Summary
이 프로토콜은 저산소증에 노출및 VEGF 수용체 길항제의 주입에 근거하여 마우스에 있는 폐 고혈압 (PH)의 유도를 기술합니다. 동물은 프로토콜의 개시 후에 PH 및 오른쪽 심실 (RV) 비대 3 주를 개발합니다. 모델의 기능적 및 형태특성도 표시됩니다.
Abstract
폐 고혈압 (PH)은 오른쪽 심장 카테터화에 의해 평가된 바와 같이, 휴식시 25mm Hg를 초과하는 평균 폐 동맥 압력에 의해 정의된 병리학적 상태입니다. 질병의 광범위 한 스펙트럼 PH로 이어질 수 있습니다., 그들의 병 인에서 다른, 조직 병리학, 임상 발표, 예 후, 그리고 치료에 응답. 지난 몇 년 동안 상당한 진전에도 불구하고, PH는 치료되지 않은 질병으로 남아 있습니다. 근본적인 기계장치를 이해하는 것은 새로운 치료의 발달을 위한 도로를 포장할 수 있습니다. 동물 모델은 이 목표를 달성하기 위한 중요한 연구 도구입니다. 현재, PH를 다시 수상에 사용할 수 있는 몇 가지 모델이 있다. 이 프로토콜은 2개의 적중 마우스 PH 모델을 설명합니다. PH 개발을 위한 자극은 저산소증및 SU5416의 주사, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 길항제이다. Hypoxia/SU5416의 개시 3 주 후에, 동물은 인간 PH에서 관찰된 조직병리학적인 변경을 모방하는 폐 혈관 리모델링을 개발합니다 (주로 그룹 1). 폐 순환에서 혈관 리모델링은 오른쪽 심실(RV)의 리모델링을 초래한다. RV 압력을 측정하기 위한 절차(오픈 가슴 방법을 사용하여), RV의 형태 분석(심장 심실을 해부하고 계량하여) 및 리모델링의 조직학적 평가(RV 심근세포 비대및 섬유증을 평가하여 혈관 리모델링 및 심장을 평가하여 폐 모두)가 상세히 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 장점은 야생 유형과 유전자 변형 마우스 모두에서 응용 프로그램의 가능성, 상대적으로 쉽고 저렴한 구현, 관심있는 질병의 빠른 개발 (3 주). 이 방법의 한계는 마우스가 심각한 표현형을 개발하지 않고 PH는 노목시아로 돌아오면 되돌릴 수 있다는 것이다. 예방, 뿐만 아니라 치료 연구, 쉽게 이 모델에서 구현될 수 있습니다., 고급 기술의 필요 없이 (외과 설치류 모델 반대).
Introduction
폐 고혈압(PH)은 병리학적 상태이며, 오른쪽 심장 카테터화1,,2에의해 평가되는 바와 같이, 휴식 시 25mm Hg를 초과하는 평균 폐 동맥(PA) 압력에 의해 정의된다. PH로 이어질 수 있는 다양한 질병이 있습니다. PH 관련 조건을 구성하기 위해 여러 분류 시스템이 개발되었습니다. 현재 임상 분류는 5개의 다른 그룹1에서다중 PH 관련 질병을 분류합니다. 이러한 구분은 다양한 환자 그룹이 임상 발표, 병리학, 예후 및 치료에 대한 반응2에서다른 질병을 가지고 있기 때문에 중요합니다. 표 1은 각 질병의 기본적인 조직 병리학적 특성으로 보완된 현재 분류를 요약합니다.
표 1: PH의 임상 분류에 대한 개요와 그룹 내의 주요 조직 병리학 적 특징. 모델링 PH를 위한 저산소증/SU5416 프로토콜의 적합성. 이 테이블은19에서수정되었습니다. PH: 폐 고혈압, PAH: 폐 동맥 고혈압
PH 관련 질병의 처리에 있는 중요한 어드밴스에 에도 불구하고, PH는 아직도 20%와 80% 사이에서 구역 수색하는 3 년 사망률과 함께 치료없이 남아있습니다. 이것은 PH의 근본적인 기계장치를 이해하기 위한 필수적필요를 나타내고, 그 후에, 진행을 방지하고, 느리게 하고, 질병을 치료하기 위하여 새로운 치료의 발달을 나타냅니다. 동물 모델은 이 범위에 매우 중요합니다. 현재 PH를 연구하기 위해 다양한 모델이 존재합니다. 관심있는 독자는이 주제에 대한 우수한 리뷰를참조2,,3,,4. PH로 이어지는 다양한 질병을 염두에 두고, 인간 PH의 다양한 조건이 한 동물 모델에서 완벽하게 재구성될 수 없다는 것은 명백합니다. 사용 가능한 동물 모델은 i) 단일 히트, ii) 투히트, iii) 녹아웃, iv) 과발현 모델3로분류될 수 있다. 단일 히트 모델에서 PH는 단일 병리학 적 자극에 의해 유도되는 반면, 2 히트 모델은 두 개의 병리학적 자극을 더 심한 PH를 유도하는 목표와 결합하여 복잡한 인간 질병을 보다 밀접하게 모방합니다. 이외에도, 몇몇 자극은 동물의 종 및 유전적 배경에 의존하는 PH 모델링차이귀착됩니다 4.
