Summary
Ce protocole décrit l’induction de l’hypertension pulmonaire (PH) chez les souris basée sur l’exposition à l’hypoxie et l’injection d’un antagoniste des récepteurs VEGF. Les animaux développent l’hypertrophie ph et ventriculaire droite (RV) 3 semaines après le début du protocole. La caractérisation fonctionnelle et morphométrique du modèle est également présentée.
Abstract
L’hypertension pulmonaire (PH) est une condition pathophysiologique, définie par une pression artérielle pulmonaire moyenne dépassant 25 mm Hg au repos, telle qu’évaluée par cathétérisme cardiaque droit. Un large éventail de maladies peut mener à PH, différent dans leur étiologie, histopathologie, présentation clinique, pronostic, et réponse au traitement. Malgré des progrès significatifs au cours des dernières années, ph reste une maladie non réparée. Comprendre les mécanismes sous-jacents peut ouvrir la voie au développement de nouvelles thérapies. Les modèles animaux sont d’importants outils de recherche pour atteindre cet objectif. Actuellement, il existe plusieurs modèles disponibles pour la récapitulation ph. Ce protocole décrit un modèle PH de souris à deux succès. Les stimuli pour le développement de PH sont l’hypoxie et l’injection de SU5416, un antagoniste du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF). Trois semaines après l’initiation de l’Hypoxie/SU5416, les animaux développent le remodelage vasculaire pulmonaire imitant les changements histopathologiques observés dans le PH humain (principalement groupe 1). Le remodelage vasculaire dans la circulation pulmonaire a comme résultat le remodelage du ventricule droit (RV). Les procédures de mesure des pressions de RV (utilisant la méthode de coffre ouvert), les analyses morphométriques du RV (par disséquer et pesant les deux ventricules cardiaques) et les évaluations histologiques du remodelage (à la fois pulmonaire en évaluant le remodelage vasculaire et cardiaque en évaluant l’hypertrophie cardiomyocyte de RV) sont décrites en détail. Les avantages de ce protocole sont la possibilité de l’application à la fois chez les souris sauvages et chez les souris génétiquement modifiées, la mise en œuvre relativement facile et peu coûteuse, et le développement rapide de la maladie d’intérêt (3 semaines). Les limites de cette méthode sont que les souris ne développent pas un phénotype grave et PH est réversible au retour à la normoxie. La prévention, ainsi que les études thérapeutiques, peuvent facilement être mises en œuvre dans ce modèle, sans la nécessité de compétences avancées (par opposition aux modèles chirurgicaux de rongeurs).
Introduction
L’hypertension pulmonaire (PH) est une affection pathophysiologique, définie par une pression artérielle pulmonaire moyenne (PA) supérieure à 25 mm Hg au repos, telle qu’évaluée par cathétérisme cardiaque droit1,2. Il ya une variété de maladies qui peuvent conduire à PH. Dans le but d’organiser les conditions associées au PH, plusieurs systèmes de classification ont été mis au point. La classification clinique actuelle classe les multiples maladies associées au PH dans 5 groupes différents1. Cette distinction est importante puisque divers groupes de patients ont des maladies qui diffèrent dans leur présentation clinique, la pathologie, le pronostic, et la réponse au traitement2. Le tableau 1 résume la classification actuelle, complétée par les caractéristiques histopathologiques de base de chaque maladie.
Tableau 1 : Vue d’ensemble de la classification clinique de ph, ainsi que des principales caractéristiques histopathologiques au sein des groupes. Aptitude du protocole Hypoxia/SU5416 pour la modélisation de PH. Ce tableau a été modifié à partir de19. PH: Hypertension pulmonaire, HAP: Hypertension artérielle pulmonaire
Malgré des progrès significatifs dans le traitement des maladies associées au PH, PH reste toujours sans remède, avec un taux de mortalité à 3 ans allant de 20% à 80%3. Cela indique la nécessité impérative de comprendre les mécanismes sous-jacents de PH et, par la suite, le développement de nouvelles thérapies pour prévenir, ralentir la progression, et guérir la maladie. Les modèles animaux sont d’une importance cruciale pour cette portée. Actuellement, divers modèles existent pour étudier le PH. Le lecteur intéressé est référé aux excellents commentaires sur ce sujet2,3,4. Compte tenu de la variété des maladies conduisant à la PH, il est évident que les diverses conditions de PH humaine ne peut pas être parfaitement récapitulée dans un modèle animal. Les modèles animaux disponibles peuvent être classés dans i) single-hit, ii) deux coups, iii) knock-out, et iv) modèles de surexpression3. Dans les modèles à impact unique, PH est induite par un stimulus pathologique unique, tandis que les modèles à deux coups combinent deux stimuli pathologiques dans le but d’induire un PH plus grave et donc plus étroitement imiter la maladie humaine complexe. Outre les différences étiologiques, les plusieurs stimuli entraînent des différences de modélisation ph qui dépendent aussi de l’espèce et de l’arrière-plan génétique des animaux4.
