Summary
Wir präsentieren ein optimiertes lokales Auswurfverfahren mit einer Glas-Mikropipette und einem schnellen Zwei-Photon-Hyperstack-Bildgebungsverfahren, das eine präzise Messung von Änderungen des Kapillardurchmessers und die Untersuchung seiner Regulierung in drei Dimensionen ermöglicht.
Abstract
Die Aufrechterhaltung der normalen Gehirnfunktion erfordert eine ausreichende und effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Ernährung durch ein komplexes Netzwerk von Gefäßen. Die Regulierung des zerebralen Blutflusses (CBF) ist jedoch unvollständig verstanden, insbesondere auf Kapillarebene. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig zur Untersuchung von CBF und seiner Regulierung eingesetzt wird. Derzeit ist dieses Feld durch den Mangel an in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie-Studien begrenzt, die (1) CBF-Antworten in drei Dimensionen untersuchen, (2) vaskuläre Reaktionen und (3) lokalisierte Interventionen innerhalb des Gefäßnetzwerks durchführen. Hier beschreiben wir eine 3D-in-vivo-Methode, die die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um durchgeführte Gefäßreaktionen zu untersuchen, die durch den lokalen Auswurf von ATP mit einer Glasmikropipette ausgelöst wurden. Unsere Methode verwendet schnelle und sich wiederholende Hyperstack-Zwei-Photon-Bildgebung, die präzise Durchmessermessungen durch maximale Intensitätsprojektion der erhaltenen Bilder ermöglicht. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Methode auch verwendet werden kann, um 3D-astrozytische Kalzium-Antworten zu untersuchen. Wir besprechen auch die Vorteile und Grenzen des Einsetzens von Mikropipetten aus Glas und der Zwei-Photonen-Hyperstack-Bildgebung.
Introduction
Das Gehirn hat eine hohe Energieverbrauchsrate. Etwa 20% des Sauerstoffs und 25% der Glukose, die vom menschlichen Körper verbraucht wird, sind der Gehirnfunktion gewidmet, während das Gehirn nur 2% der gesamten Körpermasse einnimmt. Die Aufrechterhaltung der normalen Gehirnfunktion erfordert eine ausreichende und effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Ernährung durch Dendurchfluss in einem komplexen Netzwerk von Gefäßen. Lokale Gehirnaktivität und zerebraler Blutfluss (CBF) sind robust gekoppelt, abhängig von den funktionellen Eigenschaften von Neuronen, Astrozyten, Pericyten, glatten Muskelzellen (SMCs) und Endothelzellen (ECs)1. Kürzlich haben sich die ersten Aufträge von Kapillaren, die von durchdringenden Arteriolen verzweigen, als "Hotspot" 2 herauskristallisiert,dereine aktive Regulierung des Kapillarblutflusses zeigt. An diesem "Hotspot" im somatosensorischen Kortex der Maus wurde sowohl bei der Whiskerstimulation als auch bei der lokalen Auswurfung (Puffing) von ATP mit einer Glasmikropipette3eine langsam durchgeführte Gefäßreaktion (CVR) entdeckt.
Obwohl die In-vivo-Bildgebung mittels zwei photonenlaserscanning-Fluoreszenzmikroskopie weit verbreitet ist, um neurovaskuläre Reaktionen in der Großhirnrinde zu untersuchen, wurden in den meisten Studien Blutgefäßdurchmesser gemessen und ihre zweidimensionale (2D) x-y-Ebene. Die Herausforderungen sind: Erstens bauen zerebrale Blutgefäße und ihre umarmenden Astrozyten, Pericyten und SMCs Zweige in drei Dimensionen (3D). Es ist daher wichtig, ihre Wechselwirkungen in 3D zu untersuchen. Zweitens wird schon eine geringe Menge an Drift im Fokus die genaue Messung sowohl der Gefäßdurchmesser als auch der zellulären Fluoreszenzsignale beeinflussen. Schließlich sind CVRs schnell und weitreichend in drei Dimensionen. Das 3D-Volumenscannen ist optimal für die Erkennung von CVRs und die Enthüllung ihrer Mechanismen. Wir implementierten ein Piezo-Motorobjektiv in einem Zwei-Photonen-Mikroskop, um den somatosensorischen Kortex der Maus in vivo zu untersuchen, wodurch präzise Durchmessermessungen durch maximale Intensitätsprojektionen der erhaltenen Bilder ermöglicht wurden.
