле.
Ex vivo визуализация гиалоидных сосудов
Рисунок 4 A,B демонстрирует изолированные гиалоидные сосуды, визуализированные в плоских креплениях, где сосудистые клетки и связанные с ними макрофаги были окрашены их ядрами с dAPI окрашиванием (синим). HA находится в центре каждого изображения, и гиалоидные сосуды выявлены DAPI полученных разрывных линий. Каждая линия представляет собой одно судно VHP. В Lrp5-/-мышей, большее количество оставшихся сосудов гиалоидов наблюдалось на P8 в плоских креплениях (рисунок4A). У мышей WT было в среднем 12 ветвей гиалоидных сосудов при P8, в то время как возрастные Lrp5-/- щенки показали около 25 ветвей гиалоидных сосудов, демонстрируя значительно нарушение регрессии гиалоидной сосуды (Рисунок 4 B). Кроме того, задержки и неполное развитие сосудов сетчатки, другая характеристика часто ассоциируется с стойкими гиалоидных сосудов, также наблюдается в Lrp5-/- щенки (Рисунок4C,D). На рисунке 5 показаны оставшиеся гиалоидные сосуды в поперечных сечениях Lrp5-/-глаза при P8, в то время как глаза WT не отображают гиалоидные сосуды.
Рисунок 1 : Схематическая диаграмма, изображающая регрессию развития гиалоидной сосуды в глазах мышей. Гиалоидные сосуды и ветви, включая VHP, TVL и PM, являются производными от HA и занимают большую часть пространства между объективом и незрелой сетчаткой при рождении (P0). Гиалоидная инволюция у мышей начинается с регрессии капилляров PM уже в P4. В P8, PM, VHP и TVL слои постоянно регрессируют, что совпадает с полным образованием поверхностного слоя сосудов сыворотки. К P12 инволюция слоя PM завершена, в то время как атрофия VHP и TVL все еще продолжается. В то же время, глубокий слой сосудов сыщей начинает образовываться во время P7-P12. К P16 регрессия гиалоидной системы частично завершена (с оставшимися сосудами ТВЛ и левыми ТВЗ), а промежуточный слой сосудистого сплетения с ыветной системы продолжает развиваться. Сокула для стыковки в полной мере созревает p21 и берет на себя роль питательных тканей женевой из гиалоидных сосудов, которые в настоящее время в основном регрессированы. На P21, стекловидное, в отсутствие гиалоидных сосудов, показывает четкий визуальный путь. Dashed красные линии представляют регрессивные сосуды. VHP и vasa hyaloidea propria; ТВЛ и туника васкулоза лентис; ПМ - мембрана зрачков; HA и гиалоидная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Схематическая диаграмма, изображающая последовательную процедуру изоляции гиалоидных сосудов для ex vivo плоский монтаж визуализация. (A) Инъекции желатина в энуклеированный глаз через четыре инъекционные точки (красные точки) на лимбус, чтобы укрепить стекловидное тело. (B) Удаление роговицы и зрительного нерва, тщательное вскрытие радужной оболочки глаза, и пилинг от склеры-хороид-RPE комплекса. (C) Перелистывание оставшейся чашки сетчатки с объективом, чтобы сделать сторону сетчатки лицом вверх; затем, инъекционные PBS между сетчаткой и стекловидного тела, чтобы отделить их, а затем пилинг от слоя сетчатки. (D) Перелистывание с ног на голову снова остальной части ткани, содержащей линзы с окружающими гиалоид. Подъем объектива немного ослабить соединение TVL и VHP. (E) Резка на HA между TVL и VHP, и удаление объектива и TVL. Плоский слой VHP. VHP и vasa hyaloidea propria; ТВЛ и туника васкулоза лентис; ПМ - мембрана зрачков; HA и гиалоидная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : In vivo изображение гиалоидных сосудов с оптической когересцена томографии (OCT) и фонду флуоресценции ангиографии (FFA). A: Представитель