Summary
Descriviamo un metodo per costruire dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari. Questo dispositivo consente l'analisi delle risposte cellulari ai segnali solubili in microambienti 3D con gradienti chemioattrattante definiti. Gli organoidi sono meglio di cellule singole al rilevamento di ingressi rumorosi deboli.
Abstract
Varie limitazioni dei sistemi di coltura cellulare 2D hanno suscitato interesse per le piattaforme di analisi e coltura cellulare 3D, che simulerebbero meglio la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi e mimano le funzioni tissutali in vivo. I recenti progressi nelle tecnologie di microfabbricazione hanno facilitato lo sviluppo di ambienti 3D in vitro in cui le cellule possono essere integrate in una matrice extracellulare ben definita (ECM) e un set definito di biomolecole solubili o a matrice associata. Tuttavia, le barriere tecnologiche hanno limitato il loro uso diffuso nei laboratori di ricerca. Qui, descriviamo un metodo per costruire semplici dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari in microambienti 3D con un gradiente chemioattrattante definito. Illustreremo l'uso di questa piattaforma per l'analisi della risposta delle cellule epiteliali e degli organoidi ai gradienti dei fattori di crescita, come il fattore di crescita epidermico (FEG). I gradienti del FEG erano stabili nei dispositivi per diversi giorni, portando alla formazione di rami diretti negli organoidi del seno. Questa analisi ci ha permesso di concludere che il rilevamento del gradiente collettivo da parte di gruppi di cellule è più sensibile rispetto alle singole cellule. Descriviamo anche il metodo di fabbricazione, che non richiede strutture fotolitografiche né tecniche avanzate di Litografia morbida. Questo metodo sarà utile per studiare i comportamenti cellulari 3D nel contesto dell'analisi dello sviluppo e degli stati patologici, compreso il cancro.
Introduction
In ambiente fisiologico, le cellule sono incorporate in una matrice extracellulare (ECM) ed esposte a una pletora di biomolecole. Le interazioni tra le cellule e il microambiente circostante regolano i processi intracellulari che controllano diversi fenotipi, tra cui la migrazione, la crescita, la differenziazione e la sopravvivenza1,2. Molto è stato appreso sui comportamenti cellulari in una coltura cellulare 2D convenzionale. Tuttavia, con l'avvento dell'imaging intravitale e della sperimentazione con cellule incorporate in idrogel 3D, importanti differenze nei comportamenti delle cellule sono state riconosciute nelle colture 2D in vitro semplificate rispetto agli ambienti simili a tessuti 3D. Mentre le cellule interagiscono con le fibre ECM e percepiscono le loro proprietà meccaniche all'interno della matrice 3D, la rigidità del materiale del gel non è una variabile completamente indipendente in un sistema 2D in vitro. La dimensionalità altera la formazione di adesione focale, con conseguente morfologia e comportamento delle cellule differenti. Inoltre, le celle su una superficie 2D sono esposte a meno segnali di segnalazione rispetto alle celle aperte a tutte le direzioni in 3D.
Queste limitazioni hanno aumentato gli interessi dei sistemi 3D che rappresentano la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi e prevedono meglio le funzioni tissutali in vivo. Sono stati sviluppati in molte forme da organoidi come microstrutture cellulari auto-assemblaggio alle cellule intervallate casualmente in ECM3,4. I recenti progressi nelle tecnologie di microfabbricazione hanno facilitato l'avvento di vari tipi di sistemi di coltura 3D5, 6,7,8,9 per lo studio dei cambiamenti fenotipici e risposte cellulari ai segnali solubili; Tuttavia, le barriere tecnologiche limitano l'uso diffuso nei laboratori di ricerca. In molti casi, i processi di fabbricazione richiedono tecniche di fotolitografia e conoscenze di fondo per la litografia morbida. Inoltre, vari fattori devono essere controllati per costruire con successo un dispositivo e per ottenere una funzione ottimale del dispositivo per un lungo periodo di tempo.