가장 일반적으로 사용되는 고전적인 PH 설치류 모델 중 하나는 만성 저산소증 모델2입니다. 저산소증은 여러 동물 종뿐만 아니라 인간에서 PH를 유도하는 것으로 알려져있다. 저산소증은PH(표 1)에대한 생리학적 자극이라는 장점이 있다. 그러나 설치류에서 PH를 유도하는 데 사용되는 저산소증의 정도는 인간보다 훨씬 더 심각하지만 단일 모욕 (저산소증)은 혈관 리모델링의 온화한 형태로만 이어집니다. 이것은 인간 적인 질병의 엄격을 모방하지 않습니다. 두 번째 히트의 추가, PH 유도에 대한 추가 자극, 유망한 결과를 보여 주었다: 저산소 자극과 결합 된 설치류에 화합물 SU5416의 주입은 더 심각한 PH 표현형2,,5,,6을유도한다. SU5416은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체-2의 억제제이다. It blocks the VEGF receptors and leads to endothelial cell apoptosis. 저산소 조건하에서, 이것은 세포증 저항하는 내피 세포의 부분 집합의 증식을 자극합니다. 또한, SU5416은 원활한 근육 세포 증식으로 이어집니다. 이러한 효과의 조합은 폐 순환의 병리학적인 혈관 리모델링을 초래하고 높은 PA 압력 및 오른쪽 심실 리모델링2,,5,,7로이어집니다. 모델은 쥐6에서 처음 기술되었고 나중에 마우스4,,5,,7에적용되었다. 마우스 모델은 쥐에 비해 덜 심한 혈관 리모델링을 나타낸다. 더욱이, 노목기로 돌아왔을 때, PH는 쥐에서 계속 진행되고, 쥐에서는 부분적으로 가역적이다.
다음 프로토콜은 Hypoxia/SU5416 메서드(계획, 타임라인, 실행)를 사용하여 마우스에서 PH모델링을 위한 모든 단계를 설명합니다. 추가적으로, 모델의 특성화는 이 프로토콜에 기술됩니다: 기능적으로 (개방된 가슴 기술을 사용하여 오른쪽 심실(RV) 압력을 침습적으로 측정함으로써), 형태 (좌우 심실을 해부하고 계량하여), 뿐만 아니라 조직학적으로 (폐 혈관 리모델링, 오른쪽 심실 심근 경전경을 평가하여).
이 프로토콜에 설명된 모든 단계와 메서드는 모든 경험 수준에서 조사관에 의해 쉽게 구현될 수 있습니다. 오픈 가슴 기술을 이용한 RV의 기능적 측정(here 편설명)은 현장에서 금본위제 방법이 아니지만, 경험이 부족한 실험가에서도 빠르게 학습하고 정확하게 재현할 수 있다는 장점이 있다.
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Protocol
동물 실험에 앞서 지역 기관 동물 관리 위원회의 승인을 받아야 합니다. 현재 실험은 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 후 수행되었다.
1. PH 유도
- 준비
- 연구를 시작하기 전에 실험 설계를 신중하게 계획하십시오. 마우스가 첫 번째 SU5416 주사와 동시에 저산소증을 받는지 확인하십시오. 저산소증/SU5416 방법을 사용하여 PH를 유도하기 위한 실험 설계의 예가 도 1A에도시된다. 제어 마우스는 차량만 수신하였다. 이 모델의 경우, SU5416은 3주 연속 주 동안 일주일에 한 번 마우스에 주입될 것이다.
- 이 연구를 위해 8-12 주 된 C57BL/6 마우스를 사용. 12-h 밝은 어두운 주기에 18-20°C에서 동물을 보관하십시오. 음식과 물에 접근할 수 있는 광고 리비툼을확인합니다.
- 동물의 무게. 각 그룹에 무작위로 할당: 노르녹시아와 저산소증/SU5416.
- 도 1B. Secure 질소 (N2) 챔버2근처의 탱크에 도시된 바와 같이 저산소 챔버를 준비한다. 산소(O2)컨트롤러를 10% O2의지점에서 설정합니다. 시스템이 안정된 상태에 도달하도록 합니다.
- 주사에 대 한 SU5416 준비 (의 복용량을 사용 20 mg/kg 체중). SU5416은 수성 용액에 용해되지 않습니다. 따라서 계산된 금액을 100 μL DMSO8로용해하십시오. 예를 들어, 25g 마우스의 경우, 주입되는 SU5416의 양은 0.5 mg으로 용해되어 100 μL 용매(DMSO)에 용해된다. 이 마우스에 대 한 SU5416의 최종 농도는, 따라서, 5 mg/mL.
주의: SU5416은 유해 물질입니다. 제품과 함께 안전 데이터 시트를 주의 깊게 읽고 이 물질을 취급할 때 권장 사항을 주의해야 합니다. 보호 장갑을 착용하고 (모든 주입에 관해서는) 눈 보호를 사용합니다. SU5416의 화학적 구조는 도 1C로 도시된다.C.