OCT изображения WT и Lrp5-/-мышей на 3-месячный показаны стойкие гиалоидные сосуды в стекловидном пространстве в Lrp5-/-глаза. B: Представитель FFA изображения WT и Lrp5-/-мышей на 6-недель-старых. Мыши были введены с 1 мг флуоресцеина натрия в 0,1 мл соливого на мышь после анестезии, и изображения были приняты 5 минут после инъекции, сосредоточены на гиалоидных сосудов в Lrp5-/-мышей или стекловидного тела в WT (при отсутствии гиалоидных сосудов). Стойкие гиалоидные сосуды были визуализированы в Lrp5-/-но не в глазах WT. Красные стрелки указывают на гиалоидные сосуды. Оба бара масштаба: 100 мкм (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Визуализация задержки регрессии гиалоидного сосуда и задержки развития сосудов в Lrp5-/-мышей. (A) Представитель изображения плоских установленных гиалоидных сосудов, окрашенных DAPI (синий) в WT и Lrp5-/-глаза на P8. Стрелки (белые) указывают на гиалоидную артерию. (B) Количества гиалоидных сосудов, разветвляющихся из гиалоидной артерии в WT и Lrp5-/-глаза. (C) Представитель плоский сетчатки окрашенных изолектин-IB4 (красный) для сосуды в WT и Lrp5-/-глаза на P8. Белые линии, раздавленные, указывают на край сетчатки. желтые линии указывают на васкуляризированный край области. (D) Количественная оценка сосудистого покрытия поверхностного сосудистого сплетения в WT и Lrp5-/-глаза. n 8-12/группа. Шкала баров в панелях A и C - 1 мм. Данные отображаются как средние - SEM. Для статистического анализа использовался t-тест двуххвостого студента. П Злт; 0,01. Эта цифра изменена с разрешения Wang et al.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Визуализация гиалоидных сосудов в поперечных сечениях Lrp5-/-глаз. Репрезентативные изображения поперечных сечений глаз, изолированных от WT и Lrp5-/-мышей в P8. Глаза были enucleated и встроенные в оптимальной температуре резки, и разделы были сокращены с помощью криостата. Поперечные секции были окрашены DAPI (синий), чтобы показать ядра и изолектин-IB4 (красный), чтобы показать кровеносные сосуды. Белые стрелки указывают на гиалоидные сосуды. Бар шкалы 500 мкм. Эта цифра адаптирована с разрешения Чэнь и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы оценки и характеристики гиалоидных сосудов являются интуитивными и необходимыми процедурами для наблюдения регрессии гиалоидных сосудов в моделях животных, чтобы позволить исследования механизмов, лежащих в основе сосудистой регрессии во время развития. В то время как in vivo визуализации для ретины позволяет продольное наблюдение гиалоид регрессии в том же животном, доступ к грызунов fundus визуализации системы для OCT и FFA может быть ограничивающим фактором. Кроме того, in vivo изображений у живых мышей не представляется возможным, прежде чем они откроют глаза. Таким образом, эта методология не применима во время развития глаз в неонатальной стадии. С другой стороны, в то время как изображения поперечные сечения изолированных глаз могут быть использованы для любого возраста мыши и имеет низкий технический барьер, это не количественный, когда Есть только несколько видимых сосудов гиалоидов, и шанс получения идеального изображения во многом зависит от угол сечения(рисунок 5). Для сравнения, изоляция гиалоидных сосудов для визуализации плоского крепления позволяет полностью сотворить весь гиалоидный сосуд и точную количественную оценку, однако технические проблемы могут возникнуть из-за хрупкой природы гиалоидных сосудов. Мы надеемся, что протокол, подробно описанный в настоящем документе, поможет преодолеть эти проблемы.
