Summary
Perineural आक्रमण सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और अन्य ट्यूमर के लिए एक आक्रामक phenotype है. लड़की chorioallantoic झिल्ली मॉडल एंजियोजेनेसिस, कैंसर आक्रमण, और मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ हम कैसे इस मॉडल vivo में perineural आक्रमण का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है प्रदर्शन.
Abstract
Perineural आक्रमण एक phenotype जिसमें कैंसर चारों ओर या नसों पर आक्रमण है. यह सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और अन्य कैंसर के लिए गरीब नैदानिक परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है. यंत्रविज्ञानीय अध्ययनों से पता चला है कि नसों और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच आणविक क्रॉसटॉक शारीरिक संपर्क से पहले होता है। वहाँ केवल विवो मॉडल में कुछ perineural आक्रमण का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं, विशेष रूप से जल्दी प्रगति की जांच करने के लिए, शारीरिक तंत्रिका ट्यूमर बातचीत होने से पहले. चिक कोरियोएलेंटोइक झिल्ली मॉडल का उपयोग कैंसर आक्रमण का अध्ययन करने के लिए किया गया है, क्योंकि कोरियोनिक उपकला की तहखाने झिल्ली मानव उपकला ऊतक की नकल करती है। यहाँ हम chi chorioallantoic झिल्ली मॉडल perineural आक्रमण की जांच करने के लिए repurposed, grafting चूहे पृष्ठीय जड़ Ganglia और मानव सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं को chorionic उपकला पर. हम प्रदर्शन किया है कि कैसे इस मॉडल कैंसर कोशिकाओं की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए विवो में तंत्रिका ऊतक आक्रमण करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
Introduction
Perineural आक्रमण (PNI) कैंसर में एक understudied phenotype है, जो उच्च रोग पुनरावृत्ति और सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNC)1के साथ रोगियों में गरीब अस्तित्व के साथ जुड़ा हुआ है. पीएनआई को नसों के भीतर या आस - पास की ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में सूक्ष्म रूप से परिभाषित किया गया है2,3. जब पीएनआई का पता चलता है, तो रोगियों को वैकल्पिक गर्दन विच्छेदन और/या विकिरण चिकित्सा4,5 जैसे सहायक चिकित्सा प्राप्त होने की संभावनाहोतीहै। हालांकि, इन उपचारों आक्रामक हैं, और नहीं PNI-विशिष्ट. वास्तव में, पीएनआई को ब्लॉक करने के लिए कोई चिकित्सा नहीं है, मुख्य रूप से क्योंकि तंत्रिका ट्यूमर बातचीत अंतर्निहित तंत्र अभी भी खराब समझ रहे हैं।
विभिन्न आणविक तंत्र तंत्रिका ट्यूमर आकर्षण में फंसाया गया है; ट्यूमर और स्ट्रॉमल कोशिकाएं न्यूरिटोजेनेसिस6,7 को बढ़ावा देने के लिए न्यूरोपेप्टाइड और विकास कारकों को जारी करतीहैं. जब इन विट्रो में एक साथ सुसंस्कृत, HNC कोशिकाओं और पृष्ठीय जड़ Ganglia (DRG) दोनों एक मजबूत प्रतिक्रिया है; ट्यूमर सेल आक्रमण और न्यूरिटोजेनेसिस पर प्रभाव संस्कृति6,8,9में कुछ दिनों के बाद देखा जा सकता है . हालांकि, आक्रमण से पहले ट्यूमर-नेवर बातचीत को recapitulate करने के लिए विवो मॉडल में उपयुक्त की कमी है। यहाँ हम एचएनसी कोशिकाओं और नसों6के बीच प्रारंभिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक में विवो पीएनआई मॉडल प्रस्तुत करते हैं . हम एक तंत्रिका घटक शामिल करने के लिए लड़की chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) मॉडल अनुकूलित, सीएएम में एक DRG grafting, कैंसर कोशिकाओं के एक कलम के बाद एक innervated ट्यूमर microenvironment नकल करने के लिए.
सीएएम मॉडल का उपयोग तहखाने झिल्ली के माध्यम से कोशिकाओं के आक्रमण का आकलन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है , कार्सिनोमा और मेलेनोमा10,11,12के प्रारंभिक आक्रामक चरणों की नकल करते हुए . सीएएम में ऊपरी कोरियोनिक उपकला, मध्यवर्ती मेसेन्काइम, और कम एलान्टोइक उपकला शामिल है। कोरियोनिक उपकला संरचनात्मक रूप से मानव उपकला10,13 के समान है जिसमें कोलेजन-IV-रिच बेसमेंट झिल्ली तहखाने झिल्ली को simulates जो अंतर्निहित संयोजी ऊतक से मौखिक उपकला को अलग करती है। के बाद से पहले ट्यूमर grafts 191314में सीएएम में प्रदर्शन किया गया , विधि के कई रूपांतरों एंजियोजेनेसिस15,16,17, ट्यूमर प्रगति के आकलन के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किए गए थे , और मेटास्टेसिस18| महत्वपूर्ण बात, सीएएम पर ट्यूमर grafting की तकनीक बहुत कम बदल गया है, लेकिन आवेदन लगातार विकसित कर रहे हैं. बढ़ती जटिलता के परख प्रकाशित किया गया है, दवा स्क्रीनिंग19,हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग20,और नैनोकण आधारित कैंसर विरोधी दवाओं21सहित .