참고: 주사 중에 손실되는 부피를 보상하기 위해 적절한 초과 솔루션을 계산합니다(예: 주사기, 바이알 등). 사용된 주사기에 따라 데드 볼륨은 약 200 μL입니다. 10 마우스의 그룹에 대 한, 2 마우스 복용량의 초과 계산. - 주사를 위해 주사기를 준비합니다. 25 G x 5/8" 바늘로 1mL 주사기를 사용하십시오.
- SU5416 피하 주입
- 동물을 억제합니다. 구속을 돕기 위해 케이지 뚜껑에 마우스를 놓습니다. 피부를 잡고 척추와 평행한 텐트를 형성합니다. 마우스에 의한 잠재적 물린 부상을 피하기 위해 머리 뒤쪽을 단단히 파악하십시오.
참고: 두 명의 조사관의 존재는 다른 한 명이 주사를 수행하는 동안 동물을 잡을 수 있기 때문에 절차를 더 빠르고 정확하게 만듭니다. - 바늘을 피부의 느슨한 접기에서 측면 위에 피하로 삽입합니다. 바늘을 피부에 평행하게 삽입해야 합니다. 복벽을 관통하지 마십시오.
- 주사기 의 함량 (용해 된 SU5416 또는 차량의 100 μL)를 주입하십시오.
참고 : 완전한 전달 후 누출을 방지하기 위해, 약 10 s에 대한 주사기를 잡고 약간 피부 아래에 바늘을 회전. - 바늘을 철회하고 동물을 케이지로 돌려놓습니다. SU5416 주입 후, 통풍저 산소 챔버에 케이지를 배치합니다.
- 동물을 억제합니다. 구속을 돕기 위해 케이지 뚜껑에 마우스를 놓습니다. 피부를 잡고 척추와 평행한 텐트를 형성합니다. 마우스에 의한 잠재적 물린 부상을 피하기 위해 머리 뒤쪽을 단단히 파악하십시오.
- 저산소증에 노출
- 시간이 지남에 따라 환기를 모니터링합니다. 산소 공급의 10%를 유지해야 합니다. 21% O2에서반 밀봉 챔버에서 노목시아 동물을 유지합니다.
- 챔버에 산소 레벨을 측정하는 산소 센서가 장착되어 있는지 확인합니다. 챔버의 광범위한 개방을 피하십시오. 청소하고 음식과 물을 추가하면 3 일마다 20 분 이상 챔버를 엽니 다.
- 매일 동물을 검사합니다. 필로직기 또는 체중의 상당한 손실과 같은 스트레스 신호를 고려하십시오.
참고 : 저산소증 / SU5416에서 동물은 체중 을 잃을 것으로 예상된다5. 이것은 질병 발달의 표시입니다. - 3주 연속 SU5416 주입을 반복합니다(실험 설계 개요에 대한 그림 1A 참조).
참고: 주사 부위를 다양화하면 피부 자극을 줄일 수 있습니다.
2. 침습적 RV 압력 측정에 의한 기능적 특성화
- 준비
참고: 마취제를 선택합니다. 주사용 또는 흡입 가능한 마취제를 사용할 수 있습니다. 주 사용 마취제의 약간의 과다 복용 (특히 케타민 / 자일라진 또는 펜토 바르 비탈에서) 심장 기능에 크게 영향을 미칠 수 있기 때문에, 휘발성 마취제의 사용은 권장됩니다. 연구 내의 모든 마우스에 대해 동일한 마취제를 사용하는 것이 매우 중요합니다.- 기화기를 사용하여 동물당 정확한 마취제를 보장합니다. 이소플루란에 대한 용량은 다음과 같이 : 유도 3-4%, 유지 보수 1 % 100 % 산소와 혼합.
참고: 개인 보호 장비를 착용하고 증기를 호흡하지 마십시오. - 체온을 유지하기 위해 난방 패드 및/또는 온난화 램프를 준비합니다. 체온을 모니터링하기 위해 직장 온도 프로브를 준비합니다.
- 적절한 환기를 보장합니다. 인공 호흡기를 미리 준비합니다. Y-튜브 커넥터를 준비하고 수동 모드를 사용하여 인공호흡기의 기능을 확인합니다. 바로 외상을 피하기 위해 피의 압력은 & 1cm H2O인지 확인하십시오. 호흡 속도를 110 호흡 /분으로 설정합니다.
- 20 G 내트라바스 칸 카테터를 절단하여 내트라큐어 튜브를 준비합니다.
- 작은 집게, 가위, 탄성 후크 리트랙터, 선박 소작자 및 면봉 : 필요한 악기를 준비합니다. 면 봉봉에 오른쪽 심실에 작은 구멍을 만드는 데 사용되는 작은 25 G x 5/8 "바늘을 조정합니다.
- 압력 볼륨 제어 장치인 압력 카테터를 준비하고 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다. PV 카테터를 PBS로 채워진 15mL 튜브에 37°C에서 15분 동안 배치하고 제조업체의 프로토콜에 따라 보정합니다.
- 기관의 관류 및 고정을 위해 PBS와 50% PBS/ 50% 10월의 용액을 준비하십시오. 2 x 10 mL 주사기 준비(25G 바늘 있음): 1명은 심혼과 폐를 현장으로 침투시키는 데 사용되며, 두 번째는 10월/PBS(50/50)를 혈액 검사용으로 사용한다.
