In vivo tredimensionell två-Photon mikroskopi att studera genomförda vaskulära svar av lokala ATP utmatning med hjälp av en glas mikro-pipett
Summary
Vi presenterar en optimerad lokal utmatning förfarande med hjälp av en glas mikro-pipett och en snabb två-Photon hyperstack Imaging metod, som möjliggör exakt mätning av kapillär diameter förändringar och utredning av dess reglering i tre dimensioner.
Abstract
Underhåll av normal hjärnfunktion kräver en tillräcklig och effektiv tillförsel av syre och näring genom ett komplext nätverk av fartyg. Emellertid, regleringen av cerebralt blodflöde (CBF) är ofullständigt förstås, särskilt på kapillär nivå. Två-Photon mikroskopi är ett kraftfullt verktyg som ofta används för att studera CBF och dess reglering. För närvarande är detta område begränsas av avsaknaden av in vivo två-Photon mikroskopi studier undersöker (1) CBF svar i tre dimensioner, (2) utfört vaskulära svar, och (3) lokaliserade interventioner inom det vaskulära nätverket. Här beskriver vi en 3D in vivo metod med hjälp av två-Photon mikroskopi att studera genomförda vaskulära svar framkallade av lokala utmatning av ATP med en glas mikro-pipett. Vår metod använder snabb och repetitiv hyperstack två-Photon Imaging ger exakta diameter mätningar av maximal intensitet projektion av de erhållna bilderna. Dessutom visar vi att denna metod kan också användas för att studera 3D astrocytic kalcium svar. Vi diskuterar också fördelar och begränsningar av glas mikro-pipett insättning och två-Photon hyperstack Imaging.
Introduction
Hjärnan har en hög energiförbruknings takt. Om 20% av syre och 25% av glukos som förbrukas av den mänskliga kroppen är dedikerade till hjärnans funktion, medan hjärnan bara upptar 2% av den totala kroppsmassan. Underhåll av normal hjärnfunktion kräver en tillräcklig och effektiv tillförsel av syre och näring genom blodflödet i ett komplext nätverk av fartyg. Lokal hjärnaktivitet och cerebralt blodflöde (CBF) är robust kopplade, beroende på de funktionella egenskaperna hos nervceller, astrocyter, pericyter, glatta muskelceller (SMCs) och endotelceller (ECs)1. Nyligen, de första order av kapillärer förgrening från penetrerande arterioler har dykt upp som en “hotspot”2, visar aktiv reglering av kapillär blodflöde. En långsam genomfört vaskulär respons (CVR) upptäcktes vid denna “hotspot” i mus somatosensorisk cortex under både morrhår stimulering och lokal ejektion (puffing) av ATP med ett glas mikro-pipett3.
Även in vivo Imaging av två-Photon laserskanning fluorescerande mikroskopi har använts i stor utsträckning för att studera neurovaskulära reaktioner i hjärnbarken, de flesta av studierna mätt blodkärlens diametrar och undersökte deras reglering i en tvådimensionellt (2D) x-y-plan. Utmaningarna är: för det första, cerebrala blodkärl och deras omfamna astrocyter, pericyter och SMCs konstruera grenar i tre dimensioner (3D). Det är därför viktigt att studera deras interaktioner i 3D. För det andra, även en liten mängd avdrift i fokus kommer att påverka den exakta mätningen av både fartygs diameter och cellulära fluorescerande signaler. Slutligen, CVRs är snabba och långtgående i tre dimensioner. 3D-volymskanning är optimalt för att upptäcka CVRs och avslöja deras mekanismer. Vi genomförde en piezo motor mål i en två-Photon Mikroskop för att studera mus somatosensorisk cortex in vivo, vilket gör exakta diameter mätningar av maximal intensitet projektioner av de erhållna bilderna.
Mikropipetter av glas har ofta använts för in vivo Hjärnstudier, till exempel för att bulk-load organiska färgämnen4, rekord EEGs5 och för patch fastspänning6. Icke desto mindre kvarstår begränsningarna. Vanligtvis är spetsen på glasmikropipetten exakt placerad, eller mikropipetten används inte för lokala ingrepp. Här har vi optimerat förfarandet för mikro-pipettinsättning och lokal utmatning.
Dessutom, kombinationen av 3D två-Photon mikroskopi och genetiskt kodade fluorescerande indikatorer ger en oöverträffad möjlighet att undersöka neurovaskulär koppling i en 3D-scope. I denna studie, vi drog fördel av detta och injicerade virala vektorer som transporterar astrocytmodell specifika genetiskt kodade kalcium indikatorer i musen somatosensoriska cortex. Astrocyter samt kärl diametrarna avbildades samtidigt genom att kombinera olika fluorescerande markörer.
Sammantaget presenterar vi en optimerad metod för lokal utmatning (puffing) med glas mikro-pipett och snabb två-Photon hyperstack Imaging, som möjliggör exakt mätning av kapillär diameter förändringar. Dessutom ger vår metod ett nytt verktyg för att samtidigt studera 3D-profiler av ca2 + svar i astrocyter och vaskulär diameter svar.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utmaning för vaskulära studier är den exakta mätningen av fartygs diametrarna. Den metod som vi beskriver här används en motoriserad piezo mål att göra snabba och repetitiva hyperstack Imaging av två-Photon mikroskopi. För det första, denna metod tillåter upprepade undersökningar av penetrerande arteriole, 1St ordning och 2nd order kapillärer utan förlust av fokus och ledde till upptäckten av långsamt genomförda vaskulära svar i kapillärer in vivo. För det andra, i kombinatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Lundbecks stiftelse, NOVO-nordisk stiftelse, Danmarks oberoende forskningsråd | Medicinska vetenskaper och NORDEA Foundation Grant till centrum för hälsosamt åldrande.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