हमारी प्रयोगशाला एक सीएएम-डीआरजी मॉडल का उपयोग करती है जिसमें एक स्तनधारी डीआरजी अलग है और ऊपरी सीएएम की सतह पर कलम लगाया जाता है। के बाद DRG सीएएम में शामिल हो जाता है, HNC कोशिकाओं DRG के पास grafted और DRG के साथ बातचीत करने से पहले vivo प्रणाली में पूरी काटा और विश्लेषण की अनुमति दी जाती है. महत्वपूर्ण बात, प्रणाली DRG और ट्यूमर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा DRG और ट्यूमर दोनों के पूर्व-vivo दृश्य अवलोकन की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल में 17 दिनों के भीतर निष्पादित जटिलता के विभिन्न स्तरों केसाथ कई चरणों को शामिल किया गया है, अंडे को इनक्यूबेट करने से लेकर सीएएम (चित्र 1) की कटाई तक। ब्याज के विभिन्न प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को इस मॉडल में परीक्षण किया जा सकता है आणविक रास्ते कैंसर में तंत्रिका आक्रमण के लिए जिम्मेदार स्पष्ट करने के लिए, और भी स्क्रीनिंग दवाओं के लिए सीधे तंत्रिका आक्रमण को लक्षित करने के लिए. एक उम्मीदवार दवा के साथ पूर्व इलाज कोशिकाओं सीएएम पर grafted किया जा सकता है और इलाज नियंत्रण की तुलना में जांच पीएनआई की घटना. वास्तव में, सीएएम मॉडल का उपयोग दवा जांच के लिए इन विट्रो अध्ययनों और कृन्तकों में विवो परीक्षणों में पूर्व-नैदानिक के बीच एक मध्यवर्ती कदम के रूप में किया गयाहै।
प्रयोगात्मक डिजाइन परिकल्पना के साथ अलग अलग होंगे. उदाहरण के लिए, यदि पीएनआई पर एक विशिष्ट प्रोटीन की भूमिका का परीक्षण, प्रयोगात्मक समूह DRG ट्यूमर कोशिकाओं के साथ grafted प्रोटीन overexpressing शामिल होगा, जबकि नियंत्रण समूह खाली वेक्टर के साथ stably transfected कोशिकाओं के साथ DRG शामिल करना चाहिए. कई अलग अलग प्रयोगात्मक डिजाइन विशिष्ट सवालों के पते के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
आचार विवरण: इस प्रोटोकॉल में चूहों का उपयोग कर सभी प्रयोगों आईएसयूसी (संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति) हमारी संस्था से नियमों के अनुसार किया जाता है। इस अध्ययन में अंडों के साथ प्रयोग IACUC विनियमन से मुक्त हैं.
1. अंडा इनक्यूबेशन (अनुमानित समय: 5 मिनट, दिन शून्य)
- रोगज़नक़ मुक्त निषेचित वाणिज्यिक Lohmann सफेद लेगहॉर्न अंडे जाओ, अधिमानतः पहले दिन के बाद निषेचन पर. प्रति प्रयोगात्मक समूह में छह अंडे को 38 डिग्री सेल्सियस पर अंडे humidifying इनक्यूबेटर और प्रति घंटा रोटेशन के साथ 8 दिनों के लिए 54% आर्द्रता। अंडे के नियमित रोटेशन का उपयोग करने के लिए अंडे झिल्ली से चिपके से भ्रूण को रोकने के.
नोट: ऊष्मायन से पहले, अंडे को अधिकतम 1 सप्ताह के लिए भ्रूण के विकास को रोकने के लिए 18 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखें।
2. हार्वेस्ट और DRGs की तैयारी (अनुमानित समय: 2 ज, दिन 8)
नोट: चूहों और चूहों के साथ प्रयोगों से अनुमोदन की आवश्यकता (IACUC). कुछ देशों में, चिकन अंडे के उपयोग को भी अनुमोदन की आवश्यकता है।
- छह से सात सप्ताह पुराने Sprague Dawley चूहों जाओ (वजन में $ 200 ग्राम) DRGs निकालने के लिए.
नोट: एक चूहे को $40 ग्रीवा और थोरैसिक DRGs उपज चाहिए. माउस DRG भी सीएएम में एकीकृत करता है, हालांकि इस प्रजाति के लिए शर्तों को स्वतंत्र रूप से अनुकूलित किया जाना चाहिए। - एक स्तरीय प्रवाह कैबिनेट में, चूहा DRG निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल का पालन गर्भाशय ग्रीवा और वक्ष क्षेत्रों से फसल DRGs22कहीं और प्रकाशित . DRGs फसल के लिए कैसे पर अभिविन्यास के लिए चित्र 2 का पालन करें.
- केटामाइन/Xylazine के प्रशासन के बाद कार्डियक पंचर द्वारा चूहे को यूथेनाइज करें जो इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन लगाते हैं। 70% इथेनॉल के साथ चूहे त्वचा को साफ और एक कैंची का उपयोग कर चूहे रीढ़ हटा दें। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन नहीं है क्योंकि यह गर्भाशय ग्रीवा DRGs नुकसान होगा.
- चित्र 2क-डीमें प्रदत्त योजनाबद्ध शारीरिक निरूपण और सकल छवियों का अनुसरण करते हुए गर्भाशय ग्रीवा, वक्ष और कटि के क्षेत्रों को एक ही कैंची से अलग करें। ऊतकों को गीला रखने के लिए 1x PBS के साथ एक 10 सेमी संस्कृति पकवान में रीढ़ वर्गों प्लेस.
- एक नाजुक हड्डी कैंची के साथ, पृष्ठीय और अधर पहलुओं में कशेरुक हड्डियों को खोलें, दो पार्श्व हिस्सों में रीढ़ को अलग (चित्र 2E-F)। ताजा 1x पीबीएस के साथ एक साफ 10 सेमी पकवान में ऊतक वर्गों प्लेस.
- बलप्स का प्रयोग करके, धीरे से रीढ़ की हड्डी को कशेरुकी हड्डियों से अलग कर के लिए DRGs कल्पना (चित्र 2जी).
- प्रत्येक डीआरजी के नीचे रखे गए ठीक बलप्स के साथ, इसे समझलें और इसे हड्डी गुहा से बाहर निकाल दें जिसमें यह दर्ज किया गया है। DRG सीधे पकड़ नहीं है क्योंकि यह ऊतक नुकसान का कारण होगा. डीआरजी से एक्सॉन बंडलों को ट्रिम न करें (चित्र 2एच)
नोट: काठ का DRGs का उपयोग करने से बचें क्योंकि इन सीएएम में एकीकरण कम कर दिया है. DRG क्षेत्र स्थान के लिए, चित्र 2A-Dपर योजनाबद्ध चित्रण और सकल शारीरिक छवियों का पालन करें।
- कटाई के तुरंत बाद, प्रत्येक डीआरजी को डीएमईएम संस्कृति मध्यम में 2% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन/स्ट्रेप) और 10% हीट-इनएक्टिव्ड फेटल बोवाइन सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक रखें ताकि डीआरजी के जीवाणु संदूषण को रोकने में मदद मिल सके। समूह सभी डीजी को एक ही 6 सेमी में संस्कृति माध्यम के 4 एमएल के साथ संस्कृति पकवान.