Glas-Mikropipetten wurden häufig für in vivo Gehirnstudien verwendet, z.B. zum Massenladen organischer Farbstoffe4, Aufzeichnung EEGs5 und zum Patch-Spannen6. Dennoch bleiben Einschränkungen bestehen. Üblicherweise wird die Spitze der Glas-Mikropipette ungenau platziert, oder die Mikropipette wird nicht für lokale Eingriffe verwendet. Hier haben wir das Verfahren des Einsetzens von Mikropipetten und des lokalen Auswurfs optimiert.
Darüber hinaus bietet die Kombination aus 3D-Zweiphotonenmikroskopie und genetisch kodierten Fluoreszenzindikatoren eine beispiellose Möglichkeit, neurovaskuläre Kopplung in einem 3D-Bereich zu untersuchen. In dieser Studie nutzten wir dies und injizierten virale Vektoren, die astrozytenspezifische genetisch kodierte Kalziumindikatoren in den somatosensorischen Kortex der Maus trugen. Astrozyten sowie Gefäßdurchmesser wurden gleichzeitig durch die Kombination verschiedener fluoreszierender Marker abgebildet.
Insgesamt präsentieren wir eine optimierte Methode des lokalen Auswurfs (Puffens) durch Glas-Mikropipette und schnelle Zwei-Photonen-Hyperstack-Bildgebung, die eine präzise Messung von Kapillardurchmesseränderungen ermöglicht. Darüber hinaus bietet unsere Methode ein neuartiges Werkzeug, um gleichzeitig 3D-Profile von Ca 2+-Antworten in Astrozyten und Gefäßdurchmesserreaktionen zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren, an denen Tiere beteiligt waren, wurden von der dänischen Nationalen Ethikkommission gemäß den Leitlinien des Übereinkommens des Europäischen Rates zum Schutz von Wirbeltieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, genehmigt. den ARRIVE-Richtlinien entsprachen. Dies ist ein terminales Verfahren, bei dem die Mäuse vor der Anästhesie-Wiederherstellung eingeschläfert werden.
1. Prächirurgische Präparation
- Reinigen Sie den OP-Tisch und die umgebung mit 70% Ethanol. Reinigen und trocknen Sie die chirurgischen Werkzeuge vor der Operation gründlich.
- Anästhetisieren Sie eine NG2DsRed Maus (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; beide Geschlechter; 4-8 Monate alt) durch eine peritoneale Injektion von Ketamin + Xylazin (60 mg/kg + 10 mg/kg) gelöst in sterilisiertem Wasser, pH 7,4. Verabreichen Sie zusätzliche Dosen von Ketamin (30 mg/kg) alle 25 min bis zum Abschluss des chirurgischen Eingriffs. Überprüfen Sie regelmäßig Die Reflexe des Schwanzes und der Zehenkneifen, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen.
- Injizieren Sie Saline subkutan an vier verschiedenen Stellen auf der Rückseite der Maus für ein Gesamtvolumen von 1 ml, um Austrocknung während des Experiments zu verhindern. Um die Augen vor dem Austrocknen zu schützen, tragen Sie Augenschmiermittel auf. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37 °C mit einer rektalen Temperatursonde und einer Heizdecke.
2. Chirurgischer Eingriff
- Tracheotomie
- Legen Sie die Maus auf den Rücken. 0,04 ml 0,5% Lidocain subkutan unter dem geplanten Schnitt injizieren und 2 min. 2 min. Einen 10 mm langen Schnitt über dem Brustknochen (Manubrium) machen. Trennen Sie die submandibulären Drüsen und SternothyreoseMuskeln, und dann die Luftröhre aussetzen.
- Machen Sie Tracheostomie zwischen zwei Trachealringen mit Schere. Legen Sie ein kleines Metallrohr mit einer Länge von 16,2 mm und einem Durchmesser von 1 mm in die Luftröhre ein. Schließen Sie das Rohr an ein mechanisches Beatmungsgerät und einen Capnographan an, um das endexpiratorische CO2 zu überwachen (Abbildung 1A).
- Kathetereinfügung
- 0,5% Lidocain (0,04 ml) subkutan unter dem geplanten Schnitt injizieren und 2 min warten.
- Mit feinen Spitzenzangen trennen Sie die Arterie sanft von der Vene. Stoppen Sie den Blutfluss stromaufwärts mit einer mikrovaskulären Klemme. Verengen Sie den Blutfluss flussabwärts mit einer 10-0 Nylon-Nähte, die beide Blutgefäße ligan.
