Summary
여기, 우리 갤러리아 mellonella 애벌레를 사용 하는 구강 관리 모델에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 특성화 하는 방법을 타고 난 면역 반응 유도. 이 프로토콜을 사용 하 여, 실제적인 경험 없이 연구원 G. mellonella 강제로 메서드를 사용할 수 있게 됩니다.
Abstract
숙주 면역 체계에 공생 박테리아의 면역성 잠재력의 조사 장 호스트-미생물 상호 작용을 공부 하면 한 필수 구성 요소입니다. 그것은 잘 다른 공생 호스트 장 면역 체계를 자극 하는 다른 잠재력을 전시 설립. 이러한 조사는 척추 동물, 특히 설치류를 포함 한다. 이후 증가 윤리적인 우려 척추 동물을 포함 하는 실험과 함께 연결, 무척 추 동물 대체 모델에 대 한 높은 수요가 있다.
여기, 우리는 G. mellonella 면역 시스템에 공생 비 병원 성 박테리아와 공생의 면역성 잠재력의 가능한 평가 사용 하 여 갤러리아 mellonella 구강 관리 모델을 제공 합니다. G. mellonella Bacteroides vulgatus , 대장균등 다른 면역성 잠재력과 공생의 분석을 허용 하는 유용한 다른 무척 추 동물 대체 모델은 설명 합니다. 흥미롭게도, 박테리아 전시는 포유류와 비슷한 애벌레에 죽이 효과가 없습니다. G. mellonella 의 면역 반응 척 추가 있는 타고 난 면역 반응에 대 등 했다 하 고 박테리아의 인식 및 항균 분자의 생산을 포함 한다. 우리가 제안 하는 G. mellonella 건강 한 포유류 개인에서 잘 알려진 이전 microbiota 균형을 복구할 수 있었다. 제공 하는 G. mellonella 및 척추 동물에 비해 타고 난 면역 반응, 비록 G. mellonella 는 적합 한 면역 계통 항구 하지 않습니다. 타고 난 면역 체계의 구성 하는 조사 요소는 진화 보존, 모델 세균 면역성 속성의 첫 번째 해 분석을 수 있습니다.
Introduction
장내 미생물의 항상성 유지를 위한 필수 구성 요소 이며 모두 타고 난 및 적응형 면역 반응1,2를 포함 한다. 공생 microbiota 커뮤니티 다른 주요 공생 성분에 의해 특징입니다: symbionts 중요 한 immunomodulatory 기능을 가질 수 있는 해로운 효과 유전으로 predisposed pathobionts 효능 효과 부여 호스트 및 홍보 하 고 방 아 쇠 창 자 염증3,4. Symbionts 및 pathobionts에 대 한 많은 연구와 숙주 면역 체계에 영향을 미치는 그들의 주로 공부 적응 면역 응답 출판 되었습니다.
이러한 연구 조사와 보호에 대 한 많은 동물 포함 동물 실험에 대 한 사용의 공공 이익 증가의 이후 우리는 찾을 수 있도록 다른 박테리아의 심사에 대 한 면역성 대체 모델 추구 속성입니다. 곤충, 특히 갤러리아 mellonella, 감염 연구에서 널리 사용 되는 대체 모델은. G. mellonella 는 낮은 비용, 높은 처리량; 등 다른 장점 결합 그것은 자연 노출 경로 박테리아의 구강 관리를 허용 하 고 조직의 감염5,6있습니다. G. mellonella 더 포유류와 세균 독성 인자 식5에 대 한 최적의 생리 적 체온은 37 ° C에 외피를 수 있습니다. G. mellonella 의 주요 장점은 보존된 타고 난 면역 시스템을 비 자체에서 자기의 차별 하 고 인코딩합니다 opsonin hemolin6, 또는 apolipophorin 같은 패턴 인식 수용 체의 다양 한 7. 미생물 인식 시 G. mellonella 다른 다운스트림 체액 면역 응답을 실행할 수 있습니다. 그것은 산화 긴장 응답을 유도 하 고 개 (질소 산화 효소 synthase)와 NOX (NADPH 산화 효소)6,8의 활동을 포함 하는 반응성 산소 종 (선생님)을 분 비 수 있습니다. G. mellonella gloverin, moricin, cecropin 또는 defensin 같은 gallerimycin6, 등의 다른 혼합물의 분 비에 결과 강력한 항균 성 펩 티 드 (AMP) 응답을 활성화 하는 또한, 8,,910. 일반적으로, 앰프 그람 양성 및 그람 음성 박테리아와 곰 팡이 대 한 매우 광범위 한 호스트 특이성 있고 곤충 어떤 적응 응답10부족 이후 강력한 응답을 제공 해야 합니다. Gloverin 앰프 박테리아와 곰 팡이 대 한 활성 이며 외부 막 형성6,11을 억제. Moricins 막 관통과 기 공9,11을 형성 하 여 그람 양성 및 그람 음성 세균에 대해 항균 기능을 전시 한다. Cecropins는 박테리아와 곰 팡이 대 한 활동을 제공 하 고 moricins9,10처럼 비슷하게 막 permeabilize. Gallerimycin 곰 팡이 방지 속성9defensin 같은 펩 티 드 이다. 흥미롭게도, 그것은 발견 했다 cecropin 및 gallerimycin의 조합 대장균10에 대 한 시너지 활동 했다.