- सभी DRGs कटाई के बाद, उन्हें DMEM संस्कृति मध्यम के साथ एक नई संस्कृति पकवान के लिए स्थानांतरण 2% पेन / सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 1 एच के लिए इनक्यूबेट। इस समय के दौरान, नीचे वर्णित के रूप में DRG प्राप्त करने के लिए अंडे तैयार (चरण 3).
नोट: DRGs कटाई और फ्लोरोसेंट लेबलिंग के पूरा होने के बीच अंतराल अंडे तैयार करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए; DRGs इनक्यूबेटर में कुछ घंटों के लिए रखा जा सकता है।
3. DRG grafting के लिए अंडे की तैयारी (अनुमानित समय: एक दर्जन अंडे के लिए 1 एच, दिन 8)
- एक स्तरीय प्रवाह कैबिनेट में, प्रकाश मंद और व्यवहार्यता और भ्रूण चरण के लिए जाँच करने के लिए अंडे transilluminate. गरीब vascualture, गैर निषेचित अंडे, या अंडे दिन 8 के बाद निषेचन के साथ संगत नहीं के साथ अंडे को बाहर निकलें. अंडे को प्राकृतिक रूप से उत्पन्न होने वाली वायु कोष से प्रकाश स्रोत की ओर धीरे से रखें (चित्र 3क)।
- एक पेंसिल से, उद्घाटन प्राप्त करने के लिए अंडे के खोल को चिह्नित करें (चित्र 3क-बी)।
- सबसे पहले, अंडे की झिल्ली से जुड़े एक अंधेरे चलती पोत के रूप में सीएएम को विकासशील भ्रूण के लगाव की पहचान करें और इस क्षेत्र में हस्तक्षेप से बचने के लिए इस क्षेत्र को चिह्नित करें।
- दूसरा, एक अच्छी तरह से संवहनी क्षेत्र के रूप में ऑपरेटिंग विंडो क्षेत्र का चयन भ्रूण लगाव से कम से कम 2 सेमी और एक 1.5 सेमी व्यास चक्र आकर्षित. ऑपरेटिंग विंडो से लगभग 1 सेमी, एक कम संवहनी क्षेत्र में एक 0.5 सेमी वर्ग आकर्षित.
- तीसरा, ऑपरेशन क्षेत्र से बाहर करने के लिए हवा की थैली क्षेत्र आकर्षित। वायु थैली के मध्य को क्रॉस से चिह्नित की जा सकता है।
- एक रोटरी उपकरण और उत्कीर्णन ड्रिल के साथ, व्यास में 3 मिमी, चिह्नित वर्ग में अंडे खोल ड्रिल (चित्र 3C)। बाहरी अंडे के खोल झिल्ली को हटाने के बिना अंडे के खोल को हटाने के लिए कुंद संदंश का प्रयोग करें (खोल के नीचे सफेद झिल्ली) (चित्र3 डी)। इस झिल्ली के आकस्मिक छिद्र से बचने के लिए सावधानी से कार्य करें।
- चरण 3-3 के समान अभ्यास का उपयोग करके वायु कोष क्षेत्र में चिह्नित क्रॉस में एक तुच्छ छिद्र ण करें ताकि अंडे में वायु प्रवाह की अनुमति मिल सके (चित्र 3E)। अंडे पर बहुत अधिक दबाव न थोपें, ताकि इसे तोड़ने या नुकसान से बचा जा सके।
- वर्ग के उद्घाटन में HBSS के 30 डिग्री सेल्सियस रखें, बरकरार बाहरी अंडे खोल झिल्ली पर (चित्र 3E)। 30-जी सिरिंज सुई के साथ, इस वर्ग क्षेत्र में बाहरी झिल्ली में एक तुच्छ छिद्रण बनाएं (चित्र 3एफ)।
- हवा की थैली कल्पना करने के लिए प्रकाश स्रोत में अंडे रखें। एक आईड्रॉपर रबर बल्ब पर दबाव लागू करें और इसे वायु कोष क्षेत्र (चरण 3-4) में बनाए गए छोटे छिद्र में रखें। जब तक आप ऑपरेटिंग विंडो क्षेत्र में दो झिल्ली के पृथक्करण को नहीं देखते तब तक बल्ब में दाब को छोड़ें (चित्र 3G; आप ऑपरेटिंग विंडो क्षेत्र में झिल्ली की पूरी जुदाई को प्राप्त करने की जरूरत के रूप में कई बार के रूप में इस कदम को दोहराने.
- सभी अंडों के लिए चरण 3-1-3.6 दोहराएँ.
- चरण 3-3 के समान ड्रिल का उपयोग करते हुए, गोलाकार ऑपरेटिंग विंडो को बाह्य अंडा कवच झिल्ली को टूटने के लिए सावधान न किया जाए (चित्र 3H)। सभी ढीले कणों को हटाने के लिए धीरे से एक चिपकने वाला टेप चिपकाकर अंडे की सतह को साफ करें।
- कुंद संदंश के साथ, ड्रिल्ड क्षेत्र से अंडे के खोल को हटा दें (चित्र 3I-J)। इसके बाद, एक ही संदंश के साथ, बाहरी अंडे की खोल झिल्ली को हटा दें (चित्र 3K),प्रदूषण को कम करने के लिए अंडे के अंदर छोटे खोल कणों को पेश न करने के लिए सावधान रहें।
- अंडे की सतह से लगभग 1 सेमी गहराई पर सीएएम की पहचान करें। संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक खुले अंडे को अस्थायी रूप से पैराफिन मोम झिल्ली के साथ कवर करें (चित्र 3L) ।
- सभी अंडों के लिए चरण 3-8-3.10 दोहराएँ। अंडे को रोटेशन के बिना अंडे इनक्यूबेटर में वापस रखें जब तक कि डीआरजी कलम करने के लिए तैयार नहीं हो जाते।
4. सीएएम पर DRG grafting (अनुमानित समय: 40 मिनट, दिन 8)
- प्रत्यारोपण से पहले DRGs धोने के लिए, HBSS माध्यम के साथ एक 6 सेमी संस्कृति पकवान तैयार करें। सेल संस्कृति स्तरीय प्रवाह कैबिनेट के लिए तैयार अंडे लाओ. अंडे से पैराफिन झिल्ली निकालें (चित्र 4क)
- ठीक बाँझ forceps के साथ, धीरे संस्कृति माध्यम के अंदर से एक DRG समझ. यह HBSS माध्यम में डुबकी अतिरिक्त माध्यम है कि फ्लोरोसेंट डाई होता है हटाने के लिए. डीआरजी को बहुत धीरे से पकड़ो; अन्यथा, यह forceps के लिए रहना होगा.