L’un des modèles classiques les plus couramment utilisés de rongeurs PH est le modèle chronique d’hypoxie2. L’hypoxie est connue pour induire la PH chez l’homme ainsi que chez plusieurs espèces animales. L’hypoxie a l’avantage d’être un stimulus physiologique pour ph (Tableau 1). Cependant, alors que le degré d’hypoxie utilisé pour induire la PH chez les rongeurs est beaucoup plus grave que chez l’homme, l’insulte unique (hypoxie) conduit seulement à une forme légère de remodelage vasculaire. Cela n’imite pas la gravité de la maladie humaine. L’ajout d’un deuxième coup, un stimulus supplémentaire pour induire PH, a montré des résultats prometteurs: injection du composé SU5416 aux rongeurs combiné avec le stimulus hypoxique induit un phénotype PH plus grave2,5,6. SU5416 est un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) récepteur-2. Il bloque les récepteurs vegf et conduit à l’apoptose des cellules endothéliales. Dans des conditions hypoxiques, cela stimule la prolifération d’un sous-ensemble de cellules endothéliales résistantes à l’apoptose. En outre, SU5416 conduit à la prolifération des cellules musculaires lisses. La combinaison de ces effets entraîne un remodelage vasculaire pathologique de la circulation pulmonaire et conduit à une pression élevée pa et le remodelage ventriculaire droit2,5,7. Le modèle a d’abord été décrit chez les rats6 et plus tard appliqué sur les souris4,5,7. Le modèle de souris présente un remodelage vasculaire moins sévère que celui des rats. En outre, lorsqu’il est retourné à la normoxie, PH continue de progresser chez les rats, tandis que chez les souris, il est partiellement réversible.
Le protocole suivant décrit toutes les étapes de modélisation de PH chez les souris à l’aide de la méthode Hypoxia/SU5416 (planification, chronologie, exécution). En outre, la caractérisation du modèle est décrite dans ce protocole : fonctionnellement (en mesurant invasivement la pression ventriculaire droite (RV) utilisant la technique de coffre ouverte), morphométrique (par disséquer et pesant les ventricules droit et gauche), aussi bien que histologiquement (en évaluant le remodelage vasculaire pulmonaire, hypertrophie et fibrose ventriculaire droite).
Toutes les étapes et méthodes décrites dans ce protocole peuvent être facilement mises en œuvre par les enquêteurs à n’importe quel niveau d’expérience. Bien que les mesures fonctionnelles du RV en utilisant la technique de la poitrine ouverte (décrite ici) ne soit pas la méthode d’étalon-or sur le terrain, elle a l’avantage qu’elle peut être rapidement apprise et reproduite avec précision même par un expérimentateur moins expérimenté.
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Protocol
Avant toute expérimentation animale obtenir l’autorisation du comité local de soins aux animaux en établissement. Les expériences actuelles ont été réalisées après approbation par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) à l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï.
1. Induction de PH
- Préparation
- Avant de commencer l’étude, planifiez soigneusement la conception expérimentale. Assurez-vous que les souris sont soumises à l’hypoxie en même temps que la première injection de SU5416. Un exemple de la conception expérimentale pour induire le PH à l’aide de la méthode Hypoxia/SU5416 est illustré à la figure 1A. Les souris témoins n’ont reçu que le véhicule. Pour ce modèle, SU5416 sera injecté aux souris une fois par semaine pendant 3 semaines consécutives.
- Utilisez des souris C57BL/6 de huit à douze semaines pour cette étude. Loger les animaux à 18-20 °C dans un cycle clair-foncé de 12 h. Assurez-vous que la nourriture et l’eau sont accessibles ad libitum.
- Peser les animaux. Attribuez-les au hasard à chaque groupe : Normoxia et Hypoxia/SU5416.
- Préparer la chambre hypoxique comme le montre la figure 1B. Fixer les réservoirs d’azote (N2)près de la chambre. Réglez le contrôleur de l’oxygène (O2)à un point de 10% O2. Laissez le système atteindre un état stable.
- Préparer su5416 pour l’injection (utiliser une dose de 20 mg/kg de poids corporel). SU5416 ne se dissout pas dans des solutions aqueuses; par conséquent, dissoudre la quantité calculée en 100 μL DMSO8. Par exemple, pour une souris de 25 g, la quantité de SU5416 à injecter est de 0,5 mg dissous dans un solvant de 100 μL (DMSO). La concentration finale de SU5416 pour cette souris est donc de 5 mg/mL.
ATTENTION: SU5416 est une matière dangereuse. Lisez attentivement la fiche de données de sécurité accompagnée du produit et assurez-vous de prendre les précautions recommandées lors de la manipulation de cette substance. Portez des gants de protection et (comme pour toute injection) utilisez une protection oculaire. La structure chimique de SU5416 est indiquée à la figure 1C.