- 기화기를 사용하여 동물당 정확한 마취제를 보장합니다. 이소플루란에 대한 용량은 다음과 같이 : 유도 3-4%, 유지 보수 1 % 100 % 산소와 혼합.
- 삽관
- 마우스의 무게를 측정하고 마취 전에 건강 상태를 기록합니다.
- 3-4%의 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 발가락 핀치 반사를 테스트하여 마취 깊이를 확인하십시오: 팔다리 중 하나의 발가락을 단단히 꼬집습니다. 동물이 사지를 철회하면 마취가 충분하지 않다는 징후입니다.
- 마취 유도 후 목과 가슴 부위를 면도하십시오.
- 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 체온 모니터링을 위해 직장 온도 프로브를 배치합니다.
참고: 체온 유지 보수는 기능 측정에 중요합니다. 체온은 약 36.5-37°C여야 합니다. - 구부러진 집게를 사용하여 마우스의 상부 절개에 봉합실을 부착하고 수술 용 테이프로 가열 패드에 고정하십시오. 수술 용 테이프를 사용하여 마우스의 사지를 보호하십시오.
- 동물을 삽관하기 위해 작은 가위를 사용하여 내측 자궁 경부 피부에 약 1cm의 작은 절개를합니다.
참고: 구두 삽관은 더 많은 경험을 필요로 하는 대체 방법입니다. - 면에 기울어진 어플리케이터가 무뚝뚝하게 중간 수준의 파로티드와 하황 타액 땀샘을 분리합니다. 이것은 기관장 위에 있는 근육을 드러내게 할 것입니다.
- 기관지 노출이 근육을 조심스럽게 잘라.
- 작은 가위를 사용하면 기관 연골 사이에 작은 절개를하고 준비된 내트라큐어 튜브를 삽입합니다. 인트라바스 내 카테터의 금속 가이드를 꺼내.
- 카테터를 인공호흡기에 연결합니다. 수동으로 폐를 팽창시켜 기관관 위치를 확인합니다. 테이프로 위치를 고정합니다.
- 절차 전반에 걸쳐 1 % 이소플루란 마취를 유지합니다.
- 발가락 핀치 반사를 테스트하여 마취의 깊이를 정기적으로 모니터링합니다. 마취를 적절히 조정합니다.
참고: 실험 중 권장 심박수는 1% 미만의 이소플루란 마취이며 약 400비트/분입니다. 체온 및 마취의 유지 보수는 심박수를 조절하는 데 필수적입니다. 이소플루란을 초과하면 심박수를 줄일 수 있습니다. 그러나, 회복은 이소플루란 속도를 감소시킴으로써 달성될 수 있다.
- RV 압력 측정(개방형 가슴 접근 법)
- 작은 가위를 사용하면 xiphoid 과정과 상부 복부 부분에 약 1cm의 피부 절개를 수행합니다. 상부 복부 사분면의 가슴과 복부 벽을 덮고 있는 피부를 분리합니다: 중간 선에서 시작하여 xiphoid에 단언하고 양쪽에서 측면으로 조심스럽게 움직입니다. 열병고를 사용하여 출혈을 제어하십시오.
참고: 목표는 복벽을 통해 흉부 구멍에 접근할 수 있는 것입니다. - 복강을 열고 격돌심장이나 폐를 해치지 않도록 주의하여 조심스럽게 다이어프램을 잘라냅니다.
참고: 목표는 심장의 정점과 오른쪽 심실을 노출하는 것입니다. 좋은 노출과 마음의 보기는 카테터의 올바른 배치에 매우 중요합니다. 그것은 절차 전반에 걸쳐 출혈을 피하기 위해 매우 중요합니다. 인트라바살 볼륨의 작은 변화조차도 오른쪽 심장의 부하를 변경하고 기록된 매개 변수에 영향을 줄 수 있습니다. - 면팁 어플리케이터를 사용하여 심리카르듐을 부드럽게 제거합니다.
- 압력 카테터를 심혼에 넣기 직전에 카테터를 마우스 옆에 놓습니다.
- 바늘과 함께 준비된 면 기울어진 어플리케이터를 사용하면 오른쪽 심실의 정모 적인 부분에서 찔린 상처를 줍니다. 조심스럽게 바늘을 제거하고이 구멍에 압력 카테터를 삽입합니다.
참고: 힘을 적용하지 않고 작동해야 합니다. 이 불가능한 경우, 심장의 연장 된 부상을 피하기 위해 첫 번째 구멍 근처에 새로운 구멍을 만들려고합니다. 바늘은 약 3mm보다 더 깊이 삽입해서는 안됩니다. - 오른쪽 심실의 방향에 평행한 압력 카테터를 삽입하고 폐 동맥을 향한 팁을 삽입합니다.
- 카테터의 올바른 위치를 보장하기 위해 압력 파 추적을 시청하십시오. 대표 추적은 그림 2에서시연됩니다.
- 압력 신호가 안정화되도록 허용합니다. 호흡을 일시 중지하고 적어도 3 개의 측정을 얻습니다. 개별 측정 사이에는 동물이 환기될 수 있습니다.