때문에 그들의 사용 하기 쉬운 문자 G. mellonella 애벌레는 세균성 pathogenicity를 평가 하기 위해 종종 사용된 감염 모델입니다. 특히, G. mellonella 에서 얻은 데이터 연구가 대체 호스트 모델의 강도 마우스 지원에서 얻은 데이터와 연관. 그것은 조직의 감염 후 감염 마우스 모델에서의 Listeria monocytogenes 가장 병원 성 serotypes G. mellonella 에서 높은 사망 율에 또한 지도 발견 했다. 또한, 악성 serotypes 덜 밝혀졌다 G. mellonella 모델12에서 보다 적게 악성도 될. 인간 병원 성 균 류 칸디 다 albicans와 비슷한 관찰 되었습니다. 독성 다른 C. albicans 의 종자는 조직의 감염 및 애벌레 생존의 후속 모니터링에 의해 부과 되었습니다. 마우스 avirulent 긴장은 또한 avirulent 또는 전시 마우스 악성 변종 리드 하 고 또한 애벌레 사망률13반면 G. mellonella에 독성을 감소. G. mellonella 모델 추가 녹 농 균14의 유형 3 분 비 시스템 pathogenicity 요소를 식별 하기 위해 사용 될 수 있습니다.
G. mellonella 관련 된 대부분의 조사 조직의 감염 방식을 사용 하 여 독성 요인에 초점을 했다 이후 우리 메서드는 구두 강제로에 장내 공생의 분석에 적합 제공에 특히 흥미 있었다 모델은 우리 수 애벌레 당 박테리아의 다른 복용량을 적용 하 고 뿐만 아니라 애벌레 사망률을 관찰 하지만 장내 항상성 유지를 타고 난 면역 반응의 다른 특징을 분석.
우리의 방법은 우리가 박테리아의 응용 프로그램 및 RNA 발현의 분석을 결합 하는 이후 대체 모델로 G. mellonella 의 사용을 증가 하는 데 도움이 됩니다. 만 때 구강 관리 및 조직의 감염 후 사망률 뿐만 아니라 관찰 후 면역 반응의 분석을 포함 한 세균 병 인 연구의 의미를 강화 하기 위해 유용 하다. 우리의 방법을 수 있습니다 박테리아의 면역성 속성의 분석에 대 한 비 병원 성 공생 이후 살아있는 유기 체에는 장 방 벽을 제공 하 여 세포 배양 보다 더 복잡 한 조건을 제공 합니다.
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Protocol
1. G. mellonella 양육 및 실험에 대 한 애벌레의 준비
참고: 마지막 유 충 탈피를 달걀에서 주기 약 5-6 주 걸립니다.
- 성인 나 방 2 L 상자 포함 하는 왁 스 나 방 기판 (22% 옥수수 밀가루, 22% 밀 식사, 17.5% 밀랍, 11% 무 지방 우유 분말, 꿀 11%, 11% 글리세롤, 5.5% 건조 효 모)에 의해 누워 계란을 전송 합니다. 어둠 속에서 30 ° C에서 번 식 하는 전체를 수행 합니다.
- 애벌레를 포함 하는 때 작고 작은 애벌레 표시 했다 약 1-2 주 후에 신선한 기판으로 기판의 25 g을 전송 합니다. 그들의 크기에 따라 2 주 후 애벌레를 동기화 하 고 추가적인 2 주 동안 왁 스 나 방 기판에 2 L 용기에 30-40 애벌레의 그룹을 유지.
- 무게에 의해 실험에 대 한 애벌레를 선택 합니다. 180-200 mg의 질량만 창백 하 고 빠른 움직이는 애벌레를 사용 합니다.
2. 재배 및 Bacteroides vulgatus 및 대장균 의 구강 관리에 대 한 준비
- Anaerobically는 혐 기성 환경을 만들기 위한 항아리와 sachets를 사용 하는 37 ° C에서 의무 혐 기성 박테리아 Bacteroides vulgatus mpk를 성장 (참조 테이블의 재료)15,16. B. vulgatus 2 일간 배양 하 고 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 국물에 하룻밤 subculture 성장.