REMARQUE : Calculer un excédent approprié de la solution pour compenser le volume qui sera perdu pendant l’injection (p. ex. dans la seringue, flacon, etc.). Selon la seringue utilisée, le volume mort est d’environ 200 μL. Pour un groupe de 10 souris, calculer un excès de 2 doses de souris. - Préparer les seringues pour l’injection. Utilisez 1 seringue mL avec des aiguilles de 25 G x 5/8 po.
- Injection sous-cutanée SU5416
- Retenez l’animal. Placez la souris sur le couvercle de la cage pour aider à la retenue. Saisissez la peau et formez une tente parallèle à la colonne vertébrale. Assurez-vous de saisir à l’arrière de la tête étroitement, pour éviter la blessure de morsure potentielle par la souris.
REMARQUE : La présence de deux chercheurs rend la procédure plus rapide et plus précise, car l’un peut retenir l’animal pendant que l’autre effectue l’injection. - Insérez l’aiguille sous-cutanéement sur le flanc au pli lâche de la peau. Assurez-vous d’insérer l’aiguille parallèle à la peau. Évitez de pénétrer la paroi abdominale.
- Injectez la teneur de la seringue (100 μL de SU5416 dissous ou d’un véhicule).
REMARQUE : Afin d’éviter les fuites après la livraison complète, tenez la seringue pendant environ 10 s et faites pivoter légèrement l’aiguille sous la peau. - Retirez l’aiguille et remettez l’animal dans sa cage. Après l’injection de SU5416, placez les cages dans la chambre d’hypoxie ventilée.
- Retenez l’animal. Placez la souris sur le couvercle de la cage pour aider à la retenue. Saisissez la peau et formez une tente parallèle à la colonne vertébrale. Assurez-vous de saisir à l’arrière de la tête étroitement, pour éviter la blessure de morsure potentielle par la souris.
- Exposition à l’hypoxie
- Surveillez la ventilation au fil du temps. Assurez-vous de maintenir 10% de l’approvisionnement en oxygène. Maintenir les animaux normoxia dans une chambre semi-sealable à 21% O2.
- Assurez-vous que les chambres sont équipées d’un capteur d’oxygène pour mesurer le niveau d’oxygène. Évitez l’ouverture extensive des chambres. Pour le nettoyage et l’ajout de nourriture et d’eau ouvrir les chambres pour pas plus de 20 min tous les 3 jours.
- Inspectez les animaux tous les jours. Considérez les signaux de stress tels que la piloérection ou la perte de poids significative.
REMARQUE : On s’attend à ce que les animaux sous Hypoxie/SU5416 perdent du poids5. C’est une indication du développement de la maladie. - Répétez l’injection de SU5416 chaque semaine pendant 3 semaines consécutives (voir la figure 1A pour la vue d’ensemble de la conception expérimentale).
REMARQUE : La variation du site d’injection peut aider à réduire les irritations cutanées.
2. Caractérisation fonctionnelle par des mesures invasives de pression de VR
- Préparation
REMARQUE : Choisissez un régime anesthésique. Des anesthésiques injectables ou inhalables peuvent être utilisés. Étant donné qu’une légère surdose d’anesthésiques injectables (en particulier de kétamine/xylazine ou de pentobarbital) peut affecter de manière significative la fonction cardiaque, l’utilisation d’anesthésiques volatils est recommandée. Il est d’une grande importance d’utiliser le même anesthésique pour toutes les souris dans le cadre d’une étude.- Utilisez un vaporisateur pour assurer une dose précise d’anesthésiques par animal. La dose d’isoflurane est la suivante: induction 3-4%, entretien 1% mélangé avec 100% d’oxygène.
REMARQUE : Portez de l’équipement de protection individuelle et évitez de respirer la vapeur. - Préparer un coussin chauffant et/ou des lampes chauffantes pour maintenir la température corporelle. Préparer une sonde de température rectale pour surveiller la température corporelle.
- Assurer une bonne ventilation. Préparer le ventilateur à l’avance. Préparer le connecteur y-tube et vérifier la fonction du ventilateur à l’aide du mode manuel. Assurez-vous que la pression inspiratoire est de 1 cm H2O pour éviter le barotrauma. Réglez le taux respiratoire à 110 respirations/min.
- Préparer un tube endotrachéal en coupant un cathéter intravasculaire de 20 G.
- Préparer les instruments nécessaires : petits forceps, ciseaux, rétracteurs élastiques, cautérisateur de navire et coton-tige. Sur un coton-tige ajuster une petite aiguille de 25 G x 5/8 " qui sera utilisé pour faire une petite perforation dans le ventricule droit.
- Préparez le cathéter de pression, l’unité de contrôle du volume de pression et lancez le logiciel d’acquisition de données. Placez le cathéter PV dans un tube de 15 ml rempli de PBS à 37 °C pendant 15 min et calibrez selon le protocole du fabricant.
- Pour la perfusion et la fixation des organes, préparer pbs et une solution de 50% PBS / 50% OCT. Préparer 2 x 10 mL seringues (avec une aiguille de 25 G): l’un sera utilisé pour perfuser le cœur et le poumon avec PBS in situ et le second pour l’injection de l’OCT / PBS (50/50) solution à l’échantillon pulmonaire qui sera utilisé pour l’examen histologique.