Несколько критических шагов в протоколе изоляции гиалоидов включают инъекцию желатина, удаление сетчатки и окончательное плоское крепеж. Техническая сложность обработки гиалоидных сосудов заключается в ее деликатном характере, почти жидком состоянии стекловидного тела, в котором находятся гиалоидные сосуды, и его тесной связи с соседними линзами и сетчаткой. Инъекционный желатиновый раствор intravitreally является ключом к затвердеванию стекловидного тела, содержащего гиалоидные сосуды и, тем самым, делая их текстуру более упругой для облегчения вскрытия и обработки. Желатин является гелеобразующим агентом, образующим прозрачные эластичные терморепережимые гели. Путем введения жидкой формы желатина (при комнатной температуре или при температуре 37 градусов Цельсия) в стекловидное пространство и охлаждения его до более низкой температуры (4 градусов по Цельсию), стекловидное тело превращается в более твердую чашку геля. Выполнение нескольких инъекций желатина в глаз позволяет полное рассеивание достаточного количества желатина в стекловидное пространство, сформировать единую и круглую желатинированную чашу ткани гиалоид. Другая техническая трудность заключается в удалении сетчатки без повреждения гиалоидной ткани. В отличие от хориоида, который относительно легко вскрыть друг от друга, желатинированное стекловидное тело, содержащее гиалоидные сосуды, сложно отделиться от близлежащей сетчатки, не повреждая гиалоид. Мы обнаружили, что введение PBS в пространство между стекловидном телом и сетчаткой порожденных жидкого буферного слоя, что делает его гораздо легче отделить эти две ткани. Это несколько похоже на метод гидродиссекции, используемый в хирургии катаракты, чтобы отделить капсулу и кору катаракты. Окончательный плоский монтаж является последним технически трудным шагом протокола. Потепление желатинированной гиалоидной ткани в капле PBS на слайде теплее преобразует его обратно в более жидкой форме, чтобы легче плоский монтаж. Правильное расположение и ориентация чашки гиалоидного геля по-прежнему имеет важное значение для обеспечения его даже уплощения после плавления и сушки.
Протокол изоляции гиалоидных сосудов может быть дополнительно изменен несколькими способами. Концентрация желатина раствор мы использовали 5%, но выше или ниже концентрации могут также работать, в зависимости от предпочтений исследователя для достижения более прочной или мягкой текстуры для обработки. DAPI окрашивание клеточных ядер также может быть изменено с изолектин-IB4 или других эндотелиальных клеток или макрофаг маркеров, чтобы лучше отличить сосудистых эндотелиальных клеток от макрофагов. Слово предостережения: плоские гиалоидные сосуды очень деликатные и только слабо придерживаются слайда; следовательно, гиалоидные слайды должны быть обработаны очень осторожно и осторожно, если промывка необходима во время окрашивания. Этот протокол изоляции также имеет свои ограничения, втомую сложность выполнять точное вскрытие и затруднение долгосрочного консервации образцов из-за природы хрупкой ткани. Тем не менее, изоляция и плоский монтаж гиалоидных сосудов по-прежнему является наиболее полным и интуитивным способом изучения гиалоидной сосуды, для содействия глазной и ангиогенез исследований10,17,27, 29,30,31.
Гиалоидная сосуда обеспечивает отличную экспериментальную модель изучения роста и регрессии сосудов, имеющих отношение к исследовательским областям в области офтальмологии, ангиогенеза и запрограммированной клеточной смерти, с которой эта статья призвана помочь. Будущие изменения протокола изоляции могут быть направлены на улучшение осуществимости процедуры технического вскрытия. В целом, комбинированная виво-изображение и ex vivo изоляция гиалоидных сосудов является выгодным методом, позволяющим полную оценку и характеристику гиалоидных сосудов у мышей в качестве полезной модели сосудистой регрессии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты (R01 EY024963 и EY028100) в JC З.В. была поддержана Рыцари тамплиеров Глаз Фонд Карьера Грант. Процедура изоляции гиалоидов, описанная в этом исследовании, была адаптирована с модификацией протоколов, щедро разделяемых докторами Ричардом Лэнгом, Тосихидэ Курихара и Лоис Смит, которым авторы благодарны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. Besharse, J., Bok, D. , Academic Press. Oxford, UK. (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. Hartnett, M. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2013).
- Fruttiger, M.
- Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