- 37 ° c.에 Luria Bertani (파운드) 국물에 호 기성 조건 하에서 facultative 혐 기성 박테리아 대장균 mpk를 성장 대장균 파운드 국물에서 하룻밤 배양 실험의 하루에 37 ° C에서 2 시간에 대 한 하위를 성장 하 고.
- 5 분 Resuspend는 세균성 DPBS (Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분)에 알 약에 대 한 1700 x g 에서 원심 분리 하 여 문화를 수확. OD 600 nm에서 세균성 문화의 광학 밀도 (OD)을 확인 하 고 세균성 농도 계산. 세균성 농도 109/mL을 조정 했다.
3. 세균 정지로 G. mellonella 애벌레의 강제로
- 복용량 당 107 박테리아를 포함 하는 조정된 세균 현 탁 액의 10 µ L 각 애벌레 농성 인슐린 주사기를 사용 하 여 세균 현 탁 액의 구강 응용 프로그램에 대 한 무딘 종단 바늘.
- Microsyringe 펌프 (그림 1) 각 유 충에 적용 된 서 스 펜 션 볼륨의 정확성을 보장 하기에 주사기를 수정 ( 재료의 표참조). 신중 하 게 그들의 mandibles 사이 주사기를 삽입 합니다. 주사기는 mandibles 사이 강요 하지 않습니다. 그것 mouthparts 열고 다음 주사기를 삽입 하는 애벌레를 기다립니다.
- 1-24 h. 사용 DPBS 관리 애벌레 모의 배경 컨트롤을 강제로 동안 애벌레의 처리로 인해 유발 하는 잠재적인 스트레스 응답을 제외로 사이 37 ° C에서 어둠 속에서 강제 애벌레를 품 어.
4. 구두 관리 애벌레와 RNA 격리의 처리
- 후드 밑 작업과 안전 안경을 착용. 후드와 스프레이 시 RNase 오염을 방지 하기 위해 청소.
- 스냅-동결 살아있는 애벌레 부 화 후 액체 질소에 그리고 그들을 균질. 균질에 대 한 박격포와 암 꽃 술을 사용 합니다. 액체 질소를 추가 박격포와 그리드 애벌레 각각 가루 homogenates는 생성 될 때까지.
- 보트 무게는 일회용에 homogenate를 부 어 하 고 증발 하는 액체 질소에 대 한 기다립니다.
- 2 mL 튜브에서 Trizol의 1 mL와 가루 homogenates 냉동 질소 무료 액체를 혼합 하 고 1 시간을 위한 실내 온도에 혼합물을 품 어.
- 실 온에서 15 분 동안 8000 x g 에서 혼합물을 원심 신선한 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 펠 릿을 삭제. 1-브로 모-3-Chloropropane (BCP)의 200 µ L는 상쾌한 믹스. 소용돌이 실 온에서 5 분와 얼음에 10 분을 위한 혼합물을 품 어.
- 18000 x g 4 ° c.에 15 분에서 BCP 추가 반응 원심 새로운 2 mL 튜브에 상단 투명 레이어를 전송 하 고 나머지를 폐기로. 혼합 5 분에 대 한 튜브를 거꾸로 하 여 500 µ L 소 프로 파 놀으로 전송 된 상위 계층의 RNA 침전.
- 18000 x g 4 ° c.에 15 분 동안에 관을 원심 75% 에탄올 500 µ L로 침전 된 RNA 펠 릿을 세척.
- 실시간에서 5-10 분의 RNA 펠 렛 건조 주의 하지 건조로 나중에 분해 하는 것이 어려울 것입니다.
- Ribonuclease 억제제 (1: 100) nuclease 무료 물에 묽 게 하십시오를 사용 하는 솔루션의 100 µ L 말린된 RNA 펠 릿 resuspend. 소용돌이 펠 릿은 완전히 해산 때까지 신중 하 게 관.
- 측정 RNA 품질과 수량입니다. 260/280 비율 약 2.0 260/230 비율 2.0-2.2 ( 재료의 표참조)의 범위에 있는지 확인 합니다.
- 격리 된 RNA의 5 µ g를 사용 하 여 DNase 소화에 대 한. 버퍼, ribonuclease 억제제 효소의 1 µ L, DNase 효소의 2 µ L x 10의 믹스 5 µ L, RNA, 그리고 nuclease 무료를 채우기의 5 µ g 물 50 µ L. 30 분 실시간에 대 한 품
- 비활성화 시 약의 6 µ L을 추가 하 고 때때로 RT와 소용돌이 반응에서 2 분 동안 품 어. 신선한 1.5 mL 튜브에 반응 1 분 전송 상쾌한에 대 한 10000 x g 에서 원심
참고: RNA에 구강 관리에 사용 하는 각각 스트레인의 세균성 RNA로 서 애벌레 RNA가 포함 되어 있습니다.