- Utilisez un vaporisateur pour assurer une dose précise d’anesthésiques par animal. La dose d’isoflurane est la suivante: induction 3-4%, entretien 1% mélangé avec 100% d’oxygène.
- Intubation
- Peser la souris et enregistrer l’état de santé avant l’anesthésie.
- Induire l’anesthésie avec 3-4% isoflurane. Vérifiez la profondeur d’anesthésie en testant le réflexe de pincement des orteils : pincez fermement l’orteil d’un des membres. Si l’animal retire le membre, c’est un signe d’anesthésie insuffisante.
- Après l’induction d’anesthésie, raser le cou et les zones de la poitrine.
- Placez la souris sur le coussin chauffant. Placez une sonde de température rectale pour surveiller la température corporelle.
REMARQUE : Le maintien de la température corporelle est important pour les mesures fonctionnelles. La température corporelle doit être d’environ 36,5 à 37 °C. - À l’aide de forceps incurvés attacher un fil de suture aux incisives supérieures de la souris, étirer et fixer au coussin chauffant avec du ruban chirurgical. Fixez les membres de la souris à l’aide de bandes chirurgicales.
- Pour l’intubétisation de l’animal faire une petite incision d’environ 1 cm dans la peau cervicale médiale à l’aide de petits ciseaux.
REMARQUE : L’intubation orale est une méthode alternative qui nécessite plus d’expérience. - Avec un applicateur à pointe de coton séparer brutalement les glandes salivaires parotides et submandibulaires au niveau intermédiaire. Cela exposera les muscles au-dessus de la trachée.
- Coupez soigneusement ces muscles exposant la trachée.
- Avec de petits ciseaux faire une petite incision entre les cartilages trachéaux et insérer le tube endotrachéal préparé. Sortez le guide métallique du cathéter intravasculaire.
- Connectez le cathéter au ventilateur. Vérifiez la position du tube trachéal en gonflant manuellement les poumons. Sécurisez la position avec du ruban adhésif.
- Maintenir une anesthésie isoflurane de 1% tout au long de la procédure.
- Surveillez régulièrement la profondeur de l’anesthésie en testant le réflexe de pincement des orteils. Ajuster l’anesthésie en conséquence.
NOTE: La fréquence cardiaque recommandée pendant les expériences, sous 1% d’anesthésie isoflurane, est d’environ 400 battements /min. Le maintien de la température corporelle et l’anesthésie sont essentiels pour contrôler la fréquence cardiaque. L’excès d’isoflurane peut réduire la fréquence cardiaque. Cependant, la récupération peut être réalisée en réduisant le taux d’isoflurane.
- Mesures de pression RV (approche thoracique ouverte)
- Avec de petits ciseaux effectuer une incision de la peau d’environ 1 cm sur le processus xiphoide et la partie abdominale supérieure. Séparez la peau couvrant la poitrine et la paroi abdominale des quadrants abdominaux supérieurs : commencez à la ligne médiane, distale au xiphoide et déplacez-vous soigneusement de façon postérieure des deux côtés. Utilisez la thermocauté pour contrôler les saignements.
REMARQUE : Le but est d’avoir accès à la cavité thoracique par la paroi abdominale. - Ouvrez la cavité abdominale et coupez soigneusement le diaphragme, en prenant soin de ne pas blesser le cœur ou les poumons.
NOTE: Le but est d’exposer l’apex et le ventricule droit du cœur. Une bonne exposition et une bonne vue du cœur sont d’une importance cruciale pour le placement correct du cathéter. Il est d’une grande importance d’éviter les saignements tout au long de la procédure. Même de petits changements dans le volume intravasal peuvent modifier la charge du cœur droit et affecter les paramètres enregistrés. - Retirez délicatement le péricarde à l’aide d’un applicateur à pointe de coton.
- Juste avant de placer le cathéter de pression dans le cœur, apportez le cathéter à côté de la souris.
- L’utilisation de l’applicateur préparé à pointe de coton avec l’aiguille fait une blessure au couteau dans la partie distale apicale du ventricule droit. Retirez soigneusement l’aiguille et insérez le cathéter de pression dans ce trou.
REMARQUE : Cela devrait fonctionner sans appliquer la force. Dans le cas où cela n’est pas possible, essayez de faire un nouveau trou près du premier afin d’éviter les blessures prolongées du cœur. L’aiguille ne doit pas être insérée plus profondément qu’environ 3 mm. - Insérez le cathéter de pression parallèle à la direction du ventricule droit, avec la pointe faisant face à l’artère pulmonaire.
- Surveillez le traçage des ondes de pression pour assurer le positionnement correct du cathéter. Les recherches représentatives sont démontrées à la figure 2.
- Laissez le signal de pression se stabiliser. Pause respirations et obtenir au moins 3 mesures. Entre les mesures individuelles, on peut aérer l’animal.