Il nostro metodo descrive come costruire un dispositivo 3D PDMS per incorporare le cellule e gli organoidi multicellulari in un microambiente 3D con gradienti chemioattrattante definiti e quindi analizzare le risposte epiteliali a EGF10. I nostri dati rivelano che la capacità degli organoidi di reagire ai gradienti del FEG superficiali deriva dall'accoppiamento chimico intercellulare attraverso incroci di Gap. Suggerisce il potenziale degli organoidi per una rilevazione più precisa di ingressi deboli e rumorosi spazialmente graduati. Il processo di fabbricazione non richiede una struttura per camera bianca né tecniche di fotolitografia. Tuttavia, il dispositivo 3D PDMS include i fattori necessari dell'ambiente fisiologico 3D. Questo metodo sarà utile per studiare i comportamenti cellulari 3D e ha un grande potenziale di ricerca con diversi tipi di cellule, chemoattractants, e combinazioni ECM.
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Protocol
Tutto il lavoro animale è stato condotto in conformità con i protocolli esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali, Johns Hopkins University, School of Medicine.
1. fabbricazione del dispositivo mesofluidico
- Progettare la maschera dello stampo per il dispositivo PDMS utilizzando un software CAD 3D.
- Stampare lo stampo utilizzando apparecchiature di stereolitografia con una resina termoresistente.
Nota: le procedure qui descritte sono state svolte da un servizio di stampa 3D commerciale. - Miscelare accuratamente una soluzione di monomero PDMS con l'agente polimerizzante in un rapporto di 10:1. per la fabbricazione del dispositivo è stato richiesto 3 mL di miscela PDMS. Il volume totale dipende dal numero degli stampi da fabbricare.
- Degas la miscela applicando un vuoto con l'uso di un laboratorio in-House vuoto o pompa a vuoto in un essiccatore sottovuoto per 1 ora.
- Tamponare la superficie dello stampo con un nastro adesivo per rimuovere la polvere, quindi versare la miscela di PDMS allo stampo. Se si introducono bolle nel processo, ripetere il degassamento nell'essiccatore a vuoto. Le bolle intrappolate tra i pilastri dello stampo possono essere rimosse infilandole con un ago affilato.
Nota: il processo di degassamento a temperatura ambiente deve essere fatto entro 1 ora o meno. - Curare il PDMS riscaldando a 80 ° c per 2 ore. Lasciare raffreddare lo stampo a temperatura ambiente.
- Tagliare il confine tra lo stampo e PDMS con una lama e poi staccare PDMS dallo stampo con attenzione.
- Tagliare la parte PDMS per adattarla al coprioggetti da 22 mm x 22 mm e perforare un foro all'ingresso.
Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui. - Pulire la parte PDMS e il vetrino coprioggetti da 22 mm x 22 mm asciugando le superfici con tessuti a basso contenuto di lanugine e 70% di etanolo. Quindi rimuovere grandi particelle di polvere da afferrare con un nastro adesivo.
- Sterilizzare la parte PDMS e il vetrino coprioggetti in autoclave (121 ° c per 8 minuti bagnati, 15 minuti a secco) o l'esposizione alla luce UV per 1 ora.
- Trattare la superficie inferiore della parte PDMS e coprire con pistola di scarico corona per 5 min nel cappuccio cultura del tessuto e poi legarli insieme.
Attenzione: posare qualsiasi materiale non conduttivo come polistirolo espanso sul fondo e rimuovere tutti i materiali conduttori durante questo processo. Iniettare il collagene nel dispositivo immediatamente, entro 5 minuti, dopo il trattamento per aumentare l'incollaggio tra gel di collagene e vetrino coprioggetti.
2. preparazione delle cellule: isolamento organoide primario mammario
Nota: i dettagli dell'isolamento organoide mammario possono essere trovati in un lavoro precedente11. Qualsiasi tipo di singola cellula o organoide può essere preparato secondo i propri protocolli di isolamento/distacco.