- 비활성화 시 약의 6 µ L을 추가 하 고 때때로 RT와 소용돌이 반응에서 2 분 동안 품 어. 신선한 1.5 mL 튜브에 반응 1 분 전송 상쾌한에 대 한 10000 x g 에서 원심
5. 강제로 후 박테리아 16S 복사 번호의 정량화
참고: 복사 수 표현된 세균성 16S의 cDNA에서 섹션 4에서에서 추출한 RNA 합성을 사용 하 여 결정 했다. 최종 정량화 B. vulgatus 또는 대장균 의 16S PCR 파편 복제는 플라스 미드의 표준 곡선의 도움으로 계산 됩니다.
- 플라스 미드 표준의 준비
- 16 조각 대장균 mpk 또는 PCR에 의해 B. vulgatus mpk genomic DNA에서 증폭. 버퍼, 10mm dNTP 솔루션, 10 µ M 앞으로 뇌관의 2.5 µ L 10 µ M 역 뇌관 희석의 2.5 µ L의 1 µ L, DMSO, genomic DNA 템플렛의 1 µ L, nuclease 무료 물 31.5 µ L의 증거-독서 효소의 0.5 µ L 1 µ L x 5의 믹스 10 µ L.
- PCR를 실행 (초기 변성: 98 ° C 30에 대 한 s, 변성: 98 ° C 10에 대 한 s, 어 닐 링: 30, 확장에 대 한 60 ° C: 72 ° C 30에 대 한 s, 마지막 연장: 72 ° C 5 분, 반복 변성, 어 닐 링 및 30 사이클에 대 한 확장에 대 한).
- 16S 대장균 뇌관을 사용 하 여 (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) 또는 16 B. vulgatus 뇌관 (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp)에 대 한 증폭입니다.
- 무뚝뚝한 끝 복제 복제 벡터에 대 한 대장균 과 B. vulgatus 16S PCR 파편을 사용 합니다. 결 찰을 설정 하 고 버퍼, 정화 비 PCR 제품의 1 µ L, 무뚝뚝한 끝 복제 플라스 미드, nuclease 무료 물 7 µ L 및 T4 DNA 리가의 1 µ L의 1 µ L x 2의 10 µ L를 혼합. 실시간에서 10 분에 대 한 결 찰을 품 어
- 대장균 DH5α 유능한 세포 준비.
- 야간 문화의 1 mL를 삼각 플라스 크에 파운드 매체의 100 mL 접종 OD 600 nm 0.4-0.6 사이 때까지 문화를 성장. 2 50 mL 튜브에 결과 문화를 분리 하 고 10 분 동안 얼음에 문화를 품 어.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 1700 x g 에서 문화 원심 삭제는 상쾌한 고 RFI 솔루션의 5 mL와 함께 신중 하 게 각 펠 릿 resuspend (30mm 채널3쿡, 100 m m KCl, 10mm CaCl, 50 m m MnCl2, 조정 필터링 빙하 산, 살 균 pH 5.8). RFI 솔루션의 추가 45 mL로 각 튜브를 채우십시오.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 1700 x g 에서 문화 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend RFII (10mm MOPS, 15mm CaCl2, 10mm KCl, 15% 글리세롤, 압력가)의 6 mL와 함께 신중 하 게 각 펠 릿 솔루션. 두 분수 풀 하 고 15 분 준비 세포 현 탁 액 aliquots (200 µ L)에 대 한 얼음에 12 mL 정지를 품 어. -80 ° c.에 aliquots 저장
- 유능한 대장균 의 한 약 수를 결 찰 반응 전송 DH5α 세포와 15 분 열에 대 한 얼음에 두고 반응 충격 45 셀 42 ° C에서 s LB 매체 1 mL을 추가.
- 37 ° c.에서 45 분에 대 한 변환 품 어 암 피 실린 포함 된 파운드 천 배지를 변환의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 5.1.5 단계의 파운드 한 천 배지에서 식민지 8 결과 transformants의 PCR를 수행 합니다. 이쑤시개와 각 식민지를 선택 하 고 포함 하는 암 피 실린 (마스터 플레이트) 신선한 파운드 접시에 찍어 다음 PCR 스트라이프에 nuclease 무료 물 잘 포함 5.5 µ L로 같은 이쑤시개를 찍어.
- 2 x PCR 믹스의 7.5 µ L, 10 µ M 앞으로 뇌관의 0.5 µ L 10 µ M 역 뇌관 희석의 0.5 µ L를 추가 합니다. 5.1.1 절에서 언급 한 동일한 뇌관 쌍을 사용 합니다.
- PCR를 실행 (초기 변성: 5 분 동안 95 ° C 변성: 1 분 동안 95 ° C 어 닐 링: 30, 확장에 대 한 60 ° C: 1 분, 마지막 확장에 대 한 72 ° C: 7 분, 반복 변성, 어 닐 링 및 35 사이클에 대 한 확장을 위한 72 ° C).