- Une fois que toutes les mesures sont enregistrées, retirez le cathéter et placez-le dans le tube rempli de PBS dans le bain d’eau.
REMARQUE : Après l’expérience, nettoyez le cathéter selon les instructions du fabricant.
- Avec de petits ciseaux effectuer une incision de la peau d’environ 1 cm sur le processus xiphoide et la partie abdominale supérieure. Séparez la peau couvrant la poitrine et la paroi abdominale des quadrants abdominaux supérieurs : commencez à la ligne médiane, distale au xiphoide et déplacez-vous soigneusement de façon postérieure des deux côtés. Utilisez la thermocauté pour contrôler les saignements.
- Euthanasie et perfusion pulmonaire
- À la fin de l’expérience euthanasier la souris par exsanguination.
- Ouvrez largement la poitrine. À l’aide de ciseaux, couper tout le sternum et faire attention à ne pas blesser le cœur ou les poumons.
- L’utilisation de ciseaux d’iris fait une petite incision dans le ventricule gauche pour permettre au sang de quitter la chambre.
- Placez l’aiguille de 25 G d’une seringue contenant 10 mL de PBS dans le ventricule droit et injectez la solution PBS jusqu’à ce que les poumons soient dégagés du sang.
- Une fois cette étape terminée, confirmez l’euthanasie par la récolte des tissus vitaux (cœur et poumons): couper le cava et les attachements aortiques et enlever le cœur et les poumons en bloc.
3. Caractérisation morphométrique
- Immédiatement après avoir enlevé le cœur et les poumons (étape 2.4.5), isoler le cœur et enlever les deux atrias. Avec des ciseaux incurvés de tenotomie disséquent soigneusement le ventricule droit (RV) du ventricule gauche (LV), laissant le septum (S) avec le ventricule gauche. Peser RV et LV+S et calculer l’indice Fulton = RV/LV+ S (Figure 3)5,9.
- Prenez une partie du ventricule droit et placez-le dans un moule d’incorporation préremplie oct. Utilisez l’autre partie du ventricule droit pour l’analyse de l’ARN et/ou des protéines. Casser le gel dans la glace sèche et conserver à -80 °C.
- Utilisez des ciseaux d’iris pour isoler les poumons du cœur et de tout autre tissu restant.
REMARQUE : Pour la préparation des poumons, la perfusion décrite ci-dessus (étapes 2.4.3-2.4.5) est d’une grande importance. - Casser congeler une partie des poumons et la stocker pour l’ARN, l’extraction de protéines ou d’autres tests.
- Utilisez l’autre partie des poumons pour l’analyse histologique. À cette fin, insérez la seringue contenant 50 % de PBS et 50 % d’OCT dans une bronche du lobe utilisé10,11. L’expérimentateur peut facilement voir que le poumon se gonfle lorsque le contenu de la seringue est perfusé dans le tissu.
- Placez ces morceaux de poumon dans les moules d’incorporation préremplis avec les PTOM et casser les congeler dans la glace sèche. Conserver les échantillons à -80 °C après leur congélation.
- Préparer 8 sections de μm de RV et de poumon à l’aide d’une machine cryostat. Sécher les sections à l’air à température ambiante pendant 30 min.
- Fixer les lames à température ambiante à l’aide de 10 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min.
NOTE : La PFA est un cancérogène connu pour l’homme. Réduisez le risque d’exposition à l’aide d’une hotte à fumée chimique, de procédures appropriées et d’un équipement de protection individuelle. Consultez la fiche de données sur la sécurité des matériaux (MSDS) pour plus d’informations. - Évaluation vascularisation de remodelage par coloration d’hématoxyline/d’éosine
Note : Effectuer la coloration de l’hématoxyline/éosine afin d’évaluer les changements structurels du cœur et le remodelage vasculaire dans le poumon (Figure 3).- Tacher avec la solution d’hématoxyline pendant 8 min.
- Rincer à l’eau courante du robinet pendant 5 min, puis rincer rapidement à l’eau distillée.
- Rincer à 95% EtOH pendant 1 min et contre-tacher dans la solution Eosin pendant 1 min.
- Déshydrater (80% éthanol 10-30 s, 100 éthanol pour 1 min et 100% toluol pendant 3 min).
- Monter et couvrir d’un couvercle. Sécher les toboggans toute la nuit à température ambiante.
REMARQUE : Les solutions utilisées pour la coloration peuvent être dangereuses. Réduisez le risque d’exposition à l’aide d’une hotte à fumée chimique, de procédures appropriées et d’un équipement de protection individuelle. Reportez-vous au MSDS pour plus d’informations.
- Évaluation de la fibrose ventriculaire droite par Picrosirius Red Staining
NOTE: Dans le Picrosirius Red Staining, Picrosirius Rouge, qui est acide, se lie au collagène12. Par conséquent, cette coloration peut être utilisée pour un examen histologique de la teneur en collagène.- Incuber les lames dans une solution bouin préchauffée à 58 °C pendant 1 h.
- Laver les diapositives dans l’eau courante du robinet pour enlever la couleur jaune des sections pendant 10-15 min.
