Summary
الغزو الحولي هو نمط ظاهري عدواني لسرطان الخلايا الحرشفية للرأس والرقبة والأورام الأخرى. وقد استخدم نموذج الغشاء chorioallantoic كتكوت لدراسة تكوين الأوعية الدموية, غزو السرطان, والانبثاث. هنا نبين كيف يمكن استخدام هذا النموذج لتقييم الغزو حول العصب في الجسم الحي.
Abstract
الغزو المحيطي هو نمط ظاهري يحيط به السرطان أو يغزو الأعصاب. ويرتبط مع النتائج السريرية السيئة لسرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة وغيرها من السرطانات. وقد أظهرت الدراسات الميكانيكية أن التداخل الجزيئي بين الأعصاب والخلايا السرطانية يحدث قبل التفاعل البدني. هناك فقط عدد قليل في نماذج الحي لدراسة الغزو حول العصب، وخاصة للتحقيق في التقدم المبكر، قبل التفاعلات الفيزيائية بين الأعصاب وورم. وقد استخدم نموذج الغشاء chorioallantoic كتكوت لدراسة غزو السرطان، لأن غشاء الطابق السفلي من ظهارة المشيمية يحاكي أن من الأنسجة الظهارية البشرية. هنا نحن إعادة الغرض نموذج الغشاء chorioallantoic الفرخ للتحقيق في الغزو حول العصب، تطعيم الجرذان العضدية الجذر والرأس البشري وخلايا سرطان الخلايا الحرشفية على الظهارة المشيمية. لقد أظهرنا كيف يمكن لهذا النموذج أن يكون مفيدا لتقييم قدرة الخلايا السرطانية على غزو الأنسجة العصبية في الجسم الحي.
Introduction
الغزو قبل العصبي (PNI) هو النمط الظاهري غير مدروسة في السرطان، والذي يرتبط مع ارتفاع تكرار المرض وسوء البقاء على قيد الحياة في المرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة (HNC)1. يتم تعريف PNI مجهريا كخلايا ورم داخل أو المحيطة الأعصاب2,3. عندما يتم الكشف عن PNI، من المرجح أن يتلقى المرضى العلاجات الشبيهة بتشريح الرقبة الاختيارية و/أو العلاج الإشعاعي4و5. ومع ذلك، هذه العلاجات عدوانية، وليس PNI محددة. في الواقع، لا يوجد علاج لمنع PNI، في المقام الأول لأن الآليات الكامنة وراء التفاعلات العصبية والورم لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.
وقد تورطت آليات جزيئية مختلفة في جذب ورم الأعصاب. الأورام والخلايا السترومالية الإفراج عن الببتيدات العصبية وعوامل النمو لتعزيز تكوين النيوتوريتيسيس6,7. عندما مثقف معا في المختبر, خلايا HNC والعُزُع الجذر الدُور (DRG) على حد سواء لها استجابة قوية; ويمكن رؤية الآثار على غزو الخلايا السرطانية ونشوء الخلايا بعد بضعة أيام في الثقافة6,8,9. ومع ذلك، هناك نقص في النماذج المناسبة في الجسم الحي لتلخيص التفاعلات بين الورم والأعصاب قبل الغزو. هنا نقدم نموذج في الجسم الحي PNI لدراسة التفاعلات المبكرة بين خلايا HNC والأعصاب6. لقد قمنا بتكييف نموذج الغشاء الشودوري الأنتيك (CAM) ليشمل مكونًا عصبيًا، وتطعيمًا لـ DRG في CAM، يليه ترقيع الخلايا السرطانية لتقليد بيئة ورم مجهرية مُتَرَكَر.