- डी.आर.जी. को सीएएम पर रखें, सावधान रहें कि झिल्ली को पंचर न करें (चित्र 4 बी-सी)। यदि आवश्यक हो, बल की एक और जोड़ी का उपयोग करने में मदद करने के लिए forceps की नोक से DRG अलग जब यह CAM पर रखकर.
नोट: HBSS माध्यम के साथ DRG गीला रखते हुए भी forceps से अलगाव की सुविधा होगी. - एक बाँझ पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के साथ अंडे को कवर। जीवाणु संदूषण से बचने के लिए अंडे के खोल में बनाई गई सभी खिड़कियों और पंचरों को ढक दें (चित्र 4डी) ।
- सभी अंडों में DRGs grafting के बाद, 38 डिग्री सेल्सियस पर एक humidifying इनक्यूबेटर में अंडे और 54% आर्द्रता 2 दिनों के लिए, रोटेशन के बिना इनक्यूबेट करें।
5. सीएएम पर ट्यूमर कोशिकाओं grafting (अनुमानित समय: 1 ज 30 मिनट, दिन 10)
- कोशिकाओं grafting से पहले 48 ज पर, संस्कृति प्लेटों में आवश्यक कोशिकाओं प्लेट. सीएएम में तीन आयामी ट्यूमर उत्पन्न करने के क्रम में UM-SCC-1 कोशिकाओं के लिए 0.5 से 1 x 106 कोशिकाओं प्रति अंडे की गणना करें। ध्यान रखें कि कक्ष संख्या कक्ष पंक्ति के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।
- Aspirate मध्यम और DMEM संस्कृति मध्यम जोड़ने के साथ पूरक 1% पेन / सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट। फिर, माइक्रोस्कोप पर फ्लोरोसेंट तीव्रता की जांच करें, एस्पायर मीडियम, 1x पीबीएस के साथ एक बार धोएं, और 10 मिनट तक 0.25% ट्रिप्सिन जोड़ें। DMEM पूरक माध्यम के साथ ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें।
- एक सेल गोली बनाने के लिए 4 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। अतिरिक्त फ्लोरोसेंट डाई धोने के लिए HBSS में Aspirate DMEM मध्यम और फिर से निलंबित. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
- सेल संस्कृति स्तरीय प्रवाह कैबिनेट के लिए अंडे लाओ. कैंची और बलप्स के साथ, पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग कि अंडे को शामिल किया गया खुला (चित्र 4E-F).
- कोशिकाओं की गणना की संख्या को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें, एचबीएसएस माध्यम को प्रेरित करें और एक ही माध्यम के 5 डिग्री सेल्सियस प्रति6 कोशिकाओं की अंतिम सांद्रता पर पुन: निलंबित करें (चित्र 4जी)। अंडों की कुल संख्या (5 डिग्री सेल्सियस सेल निलंबन प्रति अंडे) के लिए आवश्यक राशि तैयार करें।
- सीएएम पर सेल विलयन का 5 डिग्री सेल्सियस, डीआरजी से लगभग 2 मिमी (चित्र 4ह) रखें। DRG और कोशिकाओं के बीच एक समान दूरी रखें. कोशिकाओं के प्रसार को कम करने के लिए अंडे को परेशान न करें।
नोट: सेल प्रत्यारोपण शुरू करने के लिए, जिस पर सीएएम सतह नेत्रहीन शुष्क है अंडे का चयन करें। यदि सतह बहुत गीला है, कोशिकाओं फैल सकता है और नियमित रूप से ट्यूमर फार्म नहीं है. - कदम 4.4 में के रूप में एक नई फिल्म ड्रेसिंग के साथ अंडे को कवर. सभी अंडे में कोशिकाओं को Graft. रोटेशन के बिना, 38 डिग्री सेल्सियस और 54% आर्द्रता पर एक humidifying इनक्यूबेटर में अंडे इनक्यूबेट करें।
6. सीएएम कटाई (अनुमानित समय: दर्जन अंडे के लिए 1 एच, दिन 17)
- 4% पीएफए (पैराफॉर्मेल्डिहाइड) पीएच7.0, एक अच्छी तरह से प्रति अंडे, 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से के साथ 6-वेल प्लेट तैयार करें।
- एक प्रयोगशाला बेंच के लिए अंडे लाओ. फिल्म ड्रेसिंग को छिद्रित करने के लिए सिरिंज से जुड़ी सुई का उपयोग करना, सीएएम पर पीएफए के 300 डिग्री एल के आसपास ड्रॉप करने के लिए सीएएम को थोड़ा कड़ा करना, इस प्रकार कटाई प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाते हैं। सभी अंडे के लिए यह दोहराएँ.