- 모든 측정이 기록되면 카테터를 제거하고 수조에 있는 PBS 채워진 튜브에 다시 놓습니다.
참고: 실험이 완료된 후 제조업체의 지침에 따라 카테터를 청소하십시오.
- 작은 가위를 사용하면 xiphoid 과정과 상부 복부 부분에 약 1cm의 피부 절개를 수행합니다. 상부 복부 사분면의 가슴과 복부 벽을 덮고 있는 피부를 분리합니다: 중간 선에서 시작하여 xiphoid에 단언하고 양쪽에서 측면으로 조심스럽게 움직입니다. 열병고를 사용하여 출혈을 제어하십시오.
- 안락사 및 폐 관류
- 실험이 완료되면 exsanguination에 의해 마우스를 안락사.
- 가슴을 넓게 엽니다. 가위를 사용하여 흉골 전체를 자르고 심장이나 폐를 손상시키지 않도록주의를 기울입니다.
- 홍채 가위를 사용하면 혈액이 챔버를 떠날 수 있도록 왼쪽 심실에 작은 절개를합니다.
- 오른쪽 심실에 10mL의 PBS를 포함하는 주사기의 25 G 바늘을 놓고 폐가 혈액을 지울 때까지 PBS 용액을 주입한다.
- 이 단계가 완료되면, 중요한 조직 수확에 의해 안락사를 확인 (심장과 폐): 카바와 대동맥 부착물을 잘라 심장과 폐en 블록을제거합니다.
3. 형태 학적 특성화
- 심장과 폐를 제거한 직후(2.4.5단계)는 심장을 분리하고 아리아를 모두 제거합니다. 구부러진 발동 가위를 사용하여 왼쪽 심실(LV)에서 오른쪽 심실(RV)을 조심스럽게 해부하여 중격(S)을 왼쪽 심실로 남깁니다. RV 및 LV+S의 무게를 측정하고 풀턴 인덱스 = RV / LV + S(그림 3)5,9를계산합니다.
- 오른쪽 심실의 일부를 가지고 10 월 미리 채워진 포함 금형에 배치합니다. RNA 및/또는 단백질 분석을 위해 오른쪽 심실의 다른 부분을 사용합니다. 드라이 아이스에서 동결을 스냅하고 -80 °C에 보관하십시오.
- 홍채 가위를 사용하여 심장과 다른 나머지 조직에서 폐를 분리하십시오.
참고: 폐의 준비를 위해, 위에서 설명한 바와 같은 관류(단계 2.4.3-2.4.5)는 매우 중요합니다. - 폐의 일부를 고정하고 RNA, 단백질 추출 또는 기타 분석에 저장합니다.
- 조직학적 분석을 위해 폐의 다른 부분을 사용하십시오. 이를 위해, 사용된 로브10,11의기관지에 50% PBS 및 50% 100월을 포함하는 주사기를 삽입한다.10 실험자는 주사기의 내용이 조직에 퍼질 때 폐가 팽창되는 것을 쉽게 볼 수 있습니다.
- 이 폐 조각을 OCT로 미리 채워진 금형에 넣어 드라이 아이스로 얼립니다. 샘플을 동결한 후 -80°C로 저장합니다.
- 저온 기계를 사용하여 RV및 폐의 8 μm 섹션을 준비합니다. 공기는 30 분 동안 실온에서 섹션을 건조.
- 10% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 실온에서 슬라이드를 10분 동안 수정합니다.
참고: PFA는 알려진 인간 발암 물질입니다. 화학 연기 후드, 적절한 절차 및 개인 보호 장비를 사용하여 노출 위험을 줄입니다. 자세한 내용은 MSDS(재료 안전 데이터 시트)를 참조하십시오. - 헤마톡클린/에신 염색에 의한 혈관 리모델링 평가
참고: 폐에서 심장및 혈관 리모델링의 구조적 변화를 평가하기 위해 헤마톡시린/에오신 염색을수행한다(그림 3).- 8 분 동안 헤마톡시린 용액을 가진 얼룩.
- 흐르는 수돗물로 5분 간 헹구고 증류수에 빠르게 헹구릅니다.
- 95% EtOH에서 1분 동안 헹구고 에오신 용액에서 1분 동안 반염색을 합니다.
- 탈수(80% 에탄올 10-30s, 100 에탄올 1분 1분, 톨루올 100% 3분).
- 커버슬립으로 마운트 및 커버. 실온에서 밤새 슬라이드를 건조시다.
참고: 염색에 사용되는 솔루션은 위험할 수 있습니다. 화학 연기 후드, 적절한 절차 및 개인 보호 장비를 사용하여 노출 위험을 줄입니다. 자세한 내용은 MSDS를 참조하십시오.
- Picrosirius 빨간 염색에 의한 오른쪽 심실 섬유증 평가
참고 : 피그리리우스 붉은 염색에서, 산인 피그리리우스 레드, 콜라겐 에 바인딩12. 따라서, 이러한 염색은 콜라겐 함량의 조직학적 검사에 사용될 수 있다.- 예열된 부인용액에서 슬라이드를 58°C에서 1시간 동안 배양한다.