- Verwenden Sie mikrosezierende Scheren, um einen kleinen Schnitt sowohl in der Arterie als auch in der Vene zu machen. Setzen Sie Kunststoffkatheter in beide Blutgefäße ein. Sichern Sie die Katheter durch Anziehen der Nähte (8-0 oder 10-0 Nylonnähte abhängig von der Gefäßgröße) ohne Kompromisse bei Katheterlumen. Entfernen Sie die mikrovaskuläre Klemme und schließen Sie die Haut.
- Überwachen Sie den Blutdruck über den arteriellen Katheter. Messen Sie die Werte der Blutgase in arteriellen Blutproben (50 l) vor und nach jedem Experiment (Normalwerte: pO2, 90-120 mmHg; pCO2, 35-40 mmHg; pH, 7,25-7,45) mit einem Blutgasanalysator. Verwenden Sie den Venenkatheter zur Infusion von Fluorescein und Anästhesie.
- Kraniotomie
- Rasieren Sie das Fell vom Kopf der Maus zwischen den Ohren. 0,04 ml 0,5% Lidocain subkutan unter dem geplanten Schnitt injizieren und 2 min warten.
- Wischen Sie den Schädel mit einer 10% Eisen-Chlorid-Lösung, um das Periost zu entfernen. Spülen Sie den Schädel gründlich mit Derinline. Kleben Sie eine Metallkopfstange mit Cyanoacrylatkleber und Aktivator an den Schädel (Abbildung 1A).
HINWEIS: Die Metallkopfstange ist 75 mm lang und 13,5 mm breit, mit einem runden Loch von 5 mm Durchmesser in der Mitte. - Bohren Sie eine Kraniotomie mit 4 mm Durchmesser, zentriert bei 0,5 mm hinter und 3 mm rechts neben dem Bregma über den rechten Sinnesfass-Kortex. Entfernen Sie die Dura mit einem Feinspitzen-Gefäßdilatator.
- Bedecken Sie den exponierten Kortex mit 0,75% Agarosegel, gelöst in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF; pH = 7,4) und auf 35 °C abgekühlt. Abdeckung 80-90% der Kraniotomie mit einem Glasdeckel in einem Winkel von 10-15° zur Metallkopfstange (Abbildung1B), die das Einsetzen und Platzieren der Glas-Mikropipette ermöglicht.
- Um die Pulsation des Gehirns zu minimieren, kleben Sie die beiden Ecken der Glasabdeckung mit Cyanoacrylatkleber und Aktivator auf die Metallkopfstange. Tragen Sie den Aktivator sorgfältig auf, um zu verhindern, dass er auf das exponierte Gehirn kommt. Spülen Sie den geklebten Glasdeckel anschließend gründlich mit Derinline.
- Führen Sie das Einführen der Whisker Pad Stimulationsonde durch. Legen Sie einen Satz von maßgeschneiderten bipolaren Elektroden (8 mm Länge und 0,25 mm Dicke) perkutan in die linke Seite des Gesichts, um die Ramus-Infraorbitalis des trigeminalen Nervs kontralateral zur Kraniotomie zu stimulieren. Positionieren Sie die Kathode in der Nähe der Pause infraorbitalis, und legen Sie die Anode in die Kaumuskeln7. Führen Sie die Stimulation mit einem elektrischen Stimulator mit einer Intensität von 1,5 mA für 1 ms in Zügen von 20 s bei 2 Hz durch.
- Nach Abschluss der Operation einen Bolus von 0,05 ml Fluorescein Isothiocyanat-Dextran (FITC-Dextran, 4% w/v, Molekulargewicht [MW] 50.000) in die femorale Vene geben, um das Blutplasma zu kennzeichnen. Ketamin absetzen und die Anästhesie auf eine kontinuierliche intravenöse Infusion von Chloralose (17% w/v, Endkonzentration) gemischt mit FITC-Dextran (2% w/v, Endkonzentration) bei 0,02 ml/10 g/h umstellen. Warten Sie etwa eine halbe Stunde auf die Stabilisierung des neuen Anästhesiezustand.
HINWEIS: Sowohl FITC-Dextran als auch S-Chloralose werden in 0,9% Salzsäure gelöst.
3. Erste Zwei-Photonen-Bildgebungssitzung
- Übertragen Sie die Maus auf die Bühne eines kommerziellen Zwei-Photonen-Mikroskops (Tabelle der Materialien). Unter sowohl rotem fluoreszierendem Protein (RFP, Abbildung 1C) als auch grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP, Abbildung 1C)modisch der Epifluoreszenzbeleuchtung, machen Sie ein Bild des exponierten Kortex mit einem 5-fachen Objektiv. Verwenden Sie das RFP-Bild als "Karte" zum Einfügen der Glas-Mikropipette in der nächsten Sitzung.
