Summary
טכניקות ביטוי מסורתיים מבוססי cDNA יש של תחולה מוגבלת עבור ביטוי של RNAs noncoding זמן עקב שלהם טפסים splice מרובים עם פונקציונליות פוטנציאליים. ביקורת זו דוחות באמצעות טכנולוגיית CRISPR את overexpress וריאציות splice מרובים של RNA זמן noncoding פרוטוקול.
Abstract
זמן noncoding RNA (lncRNA) ביולוגיה היא שדה חדש ומרגש של מחקר, עם מספר פרסומים משדה זה גדלה אקספוננציאלית מאז 2007. מחקרים אלה אישרו כי lncRNAs הם שינו כמעט כל מחלות. עם זאת, ללמוד את התפקידים פונקציונלי עבור lncRNAs בהקשר של מחלה נשאר קשה עקב חוסר חלבון מוצרים, ביטוי רקמות ספציפיות, רמות הביטוי נמוך, המורכבויות טפסים splice, חוסר שימור בין המינים. נתון הביטוי תלויי מין, מחקרים lncRNA מוגבלים לעיתים קרובות מחקר האנושית בהקשרים כשלמדתי תהליכי מחלה. מאז lncRNAs לתפקד ברמה המולקולרית, אחת הדרכים לנתח lncRNA ביולוגיה היא להסיר את lncRNA או overexpress ההשפעות הסלולר lncRNA ולמדוד. במאמר זה, מוצג פרוטוקול בכתב, דמיינו overexpress lncRNAs במבחנה. בתור ניסוי נציג lncRNA הקשורים עם מחלות מעי דלקתיות, אינטרפרון גמא Antisense 1 (IFNG-AS1), מוצג כדי להיות overexpressed במודל Jurkat T-cell. כדי לעשות זאת, הטכניקה הפעלת באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) משמש כדי לאפשר ביטוי-לוקוסים גנומית אנדוגני. הפעלת הטכניקה CRISPR מטרות ערכה של גורמי שעתוק לאתר התחלה תעתיק של הגן, מתן אפשרות של ביטוי חזקים של טפסים splice lncRNA מרובים. הליך זה ניתן לפרק לתוך שלושה שלבים, כלומר RNA (gRNA) (i) מדריך בנייה ועיצוב וקטור, דור (ii) וירוס, התמרה חושית ו- (iii) המושבה הקרנה של ביטוי. עבור ניסוי נציג של יותר מאשר שיפור 20-fold IFNG-AS1 בתאי Jurkat T נצפתה.
Introduction
בעוד המחקר הביו-רפואי ביותר התמקדה תעתיקים חלבונים, רוב הגנים משועתקים למעשה מורכבת noncoding RNAs (שחרור Ensembl 93). המחקר הנוכחי מתחיל לחקור את השדה עם מספר פרסומים על lncRNAs בתהליכי מחלה עולה אקספוננציאלית בין 2007 ו 20171. פרסומים אלה מדגימים כי lncRNAs רבים הקשורים במחלה. עם זאת, המנגנון המולקולרי של lncRNAs האלה קשים ללמוד בשל הפונקציות מגוונות שלהם לעומת mRNAs. הרכבה הבעיה של להבין את התפקיד של lncRNAs במחלה, lncRNAs מבוטאים לעיתים קרובות ברמות נמוכות יותר קידוד RNAs2. בנוסף, lncRNAs לקוי נשמרים, אשר מגביל את המחקרים פונקציונלי טכניקות האדם תא קו-מבוססת על3. שיטה אחת כדי לחקור את המנגנון של הגנים האלה הרומן היא endogenously overexpress אותם בתאים בתרבית. מחקרים ביטוי יכול לספק מידע מפתח הפונקציה של גנים ספציפיים ולאפשר חוקרים לנתח מפתח מסלולים מולקולריים.