وقد استخدم نموذج CAM بنجاح لتقييم غزو الخلايا من خلال غشاء الطابق السفلي، ومحاكاة المراحل الغازية في وقت مبكر من السرطانات وسرطان الجلد10،11،12. وتتألف CAM من ظهارة المشيمية العليا، مسيينشيم التدخل، وظهارة الألانتوية السفلية. ظهارة المشيمية هي هيكليا مماثلة للظهارة البشرية10،13 في أن غشاء القبو الكولاجين الرابع الغنية يحاكي غشاء الطابق السفلي الذي يفصل ظهارة عن طريق الفم من النسيج الضام الكامنة. منذ تم تنفيذ الطعوم الورم الأول في CAM في 191314، تم تطوير العديد من التعديلات من الأسلوب للسماح لتقييم تكوين الأوعية الدموية15،16،17، تطور الورم، و الإنبثاث18. الأهم من ذلك، فإن تقنية تطعيم الأورام على CAM قد تغيرت قليلا جدا، ولكن التطبيقات تتطور باستمرار. وقد نشرت اختبارات من التعقيد المتزايد, بما في ذلك فحص المخدرات19,هندسة أنسجةالعظام20, والأدوية المضادة للسرطان الجسيمات النانوية 21 .
يستخدم مختبرنا نموذج CAM-DRG الذي يتم فيه عزل DRG الثدييات وتطعيمها على سطح CAM العلوي. بعد أن يصبح DRG مدمجة في CAM، يتم تطعيم خلايا HNC بالقرب من DRG ويسمح لها بالتفاعل مع DRG قبل حصاد وتحليل النظام الكامل في الجسم الحي. الأهم من ذلك، يسمح النظام المراقبة البصرية السابقة فيالجسم من كل من DRG والورم عن طريق وضع العلامات الفلورسنت من DRG والخلايا السرطانية. ويشمل هذا البروتوكول خطوات متعددة ذات مستويات مختلفة من التعقيد التي يتم تنفيذها في غضون17 يوما، من احتضان البيض إلى حصاد CAM (الشكل 1). الخلايا التي تعبر عن البروتينات المختلفة ذات الاهتمام يمكن اختبارها في هذا النموذج لتوضيح المسارات الجزيئية المسؤولة عن غزو الأعصاب في السرطان، وأيضا لفحص الأدوية لاستهداف الغزو العصبي مباشرة. الخلايا المعالجة مسبقا مع دواء مرشح يمكن تطعيمها على CAM وحدوث PNI التحقيق بالمقارنة مع الضوابط غير المعالجة. في الواقع، تم استخدام نموذج CAM لفحص المخدرات كخطوة وسيطة بين الدراسات في المختبر والتجارب قبل السريرية في الجسم الحي في القوارض19.
وسوف يختلف التصميم التجريبي مع الفرضية. على سبيل المثال، إذا كان اختبار دور بروتين معين على PNI، فإن المجموعة التجريبية تشمل DRG تطعيم مع الخلايا السرطانية المبالغة في البروتين، في حين أن مجموعة التحكم يجب أن تشمل DRG مع الخلايا المصابة بشكل ثابت مع ناقلات فارغة. ويمكن استخدام عدة تصاميم تجريبية مختلفة لمعالجة أسئلة محددة.
Protocol
بيان الأخلاقيات: تتم جميع التجارب التي تستخدم الفئران في هذا البروتوكول وفقا لقواعد IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها) من مؤسستنا. التجارب مع البيض في هذه الدراسة معفاة من تنظيم IACUC.
1. حضانة البيض (توقيت تقديري: 5 دقائق، يوم الصفر)
- الحصول على خالية من مسببات الأمراض التجارية الخصبة لوهمان البيض الأبيض Leghorn، ويفضل في اليوم الأول بعد الإخصاب. احتضان ستة بيضات لكل مجموعة تجريبية في حاضنة ترطيب البيض في 38 درجة مئوية و الرطوبة 54٪ لمدة 8 أيام مع التناوب كل ساعة. استخدام التناوب المنتظم للبيض لمنع الجنين من الالتصاق بأغشية البيض.
ملاحظة: قبل الحضانة، احتفظ بالبويضات في ثلاجة 18 درجة مئوية لوقف نمو الجنين لمدة أقصاها أسبوع واحد.
2- حصاد وإعداد الغازات التي نُفِّرت (التوقيت المقدَّر: 2 ح، اليوم الثامن)
ملاحظة: التجارب مع الفئران والجرذان تتطلب موافقة من (IACUC). وفي بعض البلدان، يتطلب استخدام بيض الدجاج أيضاً موافقة.