HINWEIS: Die GFP-Karte wird verwendet, um Venen/Venen von Arterien/Arteriolen zu unterscheiden. - Führen Sie zwei Photonenaufnahmen mit dem Zwei-Photonen-Mikroskop und einem 25x 1,0 numerischen Blende (NA) Wasser-Immersion-Objektiv mit Piezomotor durch. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 900 nm ein. Durchsuchen Sie den Kortex und folgen Sie jeder durchdringenden Artebole und finden Sie ihre horizontalen Zweige (1. Ordnung Kapillaren).
- Bild durchdringende Arterioles und ihre 1. Ordnung Kapillaren in Ruhe und während Derwhisker Pad Stimulation. Siehe die detaillierten Abbildungsparameter in Abschnitt 5.
- Markieren Sie Positionen von Kapillaren 1. Ordnung mit >5% Vasodilatation während der Whisker-Pad-Stimulation auf der RFP -Karte (Abbildung 1C). Standorte mit <5% Vasodilatation werden als außerhalb der Whisker-Fass-Kortex-Region betrachtet.
HINWEIS: Wenn im Experiment Wildtypmäuse anstelle von NG2DsRed-Mäusen verwendet werden, wird das GFP-Bild stattdessen als "Karte" verwendet.
4. Einsetzen der Glas-Mikropipette
- Bereiten Sie Glas-Mikropipetten zum Puffen mit einem Pipettenzieher(Materialtabelle). Die Glas-Mikropipetten haben einen Widerstand von 3-3,5 M' und eine Verjüngungslänge von 4,5-5 mm. Laden Sie eine Pipette mit einer Mischung aus 1 mM ATP und 10 m Alexa 594, um die Pipettenspitze unter der Epi-Leuchtstofflampe und dem Zwei-Photon-Mikroskop zu visualisieren.
- Montieren Sie die Glas-Mikropipette auf einen Patch-Klemmenhalter und schließen Sie sie an eine Luftpumpe an. Stellen Sie den Haltedruck der Pumpe auf 0 psi ein.
- Mit roter Epifluoreszenzbeleuchtung konzentrieren Sie sich mit dem 5x Objektiv auf die Pipettenspitze. Legen Sie die Glas-Mikropipette in das aCSF über der Agarose. Stellen Sie den Haltedruck der Luftpumpe auf 0,2 psi ein. Eine kleine rote Wolke kann beobachtet werden, die aus der Pipettenspitze im aCSF ausgeworfen wird. Dadurch soll eine Verstopfung beim Einsetzen der Pipetten verhindert werden.
- Wählen Sie eine der markierten Positionen in der RFP-Karte als Ziel aus. Bewegen Sie die Pipettenspitze mit einem Abstand von 30 m auf die horizontale Ebene der Abdeckungsglaskante, die in etwa auf das Ziel in der x-y-Ebene zeigt.
- Senken Sie die Pipettenspitze vorsichtig in z-Achse unter dem Deckelglasschlupf. Dann beginnen Sie, die Glaspipette in Richtung des Ziels bis zu 500 m über der Hirnoberfläche vorzutreiben. Wechseln Sie häufig den Fokus zwischen der AbdeckungGlaskante, der Pipettenspitze und der Gehirnoberfläche, um sicherzustellen, dass genügend freier Platz für die Verlegung der Pipette vorhanden ist.
- Schalten Sie das Ziel auf 25x. Zentrieren Sie die Pipettenspitze neu und bringen Sie die Pipettenspitze weiter in Richtung Ziel auf der RFP -Karte vor. Bewahren Sie die Pipettenspitze in der Agaroseschicht auf.
- Wenn sich die Pipettenspitze über der Hirnoberfläche befindet, schalten Sie den Bildgebungsmodus auf zwei Photonenmikroskopie um. Konzentrieren Sie sich auf eine Zielposition, an der Puff. Notieren Sie sich die x-, y-Koordinaten (x0, y0) und ihre Tiefe unter der Oberfläche (z0). Berechnen Sie die Koordinaten der Einfügemarke auf der Hirnoberfläche (xi, yi) wie folgt:
xi = x0 + z0 / tan
yi = y0
wobei der Winkel zwischen dem Pipettehalter und der horizontalen Ebene ist. - Positionieren Sie die Pipettenspitze zu den Koordinaten (xi, yi) auf der Gehirnoberfläche. Legen Sie die Pipette vorsichtig und langsam ein, bis sie erreicht ist (x0, y0, z0). Wenn sich ein Gefäß einem Einfügepfad im Weg befindet, ziehen Sie die Pipette zurück, und berechnen Sie andere Einfügekoordinaten und den Pfad neu. oder drehen Sie die Bühnenplatte leicht (wie in Abbildung 1Aangegeben).