- Tacher dans 0,1% Vert rapide pendant 20 min à température ambiante.
- Rincer à 1% d’acide acétique pendant 1 min.
- Rincer à l’eau du robinet pendant 5 min.
- Tache dans 0,1% de sirius rouge pendant 30 min à température ambiante suivie de déshydratation dans le Toluol.
ATTENTION : Les solutions utilisées pour la coloration peuvent être dangereuses. Réduisez le risque d’exposition à l’aide d’une hotte à fumée chimique, de procédures appropriées et d’un équipement de protection individuelle. Reportez-vous au MSDS pour plus d’informations.
- Évaluation de l’hypertrophie de cardiomyocyte de RV par WGA Staining
REMARQUE : L’hypertrophie du ventricule droit (RV) au niveau cellulaire peut être évaluée en effectuant une coloration d’agglutinine de germe de blé (WGA) (figure 4).- Fixer les diapositives dans la solution d’acétone froide pendant 15 min suivie de 3 étapes de lavage en PBS (5 min chacune).
- Bloc avec 10% de sérum de chèvre dans une solution Dako pendant 30 min à température ambiante.
- Incuber les diapositives avec WGA: Ajouter WGA 1:200 et incuber pendant 1 1/2 h à 37 °C dans l’obscurité.
- Laver les diapositives trois fois avec PBS.
- Incuber les lames avec un colorant acide nucléique.
- Laver les diapositives trois fois avec PBS.
- Pour le montage, retirer l’excès de liquide et appliquer un support de montage et un couvercle. Sécher les lames pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité et les conserver à 4 °C.
REMARQUE : Les solutions utilisées pour la coloration peuvent être dangereuses. Réduisez le risque d’exposition à l’aide d’une hotte à fumée chimique, de procédures appropriées et d’un équipement de protection individuelle. Reportez-vous au MSDS pour plus d’informations.
- Effectuer l’immunochimie du poumon pour évaluer plus loin et spécifiquement le remodelage vasculaire. Par exemple, la coloration lisse des cellules musculaires peut être utilisée pour évaluer la musculature des vaisseaux, tandis que la coloration de facteur von Willebrand peut être utilisée pour visualiser les changements endothéliales. Ces méthodes sont décrites ailleurs5.
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Representative Results
Dans ce protocole, nous décrivons en détail la création du modèle Hypoxia/SU5416 pour induire le PH chez les souris. En outre, nous détaillons toutes les étapes nécessaires pour effectuer l’évaluation vasculaire pulmonaire et cardiaque à la fin de la période d’observation.
Un aperçu de la conception expérimentale de ce modèle est présenté à la figure 1A13,14. Les souris sont soumises à l’hypoxie normobare (10% O2) et sous-cutanéement injectées une fois par semaine avec SU5416 pendant trois semaines consécutives. Les stimuli utilisés pour induire le PH dans ce protocole sont indiqués aux figures 1B et 1C.
L’antagoniste des récepteurs VEGF SU5416 agit en causant l’apoptose de cellules endothéliales et, par conséquent, permettant la prolifération des cellules endothéliales résistantes à l’apoptose. Ceci conduit au remodelage vasculaire dans la vascularisation pulmonaire et à la résistance vasculaire accrue5. La pression élevée dans la circulation pulmonaire augmente le RV afterload et conduit progressivement au dysfonctionnement et à l’échec de RV9. Dans la première étape, le succès du protocole Hypoxia/SU5416 peut être évalué en évaluant fonctionnellement la fonction RV à la fin de la période d’observation. Dans ce protocole, nous décrivons en détail l’évaluation invasive de la pression systolique de RV utilisant la méthode ouverte de mesure de pression de RV de coffre. Les courbes de pression représentatives et l’analyse quantitative de la pression ventriculaire droite sont affichées à la figure 2.
Comment pouvons-nous quantifier le remodelage vasculaire, qui conduit à une résistance vasculaire élevée et par conséquent PH? L’histomorphométrie est l’étalon-or pour caractériser la vascularisation pulmonaire. Dans ce protocole, nous décrivons en détail le protocole de coloration hématoxyline et éosine (H&E). Après la coloration et la capture des images, les artères pulmonaires peuvent être distinguées en petites (<50 μm) et plus grandes (> 50 μm). Les artères bronchiques ont été exclues de notre étude. Pour évaluer l’épaisseur médiale, l’externe (ED), ainsi que le diamètre interne (ID) des artères, est mesuré. Les images représentatives des artères pulmonaires remodelées après le traitement par hypoxie/SU5416 sont présentées à la figure 3A. Le pourcentage d’épaisseur médiale des artères par rapport au diamètre transversal est indiqué à la figure 3B. L’analyse morphométrique des artères pulmonaires distales démontre une augmentation significative de l’épaisseur médiale chez les souris traitées par Hypoxia/SU5416 par rapport aux animaux normoxie (figure 3).