- 슬라이드를 흐르는 수돗물로 씻어 10-15 분 동안 섹션에서 노란색을 제거하십시오.
- 실온에서 20 분 동안 0.1 % 빠른 녹색에 얼룩.
- 1% 아세트산으로 헹구고 1분 동안 헹구는 다.
- 수돗물로 5분 동안 헹구습니다.
- 실온에서 30분 동안 0.1% 시리우스 레드에 스테인이, 톨루올에서는 탈수상태가 뒤따랐다.
주의: 염색에 사용되는 솔루션은 위험할 수 있습니다. 화학 연기 후드, 적절한 절차 및 개인 보호 장비를 사용하여 노출 위험을 줄입니다. 자세한 내용은 MSDS를 참조하십시오.
- WGA 염색에 의한 RV 심근세포 비대 평가
참고: 세포 수준에서 오른쪽 심실(RV)의 비대증은 밀 배아 글루티닌(WGA) 염색(도4)을수행하여 평가될 수 있다.- 차가운 아세톤 용액으로 슬라이드를 15분 동안 수정한 다음 PBS에서 3단계의 세탁(각 5분)을 세척합니다.
- 다코 용액에 염소 세럼 10%를 실온에서 30분 동안 차단합니다.
- WGA와 슬라이드를 인큐베이션: WGA 1:200을 추가하고 어둠 속에서 37°C에서 1 1/2 h의 인큐베이션을 넣습니다.
- PBS로 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
- 핵산 염료로 슬라이드를 배양합니다.
- PBS로 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
- 장착의 경우 액체를 과도하게 제거하고 장착 미디어와 커버 슬립을 적용하십시오. 어두운 실온에서 1 시간 동안 슬라이드를 건조하고 4 ° C에 보관하십시오.
참고: 염색에 사용되는 솔루션은 위험할 수 있습니다. 화학 연기 후드, 적절한 절차 및 개인 보호 장비를 사용하여 노출 위험을 줄입니다. 자세한 내용은 MSDS를 참조하십시오.
- 폐의 면역 화학작용을 수행하여 혈관 리모델링을 더욱 구체적으로 평가합니다. 예를 들어, 부드러운 근육 세포 염색은 혈관의 근육화를 평가하는 데 사용될 수 있으며, 폰 윌레브란트 팩터 염색은 내피 변화를 시각화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 메서드는 다른 곳에서 설명5.
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Representative Results
이 프로토콜에서, 우리는 마우스에서 PH를 유도하기위한 저산소증 / SU5416 모델의 생성을 자세히 설명합니다. 또한 관찰 기간이 끝날 때 폐 혈관 및 심장 평가를 수행하기 위해 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.
이 모델에 대한 실험 설계에 대한 개요는 도 1A 13,13,14에나와 있다. 마우스는 노르모바릭 저산소증(10%O2)을실시하며, 3주 연속 SU5416로 주 1회 피하 주사한다. 이 프로토콜에서 PH를 유도하는 데 사용되는 자극은 도 1B및 1C에도시된다.
VEGF 수용체 길항제 SU5416내피 세포 세포 세포 멸각증을 유발하여 작용하고, 따라서, 세포 내성 내피 세포의 증식을 허용한다. 이것은 폐 혈관및 증가한 혈관 저항에서 혈관 리모델링에 이끌어 냅니다5. 폐 순환의 높은 압력은 RV 후부하를 증가시키고 RV 기능 장애 및 실패9로점진적으로 이어집니다. 첫 번째 단계에서, 저산소증/SU5416 프로토콜의 성공은 관측 기간이 끝날 때 RV 기능을 기능적으로 평가함으로써 평가될 수 있다. 이 프로토콜에서, 우리는 열린 흉부 RV 압력 측정 방법을 사용하여 RV 수축기 압력의 침습 적 평가를 자세히 설명합니다. 오른쪽 심실 압력의 대표적인 압력 곡선 및 정량적 해석이 도 2에표시됩니다.
혈관 내성 상승과 결과적으로 PH로 이어지는 혈관 리모델링을 어떻게 정량화할 수 있습니까? 히스토모폰트리는 폐 혈관을 특성화하는 금본위제입니다. 이 프로토콜에서는 헤마톡시린 & 에오신 스테인닝(H&E) 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이미지를 염색하고 캡처한 후 폐 동맥은 작은(&50 μm) 및 더 큰 동맥(> 50 μm)으로 구별될 수 있습니다. 기관지 동맥은 우리의 연구에서 제외되었습니다. 내측 두께를 평가하기 위해 동맥의 내부 직경(ID)뿐만 아니라 외부(ED)가 측정된다. 저산소증/SU5416 치료 후 리모델링된 폐동맥의 대표적인 이미지는 도3A. 단면 직경과 관련하여 동맥 내측 두께의 백분율이 도 3B로도시된다. Figure 3 말단 폐 동맥의 형태 분석은 노목시아 동물에 비해 저산소증/SU5416 처리된 마우스의 내측 두께가 현저한 증가를나타낸다(도 3).