- 1 %agarose 젤에 16S 파편의 크기를 확인 합니다. 0.5 x 트리 스-Borate-EDTA (TBE) 버퍼를 사용 하 여 agarose의 1 g을 녹이 고 전자 레인지에 데워 수 있습니다. 젤 하 고 그것을 1: 50000 염료를 추가 합니다. 젤에 식민지 PCR 반응 및 100 bp DNA 사다리를 추가 하 고 45 분 젤 110 V에서 실행.
- 바로 삽입 크기를 포함 하는 각 대장균 및 B. vulgatus 16S 플라스의 마스터 플레이트 (5.1.6 단원)에서 한 클론으로 암 피 실린 포함 5 mL 파운드 하룻밤 문화 접종
- 1700 x g에서 2 mL 튜브에 세균성 하룻밤 문화 원심 삭제는 상쾌한 고 600 µ L 살 균 물 속에서 펠 릿 resuspend.
- 6 번 튜브를 거꾸로 하 여 100 µ L의 세포의 용 해 버퍼와 믹스를 추가 합니다. 감기 (4 ° C)의 350 µ L 추가 중화 솔루션 및 튜브를 거꾸로 하 여 철저 하 게 혼합.
- 3 분에 대 한 원심 분리기에서 최대 속도로 원심 전송 상쾌한 (~ 900 µ L) 스핀 열 및 15에 대 한 원심 분리기에서 최대 속도로 원심 분리기 s.
- flowthrough을 삭제 하 고 15 원심 분리기에서 최대 속도로 제거 세척 및 원심 분리기의 200 µ L를 추가 s.
- 세척 솔루션의 400 µ L 열에 추가 30 미 전송에 대 한 원심 분리기에서 최대 속도에 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 열, 열에 차입 버퍼의 30 µ L 실내 온도에서 1 분 동안 그것을 품 어 추가.
- 30 대는 분리기에서 최대 속도로 원심 분리기 s ( 재료의 표참조).
- 작업 솔루션 (각 반응에 대 한 버퍼의 199 µ L 당 형광 염료의 1 µ L) 199 µ L로 플라스 미드 DNA의 1 µ L를 혼합 하 여 플라스 미드 DNA 농도 결정 합니다. 190 µ L. 표준 2의 표준 1 또는 10 µ L의 10 µ L를 혼합 하 여 준비 하는 두 개의 표준 소용돌이 샘플 및 표준 튜브와 품 어 2 분 측정 농도 대 한 반응 ( 재료의 표참조).
- 10 직렬 희석 10-100000 사본의 범위에 있는 표준 농도 준비: 계산 단일 플라스 미드의 질량 (m = (1.096x10-21 g/혈압), x (n) n = 플라스 미드의 크기, m = 질량). 플라스 미드 DNA의 원하는 복사본 수를 포함 하는 데 필요한의 질량을 계산 (복사의 수 단일 플라스 미드의 질량 x = 플라스 미드 DNA 필요의 질량).
- 정량화에 대 한 샘플의 준비
- CDNA를 음성 합성. 7 x 버퍼의 2 µ L, nuclease 무료 물 섹션 4와 11 µ L에서 DNase 소화 RNA의 1 µ L를 혼합. 42 ° c.에 2 분 동안 품 어
- 얼음에 즉시 반응을 놓습니다. 5.2.1 단계의 반응, RT 효소의 1 µ L, RT (역전사) 뇌관 믹스의 1 µ L, RT 버퍼 x 5의 믹스 4 µ L. 42 ° c.에 15 분 동안 품 어 RT 효소 비활성화를 95 ° C에서 3 분 동안 품 어.
- 5.1.9 단계에 설명 된 cDNA 농도 fluorometrically 같은 계량.
- CDNA를 음성 합성. 7 x 버퍼의 2 µ L, nuclease 무료 물 섹션 4와 11 µ L에서 DNase 소화 RNA의 1 µ L를 혼합. 42 ° c.에 2 분 동안 품 어
- 세균성 부하의 측정
- 조정 5 cDNA 농도 정량 PCR 위한 12 µ L 반응 당 ng. 2 x RT-PCR 혼합, 100 µ M 앞으로 뇌관의 0.25 µ L, 100 µ M 역 뇌관 (5.1.1)의 0.25 µ L, 조정 된 cDNA의 12 µ L를 혼합. 정량 Pcr을 실행 (초기 변성: 5 분 동안 95 ° C 변성: 95 ° C 10 s, 어 닐 링: 60 ° C 30에 대 한 s, 반복 변성 및 녹는 35 사이클 어 닐 링: 95 ° C, 차가운 4 ° c).
