Inductie en karakterisering van pulmonale hypertensie bij muizen met behulp van het Hypoxia/SU5416-model
Summary
Dit protocol beschrijft de inductie van pulmonale hypertensie (PH) bij muizen op basis van de blootstelling aan hypoxie en de injectie van een VEGF receptor antagonist. De dieren ontwikkelen PH en rechts ventriculaire (RV) hypertrofie 3 weken na de inleiding van het protocol. De functionele en morfometrische karakterisering van het model wordt ook gepresenteerd.
Abstract
Pulmonary Hypertension (PH) is een pathofysiologische aandoening, gedefinieerd door een gemiddelde longslagaderdruk van meer dan 25 mm Hg in rust, zoals beoordeeld door rechter hartkatheterisatie. Een breed spectrum van ziekten kan leiden tot PH, verschillend in hun etiologie, histopathologie, klinische presentatie, prognose, en reactie op de behandeling. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de afgelopen jaren, PH blijft een ongezcureerde ziekte. Inzicht in de onderliggende mechanismen kan de weg vrijmaken voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Diermodellen zijn belangrijke onderzoeksinstrumenten om dit doel te bereiken. Momenteel zijn er verschillende modellen beschikbaar voor het samenvatten van PH. Dit protocol beschrijft een twee-hit muis PH-model. De stimuli voor PH-ontwikkeling zijn hypoxie en de injectie van SU5416, een vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) receptor antagonist. Drie weken na de initiatie van Hypoxia/SU5416 ontwikkelen dieren longvasculaire remodellering die de histopathologische veranderingen imiteert die bij menselijke PH (voornamelijk groep 1) worden waargenomen. Vasculaire remodellering in de longcirculatie resulteert in de herinrichting van de rechter ventrikel (RV). De procedures voor het meten van rv-druk (met behulp van de open borstmethode), de morfometrische analyses van de RV (door zowel hartventriënten te ontleden en wegen) als de histologische beoordelingen van de remodellering (zowel long door het beoordelen van vasculaire remodeling en cardiale door de beoordeling van RV cardiomyocyte hypertrofie en fibrose) worden in detail beschreven. De voordelen van dit protocol zijn de mogelijkheid van de toepassing zowel in het wilde type als in genetisch gemodificeerde muizen, de relatief eenvoudige en goedkope implementatie, en de snelle ontwikkeling van de ziekte van belang (3 weken). Beperkingen van deze methode zijn dat muizen geen ernstig fenotype ontwikkelen en PH is omkeerbaar bij terugkeer naar normoxie. Preventie, evenals therapie studies, kan gemakkelijk worden uitgevoerd in dit model, zonder de noodzaak van geavanceerde vaardigheden (in tegenstelling tot chirurgische knaagdier modellen).
Introduction
Pulmonary Hypertension (PH) is een pathofysiologische aandoening, gedefinieerd door een gemiddelde longslagader (PA) druk van meer dan 25 mm Hg in rust, zoals beoordeeld door rechter hartkatheterisatie1,2. Er is een verscheidenheid aan ziekten die kunnen leiden tot PH. In een poging om de ph-geassocieerde voorwaarden te organiseren, zijn verschillende classificatiesystemen ontwikkeld. De huidige klinische classificatie categoriseert de meervoudige PH-geassocieerde ziekten in 5 verschillende groepen1. Dit onderscheid is van belang omdat verschillende groepen patiënten ziekten hebben die verschillen in hun klinische presentatie, pathologie, prognose en reactie op behandeling2. Tabel 1 geeft een overzicht van de huidige classificatie, aangevuld met de basis histopathologische kenmerken van elke ziekte.
Tabel 1: Overzicht van de klinische classificatie van PH, samen met de belangrijkste histopathologische kenmerken binnen de groepen. Geschiktheid van het Hypoxia/SU5416 protocol voor het modelleren van PH. Deze tabel is gewijzigd van19. PH: Pulmonale hypertensie, PAH: Pulmonale arteriële hypertensie
Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de behandeling van PH-geassocieerde ziekten, PH blijft nog steeds zonder genezing, met een 3-jarig sterftecijfer variërend tussen 20% en 80%3. Dit geeft de noodzaak aan om de onderliggende mechanismen van PH te begrijpen en, daarna, de ontwikkeling van nieuwe therapieën om de progressie te voorkomen, te vertragen en de ziekte te genezen. Diermodellen zijn van cruciaal belang voor deze omvang. Momenteel bestaan er verschillende modellen om PH te bestuderen. De geïnteresseerde lezer wordt verwezen naar de uitstekende recensies over dit onderwerp2,3,4. Rekening houdend met de verscheidenheid aan ziekten die leiden tot PH, is het duidelijk dat de verschillende omstandigheden van menselijke PH niet perfect kunnen worden samengevat in een diermodel. De dierlijke modellen beschikbaar kan worden gecategoriseerd in i) single-hit, ii) twee-hit, iii) knock-out, en iv) overexpression modellen3. In de single-hit modellen wordt PH veroorzaakt door een enkele pathologische stimulus, terwijl twee-hit modellen combineren twee pathologische stimuli met het doel van het induceren van meer ernstige PH en dus meer nauw imiteren de complexe menselijke ziekte. Naast de etiologische verschillen resulteren de verschillende stimuli in PH-modelleringsverschillen die ook afhangen van de soort en de genetische achtergrond van de dieren4.