- Tritare il tessuto mammario della ghiandola dei topi con un bisturi fino a quando il tessuto si rilassa e scuoterlo per 30 minuti a 37 ° c in 50 mL di soluzione di collagenasi/tripsina (10 mL per topo) in DEME/F12 completato con 0,1 g di tripsina, 0,1 g di collagenasi , 5 mL di FBS, 250 μL di 1 μg/mL di insulina e 50 μL di gentamicina da 50 μg/mL.
- Centrifugare la soluzione di collagenasi/tripsina a 1.250 x g per 10 min. rimuovere il supernatante per aspirazione. Disperdere le cellule in 10 mL di DMEM/F12 e centrifugare a 1.250 x g per 10 min. Dopo aver rimosso DMEM/F12 per aspirazione, risospendere le cellule in 4 mL di DMEM/F12 completati con 40 μL di DNase (2 unità/μL).
- Agitare la soluzione DNase a mano per 2-5 minuti e quindi centrifugare a 1.250 x g per 10 min.
- Separare gli organoidi da singole cellule attraverso quattro centrifugazioni differenziali (impulso a 1.250 x g e fermare la centrifuga 3-4 s dopo che raggiunge la velocità prevista). Tra ogni impulso, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di DMEM/F12.
- Risospendere il pellet finale nella quantità desiderata di mezzo di crescita di DMEM/F12 con 1% di penicillina/streptomicina e 1% di insulina-transferrina-selenio-X per la preparazione del collagene.
3. preparazione e iniezione del collagene
Nota: altri tipi di gel ECM possono essere preparati secondo i propri protocolli di gelazione.
- Preparare la soluzione di tipo I di collagene (3,78 mg/mL), 10x DMEM, soluzione 1 N NaOH, normale supporto di crescita sul ghiaccio.
Nota: mantenere il ghiaccio fino al completamento della procedura. - Aggiungere 6 μL di soluzione 1 N NaOH, 200 μL di mezzo di crescita e 50 μL di DMEM 10x in una provetta per microcentrifuga pre-refrigerata e miscelare accuratamente la soluzione.
- Aggiungere 425 μL di collagene nella soluzione premiscelata e miscelare accuratamente con il pipettaggio.
- Centrifugare la miscela di collagene brevemente (meno di 5 secondi) per separare e rimuovere le bolle dalla miscela.
- Mantenere la soluzione di collagene neutralizzato su ghiaccio per 1 ora per indurre la formazione di fibre.
- Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare nella miscela di collagene e mescolare accuratamente.
Nota: la concentrazione finale di collagene è di 2 mg/mL. - Iniettare la soluzione utilizzando 200 μL di Pipet attraverso l'ingresso del dispositivo PDMS fino a riempire l'intera camera. Se la miscela di collagene trabocca attraverso le lacune dei pilastri, tagliare il gel di collagene in eccesso con lama chirurgica affilata dopo la gelazione.
- Tenere il dispositivo nell'incubatore a 37 ° c con 5% di CO2 per 1 ora per indurre la gelazione.
- Riempire i serbatoi su entrambi i lati con il mezzo di crescita e mantenere il dispositivo nell'incubatore a 37 ° c con il 5% di CO2 fino a quando non viene eseguita l'imaging confocale.
4. Imaging e quantificazione 3D
- Installare una camera di coltura di imaging a cellule vive in un microscopio confocale e pre-impostare la temperatura e CO2 a 37 ° c e 5%, rispettivamente. Per ottenere umidità fino, aggiungere acqua nel serbatoio della camera e posizionare salviette umide nella camera, se necessario.
- Collocare il dispositivo PDMS nella camera e aggiungere il FEG a uno dei serbatoi come "fonte" del FEG nella formazione del gradiente. L'altro bacino servirà un "lavandino" necessario per lo sviluppo della distribuzione del FEG a livello spaziale. 2,5 nM di FEG è stato aggiunto nel lavello per rendere il gradiente di 0,5 nM/mm in questo studio.