- कैंची के साथ, अंडे के खोल के ऊपरी आधे हिस्से को हटा दें (जहां ऑपरेटिंग विंडो स्थित है) इसके साथ संलग्न सीएएम के साथ (चित्र4I)। इस आधे के आकार को लगभग 3 सेमी व्यास तक कम करें, सीएएम के हिस्से को रखते हुए जहां डी आर जी और ट्यूमर कोशिकाओं को केंद्र में कलम लगाई गई थी (चित्र 4J)। ठीक forceps के साथ सीएएम grasp और यह अंडे के खोल से अलग है, जबकि यह पीएफए में रखकर. DRG और कैंसर कोशिकाओं को ऊपर की ओर की ओर उन्मुख करें (चित्र 4K-L)
नोट: 3 सेमी क्षेत्र DRG और कोशिकाओं दोनों शामिल करना चाहिए. DRG आसानी से सीएएम पर संलग्न एक छोटी सी गांठ के रूप में देखा जाता है, लेकिन ट्यूमर कोशिकाओं कभी कभी सकल परीक्षा पर पहचान करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. - वैकल्पिक रूप से, एक कैंची के साथ, ऑपरेटिंग विंडो को चौड़ा अंडे के ऊपर से अंडे के खोल को हटाने, जबकि जगह में सीएएम रखते हुए; प्रचालन विंडो से परे लगभग 1 से. नाजुक ठीक forceps के साथ, किनारों में से एक पर सीएएम पकड़ और यह धीरे उठा. तेज नाजुक कैंची के साथ, धीरे एक परिपत्र क्षेत्र को दूर करने के लिए सीएएम में कटौती, व्यास में लगभग 3 सेमी (चित्र 4P),और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ DRG और कैंसर कोशिकाओं के साथ पीएफए में सीएएम जगह है।
नोट: ऊतक क्षति है कि माइक्रोस्कोपी कलाकृतियों उत्पन्न कर सकते हैं कम करने के लिए कई स्थानों में forceps के साथ कैम खींच या पकड़े से बचें. - प्रत्येक सीएएम झिल्ली को एक कुएं में रखें (चित्र 4ल)। पीएफए में खुले ऊतक को फैलाने के लिए सीएएम के किनारों को धीरे से समझें या धीरे से प्लेट को हिलाएं जब तक सीएएम सामने नहीं आ जाता है, ताकि गुना कलाकृतियों से बचा जा सके।
- भ्रूण (दिन 17) जल्दी decapitation द्वारा Euthanize. कमरे के तापमान पर 4 एच के लिए पीएफए में काटा ऊतकों को ठीक करें। निर्धारण के बाद, पीएफए को 1x पीबीएस के साथ बदलें और पीबीएस में ऊतकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि अनुभागके लिए पैराफिन में एम्बेड न करें। अधिक निर्धारण से बचें जो सीएएम के नाजुक वास्कुलेचर को नुकसान पहुंचाएगा।
- एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करना, फ्लोरोसेंट संकेतों को खोने से बचने के लिए कटाई के बाद 2 दिनों के भीतर झिल्ली तस्वीर.
Representative Results
जब अनुकूलित, इस विधि के पास है 100% डीआरजी एकीकरण CAM में. DRG एकीकरण के प्रतिनिधि परिणाम चित्र 5A-Bमें दिखाए गए हैं। सीएएम में डीआरजी का एकीकरण महत्वपूर्ण है क्योंकि यह प्रयोग के दौरान डीआरजी ऊतक को व्यवहार्यता प्रदान करता है। सूक्ष्म रूप से, DRG सीएएम (एच एंड ई दाग) के संयोजी ऊतक के भीतर देखा जाता है। रक्त वाहिकाओं अक्सर DRG ऊतक के अंदर देखा जाता है, सुझाव है कि सीएएम रक्त की आपूर्ति grafted ऊतक पोषण है. प्रत्यारोपित ट्यूमर भी एच एंड ई द्वारा सीएएम पर पहचाने जाते हैं; कितना आक्रमण मौजूद है पर निर्भर करता है, ट्यूमर संयोजी ऊतक पर हमला कई ट्यूमर द्वीपों के लिए कोई नहीं के साथ मौजूद हो सकता है (चित्र 5C-D)। प्रतिनिधि चित्र ााालं-F ब्राइटफील्ड इमेजिंग और मर्ज किए गए फ्लोरोसेंट पर काटी गई सीएएम को दर्शाता है। UM-SCC-1 कोशिकाओं overexpressing Galanin रिसेप्टर 2 नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में DRG के वृद्धि हुई आक्रमण प्रस्तुत (चित्र 5G-H) कैंसर-डीआरजी इंटरैक्शन को कैंसर कोशिकाओं के रूप में देखा जाता है जो डीआरजी की ओर दिशात्मक आक्रमण प्रस्तुत करते हैं (चित्र 5 एच) ।
डेटा विश्लेषण अलग-अलग तरीकों से किया जाता है। DRG की ओर कैंसर कोशिकाओं के दिशात्मक आक्रमण एक द्विभाजन चर के रूप में मनाया जाता है और आक्रमण के इस पैटर्न पेश अंडे की संख्या प्रत्येक समूह में गिना जाता है. समूहों के बीच सांख्यिकीय अंतर अनुपात के एक द्विपद परीक्षण का उपयोग कर गणना कर रहे हैं. कैंसर की कोशिकाओं और DRG के बीच निकटता, और ट्यूमर क्षेत्र ImageJ6 का उपयोग कर मापा जाता है और समूहों के बीच मतभेद छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन कर रहे हैं. ImageJ विश्लेषण के साथ सटीकता को आश्वस्त करने के लिए, एक ही प्रयोग से सभी छवियों को समान प्रकाश और जोखिम सेटिंग्स पर लिया जाना चाहिए. छवि दहलीज और एक ही मापदंड का उपयोग कर सभी छवियों की चमक का समायोजन करने के बाद, विश्लेषण कणों उपकरण ट्यूमर क्षेत्र को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है और रैखिक माप उपकरण ट्यूमर-डीआरजी दूरी के उपाय। यह विभिन्न समूहों में सभी छवियों के लिए विश्लेषण कणों के आकार के निरंतर सेटअप का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ उदाहरणों में, ट्यूमर मोटा हो जाना और मैन्युअल रूप से एक डिजिटल कैलिपर के साथ मापा जा सकता है, एक मात्रा माप के लिए अनुमति देता है.
उपकला कोशिकाओं (मानव प्रजातियों के लिए एंटी-साइटोकेराटिन एंटीबॉडी प्रतिक्रियाशील) के लिए पैराफिन-एम्बेडेड सीएएम ऊतक, एच एंड ई दाग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के वर्गों का उपयोग किया जा सकता है, जो संयोजी ऊतक के भीतर आक्रमण के आकलन के लिए अनुमति देता है। आक्रमण अंडे के प्रति संयोजी ऊतक में ट्यूमर द्वीपों की संख्या के रूप में मात्रा निर्धारित है. कोलेजन चतुर्थ के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस तहखाने झिल्ली को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, अगर GFP लेबल कैंसर कोशिकाओं का उपयोग कर, ऊतक वर्गों में इन कोशिकाओं की पहचान cytokeratin के लिए एक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के बिना सुविधा है. सीएएम प्रयोगों में मेटास्टेसिस और एंजियोजेनेसिस विश्लेषण की चर्चा कहीं और10,17से की जाती है .