- Stellen Sie den Haltedruck der Pumpe auf 0 psi und den Auswurfdruck auf 10-15 psi ein. Puff ATP für 200-400 ms am Zielort während der Zwei-Photon-Bildgebung. Passen Sie den Druck und die Dauer des Puffens für jede Pipette und im Laufe der Zeit an, wie im Diskussionsteil erläutert.
5. Hyperstack Zwei-Photon-Bildgebung
- Führen Sie Experimente mit dem Zwei-Photonen-Mikroskop und einem 25 x 1,0 NA-Wasser-Immersion-Objektiv mit Piezomotor durch. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 900 nm ein. Filtern Sie das emittierte Licht, um rotes Licht von DsRed (Pericyten)/Tetramethylrhodamine Isothiocyanat-Dextran (TRITC-dextran) zu sammeln, das Blutplasma und grünes Licht aus FITC-Dextran (Blutplasma)/GCaMP6 (GFP, astrozytisches Kalzium) färbt.
- Produziere einen hochauflösenden Z-Stack an der Ortung von Interesse, der eine durchdringende Arteriole, eine 1. Kapillare 1. Ordnung, eine 2 nd-Kapillare und möglicherweise benachbarte Fluoreszenzzellen (z. B. Pericyte, Astrozyten) enthält. Bestimmen Sie das x*y*z Volumen der Hyperstack-Bildgebung, indem Sie die 3D-Struktur der Blutgefäße so weit wie möglich einbeziehen. Die Gesamthöhe jedes Stapels kann zwischen 30 und 50 m variieren, während die x-y-Ebene ungefähr eine Fläche von 60 x 40 m abdeckt.
- Stellen Sie den Bildstapel in der Bildverarbeitungssoftware ein, der aus 8-10 Ebenen mit einem Abstand zwischen den Ebenen von 4-5 m besteht. Das Piezo-Motor-Objektiv stoppt auf jeder Ebene auf der Z-Achse, um das Bild jeder Ebene zu erfassen. Die Abtastrate beträgt 1 s pro Stapel und die Pixelauflösung in der x-y-Ebene beträgt 0,2-0,3 m (Abbildung 2A). Eine Aufnahme enthält normalerweise 10 Pre-Puff-Bildstapel und 150 Post-Puff-Bildstapel.
6. Datenverarbeitung
- Verarbeiten Sie Daten mit maßgeschneiderter Analysesoftware. Flatten Sie jeden Bildstapel durch maximale Intensitätsprojektion in ein Bild (Abbildung2B). Zeichnen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI) mit einer Breite von 3 m senkrecht über das Gefäß von Interesse (Abbildung 2C).
- Um Interferenzen durch Schatten roter Blutkörperchen und durch kleinere Schwingungen des Kortex zu minimieren, durchschnittlich den rechteckigen ROI, indem Sie ihn in eine Linie projizieren, die dann das durchschnittliche Profil des Gefäßsegments darstellt. Tun Sie dies für jedes Bild mit maximaler Intensität.
- Zeichnen Sie die Profillinien als 2D-Bild mit der x-Achse, die Bilder mit maximaler Intensität in chronologischer Reihenfolge darstellt (Abbildung2D, Oberteil). Verwenden Sie einen aktiven Konturalgorithmus (Chan-Vese-Segmentierung), um die Kanten des Gefäßes8,9 (angezeigt durch rote Kurven; Abbildung 2 D, obere Platte).
- Berechnen Sie den Zeitverlauf des Durchmessers ändert sich als die Differenz zwischen den Rändern des Blutgefäßes (vertikaler Abstand zwischen der oberen und unteren roten Kurve in Abbildung 2D, untere Platte). Normalisieren Sie Durchmesseränderungen in Vorpuffungsdurchmesser Und Diagrammkurven des Durchmessers ändern sich im Laufe der Zeit. Tun Sie dies für jeden ROI (Abbildung 2E).
- Die Gefäßantwortamplitude ist definiert als die höchste/niedrigste Peak-Amplitude nach dem Puffen. Die Antwortlatenz ist definiert als die Latenz der halbmaximalen Amplitude (Abbildung 2G). Verfolgen Sie manuell die skelettierte Gefäßstruktur, indem Sie Knoten entlang der Gefäße platzieren (Abbildung 2F) und die geografische Entfernung zwischen jedem ROI und dem eindringenden Arteriol messen. Berechnen Sie die CVR-Geschwindigkeit, indem Sie die Entfernungen durch Latenzunterschiede dividieren.