L’augmentation de la charge après conduit à l’hypertrophie RV et que la maladie progresse à la fibrose RV9,15. L’hypertrophie rv peut être évaluée morphométriquement en mesurant l’indice Fulton (RV/LV+Septum) ainsi qu’en mesurant l’hypertrophie de cardiomyocyte (CM). Le rapport de poids du ventricule droit (RV) au ventricule gauche (LV) plus le septum [RV/(LV+S)] est calculé comme un indice de l’hypertrophie ventriculaire droite. Les résultats représentatifs de l’indice Fulton dans les souris Hypoxia/SU5416 et normoxie sont indiqués à la figure 4B. La méthode décrite ici pour évaluer l’hypertrophie de CM est la coloration des sections ventriculaires droites avec l’agglutinine de germe de blé (WGA). WGA se lie aux glycoprotéines de la membrane cellulaire et peut être utilisé pour déterminer la zone transversale des myocytes16,17. Les images représentatives des sections ventriculaires droites tachées de WGA sont présentées à la figure 4A. Les quantifications de la zone CM chez les souris malades et témoins sont indiquées dans la figure 4A. L’hypoxie/SU5416 entraîne une augmentation marquée de la taille des cardiomyocytes et de l’hypertrophie ventriculaire droite (figure 4). Nous et d’autres ont déjà montré que, par rapport à l’un seul coup (seulement l’hypoxie), Hypoxia/SU5416 aggrave le phénotype RV5,18.
Figure 1: Vue d’ensemble de la méthode Hypoxia/SU5416. (A) Conception expérimentale du modèle de souris Hypoxia/SU5416. SU5416 est injecté sous-cutanéement une fois par semaine pendant 3 semaines consécutives. (B) Représentation schématique du système d’hypoxie. Le contrôleur détecte et régule l’oxygène à l’intérieur de la chambre en infusant l’azote par le tube d’infusion de gaz. (C) Structure chimique de SU5416. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Pression ventriculaire droite chez les souris exposées à l’hypoxie chronique combinée à l’injection de SU5416. (A) Suivis représentatifs des mesures de pression invasives du ventricule droit (RV). (B) RV pression systolique chez les souris Hypoxia/SU5416 et les animaux témoins exposés à la normoxie. n = 6-8 souris par groupe. p < 0,001. Toutes les données quantitatives sont déclarées comme moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Hypoxie/SU5416 induit le remodelage vasculaire pulmonaire. (A) Les sections représentatives de l’hématoxyline/éosine tachées de poumons des groupes indiqués démontrent une augmentation de l’épaisseur de la paroi des médias dans les artères pulmonaires des souris Hypoxia/SU5416. Barre d’échelle : 50 μm. (B) Pourcentage d’épaisseur médiale des artères par rapport au diamètre transversal. n = 5 souris par groupe. p < 0,001. Toutes les données quantitatives sont déclarées comme moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Hypertrophie ventriculaire droite chez les souris exposées à l’hypoxie chronique combinée à l’injection de SU5416. (A) (Gauche) Représentant WGA (Germe de blé Agglutinine) coloration du tissu ventriculaire droit après le traitement indiqué. Barre d’échelle : 50 μm. (Droite) Analyse quantitative des données. n = 5 souris par groupe. (B) hypertrophie rv reflétée par le poids de RV au-dessus de LV plus le rapport de poids interventriculaire de septum (S) (indice fulton = RV/LV+ S) dans chaque groupe. n = 8 souris par groupe. p < 0,001. Toutes les données quantitatives sont déclarées comme moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole décrit comment modéliser le PH chez la souris en combinant deux stimuli pathologiques : l’hypoxie chronique et l’injection de SU5416 (Hypoxia/SU5416)18. Dans une tentative de corréler ce modèle de souris avec la condition humaine ph, il faut inévitablement regarder la classification actuelle ph, indiqué dans le tableau 1. Ph sous presque toutes les formes est caractérisée par la vasoconstriction pulmonaire et la prolifération aberrante des cellules musculaires endothéliales et lisses. Ceci conduit à la pression élevée dans les artères pulmonaires et par conséquent à l’augmentation de la charge après du ventricule droit.
Chaque tentative de caractériser un modèle animal de PH devrait inclure la preuve du remodelage histopathologique de la vasculature pulmonaire et du ventricule droit. Le modèle de souris hypoxie à un seul coup conduit à une forme légère de vascularisation remodelage2,3. Ces résultats pathologiques incluent la musculation des vaisseaux précédemment non musclés, accompagnés de cellules endothéliales, de cellules musculaires lisses et de prolifération de fibroblastes. Ces résultats sont aggravés par l’ajout du deuxième coup (injection de SU5416). Les effets sont réversibles dans le modèle à frappé unique (hypoxie) et seulement partiellement réversibles dans le modèle Hypoxia/SU5416.