증가된 후부하는 RV 비대증으로 이어지고 질병이 RV 섬유증9,,15로진행됨에 따라. RV 비대는 풀턴 지수(RV/LV+Septum)를 측정하고 심근세포(CM) 비대기를 측정하여 형태학적으로 평가할 수 있습니다. 오른쪽 심실(RV)에서 좌심실(LV)과 중격 [RV/(LV+S)]의 중량 비는 오른쪽 심실 비대의 인덱스로 계산됩니다. 저산소증/SU5416 및 노목시아 마우스의 풀턴 지수로부터의 대표적인 결과는 도 4B로나타났다. CM 비대증을 평가하기 위해 여기에 설명된 방법은 밀 배아 아글루티닌 (WGA)을 가진 오른쪽 심실 섹션의 염색입니다. WGA는 세포막의 당단백질에 결합하고 근구 세포의 단면 영역을 결정하는 데 사용될수있다(16,,17). WGA로 염색된 오른쪽 심실 섹션의 대표적인 이미지는 도 4A에표시됩니다. 병들게 및 대조마우스 모두에서 CM 영역의 정량화는 도 4A. 저산소증/SU5416 노출결과 심근세포 크기와 오른쪽 심실 비대증의 현저한 증가를 초래한다(도4). 우리 와 다른 사람들은 이전에 단일 히트 (저산소증)에 비해, 저산소증 / SU5416RV 표현형5,,18을악화시키는 것으로 나타났습니다.
그림 1: 저산소증/SU5416 메서드개요입니다. (A) 저산소증/SU5416 마우스 모델에 대한 실험 설계. SU5416은 주 1회 3주 연속 피하 주사를 치게 된다. (B) 저산소증 시스템의 회로도 표현. 컨트롤러는 가스 주입 튜브를 통해 질소를 주입하여 챔버 내부의 산소를 감지하고 조절합니다. (C)SU5416의 화학적 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: SU5416 주사와 결합된 만성 저산소증에 노출된 마우스의 우심심압력.(A) 오른쪽 심실(RV)의 침습적 압력 측정의 대표적인 추적.A (B)저산소증/SU5416 마우스및 노목시아에 노출된 동물 조절동물의 RV 수축기 압. n = 그룹당 6-8 마우스. p < 0.001. 모든 정량적 데이터는 ± SEM을 의미하는 것으로 보고됩니다.
그림 3: 저산소증/SU5416은 폐 혈관 리모델링을 유도합니다. (A) 표시된 그룹에서 폐의 대표적인 헤마톡시린/에오신 염색 된 부분은 저산소증 /SU5416 마우스의 폐 동맥에서 증가 된 미디어 벽 두께를 보여줍니다. 스케일 바: 50 μm. (B) 단면 직경과 관련하여 동맥 내측 두께의 백분율. n = 그룹 당 5 마우스. p < 0.001. 모든 정량적 데이터는 ± SEM을 의미하는 것으로 보고됩니다.
도 4: 만성 저산소증에 노출된 마우스의 우심실 비대증과 SU5416 주사와 결합됨. (A)대표적인 WGA(밀 세균 아글루티닌) 발시 처리 후 우심실 조직의 염색. 스케일 바: 50 μm. (오른쪽) 데이터의 정량적 분석. n = 그룹 당 5 마우스. (B)RV 비대는 LV에 비해 RV 중량에 의해 반사되고 각 그룹에서 심실 중격(S) 중량 비(Fulton index= RV/LV+S). n = 그룹 당 8 마우스. p < 0.001. 모든 정량적 데이터는 ± SEM을 의미하는 것으로 보고됩니다.
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Discussion
이 프로토콜은 만성 저산소증과 SU5416 주입 (Hypoxia/SU5416)18의두 가지 병리학 적 자극을 결합하여 마우스에서 PH를 모델링하는 방법을 설명합니다. 이 마우스 모델을 인간 PH 조건과 상호 연관시키려면 표 1에표시된 현재 PH 분류를 필연적으로 살펴봐야 합니다. 거의 모든 형태의 PH는 내피 및 부드러운 근육 세포의 폐 혈관 수축 및 비정상적인 증식을 특징으로합니다. 이것은 폐 동맥에 있는 상승된 압력으로 이끌어 내고 결과적으로 오른쪽 심실의 증가한 후 하중으로 이끌어 냅니다.
PH의 동물 모델을 특성화하는 모든 시도는 폐 혈관과 오른쪽 심실의 조직 병리학 적 리모델링의 증거를 포함해야합니다. 단일 히트 저산소마우스 모델은 혈관 절제술22,3의온화한 형태로 이어집니다. 이러한 병리학적 사실 인정은 내피 세포, 매끄러운 근육 세포 및 섬유아세포 증식을 동반한 이전에 비 근육질화한 혈관의 근육화를 포함합니다. 이러한 사실 인정은 두 번째 히트 (SU5416 주입)의 첨가에 의해 악화된다. 효과는 단일 히트 (저산소증) 모델에서 되돌릴 수 있으며 Hypoxia / SU5416 모델에서 부분적으로 가역됩니다.