7. Virale Vektorinjektion
- Um gleichzeitig astrozytische Kalziumreaktionen zu untersuchen, injizieren Sie ein Volumen von 0,6 l viralen Vektor (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) in den somatosensorischen Kortex von NG2DsRed Mäusen, nach dem standard stereotaktischen viralen Vektorinjektionsverfahren 10.
- Nach drei Wochen drücken Astrozyten in maussomatosensorischem Kortex den genetisch kodierten Kalziumindikator GCaMP6f aus. Folgen Sie dem oben genannten chirurgischen Verfahren und der Zwei-Photon-Bildgebung für Mäuse. Um zwischen Astrozyten und Gefäßlumina zu unterscheiden, wird TRITC-dextran anstelle von FITC-dextran verwendet, um Gefäßluminarot zu färben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach Abschluss der Operation wurden die Mäuse zum Zwei-Photonen-Mikroskop transportiert (Abbildung 1A). Eine Glas-Mikropipette mit 1 mM ATP wurde in der Nähe des Zielblutgefäßes am Zielort eingesetzt (Abbildung 1B).
Wir führten Hyperstack-Bildgebung durch, während wir einen Puff von 1 mM ATP gaben (Abbildung 2A, Ergänzendes Video 1). Jeder Bildstapel wurde durch maximale Intensitätsprojektion auf ein Bild abgeflacht (Abbildung 2B). Rechteckige ROIs wurden senkrecht über das Gefäß gelegt, um die Änderung des Gefäßdurchmessers beim ATP-Puffen zu messen (Abbildung 2C). Die Gefäßdurchmesser wurden mit Hilfe der Chan-Vese-Segmentierung gemessen (Abbildung 2D). Bei einzelnen Puffaufnahmen wurden normalisierte Durchmesseränderungen bei jedem ROI überlagert, um die Antworten verschiedener Gefäßsegmente zu vergleichen (Abbildung 2E). Der Abstand von jedem ROI zur durchdringenden Arteriole wurde durch Handzeichnung des Gefäßskeletts (Abbildung2F) berechnet. Amplituden und Latenzen der Dilatation und Verengung bei jedem ROI in einzelnen Puffaufnahmen wurden über die berechneten Entfernungen von den ROIs zur durchdringenden Arteriole geplottet (Abbildung 2H-K). Vasodilatation beim Puffen vermehrt sich linear mit einer Geschwindigkeit von 14,69 m/s (vorgelagert) und von 2,8 m/s (nachgeschaltet), beginnend mit der Kreuzung von Kapillaren der 1. und 2. Ordnung (Abbildung 2H). Die Vasokonstriktion breitete sich auch linear bei 3,92 m/s aus, ausgehend von der eindringenden Arteriole (Abbildung 2I). Die maximale Amplitude sowohl der Vasodilatation als auch der Vasokonstriktion trat in 1. Capillarenauf (Abbildung 2J-K).
Darüber hinaus wurden die Kombination von astrozytenspezifischen viralen vektortragenden fluoreszierenden Kalziumindikatoren und zwei photonen Hyperstack-Bildgebungen, astrozytären Kalziumreaktionen auf ATP-Puffing untersucht (Abbildung 3A, Ergänzendes Video 2 ). Rechteckige ROIs wurden an astrozytischen Somata und Prozessen platziert. ATP induzierte einen Anstieg des intrazellulären Kalziums in astrozytischen Prozessen, aber nicht in Astrozytensomata (Abbildung 3B).