- 해당 ct 값 (y 축)에 대 한 플라스 미드 표준 곡선 (10-100, 000 부), 즉 1-5 (x 축)의 로그10 농도 플롯 합니다. 회귀 방정식을 얻기 위해 선형 회귀를 수행 합니다. (농도) x에 대 한 방정식을 해결. Ct 값을 수식에 삽입 하 여 복사 번호의 로그10 을 계산 하는 수식을 사용 합니다. 복사 번호를 얻기 위해 역대 수를 계산 합니다.
6. 타고 난 면역 표식 유전자 정량 RT-PCR를 사용 하 여 결정
- PCR와 후속 agarose 유전자 특이성에 대 한 프라이 머 젤 전기 이동 법 올바른 조각 크기를 확인 하려면 확인 하십시오. 5.1.5 단원에서 설명한 같은 PCR을 수행 합니다.
유비퀴틴 130 bp: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (청소) 역
Nox-4 159 혈압: TGGCACGGCATCAGTTATCA, 역 ACAGCGACTGTCATGTGGAA8 앞으로
제 76 혈압: ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, 역 GCCATTTTACAATCGCCACAA8 앞으로
Gst 156 혈압: GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, 역 TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8 앞으로
ApoIII 265 혈압: AGACTTGCACGCCATCAAGA, 역 TGCATGCTGTTTGTCACTGC8 앞으로
hemolin 267 혈압: CTCCCTCACGGAGGACAAAC, 역 GCCACGCACATGTATTCACC8 앞으로
gallerimycin 161 혈압: GAAGTCTACAGAATCACACGA, 역 ATCGAAGACATTGACATCCA8 앞으로
cecropin 158 혈압: CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, 역 GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8 앞으로
gloverin 101 혈압: GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, 역 CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8 앞으로
moricin 124 혈압: GCTGTACTCGCTGCACTGAT, 역 TGGCGATCATTGCCCTCTTT8전달) - 되도록 뇌관 효율성 평가 E = 2.
- 5-10 다른 긍정적인 샘플 (즉, 있는 뇌관 쌍 조사 필요로 하는 유전자를 표현 하는 샘플) 2 µ L 풀.
- 1:5 희석 시리즈 샘플 수영장의 준비: 표준 1 (S1): undiluted 수영장; S2: 2 µ L s 1 + 8 µ L nuclease 무료 물; S3: 2 µ L S2 + 8 µ L nuclease 무료 물; S4: 2 µ L s 3 + 8 µ L nuclease 무료 물.
- S1-S4 및 비-템플릿 제어 (nuclease 무료 물)의 1 µ L 96 잘 정량 접시에 적용 됩니다. 잘 당 RT 믹스의 0.1 µ L, nuclease 무료 물 3.7 µ L, 각 100 µ M 정방향 및 역방향 뇌관의 0.1 µ L, RT 마스터 믹스의 5 µ L를 추가 합니다.
- 양적 RT-PCR을 실행 (전사 역: 10 분, 초기 변성 50 ° C: 5 분 동안 95 ° C 변성: 95 ° C 10 s, 어 닐 링: 30 60 ° C s, 반복 변성 및 녹는 40 사이클 어 닐 링: 95 ° C, 차가운 4 ° c).
- 플롯의 S1-S4 (1, 0.2, 0.04, 0.008) 상대 단위10 로그 (x 축) 해당 ct 값 (y 축)에 대 한. 선형 회귀를 수행 하 고 표준 곡선의 기울기를 결정 합니다. E E = 10:-(1/slope)효율성을 계산 합니다. 20
참고:-3.32의 경사 이상적인 반응 조건 및 E = 2.00의 뇌관 효율을 나타냅니다. 이것은 의미 한다: PCR 제품의 금액을 각 주기 동안 두 배로.
- 소화 RNA의 사용 100 ng (100 ng / µ L) RT-PCR에 대 한 서식. 믹스 RT-PCR 시 약 및 실행된 RT-PCR에 언급 한 섹션 6.2 좋아. 가사 뇌관 쌍와 대상 뇌관 쌍 모든 박테리아 및 DPBS 관리 샘플을 측정 합니다. 항상 실행 S1-S4 희석 뇌관 쌍의 가사와 s 1-s 4 대상 뇌관 쌍 효율성 결정에 대 한 동일한 격판덮개에.
- 내부 관리와 대상 뇌관 쌍의 실험적 결정된 뇌관 효율성을 사용 하 여 다음 공식에 따라 RNA 유전자 발현의 비율 (R)을 계산 합니다. 정상화 박테리아 샘플 컨트롤20을 자극.