- Impostare l'intervallo di Z-stack che copre il volume di organoidi di interesse e avviare l'imaging.
Attenzione: per evitare la fototossicità, provate un'intensità laser più bassa nell'imaging confocale o utilizzate tecniche di imaging multi-Foton. - Ricostruisci un'immagine 3D da stack di immagini 2D utilizzando un software commerciale o un programma personalizzato. Misurare la lunghezza e l'angolo dei rami che si estendono dagli organoidi o dalla migrazione delle singole cellule. Qui, eseguire la quantificazione disegnando un contorno a mano libera intorno al corpo organoide utilizzando ImageJ.
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Representative Results
Il FEG è un regolatore essenziale della morfogenesi ramificazione nelle ghiandole mammarie e di un chemioattrattante critico che guida la migrazione delle cellule epiteliali del seno nella crescita invasiva del cancro. Abbiamo usato i dispositivi fluidi mesoscopici sopra descritti per studiare la risposta delle cellule ai gradienti del FEG definiti (Figura 1a, B)10. Il dispositivo produce un'area di coltura larga 5 mm, lunga 10 mm e alta 1 mm. I lati della zona di coltura sono separati da pozzi aperti da pilastri esagonali, che vengono utilizzati per intrappolare la ECM liquida e la miscela cellulare all'interno dell'area di coltura cellulare attraverso la tensione superficiale. Notiamo che, data la dimensione di questa cultura 3D, sarebbe molto difficile, costoso e dispendioso in termini di tempo per costruire uno stampo opportunamente dimensionato con la fotolitografia10. Utilizzando una nuova applicazione di una tecnica standard, stereolitografia, abbiamo rapidamente e a buon mercato prodotto lo stampo. Inoltre, modificando il disegno, un gradiente esponenziale (Figura 1C, i) o più gradienti lineari in un chip (Figura 1C, II) può essere indotto così come un gradiente stabile con flusso continuo (Figura 1C, III).
Entrambi in silico (Figura 2a, B, C) e in vitro (Figura 2D, e, F) test hanno dimostrato la formazione di un gradiente lineare FEG stabile attraverso l'area della coltura cellulare che durò per circa due giorni senza reintegro il " serbatoi di origine "e" sink ". La diffusione dipendente dal tempo delle proteine è stata simulata utilizzando un software di multifisica commercializzata. La geometria 3D della configurazione della camera è stata ricreata sul software e la concentrazione media all'interno del volume della camera è stata determinata e tracciata. Questi risultati hanno suggerito che il FEG, una proteina 6,4 kDa, può formare un gradiente stabile basato sulla diffusione all'interno del gel di collagene preparato come descritto sopra in un periodo relativamente breve di tempo. Abbiamo anche stabilito che i profili simili di proteine di 1, 10 e 150 kDa potevano essere formati usando questo metodo.
Gli organoidi mammari hanno formato più rami in presenza di 2,5 nM di uniformità spaziale e la formazione del ramo non ha mostrato bias direzionale su 3 giorni (Figura 3A, D). Tuttavia, se il FEG è stato aggiunto sotto forma di una pendenza lineare di 0,5 nM/mm, la formazione delle diramazioni ha mostrato una significativa polarizzazione direzionale (Figura 3B, e). Tuttavia, non abbiamo rilevato tale polarizzazione per le singole celle nello stesso gradiente. Per determinare se la comunicazione multicellulare fosse necessaria per la risposta del gradiente, abbiamo esplorato se il blocco di incroci intercellulari con vari inibitori impedirebbe la formazione di rami polarizzato. Gli inibitori di giunzione Gap infatti soppresso la capacità degli organoidi per rispondere al gradiente (Figura 3C, F). Come esplorato più approfonditamente nello studio originale che descrive questo metodo10, questo risultato sostiene l'ipotesi che la comunicazione attraverso incroci di Gap sia necessaria per la risposta del gradiente del FEG negli organoidi mammari10.