चित्र 1: दिन 0, 8, 10 और 17 पर प्रमुख चरणों सहित प्रयोग समयरेखा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: 8 दिन पर DRG निष्कर्षण . एक. चूहा योजनाबद्ध रीढ़ की हड्डी के शारीरिक स्थान का चित्रण. B.विभिन्न शरीर क्षेत्रों को दर्शाने वाले चूहे कशेरुकी विन्यास का आरेख; गर्भाशय ग्रीवा के लिए हरा, वक्ष के लिए गहरा नीला, काठ के लिए नारंगी और त्रिक कशेरुकी के लिए हल्के नीले रंग. सी-डी| सर्जिकल चीरा के बाद चूहे की रीढ़ की हड्डी के वेंकल पहलू; बीमें दर्शाए गए क्षेत्रों का पृथक्करण । ई.रीढ़ की हड्डी की नहर को खोलने के लिए कशेरुकी निकायों को दो पार्श्व खंडों में विभाजित करने के लिए कशेरुकी शरीरों को अलग करना। धारा को मिडलाइन में प्रत्येक कशेरुकी हड्डी के पृष्ठीय और अधर पहलू के माध्यम से काटना चाहिए। खोला वक्ष रीढ़ की हड्डी के सकल पहलू एफ. जीरीढ़ की हड्डी के विस्थापित होने के बाद, DRGs कशेरुकी नहरों में आसानी से दिखाई दे रहे हैं (तीर सिर 3 DRGs इशारा करते हुए). एच.इसी एक्सॉन बंडलों (तीर सिर) के साथ एक DRG (तीर) की स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक छवि। स्केल बार: सी, डी, एफ, और जी, 1 सेमी; H,1 mm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: दिन 8 पर अंडे की तैयारी. ए-बी. प्रक्रिया से पहले अंडे vasculature और चिह्नों की पहचान. प्राकृतिक रूप से होने वाली वायु थैली के लिए एक बिंदु पर तीर. सी-डी| ड्रिलिंग और वर्ग खोलने के निशान पर अंडे के खोल के उद्घाटन. कुंद संदंश की मदद से खोल को हटाने के बाद बरकरार बाहरी अंडे खोल झिल्ली को डी अंक पर तीर। ई.हवा की थैली पर चिह्नित क्रॉस को ड्रिल के साथ छिद्रित किया जाता है ताकि अंडे (तीर सिर) में वायु के प्रवाह की अनुमति दी जा सके। HBSS माध्यम के 30 डिग्री एल वर्ग खोलने पर बाहरी अंडे खोल झिल्ली पर रखा गया है. एफएक ठीक सिरिंज सुई के साथ, बाहरी अंडे खोल झिल्ली छिद्रित है जहां HBSS पहले रखा गया था. जीदाब को रबर आईड्रॉपर बल्ब पर लगाया जाता है, जबकि इसे वायु थैली पर छिद्रित छिद्रण से जोड़ते हैं. जब उंगली दबाव जारी है, हवा vacuumed है, एक कृत्रिम हवा थैली (सफेद तीर) है कि ऑपरेटिंग विंडो के लिए विस्तार करना चाहिए पैदा. एच.ऑपरेटिंग विंडो के किनारों को अंडे के खोल के लगभग समानांतर स्थिति में ड्रिल किया जाता है, ताकि आकस्मिक छिद्र से बचा जा सके। मैं-जे| कुंद संदंश के साथ अंडे के खोल को हटाना। के.कुंद संदंश के साथ बाहरी अंडे की खोल झिल्ली निकालें, सीएएम पर कणों का परिचय नहीं सावधान किया जा रहा (पृष्ठ के नीचे $ 1 सेमी पर देखा). एलअंडे अस्थायी रूप से एक पैराफिन मोम झिल्ली के साथ कवर कर रहे हैं और इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: DRG, कोशिकाओं, और सीएएम की कटाई के grafting: दिन 8: एकपर . सीएएम आसानी से पैराफिन मोम झिल्ली हटाने के बाद मनाया. बी-सी| ठीक बलके साथ, DRG सीएएम पर रखा गया है. डी. अंडा फिल्म ड्रेसिंग के साथ कवर किया जाता है और इनक्यूबेटर में डाल दिया जाता है; तीर कवर किए गए उद्घाटनों को इंगित करते हैं. 10 दिन: ई-एफ| फिल्म ड्रेसिंग हटा दिया जाता है और DRG स्थित है (एफ पर तीर सिर). जी-एच| सेल विलयन का 5 डिग्री एल डी आर जी से 2 मिमी की दूरी पर सीएएम पर गिरा दिया जाता है। 17 दिन: मैं-एल और एम-पी दो अलग अलग दृष्टिकोण CAM फसल के लिए इस्तेमाल किया प्रदर्शित करता है. मैंअंडे खोल एक ठीक कैंची हवा थैली drilled छिद्र पर शुरू के साथ खोला जाता है जब तक अंडे के ऊपरी आधे हटा दिया जाता है. जे. एग शेल जिसमें सीएएम होता है, का आकार लगभग 3 सेमी के-एलतक कम हो जाता है। ठीक संदंश के साथ, सीएएम को अंडे के खोल से अलग किया जाता है और पीएफए में रखा जाता है। एम-ओ| ऑपरेटिंग विंडो का चौड़ा करने के लिए सीएएम पर DRG और कैंसर कोशिकाओं कल्पना किया जाता है. एरोहेड ट्यूमर और तीर अंक को DRG करने के लिए अंक. पी. सीएएम को बारीक बठे से पकड़ लिया जाता है, तेज कैंची से काटा जाता है और पीएफए में रखा जाता है जैसा कि एलमें दिखाया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: प्रतिनिधि परिणाम. ए एच एंड ई अनुभाग सीएएम में DRG के एकीकरण दिखा. B. Aका उच्च आवर्धन ; तीर DRG में सीएएम रक्त वाहिकाओं दिखा. C.UM-SCC-1 कोशिकाओं CAM पर grafted और grafting के बाद चार दिन काटा (एच एंड ई दाग). डी.सीएएम संयोजी ऊतक (तीर) में आक्रामक ट्यूमर द्वीपों दिखा सी के उच्च आवर्धन. ई.UM-SCC-1-GALR2 कोशिकाओं और चूहे DRG, 17 दिन पर काटा के साथ grafted सीएएम की सकल स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक छवि. एफमर्ज्ड फ्लोरोसेंट और ब्राइटफील्ड छवियों को लाल और कैंसर कोशिकाओं में लेबल डीआरजी को उजागर करता है जो हरे रंग में लेबल किया जाता है। जी-एच| DRG और UM-SCC-1-GALR2 बनाम नियंत्रण कोशिकाओं के साथ grafted सीएएम की फ्लोरोसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी, DRG करने के लिए UM-SCC-1-GALR2 कोशिकाओं के दिशात्मक आक्रमण का चित्रण (एच)। स्केल बार: A-D,500 $m; ई-एच, 2 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