שיטה חדשה להפעלת שעתוק של גנים lncRNA מבוססת על טכנולוגיות CRISPR שפותחה בתחילה על ידי מעבדה Gersbach4. פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש בביולוגיה lncRNA והן עבור הביטוי של גנים אלה במערכות אחרות מודל. ב- CRISPR overexpressing טכניקה, חלבון הנקרא CRISPR-הקשורים חלבון 9 (Cas9) יכול להיות מופנה כלפי רצף הדנ א באמצעות gRNA antisense מזוהה על-ידי Cas9. בדרך כלל, Cas9 יניעו ביקוע DNA; עם זאת, מוטציות בגן Cas9, שפותחו בעבר ביטוי הטכניקה, לבטל את שלב5. מתי מפעיל גנים ברמת השעתוק היא דבוקה של Cas9 "מת" (dCas9) transduced לתוך שורות תאים, ביטוי אנדוגני של lncRNAs יכול להיות מושגת4,6. התוספת של שינויים נוספים gRNA, הפעלת גורמים נוספים תעתיק לקשור gRNA, הגדילו את היעילות של מערכת ההפעלה של הגן dCas9 10-fold7. חשוב, הוכח כי הפעלת גנים ברמת השעתוק דורשת הקרבה (< 200 bp) תעתיק להפעיל אתר הגנים, הפעלת קולטנים upregulation ספציפיים של ג'ין עשיר אזורים7. בניגוד CRISPR טכנולוגיות נוקאאוט, קלטות dCas9 ו- gRNA צריך להיות משולב לתוך הגנום כדי לאפשר תאים לשמור על ביטוי דורות מרובים. שיטה אחת כדי להשיג זאת היא להשתמש lentiviruses כדי לשלב את dCas9 ואת gRNA-המכילים הקלטות. לאחר שילוב, בביטוי הגן lncRNA יכול להיקבע.
במאמר זה, תודגמנה פרוטוקול עבור ביטוי lncRNA במודל Jurkat T-cell. הליך שלב אחר שלב מוצג, ניתן להתאים גם תאים חסיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: חשוב לציין כי פרוטוקול זה משתמש בשכפול לקויה lentiviruses. לבצע טיפול ויראלי רק לאחר בטיחות במעבדה המתאים. אקונומיקה כל הפריטים של משטחים יבואו במגע עם וירוסים חיים למשך תקופה מינימלית של 10 דקות לאחר טיפול. שימוש מעיל המעבדה חד פעמיות והגנה הפנים/עין, כמו גם כפפות כפול, בכל עת. ביצוע עבודה וירוס אבטחה ברמה 2 + מעבדות עם אישורים ויראלי. להקדיש תרביות רקמה וקולטי, חממות לעבודה ויראלי.
1. וקטור עיצוב ו דור
הערה: הדרך הטובה ביותר לזהות רצפים gRNA היא להשתמש בכלי העיצוב באינטרנט (למשל, http://crispr-era.stanford.edu) (משלימה איור 1: gRNA עיצוב). לניסוי נציג הנלווה, חברה עיצבת ויצרת את הווקטורים gRNA המשמשים את הניסוי נציג. פלסמיד dCas9 גם נרכש באינטרנט.
- רצף gRNA ממוקם במעלה הזרם של הרצף נוקלאוטיד "הגולה", איפה "N" נוקלאוטיד כלשהו, אשר גם הוא בתוך 100 base-זוגות התחלה גנים ברמת השעתוק באתר. לחיפוש מסדי נתונים גנטיים כגון בלאט (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) רצף gRNA, כדי לוודא שלא יהיו אין אתרים אחרים בגנום עם רצפים דומים (משלימה איור 2: BLAT). פעולה זו תבטיח כי הרצף gRNA הוא ייחודי הגן עניין (גוי).
- לאחסן את פלסמידים gRNA ו dCas9, אשר הגיעו כמו הספחים חיידקי, ב 4 º C. פס החוצה Escherichia coli -לוריא מרק (LB) אגר צלחת עם אמפיצילין (משלימה טבלה 1) ולגדול החיידק בן לילה ב 37 º C.
- לבחור מושבה ולגדול החיידק ב 5 מ של ליברות עם אמפיצילין (משלימה טבלה 1) בן לילה, נמרצות רועדת מפחד את הצלחת חממה 37 ° C. למחרת, להוסיף 2 מ של חיידקים כדי 200 מיליליטר ליברות עם אמפיצילין צומחים בקבוקון 2 ל', נמרצות לנער את הבקבוק לילה בחממה 37 ° C.
- לסובב את החיידקים ב x 3,724 g עבור 20 דק. הסר המדיה ואת המקום הצינור המכיל החיידקים על קרח.
-
לטהר DNA חיידקי באמצעות ערכת טיהור פלסמיד לכל הפרוטוקול של היצרן.
הערה: ערכות טיהור פלסמיד מכיל מאגר resuspension קניינית, פירוק מאגר, מאגר לשטוף, מאגר equilibration ו • תנאי מאגר.- להוסיף 10 מ"ל resuspension מאגר הערכה חיידקים ועל pipet החיידקים לתוך הפתרון. לאחר מכן, להוסיף 10 מ של פירוק מאגר הערכה של חיידקים resuspended ומערבבים אותם על-ידי היפוך ברכבת התחתית. המתן 5 דקות כדי lyse החיידקים; לאחר מכן, להוסיף 10 מ של ניטרול כקרח מאגר הערכה של חיידקים lysed ומערבבים אותם על-ידי היפוך ברכבת התחתית.