R: 비율
E대상: S1-4의 효율성 측정 대상 뇌관 쌍
E청소: 청소 뇌관 쌍 s 1-4의 효율성 측정
Δct대상(컨트롤-샘플): (DPBS 먹이 샘플의 ct)의 Δct-(박테리아 먹이 샘플의 ct) 측정 대상 뇌관 쌍
Δct가사(컨트롤-샘플): Δct (DPBS 먹이 샘플의 ct)의-가사 뇌관 쌍 (박테리아 먹이 샘플의 ct) 측정
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Representative Results
G. mellonella hemolymph 감염 모델에는 다양 한 병원 체의 독성 요인 분석에 널리 사용. 대부분 측정 애벌레 사망률은 매우 쉬운 방법의 분석을 포함 합니다. 그럼에도 불구 하 고,이 메서드는 일반적 면역 반응에 대 한 결론을 허용 하지 않습니다 고 척 추가 있는 면역 메커니즘 G. mellonella 면역 반응의 결과 연결. G. mellonella 구강 관리 모델 다른 한편으로 거의 사용 됩니다 구강 감염 또는 어려움 때문에 애벌레의 식민지에 대 한 정확한 감염 복용량9를. 또한, 약간 비 병원 성 박테리아 특히 포유류 장내 공생으로 G. mellonella 타고 난 면역 반응에 대 한 알려져 있다.
병원 체, 달리 공생 도전 호스트 및 트리거 면역 반응 하지만 호스트 면역 체계는 면역 항상성 유지 수 있다. G. mellonella 취소 초기 강제 세균 로드 될 때까지 마지막으로 박테리아 없음 감지 더 이상 (그림 2)8할 수 있다. 16 B. vulgatus 와 대장균 의 유전자 복사 숫자는 실질적으로 24 시간 내 감소.
우리 공생 관리 시연 다른 타고 난 면역 표식 유전자의 RNA 유전자 발현을 유도 하는 G. mellonella 애벌레: LPS 인식 분자-apolipophorin (ApoIII) 및 hemolin (그림 3A, B) 대장균에 높은 표현을 일반적으로 표시 했다-관리 B. vulgatus에 비해 애벌레-애벌레8관리. 또한, 항균 성 분자의 2 개의 종류의 마커 유전자 발현을 모니터링할 수 있습니다. B. 에 비해 강하게 대장균 강제로 따라 upregulated 되도록 하는 것을 설명 되었다는 Nos 와 Nox-4 유전자 발현의 측정에 의해 반응성 산소와 질소 종 (ROS/RNS)의 생산을 예상할 수 있는 vulgatus (그림 4A, B)8. 또한, (그림 4C) antioxidative Gst 의 유전자 발현에 관찰 될 수 있었다. 8
또한 우리는 다른 항균 성 펩 티 드 식 B. vulgatus 강제로에 대 한 응답 보다 대장균 관리 후 강한 유도 되었다 보였다. Defensin 같은 gallerimycin 펩 티 드, 상호 작용 하는 LPS gloverin 펩 티 드, cecropin 및 moricin (그림 5A, B, C, D)8의 upregulation을 관찰합니다.
그림 1 : Microsyringe 펌프를 사용 하 여 설치 프로그램을 강제로. 무뚝뚝한 끝난 바늘 박테리아의 정확한 주입을 허용 하는 microsyringe 펌프에 조정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 강제로 후 갤러리아 mellonella 애벌레에서 세균 부하의 지 속성. B. vulgatus-및 대장균의 숫자를 복사-특정 16s rDNA 유전자 5에서 결정 되었다 RT-PCR를 사용 하 여 다른 시간 지점에서 cDNA의 ng. 데이터 포인트는 중간의 표시와 함께 표시 됩니다. 참조 8에서에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : G. mellonella에 의해 박테리아의 차동 패턴 인식. 애벌레는 2 개의 다른 장 공생으로 관리 했다, RNA 격리 후 1-6 h 이었고 LPS 인식 분자 apolipophorin (ApoIII) (A)와 hemolin (B)의 mRNA 표정 결정 했다. 데이터 포인트 대표 기 의미 의미의 표준 오차 (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). 8 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 선생님 마커 유전자 발현 세균성 도전 후. 대장균 및 B. vulgatus 강제 되었고 시간이 지나면서 선생님 방어 마커 유전자 발현 분석. Nos (A), Nox-4 (B) 및 Gst (C) mRNA 식 절연된 애벌레 RNA 측정 되었다. 데이터 포인트 대표 기 의미 의미의 표준 오차 (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). 참조 8에서에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : G. mellonella 애벌레와 인간 상피 세포에 공생 유도 defensin 같은 항균 성 펩 티 드 식. 애벌레는 B. vulgatus 또는 대장균구두로 관리 되었다, 면역 반응 시간이 지남에 관찰 했다 그리고 RNA 애벌레 개인 으로부터 격리. gallerimycin (A), cecropin (B), gloverin (C), moricin (D) mRNA 식을 결정 했다. 데이터 포인트 대표 기 의미 의미의 표준 오차 (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). 참조 8에서에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
G. mellonella 모델은 조직의 감염 접근21세균 독성 요인 평가 하기 위해 자주 사용된 모델. 이후 많은 병원 균과 박테리아 구두 식민지 또는 감염 경로 통해 호스트를 입력, 새로운 통찰력 G. mellonella 구두 식민과 감염에 대 한 모델로 평가를 찾이 필요가 있다.