Abbildung 1 : Diagramm der in vivo Zwei-Photonen-3D-Bildgebung und Glas-Mikropipette Puffing. (A) Die anästhesierte Maus wird kopffixiert an einer Metallstange befestigt und mechanisch belüftet. Endgezeiten-CO2 wird von einem Kapnographen überwacht. Sowohl Whisker Pad Stimulation und Mikro-Pipetten-Puffing werden verwendet, um Gefäßdurchmesser Änderungen zu induzieren. Der Glas-Mikropipettenhalter ist auf der Bühnenplatte montiert. Die Oberschenkelarterie und Vene werden katheterisiert, um Blutdruck und Blutgase zu überwachen und Anästhesie bzw. Fluorescein zu infundieren. (B) Der Glasdeckel bedeckt die Kraniotomie in einem Winkel, der eine freie Bewegung der Pipette ermöglicht. Die puffende Mikropipette befindet sich in der Nähe einer durchdringenden Arteriole und ihrer Kapillaren und enthält eine Mischung aus 10 M Alexa 594 (rote Farbe in Glas-Mikropipette) und 1 mM ATP. Die Zwei-Photonen-Bildgebung ist ein schnelles und sich wiederholendes 3D-Volumenscannen, das die durchdringende Arteriole und die ersten Kapillaren der ersten Ordnung sowie benachbarte Astrozyten und Pericyten umfasst. (C) Repräsentative Bilder von rotem fluoreszierendem Protein (RFP) und grünem Fluoreszenzprotein (GFP) mit Epifluoreszenzbeleuchtung werden gezeigt. Sie werden als "Karten" beim Einstecken der Pipetten verwendet. Rote Kreise markieren Positionen von Kapillaren 1. Ordnung mit >5% Vasodilatation während der Whisker-Pad-Stimulation. Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : ATP-Puffing durch Mikropipette induziert Gefäßdilatation, gefolgt von Verengung. (A) Kaskade von Ebenen in einem repräsentativen Bildstapel einschließlich durchdringender Arteriole und 1. und 2. Ordnung Kapillaren. Pericyte sind mit einem roten Fluorophor (NG2-DsRed) und das Behälterlumen mit FITC-Dextran (grün) gekennzeichnet. (B) Maximale Intensitätsprojektion des Bildstapels. (C) Mehrere eindeutig farbige Interessengebiete (ROIs) senkrecht über die Gefäße gelegt, um den Gefäßdurchmesser zu messen. (D) Obere, repräsentative fluoreszierende Intensität im Laufe der Zeit beim dunkelblauen ROI von Panel C. Die beiden roten Kurven definieren die Kanten der Gefäßwand. Der vertikale Abstand zwischen den beiden roten Kurven ist der Gefäßdurchmesser und wird als Funktion der Zeit (unten) angezeigt. (E) Normalisierte Durchmesseränderungen im Laufe der Zeit bei jedem ROI als Reaktion auf 1 mM ATP Puffing. Die Messungen basieren auf einem einzigen Experiment. (F) Das Gefäßskelett wurde manuell durch Platzieren von Knoten entlang der Gefäße zurückverfolgt. (G) Amplituden der Dilatation bzw. Verengung wurden während der Aufnahmesitzung als maximal positive bzw. negative vaskuläre Reaktion definiert. Die Latenz von Dilatationen und Verengungen wurde als Zeit bis zur Hälfte positiven oder negativen Maximum nach Puffing Beginn berichtet. (H-K) Graphen zeigen die Latenz der Dilatation (H), die Latenz der Verengung (I), die Amplitude der Dilatation (J), und die Amplitude der Verengung (K) aller ROIs, die in Panel C gezeigt werden, im Vergleich zur Entfernung jedes ROI von der durchdringende Arteriole. Die gestrichelten Linien stellen die lineare Anpassung vor- und nachgelagerter leitfähiger Reaktionen dar. p.a.: durchdringende Arteriole. Maßstabsleiste: 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : ATP-Puffing durch Mikropipette induziert astrozytische Kalziumaktivitäten. (A) Astrozytäre virale Vektoren, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator tragen, wurden drei Wochen vor dem experimentellen Verfahren in den somatosensorischen Kortex der Maus injiziert. Das Bild zeigt Gefäßlumina mit TRITC-Dextran (rot) und astrozytischem Kalzium in Grün. (B) Mehrere ROIs werden an astrozytischen Somata und Prozessen platziert. Bei 1 mM ATP-Puffnahme erhöhte sich intrazelluläres Kalzium in astrozytischen Prozessen, nicht aber in Somata (gepunkteten Boxen), wo Kalziumspiegel größer als der Mittelwert plus 1,5 x Standardabweichung als signifikant definiert wurden. Maßstabsleiste: 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzendes Video 1: Zeitreihenfilm abgeflacht von Hyperstack-Bildgebung von Gefäßen als Reaktion auf Puffing von 1 mM ATP. Grün: FITC-dextran, Färbegefäßlumen. Rot: NG2DsRed, Färbung Pericytes. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Ergänzendes Video 2: Zeitreihenfilm abgeflacht von Hyperstack-Bildgebung von astrozytischem Kalzium als Reaktion auf Puffing von 1 mM ATP. Grün: astrozytisches Kalzium. Rot: TRITC-dextran, Färbegefäßlumen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eine Herausforderung für Gefäßstudien ist die präzise Messung der Gefäßdurchmesser. Die Methode, die wir hier beschreiben, verwendete ein motorisiertes Piezoobjektiv, um eine schnelle und sich wiederholende Hyperstack-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie zu machen. Erstens ermöglicht diese Methode wiederholte Untersuchungen der durchdringenden Arteriole,1. Ordnung und 2. Ordnung Kapillaren ohne Fokusverlust und führte zur Entdeckung von langsam durchgeführten Gefäßreaktionen in Kapillaren in vivo. Zweitens, in Kombination mit einer viralen Vektorinjektionstechnik, ermöglicht es uns, astrozytische Kalziumreaktionen in drei Dimensionen zu untersuchen, was für Studien zur Blutflussregulation notwendig ist.