Figura 1. Dispositivo mesofluidico con gradiente FEG definito. (A) vista 3D del chip PDMS: (i) vista dall'alto e (II) vista frontale di uno stampo (unità: mm) (III) una matrice di stampi (rosso) riempito con PDMS (trasparente) (IV) camere PDMS impasticcatissimi off dallo stampo (v) uno schema schematico di un dispositivo assemblato (vi) un quadro reale del riempimento del dispositivo con gel di collagene e mezzo di coltura. (B) un diagramma schematico della camera mesofluidica con organoidi incorporati in un gel di collagene e serbatoi di alta (rossa) e bassa (rossa) concentrazione del FEG con conseguente gradienti del FEG (questa cifra è stata modificata a partire da10). (C) progetti potenziali per indurre un gradiente esponenziale (i), quattro diversi gradienti lineari in un chip (II) e un gradiente stabile con flusso continuo (III). Le regioni rosse indicano fonti o lavandini pieni di colture medie e regioni grigie indicano camere riempite con miscela gel/cellule. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2. Valutazione dei gradienti ligare attraverso il chip. (A) simulazione della concentrazione di ligando attraverso il chip che mostra i profili sfumati. Profili sfumati simulati di (B) 1 proteina kDa e (C) 70 proteina kDa. (D) immagine del dispositivo con gradiente lineare di 10 kDa Dextran Blue utilizzato per visualizzare la diffusione del FEG. Linee esagonali punteggiate indicano pilastri sul lato della zona del gel. Profili di gradiente sperimentali di 1, 10 e 150 kDa destrano attraverso il chip (questa cifra è stata modificata da Ellison et al. 201610) (E) dopo 8 ore e (F) dopo 48 ore. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3. Risposta cellulare al gradiente del FEG. A) ramificazione non direzionale di organoidi in collagene con un'uniforme 2,5 Nm EGF. (B) ramificazione direzionale di organoidi in collagene con gradiente lineare di 0,5 Nm/mm di FEG. C) ramificazione non direzionale di organoidi in una pendenza lineare di 0,5 Nm/mm di FEG con un blocco di giunzione di Gap. (D-F) Istogrammi angolari di direzioni di ramificazione organoide corrispondenti rispettivamente a (A)-(C). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
La fabbricazione di stampi PDMS è stata eseguita utilizzando un servizio di stampa 3D commerciale, ma può anche essere realizzato da una stampante 3D di fascia alta in-House. Tra i vari metodi di fabbricazione 3D, la stereolitografia è consigliata per la generazione di stampi ad alta risoluzione. Poiché la polimerizzazione PDMS si verifica ad una temperatura elevata (80 ° c), i materiali devono essere sufficientemente resistenti al termicamente, che devono essere specificati esplicitamente, se la stampa è esternalizzata. Una post-polimerizzazione termica può essere discussa con la società di servizi di stampa per aumentare la resistenza termica del pezzo. I dettagli del servizio di stampa e dei materiali sono specificati nella tabella dei materiali.
La proprietà meccanica del PDMS polimerizzato dipende dalla temperatura di indurimento. Se la miscela PDMS viene mantenuta a temperatura ambiente per lungo tempo prima della polimerizzazione in un forno, diventa troppo elastica anche dopo la completa polimerizzazione. Così, il processo di degassamento a temperatura ambiente deve essere fatto entro 1 ora o meno. Degassing si riferisce ad un'applicazione ciclica di vuoto che può aiutare a rimuovere eventuali microbolle all'interno di PDMS.
Il pH della soluzione di collagene è fondamentale non solo per la gelazione, ma anche per la vitalità delle cellule. Se il collagene non viene neutralizzato prima della miscelazione con le cellule, la vitalità delle cellule sarà bassa. La quantità di soluzione 1 N NaOH per neutralizzare la miscela di collagene dipende dal pH della soluzione di collagene originale e può essere calcolata teoricamente. Tuttavia, si raccomanda di aggiungere gradualmente la soluzione di NaOH alla soluzione di collagene, controllando le letture del pH del mezzo utilizzando l'indicatore rosso fenolo o utilizzando nastri di prova del pH.