| चरण | समस्या | कारण | समाधान | ||||||
| 3.2.1 | भ्रूण लगाव की पहचान करने में असमर्थ. | लगाव की स्थिति को देखने के लिए मुश्किल है, जबकि अंडा अभी भी है. | अंडे की झिल्ली से जुड़े एक लंबे बर्तन को देखने के लिए अंडे को जल्दी से बग़ल में घुमाएं। | ||||||
| 3.3 और 3.8 | ड्रिलिंग के दौरान बाहरी अंडे की खोल झिल्ली का परफोधन। | ड्रिल की गलत स्थिति. | ड्रिलिंग के दौरान अंडे के खोल के लगभग समानांतर ड्रिल को स्थिति दें। यदि झिल्ली चरण 3-3 में छिद्रित है, तो सुई के साथ आगे छिद्रण करने की आवश्यकता नहीं है जैसा कि चरण 3.5 में कहा गया है। यदि रक्तस्राव होता है, तो अंडे को त्याग दें। | ||||||
| 4.3 | DRG forceps के लिए चिपक जाती है. | डी आर जी सूखा है। | HBSS में फिर से गीला DRG और / या एक ठीक सुई का उपयोग करने में मदद करने के लिए forceps से DRG अलग. | ||||||
| 5.2 | कोशिकाओं को पूरी तरह से फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल नहीं कर रहे हैं. | इन्क्यूबेशन समय. कुछ कक्षों को लेबल करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है. | फ्लोरोसेंट डाई के साथ मीडिया में एक अतिरिक्त घंटे के लिए कोशिकाओं रखें. | ||||||
| 5.6 | सेल ड्रॉप पर एयर बुलबुला। | पिपेट टिप में सभी तरल पदार्थ का उपयोग करना. | 1 डिग्री एल वांछित मात्रा से अधिक लोड और pippette के अंतिम $L का उपयोग नहीं करते जब कोशिकाओं को प्रत्यारोपित. यह कोशिकाओं के मिश्रण में हवा के बुलबुले से बचना होगा। | ||||||
| 6.3 | सीएएम की कटाई करते समय DRG या कोशिकाओं की पहचान करने में असमर्थ। | छोटे DRG, DRG विस्थापित हो गया, कैंसर की कोशिकाओं का प्रसार. | यदि DRG नहीं देखा है, सीएएम के एक बड़े क्षेत्र फसल और निर्धारण के लिए एक बड़ा कंटेनर में जगह है. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप में फ्लोरोसेंट के तहत DRG और सेल स्थिति की जाँच करें, और फिर पैराफिन embedding के लिए एक छोटे आकार के लिए सीएएम ट्रिम. | ||||||
तालिका 1: समस्या निवारण तालिका
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विवो मॉडल में सीएएम-डीआरजी ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा तंत्रिका के शारीरिक आक्रमण से पहले तंत्रिका ट्यूमर बातचीत का प्रदर्शन करके पिछले मॉडलों की कमी को संबोधित करता है। पीएनआई के अधिकांश अध्ययन में ट्यूमर के प्रसार और मोटर समारोह के निषेध पर ध्यान केंद्रित है , और sciatic नसों में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन पर निर्भर23,24,25. sciatic तंत्रिका इंजेक्शन पीएनआई के एक विवो मॉडल जहां कैंसर की कोशिकाओं को एक माउस या चूहे sciatic तंत्रिका जहां ट्यूमर बाद में बढ़ता में इंजेक्ट कर रहे हैं. इंजेक्शन मॉडल विनाशकारी ट्यूमर प्रगति और नसों के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं से उत्पन्न दर्द को दिखाने के लिए उपयोगी होते हैं। sciatic तंत्रिका मॉडल भी कारकों है कि कैंसर की कोशिकाओं को तंत्रिका में कामयाब होने की अनुमति के अध्ययन के लिए उपयुक्त है, लेकिन पीएनआई के प्रारंभिक चरण का मूल्यांकन करने की क्षमता का अभाव है, क्योंकि यह सीधे तंत्रिका में कोशिकाओं का परिचय, तंत्रिका म्यान को दरकिनार. एक अलग दृष्टिकोण में, शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित orthotopic ट्यूमर grafts प्रोस्टेट कैंसर प्रगति को बढ़ावा देने में adrenergic और कोलीनर्जिक तंत्रिका फाइबर के महत्व की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया, इस प्रकार ट्यूमर प्रगति में नसों की एक प्रमुख भूमिका का सुझाव 26. इस मॉडल में मौरीन सहानुभूतिपूर्ण और परानुकंपी तंत्रिकाओं का रासायनिक अपाहिज होता था . parasympathetic फाइबर ट्यूमर के ऊतकों में घुसपैठ, पीएनआई से संबंधित एक प्रक्रिया है, लेकिन मॉडल विशेष रूप से तंत्रिका और ट्यूमर के बीच शारीरिक बातचीत का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था. सीएएम-डीआरजी मॉडल पीएनआई के दौरान तंत्रिका और कैंसर के बीच बातचीत की जांच की अनुमति देता है। इसके अलावा, murine मॉडल महंगा है और समय लेने वाली जब सीएएम मॉडल की तुलना में कर रहे हैं. हम पीएनआई के मशीनी अध्ययन के लिए सीएएम-डीआरजी मॉडल का उपयोग करने का सुझाव देते हैं।
सीएएम-डीआरजी दृष्टिकोण के कुछ लाभों में पीएनआई और अन्य फीनोटाइप्स का मूल्यांकन शामिल है, जैसे ट्यूमर विकास, मेटास्टेसिस, और एंजियोजेनेसिस। कम सीएएम पर मानव डीएनए की पहचान और / या जिगर में मानव कैंसर सेल लाइनों10के मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है , ऊतक अनुभाग और धुंधला, जो छोटे मेटास्टेसिस प्रकट नहीं हो सकता है की तुलना में एक अधिक संवेदनशील प्रयोगात्मक दृष्टिकोण.