- Equilibrate את העמודה ה-DNA הערכה עם 10 מ"ל equilibration מאגר עבור 5 דק לשפוך הדגימות לתוך עמודת ה-DNA לסנן ולתת את הפתרון לעבור דרך המסנן.
- לשטוף את הדגימות 2 x עם 30 מ של מאגר וקונטה, ואז, elute ה-DNA עם 30 מ של מאגר • תנאי צינור חרוטי 15 מ"ל. לאט לאט שכבה 10.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל בטמפרטורת החדר אל ה-DNA eluted להפוך את הצינור, מיד לסובב אותו ב x והוא מעסיק 16,200 g למשך 30 דקות ב 4 º C.
- הסר את תגובת שיקוע ולהוסיף 1 מ"ל אתנול 70% בגדר ה-DNA. Resuspend בגדר על ידי מצליף את הצינור. לסובב אותו ב x והוא מעסיק 16,200 g 10 דקות ב 4 ° C ולהשתמש טיפ pipet μL 200 כדי להסיר את מרבית האתנול. מילה נהדרת בגדר במשך 5 דקות, resuspend זה ב 200 μL של מים. לאחסן את ה-DNA ב-20 ° C. ריכוז הצפוי יהיה > 1 μg/μL.
2. וירוס הדור ואת החלקיקים ספירה
- כאשר מוכן ליצור את lentivirus המכילים dCAS9, מעיל 100 מ מ מנות תרביות רקמה עם 5 מ של 0.01% פולי-L-ליזין (משלימה טבלה 1). להסיר את עודפי הנוזלים ביסודיות הלוחיות. ותני להם air-dry לכמה דקות באבטחה ארון.
- צלחת 5 x 106 HEK 293T התאים לכל מנה ב 10 מיליליטר של Dulbecco מלאה שונה בינוני של הנשר (DMEM) (משלימה טבלה 1), דגירה אותם בן לילה ב 37 ° C עם 5% CO2. למחרת, להסיר את המדיום של הכלים 293T HEK ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM מלאה.
- מיקס 6.5 μg של פלסמיד pMDLg/pRRE המכיל את איסור הפרסום/pol (רכיבים של הנגיף), μg 3.5 של pMDG2.G פלסמיד המכיל את VSV-G (רכיב של הנגיף), 2.5 µg של המכיל פלסמיד pRSV-Rev Rev (מרכיב של הנגיף), μg 10 של מסוף זמן (אני חוזר משמאל לימין)-שמכיל וקטור gRNA או dCas9 המכילות LTR וקטור ומוסיפים מים עד הנפח הכולל של 450 μL. לסנן את התערובת דרך טיפ מסנן 0.2 µm המצורפת מזרק.
- להוסיף כל מדגם תקנים של ה-DNA µL 50 של 2.5 מטר CaCl2 (משלימה טבלה 1) ומערבבים בעדינות. לסנן את התערובת סידן/DNA באמצעות טיפ מסנן 0.2 µm המצורפת מזרק. Pipet 500 µL של x HBS 2 (משלימה טבלה 1) לתוך צינור פוליסטירן מ ל. הוסף את 500 µL DNA/CaCl2 מיקס dropwise בעדינות מערבולת. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
- לאט לאט להוסיף 1 מ"ל של ה-DNA/CaCl2/HBS ההשעיה כל מנה. מערבולת מיד את הכלים כדי להפיץ את התוכן באופן שווה. דגירה כל מנה לילה בחממה2 CO 5% ב 37 º C.
- יום 3, אט-אט להסיר ולמחוק את המדיה מן המנות. לשטוף היטב את התאים 1 x בתמיסת באגירה פוספט (PBS). להוסיף 6 מ של DMEM מלאה בתוספת 20 מ מ HEPES ו- butyrate נתרן 10 מ מ. דגירה את התאים עבור 5-6 h בחממה2 CO 5% ב 37 º C.
- לשטוף את התאים 1 x עם PBS ולהוסיף 5 מ של DMEM מלאה עם 20 מ מ HEPES על התאים HEK 293T. תקופת דגירה של 12 שעות לילה בחממה2 CO 5% ב 37 º C.