G. mellonella 15-37 ° C 사이 가능성은 큰 장점이 있기 때문에 대부분 포유류 모델 37 ° C5의 체온을 유지. G. mellonella 애벌레는 다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다 하지만 자신의 번 식 인구의 설립 방해는 분석 실험, 실험을 시작 하는 때 추정을 더 나은 하는 항생제의 부재 등 많은 이점을 제공 합니다. 공급 업체 제공 하지 않습니다 항상 애벌레 준비-사용 단계에서 스트레스 응답 교통 또는 온도 변화는 피할 수 있습니다 때문에. G. mellonella 의 온도 허용 오차 때문에 번 식을 수행할 수 있는 온도 범위가 높습니다. 빠른 발전 애벌레의 사육 온도 따라 이어질 높은 온도, 우리가 마지막 유 충 탈피를 달걀에서 수명 주기를 예측할 수 있습니다. 애벌레는 실험에 대 한 선정 됐다 때만 창백 하 고 빠른 속도로 움직이는 개인 모든 스트레스와 면역 반응 실험을 방해를 피하기 위해 선정 됐다.
Force-feeding 모델을 설정, 그것은 구두 응용 되었는지 보장 해야 합니다. 따라서, 강한 bromophenol 염료 강제로 위한 솔루션에 추가 되었습니다 몇 가지 실험을 설정 하는 데 도움이 했습니다. 이렇게 하면 어떤 부상된 애벌레를 제외 하 고 그들의 창 자22에서만 파란색 염료를 애벌레에 대 한 선택 됩니다.
이 모델을 사용 하 여, 우리는 G. mellonella 애벌레는 특정 마커 유전자의 타고 난 면역 반응 활동을 조사 하는 데 유용 발견. 구강 관리 모델의 설립과 면역 반응 속도 론 연구 하는 동안 우리는 유전자 발현은 midgut 로컬 표현 하지를 발견. 첫 번째 실험 재판 공생 박테리아의 구강 관리 후 midgut RNA를 추출 하는 결정적인 결과 제공 하지 않았다. 따라서, 면역 반응 전체 개인에서 "세계적 으로" 결정 했다. 이러한 결과 장 수용 체를 통해 세계 인식의 가설, 신호 및 extraintestinal 유전자 발현을 트리거링의 전송 지원. 일반적으로, G. mellonella 앰프 뚱뚱한 몸 주로 유도 수 이지만 hemocytes에9장 시스템 추가. 감염 후 G. mellonella 애벌레에 있는 항균 분자의 조직-특정 생산에 대 한 사용할 수 없는 정확한 정보 때문 전체 애벌레 RNA는 완전 한 개인에서 추출 하 고 RNA 유전자를 시 금 사용 식입니다. 전체 애벌레 RNA 추출의 추가 이점은 내부 용기 및 세균성 부하 계량 가능성 살아있는 박테리아의 완전 한 제약 이다. 소화 관의 해 부 준비 때문에 박테리아의 손실 될 수 있습니다.
이후 대부분의 G. mellonella 연구 세균 독성 특성에서 수행 됩니다 특히 if를 어떻게 애벌레 포유류 microbiota의 일부인 비 병원 성 세균으로 면역 반응 하는 것이 있었습니다. 최근에, 우리는 동종는 타고 난 면역 반응의 유사한 구성 요소를 공유 하는 G. mellonella 및 포유류와 진화 보존을 보였다. 질소 oxid synthase (Nos) 및 NADPH 산화 효소 (Nox) 유전자 유사성8의 고차를 공유합니다. G. mellonella 항구 더는 포유류 β-defensin 2 구조적 유사성을 공유 defensin 같은 항균 성 펩 티 드 gallerimycin8.
구강 관리 모델을 사용 하 여 항 염증 공생 B. vulgatus 또는 프로-염증 성 pathobiotic 대장균의 차동 세균성 인식을 보여주 가능 했다. 또한 다운스트림 산화 스트레스 반응과 항균 성 펩 티 드 생산 높은 대장균 관리 B. vulgatus 관리8에 비해 후 유도 했다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 DFG (SPP1656), DFG 연구 훈련 그룹 1708, Bundesministerium 위한 Bildung und Forschung (BMBF) 독일 센터에 의해 감염 연구 (DZIF)에 대 한 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
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