La principale cause de décès chez les patients atteints de PH est l’insuffisance ventriculaire droite (RVF)4,20. Le remodelage vasculaire pulmonaire dans les modèles animaux n’est pas toujours accompagné par RVF. Afin de caractériser un modèle animal en termes de données morphologiques, fonctionnelles et moléculaires RVF doit être analysé. Ce dernier est au-delà de la portée de ce protocole. Le remodelage morphologique de RV inclut les aspects macro- et microscopiques. Au niveau macroscopique, l’indice principal de l’hypertrophie rv est l’indice Fulton, défini comme le poids de RV divisé par le poids ventriculaire gauche (LV) et Septum (S) (RV/LV+S). Au niveau microscopique, la fibrose, l’inflammation et l’hypertrophie peuvent être évaluées par sirius rouge, hématoxyline/éosine et coloration WGA, respectivement.
Le modèle Hypoxia/SU5146 de souris (qui est décrit ici) montre un dysfonctionnement de RV, mesuré par des pressions systoliques élevées et des critères morphologiques. En ce qui concerne le remodelage vasculaire pulmonaire, l’hypertrophie médiale est observée trois semaines après le début du protocole. Par rapport au modèle Hypoxia/SU5416 chez les rats, le modèle de souris ne cause pas l’échec de RV (seulement le dysfonctionnement modéré), ne mène pas à l’angiopathie oblitetive grave, comme observé chez les humains gravement malades, et les ameliorates de pathologie pulmonaire après le retour à la normoxie. Dans l’ensemble, le modèle Hypoxia/SU5416 de souris convient à l’imitation des lésions vasculaires rencontrées dans ph, principalement groupe I (partiellement groupe III, voir tableau 1)1,19. L’avantage de ce modèle est l’application chez les souris de type sauvage (génétiquement non modifiés), la mise en œuvre relativement facile et peu coûteuse, la mortalité relativement faible des animaux malades, et le développement rapide de la maladie d’intérêt (3 semaines). Les études de prévention et de thérapie de PH peuvent facilement être mises en œuvre dans ce modèle, sans la nécessité de compétences avancées par opposition aux modèles chirurgicaux de rongeur.
Lors de la mise en œuvre du protocole, il y a quelques étapes critiques, que l’on doit garder à l’esprit. Lors de la planification de l’étude, il faut garder à l’esprit que dans le groupe Hypoxia/SU5416, la mortalité des animaux varie entre 0 et 10 % (observations non publiées). Par conséquent, afin d’atteindre la puissance statistique et d’éviter les études sous-puissantes, au moins 10 souris par groupe sont recommandées. La solubilité de SU5416 est faible. Par conséquent, dmso ou un autre solvant (p. ex. cellulose de carboxyméthyle, CMC) doivent être utilisés. DMSO à fortes doses peut être toxique. L’utilisation de LD50 pour l’utilisation sous-cutanée (s.c.) chez la souris a été signalée à 13,9 - 25,6 g/kg21,22. LD50 est définie comme la dose requise pour tuer 50% des membres d’une population testée après une durée d’essai spécifiée21,22. Pour une souris qui pèse 25 g, 4,4 g/kg de DMSO est utilisé (calculs basés sur la densité DMSO de 1,1 g/mL et 0,1 mL appliqué s.c./souris). Par conséquent, la dose sous-cutanée est beaucoup plus faible que la valeur LD50. Dans nos mains, l’application de SU5416 dissous dans DMSO, comme décrit ici, peut causer une irritation de la peau dans certains cas, mais aucun autre effet toxique n’est observé. Toutefois, plusieurs rapports recommandent l’utilisation de CMC comme un véhicule de remplacement à SU541614. Lors de l’exécution des mesures fonctionnelles RV, une attention particulière doit être accordée à la température du corps, saignement, et la profondeur de l’anesthésie, comme évalué par l’essai des réflexes de la souris. La technique de la poitrine ouverte pour évaluer la pression RV, comme décrit ici, a l’avantage d’être facilement mis en œuvre, même par un utilisateur inexpérimenté. La méthode à poitrine fermée (décrite ailleurs23,24,25) a l’avantage d’être moins invasive et peut donc, aussi être implémentée dans des expériences non terminales. Il faut cependant un haut niveau d’expertise.
Après la première description du modèle Hypoxia/SU5416 chez les rats, le modèle de souris a été utilisé avec succès dans plusieurs études5,9,13. Cependant, il existe des preuves que les résultats dépendent du fond génétique et du sexe des souris, le fabricant de SU5416 et la fréquence de l’injection de SU541626. Alors que l’injection de SU5416 sur trois semaines consécutives conduit à ph chez les souris, une seule dose n’induirait pas PH4. En outre, d’autres formes de PH, telles que celles associées à une maladie cardiaque gauche ou en raison de la maladie thromboembolique chronique, nécessitent des modèles liés à l’étiologie. De nouvelles thérapies devraient être testées dans au moins 2 modèles animaux différents, avant d’être en mesure d’ouvrir la voie à des études translationnelles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Heart Association (AHA- 17SDG33370112 et 18IPA34170258) et des National Institutes of Health NIH K01 HL135474 à Y.S. O.B a été soutenu par le Deutsche Herzstiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
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