- יום 4, לאסוף את supernatants תא 293T HEK ולסנן את תגובת שיקוע. הקפאת 1 מ"ל aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
- כשתהיה מוכן להשתמש הנגיף, להפשיר aliquot של החלקיק נגיפית המכילה מדיה ממוזגים (מאוחסן כשלב שמתואר 2.8) על קרח. להביא כל ריאגנטים בטמפרטורת החדר.
-
להשתמש ערכת Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (אליסה) p24 לכמת את מספר נגיפים למיליליטר.
- לדלל את שטיפת רכז הערכה על-ידי הוספת 19 חלקים של מים מזוקקים יונים. לדלל את בקרת חיובי הערכה כדי 200 ng/mL, באמצעות RMPI 1640 כמו diluent, ולהפוך דילולים עבור עיקול רגיל ב- 1.5 mL צינורות לפי p24 אליסה דילול טבלה (משלימה בטבלה 2).
- הוסף 20 μL של 5% טריטון X-100 כדי בארות כל פרט המצע ריק. להוסיף 200 μL של RPMI 1640 הבארות שליטה שלילי. להוסיף 200 μL של כל סטנדרט (כפולים) הבארות המיועדים לכך.
- באמצעות ספקטרופוטומטרים, מודדים את ריכוז הנגיף בתוך הדגימות, באמצעות עיקול רגיל. להתחיל דילול מדגם ב 1:1,000 ולשנות אמצעי האחסון לפי הצורך כדי להיות בטווח של העקומה סטנדרטי. לדלל את הדגימות עם טריטון X-100 כדי ריכוז סופי של 0.5% ולהוסיף 200 μL של כל מדגם בשנת RPMI 1640 בארות המיועדים לכך. לאטום את הצלחת ואת תקופת דגירה זה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הצלחת 6 x עם 300 μL 1 x שטיפת מאגר לכל טוב. להסיר את כל הנוזלים העודפים על ידי היפוך לצלחת, טפיחות על מגבת נייר. להוסיף 100 μL של גלאי נוגדן הערכה בארות כל פרט המצע ריק. לאטום את הצלחת ואת תקופת דגירה זה של h 1-37 מעלות צלזיוס. לשטוף את הצלחת, ואז, להסיר כל הנוזלים העודפים על-ידי היפוך לצלחת, טפיחות על מגבת נייר.
- על מנת למדוד את הנוגדן גלאי, להכין streptavidin-חזרת peroxidase (SA-HRP) בתוך 15 דקות של שימוש. לדלל את SA-HRP-מטריים עם SA-HRP diluent. לערבב את SA-HRP מדולל ביסודיות ולהוסיף 100 μL בארות כל פרט הריק. חותם, דגירה את הצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הצלחת עם 1 x שטיפת מאגר והקש משם כל נוזל עודף כמו שלב 2.10.4. השתמש בפתרון המצע אורתופדיה-phenylenediamine (OPD), אשר מספק peroxidase של סובסטרטים הדרושות כדי לייצר chemiluminescence, בתוך 15 דקות של הכנה. השתמש טבליה אחת OPD מ ל 11 של מצע diluent על כל צלחת.
- מערבולת הפתרון OPD נמרצות כדי להמיס לחלוטין, להגן עליו מפני אור. להוסיף 100 μL OPD המצע פתרון כל בארות, כולל הריק. שימוש ספקטרופוטומטרים, לקרוא את ספיגת ב 450 nm באופן מיידי, חוזר זה x 10 במרווחים s 1, ולקחת את המידה הממוצעת.
3. dCas9 -סמנכ ל64 התמרה חושית
- תרבות Jurkat T תאים DMEM מלאה בבקבוקון T75 עם צפיפות של תאים6 2 x 10 15 מ"ל של מדיה. התרבות התאים חממה 37 ° C עם 5% CO2.
- ספין למטה התאים עבור 5 דקות ב 233 x g ו, ואז, resuspend אותם ב 10 מ"ל של מדיה מופחת סרום. לספור את התאים עם hemocytometer או מונה אוטומטי תא הניתן.
- Resuspend, לוחית רישוי 1 x 106 תאים Jurkat ב 5 מ של מדיה מופחת סרום עם polybrene (משלימה טבלה 1) בבקבוקון T75. הוסף HEK ממוזגים 293T המדיה המכילה 1 x 106 dCas9 המכילים נגיפים. ניתן לחשב את מספר נגיפים בערך מ p24 אליסה כי 1 p24 μg/mL שווה 1 x 107 נגיפים. הנחתי את המבחנות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO2.