सीएएम-डीआरजी विधि की कुछ सीमाएँ हैं, जिनमें संक्षिप्त अवलोकन समय सीमा भी शामिल है. भ्रूण की प्रतिरक्षा प्रणाली दिन 1827द्वारा शारीरिक रूप से सक्रिय है, जब अस्वीकृति और एक भड़काऊ प्रक्रिया हो सकती है, प्रयोगात्मक समय को सीमित करती है। यह भी दूरी पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है जब DRG के करीब ट्यूमर कोशिकाओं grafting; बड़ा DRG-कैंसर दूरी ट्यूमर कोशिकाओं और तंत्रिका के बीच आणविक बातचीत ख़राब हो सकता है, या मॉडल के दोनों घटकों के बीच शारीरिक संपर्क में देरी हो सकती है. इसके अलावा, अगर भ्रूण इस प्रोटोकॉल में निर्धारित से पुराने हैं, भ्रूण आंदोलनों ट्यूमर कोशिकाओं को विस्थापित हो सकता है. इसलिए, यह सेल grafting के लिए दिन 10 के बाद निषेचन के साथ संगत अंडे का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
चूंकि प्रतिरक्षा प्रणाली पूरी तरह से दिन से पहले विकसित नहीं है 1827, सीएएम में ट्यूमर microenvironment अक्सर कैंसर के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया इम्यूनोसप्रेस्ड murine मॉडल के समान है. इसलिए, इस मॉडल ट्यूमर प्रगति में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका का आकलन करने के लिए उपयोगी नहीं है। एक अन्य सीमा चिकन प्रजातियों के लिए अभिकर्मकों की प्रतिबंधित उपलब्धता है, जैसे एंटीबॉडी, साइटोकिन्स और प्राइमर।
सही ढंग से इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन अभ्यास की आवश्यकता है; हालांकि, यह एक विशेष कोर सुविधा के लिए आवश्यकता के बिना एक प्रयोगशाला सदस्य द्वारा किया जा सकता है. अंडे के खोल की ड्रिलिंग प्रशिक्षण की आवश्यकता है. किराने पर अभ्यास (गैर निषेचित) अंडे पहली बार के लिए इस मॉडल का प्रयास करने से पहले की सिफारिश की है. उच्च भ्रूण अस्तित्व और मॉडल की सफलता प्राप्त किया जा सकता है अगर कुछ महत्वपूर्ण कदम संक्रमण से बचने के लिए पालन कर रहे हैं: 2% पेन / स्ट्रेप में DRGs के उपयुक्त एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस, एक laminar प्रवाह कैबिनेट में काम कर रहे हैं, और अंडे खोल कणों के प्रसार से बचने सीएएम पर. यह भी कुल अंडे ऊष्मायन समय के दौरान स्थिर आर्द्रता रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हम प्रति समूह अंडे की संख्या में वृद्धि की सलाह देते हैं जब तक तकनीक में महारत हासिल है. अनुभवहीन प्रयोगशाला कर्मियों के लिए सबसे अक्सर समस्याओं अंडे संदूषण और सेल grafting के लिए गलत तकनीक हैं.
डीआरजी कटाई के लिए भी प्रशिक्षण की आवश्यकता है; इन विट्रो प्रयोगों के लिए DRGs कटाई में अभ्यास8 में विवो मॉडल का प्रयास करने से पहले की सिफारिश की है. इन विट्रो डीआरजी संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन और DRG निष्कर्षण की अवधि को कम करने के लिए तकनीक में सुधार करने के लिए एक अवसर है। जब डी आर जी को बल के साथ पकड़ते हैं तो कटाई तकनीक पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। डीआरजी को सीधे नहीं रखा जाना चाहिए; दबाव इसके नीचे लागू किया जाना चाहिए. हम बेहतर निष्कर्षण के दौरान DRG कल्पना करने के लिए आवर्धक लेंस के उपयोग की सलाह देते हैं.
महत्वपूर्ण बात, जब पहली बार के लिए इस मॉडल प्रदर्शन, सभी शर्तों वांछित सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस मॉडल चूहा DRG और HNC सेल लाइन UM-SCC-1 के लिए अनुकूलित किया गया था. माउस DRG और अन्य कैंसर सेल प्रकार के उपयोग अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. grafted कोशिकाओं के एक उच्च एकाग्रता के साथ, ट्यूमर मोटा और कठोर हो जाना करते हैं, जो ट्यूमर माप की सुविधा. प्रत्येक समूह के लिए कई अंडे और प्रत्येक अंडे के लिए कोशिकाओं की एक उचित एकाग्रता को ध्यान में रखते हुए, कई लाख कोशिकाओं को प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक हो सकता है. योजना को सुविधाजनक बनाने के लिए, कोशिकाओं के दोहरीकरण के समय के ज्ञान को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरणों के लिए, एक समस्या निवारण तालिका प्रदान की जाती है (तालिका1).
Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं.
Acknowledgments
इस कार्य को NIH/NIDCR अनुदान DE027551 और DE022567 (NJD) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
| ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
| CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
| CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
| Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
| DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
| DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
| Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
| Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
| Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
| Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
| Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
| Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
| HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
| HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
| Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
| PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
| PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
| Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
| Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
References
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