Degassare il gel è importante durante tutto il processo. Se le bolle si formano durante la gelazione dopo che la miscela di collagene viene iniettata nel dispositivo, possono essere rimosse anche posizionando il dispositivo sul ghiaccio per 10 min o più. Abbassando la temperatura, la dimensione delle bolle si riduce e i vuoti sono alla fine occupati dalla miscela di gel. Lo stesso metodo può essere utilizzato quando le bolle sono intrappolate tra i pilastri dopo aver aggiunto il terreno di coltura ai serbatoi.
Abbiamo usato questa tecnologia per creare dispositivi mesofluidici che consentono l'incorporazione di grandi costrutti multi-cellulari in un ambiente di matrice extracellulare fisiologicamente rilevante e integrandolo con gradienti definiti di fattori di crescita e altri solubili molecole bioattive. La stereolitografia ad alta risoluzione ci ha permesso di produrre stampi di alta qualità e a basso costo. Il processo di fabbricazione non richiede strutture per camera bianca né tecniche di fotolitografia, e quindi consente una generazione semplice ma efficace di un ambiente 3D per la coltura cellulare e la sperimentazione, che ha molteplici vantaggi rispetto al tradizionale 2D sperimentazione f. Il dispositivo qui illustrato è stato progettato per avere un'area di coltura di 5 mm di larghezza, 10 mm di lunghezza e 1 mm di altezza. L'area di coltura relativamente grande con altezza più spessa permette la crescita di organoidi mesoscopicamente grandi o sferidi, che variano in dimensioni da decine a centinaia di micrometri. Consente inoltre l'analisi della morfologenesi epiteliale ramificata e l'analisi della migrazione collettiva e a singola cellula all'interno dell'ambiente 3D. I lati del dispositivo sono pozzi aperti che consentono l'uso di pipette standard per cambiare i media o per aggiungere farmaci senza la necessità di interfacciamento complicato con i dispositivi di controllo del liquido, di solito utilizzati per i dispositivi microfluidici mainstream. Inoltre, la semplice configurazione di una camera PDMS e di un vetro di copertura nella parte inferiore è universalmente compatibile con diversi sistemi microscopici. L'uso dei dispositivi ha mostrato la direzione di ramificazione parziale della morfogenesi nel tessuto mammario normale, in risposta al gradiente imposto dal FEG come esempio rappresentativo per l'uso del dispositivo. Tuttavia, questo utilizzo può anche essere esteso a diversi tessuti, fonti cellulari, chemoattractants, e farmaci per l'analisi del comportamento cellulare/tessuto in 3D. L'uso può anche essere esteso per adattarsi a una modellazione dei tessuti più realistica, che possa ospitare la formazione di reti vascolari da singole cellule all'interno del gel insieme all'incorporamento di altri tipi di cellule, inclusi i componenti stromali e immunitari mesenchimali e diversi tipi di cellule epiteliali.
Anche se la stereolitografia offre la migliore risoluzione tra le tecniche di stampa 3D, la dimensione minima della funzione è ancora limitata a diverse decine di micrometri. Pertanto, questo protocollo non è sufficiente per sostituire la fotolitografia nella fabbricazione di stampi su una scala di diversi micrometri. Un'altra limitazione di questo protocollo è la profondità relativamente bassa dell'imaging di alta qualità nella direzione z rispetto alla direzione x-y, che è un problema intrinseco dei costrutti di scala tissutale, utilizzando la microscopia convenzionale. Tuttavia, anche con queste limitazioni, il metodo descritto può fornire una piattaforma di analisi potente e flessibile che è facile da fabbricare e utilizzare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), e NCI U54 CA210173) e AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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