4. הבחירה , שיבוט הבריאה
- שלושה ימים לאחר הפגיעה, ספין למטה התאים ב x 233 g למשך 5 דקות, resuspend אותם ב 10 מ"ל של DMEM מלאה עם puromycin (משלימה טבלה 1). צלחת התאים T75 מבחנות, תרבות אותם ב 37 ° C עם 5% CO2. בכל יום שלישי, לתקופה של 9 ימים, ספין למטה התאים ב x 233 g למשך 5 דקות והחלף התקשורת מלאה DMEM עם puromycin.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית. על צלחת 96-ובכן מטופלים עם תרביות רקמה, תאים 10,000 צלחת μL 100 של DMEM מלאה עם puromycin הראשון באופן סדרתי גם לדלל 1:1 התוכן של הבארות הבאים עם מלא DMEM עם puromycin. ביצוע דילולים 24 וחזור זה 4 x לכל צלחת על מנת להבטיח כי יש מספר תאים לכל טוב. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
- הרחב את התאים המשובטים שני לוחות 24-ובכן, ואז על פלטה 6-ובכן, ובסופו של דבר לתוך בקבוקון T75. כדי להתמקד בשלושה המשובטים, צלחת 2 x 106 תאים לכל טוב של צלחת 6-ובכן שלושה ארגזים של השיבוטים. צלחת שלושת האחרים בארות עם תאים Jurkat nontransduced כפקדים. לשים את התאים חממה התרבות תאים בין לילה.
- לשימוש RNA החילוץ, ערכת זמינים מסחרית של בידוד ה-RNA. ספין למטה התאים ב x 233 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את המדיה. להשתמש טיפ pipet 1 מ"ל resuspend תאי μL 350 פירוק המאגר. להוסיף 350 μL של 70% אתנול על התאים lysed, לערבב היטב עם pipet 1 מ"ל, להעביר את הדגימה העמודה ה-RNA.
- לסובב את lysates ב 10,000 x g עבור 1 דקות, להסיר את הזרימה דרך וכיצד להוסיף 700 μL נמוך-לכתחילה לשטוף מאגר הערכה על העמודה. לסובב את lysates ב 10,000 x g עבור 1 דקות, להסיר את הזרימה דרך ולהוסיף 80 µL של DNase אני הפתרון הערכה על העמודה; תן את הדגימות תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לסובב את lysates ב 10,000 x g עבור 1 דקות, להסיר את הזרימה דרך ולהוסיף µL 700 גבוהה-לכתחילה לשטוף מאגר הערכה על העמודה. לסובב את lysates ב 10,000 x g עבור 1 דקות, להסיר את הזרימה דרך ולהוסיף µL 700 נמוך-לכתחילה לשטוף מאגר לעמודה.
- הסר את העמודה הצינור אוסף, להעביר אותו צינור אוסף חדש. לסובב את lysates ב x 10,000 g עבור 1 דקות, לאחר מכן, להעביר את העמודה ה-RNA צינור 1.5 מ. להוסיף 50 µL של מים העמודה ואת ספין-x 10,000 g עבור 1 דקות.
- השתמש ספקטרופוטומטרים לכמת את הריכוז של ה-RNA. מצפים את הריכוז יהיה בין 100 ל- 500 ng/µL, עם ספיגת 260/280 בין 1.9 – 2.1. לאחסן את הרנ א ב-80 מעלות צלזיוס.
- ב- 250 µL צינורות, להוסיף 1 µg של RNA, µL 4 משלימים מאגר סינתזה של דנ א (cDNA), µL 1 של רוורס טרנסקריפטאז, מים נפח סופי של µL 20. כוללים פקדים אין רוורס טרנסקריפטאז. ב הצנטרפוגה תרמי, לסנתז cDNA ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי להשבית את רוורס טרנסקריפטאז. לדלל את cDNA עם 60 µL של מים לאחר הסינתזה.
- להכין תגובות שרשרת פולימראז (מותני) המכילה 5 µL של SYBR ירוק, µL 4 של cDNA, 0.5 µL של פריימר לפנים (10 מיקרומטר), 0.5 µL של פריימר הפוכה (10 מיקרומטר). להפעיל את ה-PCR כדלקמן: צעד 1 = 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, שלב 2 = 95 ° C עבור 10 s, שלב 3 = 60 ° C עבור 10 s ולאחר מכן, חזור על שלבים 2 ו- 3 עבור 30 x.