Diese Methode ist nicht ohne Einschränkungen. Zunächst wird vor der 3D-Bildgebung ein schmales rechteckiges Sichtfeld definiert, um eine hohe zeitliche Auflösung zu erreichen. Dies beschränkt die Bildgebung in der Regel auf die ersten drei Kapillaren. Zweitens müssen Laser von Zwei-Photonen-Mikroskopen perfekt ausgerichtet sein. Laserfehlausrichtung wird fälschlicherweise entzentrieren jeden Rahmen und erhöhen die Gefäßdurchmesser Messung. Drittens ist die Abtastrate der 3D-Bildgebung in der Lage, langsame CVRs und langsame Kalziumveränderungen in Astrozyten zu erfassen. 1-2 Hz pro Stapel ist immer noch nicht schnell genug, um schnelle CVRs11 oder schnelle Kalziumsignale in Astrozyten12,13zu studieren.
Um die Gefäße vor Ort zu beeinflussen, haben wir das Verfahren des präzisen Einsetzens einer Glasmikropipette an eine bestimmte Stelle der Mausgroßhirnrinde optimiert. Es gibt mehrere wichtige Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode. Zunächst muss der Winkel des Mikropipettenhalters aus Glas sorgfältig eingestellt werden. Es sollte die Mikropipette frei unter dem Objektiv manövrieren können und die Glasabdeckung über dem freiliegenden Kortex rutschen. Zweitens ist beim Einsetzen der Glas-Mikropipette in die Agaroseschicht und den Kortex ein kleiner Haltedruck erforderlich, um die Pipettenspitze unverstopft zu halten. Es ist jedoch Vorsicht geboten, keinen zu großen Haltedruck aufzutragen, damit die Verbindung vor dem Puffen nicht austritt. Drittens sollte das Puffen der Pipette in der Agaroseschicht über dem Gehirn getestet werden, um den optimalen Druck und die optimale Dauer zu finden, die genügend Puffmasse auf einem Puff freisetzen, ohne eine offensichtliche Verschiebung von Zellen und Gefäßen aufgrund mechanischer druck.
Um die CVR-Geschwindigkeit genauer zu messen, sollte die Lautstärke des Scanvorgangs verbessert werden. Es gibt weitere neu entwickelte Volumen-Scanning-Mikroskope, zum Beispiel ein Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem akustischen optischen Deflektor (AOD) Scans bis zu 5 Volumen pro Sekunde mit der gleichen räumlichen Auflösung und Volumengröße (E-Mail-Kommunikation). Lichtbogenmikroskope scannen sogar eine größere Volumengröße (350 x 800 x 100 m) mit 10 Bänden pro Sekunde14.
Unsere Mausvorbereitung hat auch Einschränkungen. Akute Mausoperationen können mögliche Komplikationen haben. Schmerzlinderung Medizin und Anästhesie können die neurovaskulären Reaktionen beeinflussen. Akute Neuroinflammation kann auch ausgelöst werden, was zu mikrogliale Aktivierung und Leukozytose in kortikalen Geweben und Gefäßen führt. Obwohl die Spitzengröße von Glas-Mikropipetten in der Regel sehr klein ist (<1 m), könnte das Insertionsverfahren und das ATP-Puffing möglicherweise auch eine mikrogliale Migration und Umarmung der Einfügestelle innerhalb von 0,5-1 Stunden nach der Einfügung auslösen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von 3D-Bildgebung in der Zwei-Photonen-Mikroskopie und der lokalisierten Puffglas-Mikropipette ein fortschrittliches Werkzeug ist, um neurovaskuläre Aktivitäten und deren Mechanismus zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Lundbeck-Stiftung, der NOVO-Nordisk Foundation, dem Dänischen Rat für unabhängige Forschung | Medical Sciences und die NORDEA Foundation Grant an das Center for Healthy Aging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