PH 환자에 대한 사망의 주요 원인은 올바른 심실 부전 (RVF)4,,20이다. 동물 모델의 폐 혈관 리모델링이 항상 RVF를 동반하는 것은 아닙니다. RVF 형태학의 관점에서 동물 모델을 특성화하기 위해서는 기능적 및 분자 데이터를 분석해야 합니다. 후자는 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. RV 형태 학적 리모델링에는 매크로 및 현미경 측면을 모두 포함합니다. 매크로스코피컬 수준에서 RV 비대기의 주 지수는 왼쪽 심실(LV) 및 Septum(S) 중량(RV/LV+S)으로 나눈 RV의 중량으로 정의된 풀턴 지수입니다. 현미경 수준에서, 섬유증, 염증 및 비대는 각각 시리우스 레드, 헤마톡클린/에오신 및 WGA 염색에 의해 평가될 수 있습니다.
마우스 저산소증/SU5146 모델(여기에 설명된) RV 기능 장애를 나타내며, 이는 높은 수축기 압력 및 형태학적 기준에 의해 측정된 것이다. 폐 혈관 리모델링에 관해서는, 내측 비대는 프로토콜의 개시 후 3 주 관찰된다. 쥐의 저산소증/SU5416 모델에 비해 마우스 모델은 RV 실패(적당한 기능 장애)를 일으키지 않으며, 중증 질환인간에서 관찰된 바와 같이 심한 난소 혈관병증으로 이어지지 않으며, 폐 병리학은 노녹시아로 복귀한 후 개량한다. 전반적으로, 마우스 저산소증/SU5416 모델은 PH에서 발생하는 바와 같이 혈관 손상을 모방하는 데 적합하며, 주로 그룹 I(부분적으로 그룹 III, 표 1참조)11,19. 이 모델의 장점은 야생형(유전자 변형되지 않은) 마우스, 비교적 쉽고 저렴한 구현, 병든 동물의 사망률이 상대적으로 낮으며 관심있는 질병의 빠른 발달(3주)이다. PH 예방 및 치료 연구는 수술 설치류 모델과 는 달리 고급 기술의 필요없이이 모델에서 쉽게 구현 될 수 있습니다.
프로토콜을 구현할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 연구를 계획할 때, Hypoxia/SU5416 단에서 동물의 사망률은 0-10% 사이에서 변화한다는 것을 명심해야 합니다 (미공개 관측). 따라서 통계적 힘에 도달하고 저전력 연구를 피하기 위해 그룹당 적어도 10개의 마우스를 권장합니다. SU5416의 용해도가 낮습니다. 따라서, DMSO 또는 다른 용매(예: Carboxymethyl 셀룰로오스, CMC)를 사용해야 한다. 고용량의 DMSO는 독성이 있을 수 있습니다. 마우스에서 피하(s.c.)에 대한 LD50은 13.9-25.6 g/kg,21,22로보고되었다. LD50은 지정된 시험 기간21,,22후에 시험된 집단의 구성원의 50%를 죽이는 데 필요한 용량으로 정의된다. 25g의 무게가 있는 마우스의 경우, 4.4 g/kg의 DMSO가 사용됩니다(1.1 g/mL 및 0.1 mL의 DMSO 밀도에 따라 계산이 s.c./mouse를 적용). 따라서, 피하 투여된 투여량은 LD50 값보다 훨씬 낮다. 우리의 손에, DMSO에 용해 된 SU5416의 응용 프로그램, 여기에 설명 된 바와 같이, 어떤 경우에는 피부 자극을 일으킬 수 있습니다,하지만 다른 독성 효과는 관찰되지 않습니다. 그러나 여러 보고서는 SU541614에대한 대체 차량으로 CMC를 사용하는 것이 좋습니다. RV 기능 측정을 수행할 때, 마우스 반사 신경을 테스트하여 평가한 바와 같이 체온, 출혈 및 마취 깊이에서 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에 설명된 바와 같이 RV 압력을 평가하기 위한 개방형 가슴 기술은 경험이 부족한 사용자도 쉽게 구현할 수 있다는 장점이 있다. 폐쇄-가슴 방법(다른 곳에서 설명된23,,24,,25)은덜 침습적이어서 장점이 있으며, 따라서 비단말 실험에서도 구현될 수 있다. 높은 수준의 전문 지식이 필요합니다.
쥐에서 저산소증/SU5416 모델의 첫 번째 설명 후, 마우스 모델은5,,9,,13에서성공적으로 사용되었다. 그러나, 결과는 마우스의 유전적 배경과 성별, SU5416의 제조업체 및 SU5416주입(SU5416 주입)의주파수에 의존한다는 증거가 있다. 3주 연속 SU5416을 주입하면 마우스에서 PH로 이어지지만, 단일 용량은 PH4를유도하지 않는다. 더욱이, 그밖 형태의 PH는, 좌측 심장병과 관련되거나 만성 혈전색전성 질병으로 인한 것과 같은, 병인학 관련 모형을 요구합니다. 새로운 치료법은 번역 연구의 길을 열기 전에 적어도 2 가지 동물 모델에서 테스트해야합니다.
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Disclosures
저자는 선언할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회 (AHA-17SDG337012 및 18IPA34170258)의 보조금에 의해 지원되었으며, 건강 NIH K01 HL135474에서 Y.S. O.B에 대한 국립 보건 원에서 도이치 헤르츠스티프퉁 (Deutsche Herzstiftung)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
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