הערה: הרצף עבור פריימר לפנים dCas9 הוא 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA והוא הרצף עבור ומהצמיגים הפוכה dCas9 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. פריימר לפנים Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) הוא 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT והוא ומהצמיגים הפוכה 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gRNA התמרה חושית, בחירה, שיבוט , ויצירת ההקרנה
- Retransduce של תאים מאומתים Jurkat-dCas9 עם gRNA המכילים וירוסים כמתואר בסעיף 3. בחר תאים DMEM עם hygromycin (משלימה טבלה 1) למשך 10 ימים. ספין למטה התאים ולשנות את המדיה כל 3 ימים.
- מבצע לדילול טורי של תאים (כפי שמתואר בשלב 4.2) והרחב מושבות בודדות (כפי שמתואר בשלב 4.3). לטהר RNA מן המושבות בדיוק כפי שמתואר בשלב 4.5 ולבצע סינתזה cDNA כפי שמתואר בשלב 4.9. לבצע PCR בזמן אמת נגד ממשלת ישראל, HPRT1 או של משק הבית המתאים הגן, באופן דומה ה-PCR שמתואר בשלב 4.10, אבל במקרה הזה, התמונה שהבארות בכל מחזור לאחר שלב 3.
- השתמש בשיטת הסף (Ct) מחזור השוואתי כדי לקבוע קיפול בשינוי גוי8. בקצרה, להשתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את התעתיק היחסי רמות (RTLs): 2-(ממוצע של Ct של גוי – Ct לייעו משק בית ממוצע). לאחר מכן, לחשב את RTL הממוצע של הפקדים, לחלק את כל הערכים RTL פקד הממוצע של RTL ליצירת שינוי קיפול לעומת הדגימות שליטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת כפולה וקטורית כדי overexpress את lncRNA IFNG-AS1
הניסוי דוגמה כתב יד זה הוא ביטוי של מערכת מודל Jurkat T-cell לבטא את lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 הוא lncRNA הקשורים עם מחלות מעי דלקתיות, כי כבר ראיתי לווסת אינטרפרון גמא10. הגן IFNG-AS1 מכיל שלוש גרסאות splice כי כל שימוש באותו אתר התחלה תעתיק (איור 1 א'). לכן, רצפים gRNA היו bp 10 עד 100 מן האתר התחלה תעתיק, היה רצף "הגולה" במעלה הזרם שימשו להכוונת המתחם Cas9. מפעיל את מיקומה תעתיק של IFNG-AS1 (איור 1 א'). מערכת שני-פלסמיד שימשה מגלי dCas9 או gRNAs/משפרי לתוך תאים כמו פלסמיד אחד לבד גורם חלקיק נגיפי הדור קשה עקב גודל פלסמיד (איור 1B). כדי לאפשר את בחירת התאים transduced כפול, וקטור dCas9 הכילה גן עמידות puromycin (aminonucleoside), והכילה פלסמיד המכיל gRNA גן עמידות hygromycin (aminoglycoside). gRNAs היו התמזגו מרצף לגרדום MS2 שאיפשר החלבון לגרדום MS2 לאגד gRNAs. דבוקה של MS2 חלבון הם מפעילים תעתיק נוספים כדי לשפר את ביטוי של IFNG-AS17. באמצעות וקטורים אלה, ניתן ליצור חלקיקים נגיפיים כדי מגלי מערכת זו ביטוי לקווי התא האנושי ביותר.
Titering ויראלי, המושבה ההקרנה
לאחר יצירת פלסמידים של dCas9 ו gRNA-המכילים, פלסמיד purifications בוצעו lentiviruses נוצרו. כפי lentiviruses לשלב באופן אקראי קלטות שלהם לתוך הגנום, כימות של מספר חלקיקים נגיפיים מאפשר לפחות מספר שילובים אפשריים. כדי לעשות זאת, ממוזגים-מדיה-המכיל וירוסים נמדדו עם p24 ערכת דיאגנוסטיקה, המאפשר החישוב של מספר virions למיליליטר. לאחר מדידה, supernatants ויראלי שניהם היו כמעט 1 µg/mL של p24, אשר אפשרה את השימוש µL 100 של וירוס מגלי התאים Jurkat. לאחר התמרה חושית, התאים שנבחרו אנטיביוטיקה היו באופן סדרתי מדולל, שיבוטים הורחבו. Cas9 הביטוי היה מכן נותחו ע י PCR בזמן אמת agarose בג'ל (איור 2B). שניהם שיבוטים שנבחרו היו חיוביות עבור ביטוי Cas9. כדי לאשר את ביטוי ה-mRNA, רוורס טרנסקריפטאז הושמט מן התגובה cDNA (איור 2B). Primers נגד HPRT1 שימשו כדי לאשר הנוכחות של RNA בתאים nontransduced.