Een van de meest gebruikte klassieke PH knaagdier modellen is de chronische hypoxie model2. Hypoxie is bekend dat PH induceren bij zowel mensen als bij verschillende diersoorten. Hypoxie heeft het voordeel dat het een fysiologische stimulans is voor PH(tabel 1). Echter, terwijl de mate van hypoxie gebruikt voor het induceren van PH bij knaagdieren is veel ernstiger dan bij de mens, de enige belediging (hypoxie) leidt alleen maar tot een milde vorm van vasculaire remodellering. Dit imiteert niet de ernst van de menselijke ziekte. De toevoeging van een tweede treffer, een extra stimulans voor het opwekken van PH, toonde veelbelovende resultaten: injectie van de verbinding SU5416 aan knaagdieren in combinatie met de hypoxische stimulus veroorzaakt een ernstiger PH-fenotype2,5,6. SU5416 is een remmer van vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) receptor-2. Het blokkeert de VEGF receptoren en leidt tot endotheelcel apoptose. Onder hypoxische omstandigheden stimuleert dit de proliferatie van een subset van apoptose-resistente endotheelcellen. Bovendien leidt SU5416 tot een soepele spiercelproliferatie. De combinatie van deze effecten resulteert in pathologische vasculaire herinrichting van de longcirculatie en leidt tot verhoogde PA-druk en rechter ventriculaire remodellering2,5,7. Het model werd voor het eerst beschreven bij ratten6 en later toegepast op muizen4,5,7. Het muismodel vertoont minder ernstige vasculaire remodellering in vergelijking met ratten. Bovendien, wanneer terug naar normoxia, PH blijft vooruitgang bij ratten, terwijl in muizen is het gedeeltelijk omkeerbaar.
Het volgende protocol beschrijft alle stappen voor het modelleren van PH bij muizen met behulp van de Hypoxia/SU5416-methode (planning, tijdlijn, uitvoering). Daarnaast wordt de karakterisering van het model beschreven in dit protocol: functioneel (door invasief de juiste ventriculaire (RV) druk te meten met behulp van de open borsttechniek), morfometrisch (door zowel de rechter- als de linkerventrikels te ontleden en te wegen), evenals histologisch (door longfyvale vaatremodellering te evalueren, rechter ventriculaire cardiomyocyte hypertrofie en fibrose).
Alle stappen en methoden beschreven in dit protocol kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd door onderzoekers op elk ervaringsniveau. Terwijl de functionele metingen van de RV met behulp van de open borst techniek (hier beschreven) is niet de gouden standaard methode in het veld, het heeft het voordeel dat het snel kan worden geleerd en nauwkeurig gereproduceerd, zelfs door een minder ervaren experimentator.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe ph bij muizen te modelleren door twee pathologische stimuli te combineren: chronische hypoxie en SU5416-injectie (Hypoxie/SU5416)18. In een poging om dit muismodel te correleren met de menselijke PH-conditie, moet men onvermijdelijk kijken naar de huidige PH-classificatie, weergegeven in tabel 1. PH in bijna alle vormen wordt gekenmerkt door longvakoonstrictie en afwijkende proliferatie van endotheel en gladde spiercellen. Dit leidt tot verhoogde druk i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association (AHA- 17SDG33370112 en 18IPA34170258) en van de National Institutes of Health NIH K01 HL135474 tot Y.S. O.B werd ondersteund door de Deutsche Herzstiftung.
Materials
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
- Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
- Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
- Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
- Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
- Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
- Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
- Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184 (2013).
- Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167 (2018).
- Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
- Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
- van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
- Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448 (2014).
- Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
- Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
- Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
- Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
- Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942 (2015).
- Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335 (2016).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810 (2016).
- Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).