מדידת IFNG-AS1 גנים
באמצעות dCas9 של שיבוטים כקו תא הורים, התאים היו transduced עם nontargeting gRNA המכיל וירוס או וירוס המכיל gRNAs נגד IFNG-AS1. לאחר gRNA התמרה חושית, בחירה, ויצירת שיבוט מקבילה לבריאה קו תא dCas9, הביטוי IFNG-AS1 נמדדה כדי לוודא ביטוי. IFNG-AS1 מייצר שלוש גרסאות splice, שכל אחד מהם ניתן להבחין באופן אינדיבידואלי עם התעתיק הספציפי תחל (אדום) או נגד כל הידוע IFNG-AS1 תעתיקים (כחול) (איור 3 א). כל הקימורים קרינה פלואורסצנטית היו מעריכית עם HPRT1 להגיע שמעריכי שלב (או Ct) בתוך חצי מחזור בין שליטה IFNG-AS1-gRNA-ביטוי תאים (איור 3Bג). Primers נגד כל התמלילים IFNG-AS1 הידועים היו ביותר לזיהוי בין ניסויים עם מדידות של עליות 20-fold IFNG-AS1 (איור 3B). בעוד primers נגד תעתיקים נגד 1 ו- 2 בהצלחה מוגבר בתאי תאי דם היקפיים (PBMCs), את התעתיקים הללו לא היו לזיהוי בתאי Jurkat (נתונים לא מוצג). עם זאת, כאשר ההעתק השלישי של IFNG-AS1 היה לזיהוי ב- RNA מרוכז, חמש-כדי tenfold עלייה משמעותית ברמות IFNG-AS1 נראתה. נתונים אלו מראים גם שחבור חליפי של IFNG-AS1 ב Jurkat קיימים תאים בהשוואה לתאים הראשי. Primers נגד IFNG-AS1 זוהה עליות גדולות גן זה, ובכך מאמת את מערכת ביטוי CRISPR.
איור 1: מערכת כפולה וקטורית כדי overexpress את lncRNA IFNG-AS1. (א) A תרשים סכמטי של המבנה ג'ין IFNG-AS1, הקשר בין אתרי קישור הרנ א (gRNA) מדריך התחלה גנים ברמת השעתוק באתר (TSS). (B) התכונות של הווקטורים gRNA ו- dCAS9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: titering ויראלי, המושבה ההקרנה. (א) p24 דוגמה אליסה עיקול רגיל עבור מדיה המכילים lentivirus, ממוזגים. הנקודות השחורות מייצגות דגימות סטנדרטי, האדום הנקודות דגימות לא ידוע. (B) לאחר transducing בחירה, יצירת מושבות, PCR בזמן אמת ולא בג'ל נגד dCas9 בוצעו RNA או תאים Jurkat nontransduced (הורים) או שיבוטים dCas9-transduced. פקדים רוורס טרנסקריפטאז (לא RT) לא בוצעו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מדידת ביטוי גנים IFNG-AS1. (א) A תרשים של מערכת היחסים בין קבוצות פריימר התעתיק משתנים. החיצים האדומים מייצגים התעתיק הספציפי תחל בעוד החצים הכחולים לציין primers נגד כל התמלילים הידוע. (B ו- C) נציג הממוצע PCR עקומות, קיפול-שינוי quantifications עבור שליטה ותאים IFNG-AS1-overexpressing. RFU = יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי. N = 3 דוגמאות לכל קבוצה. זאת אומרת ± SD. *p < 0.05, * * *p < 0.001. של תלמיד t-מבחן שימש כדי לחשב את p-ערכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 1: gRNA עיצוב אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלימה איור 2: BLAT אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלימה טבלה 1: פתרונות אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלימה בטבלה 2: אליסה דילולים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מציג פרוטוקול להצפנה באמצעות הפעלת CRISPR overexpress lncRNAs במבחנה. זוהי טכניקה חשובה במיוחד כאשר ללמוד RNAs noncoding זמן כפי שהמוצר transcriptomic היא היחידה הפונקציונלית. לאחר ביטוי, החוקר יכול, ואז להשתמש תאים אלה להגדיל את יחס אות לרעש כשלמדתי האיגוד שותפים, אפילו למדוד את התוצאות הסלולר של רמות גבוהות של lncRNAs. בנוסף, כפי lncRNAs פועלים לעיתים קרובות ב- cis-גנים, טכניקה זו ביטוי אנדוגני מאפשר אירועים אלה להיות למד11,12.
כתב יד זה מדגיש פרוטוקול כללית gRNA הבריאה, דור lentivirus, התמרה חושית של בחירה, דוגמה ייצוגית lncRNA ביטוי בדם היקפי קו תא T היה המתוארים. בנוסף, טכניקה זו כבר הוכח כדי להיות מוצלחת עצם מח-נגזר תאים חיסוניים13, נוירונים7, תאי גזע עובריים בעכבר14וכליות בתאי אפיתל4. פרוטוקול זה אמנם חלים באופן כללי עבור רוב שורות תאים, התאים שקשה מגלי עשוי לדרוש titers בודדים כדי לאפשר שיעור גבוה יותר של זיהום. בנוסף, חשוב לבצע עיקולים להרוג לאנטיביוטיקה בעת שימוש שורות תאים חדשים, כמו פרוטוקול זה מנצל אסטרטגיה הבחירה חיובי.
ראוי לציין, פרוטוקול זה יש מספר היבטים טכניים הדורשים תשומת לב מיוחדת. עקבי pipetting עבור ה-PCR בזמן אמת הדירים חיוני ליצירת תוצאות לשחזור. הבדלים קטנים אפילו כרכים יגרום ערכי משתנה מאוד, ובכך מקשה על פרשנות. בנוסף ראוי כמותיים PCR תחל בעיצוב, פקדים, כולל את הפקד לא-טרנסקריפטאז עבור ה-PCR תחל בזמן אמת הם קריטיים כמו אישרו כי הרנ א להיות לכמת אינה הדנ א. הבחירה של משק בית גנים עבור ה-PCR בזמן אמת חשוב גם כדי שלמאחה לבצע ניסויים אלה. בעוד HPRT1 נבחר ב פרוטוקול זה, אחרות הגנים של האינטרסים ממוקד באמצעות הטכניקה הזו עלולה לשנות את HPRT115. בחירה זהירה של גנים משק המבוסס על גורמים אלה צריכים להילקח בחשבון.
ישנם כמה חסרונות הפעלת CRISPR ועל היבטים מסוימים של פרוטוקול זה. מגבלה אחת פוטנציאלי היא הביטוי של תעתיקים באזורים מאוד ג'ין עשיר כמו אחרות הגנים השכנות יהיה מופעל. זה אפשרי כי השכנה גנים בסמיכות עשוי להיות מופעל, הפקדים לבצע כדי להעריך את זה. בנוסף, מגבלות אחרות כוללות חוסר בכריכת gRNAs מסוים רצף DNA מסוים. הבחירה של gRNAs מרובים עשויים להידרש כדי לזהות את gRNA המתאים לביטוי נסיעה. אזהרה נוספת למערכת הוא התא של עניין יש את היכולת לנהוג היזמים הקלטות כדי להסיע את הביטוי של gRNAs ושל dCas9. המחקרים המובאים כאן, המודל Jurkat T-cell היה מסוגל לנהוג הביטוי של רכיבים אלה עבור מערכת ביטוי מוצלח.
באופן אידיאלי, הפרוטוקול המתואר כאן צריך לזווג עם מידע המסייע אחרים, כגון נתונים ביטוי יחיד התעתיק ואפקטים פונקציונלי ממחקרים תמונות ציפורים או נוקאאוט, לחזק את התיק מכל הממצאים הבאים. טכניקה זו מציעה דרך חזקים overexpressing כל הגן בסוג לתא מסוים. בהינתן המגבלות של ביולוגיה lncRNA, כגון שימור מינים המסכן, טכניקות כגון המתואר כאן הם קריטיים כדי לחקור את תפקידם סוגי תאים הרלוונטיים. מחקר זה התמקד אחד lncRNA היה מעורב פתופסיולוגיה מחלות מעי דלקתיות, אך משמש כמודל של הלומדים את הפונקציה של אחרים lncRNAs בביולוגיה מחלות אנושיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
סי. פי נתמך ע י 41301 RO1 DK60729 ו- P30 DK-26. D.P. נתמך על-ידי קרוהן & קוליטיס קרן (CCFA) הקריירה פיתוח פרס, התרופה: מרכז מחקר מחלות עיכול (DDRC) DK41301, UCLA קליני ואת מכון המדע Translational (CTSI) UL1TR0001881. ליבת וירולוגיה UCLA מומן על ידי מרכז של איידס המחקר (כפר) להעניק 30 P 5 AI028697. UCLA משולב מולקולרית טכנולוגיות הליבה נתמכה על ידי התרופה/P30 הענק DK041301. עבודה זו גם נתמך על ידי המכון איידס UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