- الحصول على ستة إلى سبعة أسابيع من العمر Sprague دولى الفئران ( ~ 200 ز في الوزن) لاستخراج DRGs.
ملاحظة: يجب أن ينتج أحد الجرذان حوالي 40 من جرّات عنق الرحم والصدر. - في مجلس الوزراء تدفق الصفيح، والحصاد DRGs من مناطق عنق الرحم والصدر بعد بروتوكول لاستخراج DRG الماوس نشرت في مكان آخر22. اتبع الشكل 2 للتوجه حول كيفية حصاد DRGs.
- الإقنال على الفئران عن طريق ثقب القلب بعد إعطاء الكيتامين / Xylazine حقن intraperitoneally. تنظيف الجلد الفئران مع 70٪ الإيثانول وإزالة العمود الفقري الفئران باستخدام مقص. لا تقم بإجراء خلع عنق الرحم لأن هذا من شأنه أن يضر DRGs عنق الرحم.
- فصل مناطق عنق الرحم والصدر والقطني مع نفس المقص، بعد التمثيل التشريحي التخطيطي والصور الإجمالية المقدمة في الشكل 2A-D. ضع أقسام العمود الفقري في طبق ثقافة 10 سم مع 1X PBS للحفاظ على الأنسجة الرطب.
- مع مقص العظام حساسة، وفتح العظام الفقرية في الجوانب الظهرية والبطني، وفصل العمود الفقري في نصفين جانبيين (الشكل2E-F). ضع أقسام الأنسجة في طبق نظيف 10 سم مع 1X PBS الطازجة.
- باستخدام الملقط، فصل بلطف الحبل الشوكي من العظام الفقرية لتصور DRGs (الشكل 2G).
- مع ملقط غرامة عقدت تحت كل DRG، وفهمه وسحبه من تجويف العظام التي يتم إيداعها. لا تعقد DRG مباشرة لأن هذا سوف يسبب تلف الأنسجة. لا تقليم حزم محور من DRG (الشكل 2H).
ملاحظة: تجنب استخدام DRGs القطنية لأن هذه قد تقليل التكامل في CAM. بالنسبة لموقع منطقة DRG، اتبع الرسم التخطيطي والصور التشريحية الإجمالية على الشكل 2A-D.
- بعد الحصاد مباشرة، ضع كل DRG في وسط ثقافة DMEM مع 2% البنسلين/الستريبوميسين (القلم/العقد) و10% مصل جنين جنيني معطل للحرارة (FBS) للمساعدة في منع التلوث البكتيري للمجموعات DRGs. طبق الثقافة مع 4 مل من وسط الثقافة.
- بعد حصاد جميع DRGs، نقلها إلى طبق ثقافة جديدة مع متوسط ثقافة DMEM تستكمل مع القلم 2٪ / العقدة بالإضافة إلى FBS 10٪ وتحتوي على 1.25 ميكروغرام / مل من صبغة الفلورسنت الأحمر. احتضان لمدة 1 ح في حاضنة ثقافة الخلية. خلال هذا الوقت، إعداد البيض لتلقي DRG على النحو المبين أدناه (الخطوة 3).
ملاحظة: ينبغي أن يكون الفاصل الزمني بين حصاد DRGs والانتهاء من وضع العلامات الفلورسنت كافية لإعداد البيض; يمكن الاحتفاظ DRGs لبضع ساعات في الحاضنة.
3. إعداد البيض لDRG تطعيم (توقيت تقديري: 1 ساعة لاثني عشر بيضة، اليوم 8)
- في خزانة تدفق الصفيحة، قم بتعتيم الضوء وتبديل البيض للتحقق من الجدوى والمرحلة الجنينية. استبعاد البيض مع ضعف الأوعية الدموية، والبيض غير المخصب، أو البيض لا يتسق مع اليوم 8 بعد الإخصاب. عقد البيض بلطف مع كيس الهواء التي تحدث بشكل طبيعي نحو مصدر الضوء (الشكل3A).
- مع قلم رصاص، بمناسبة قذيفة البيض لتلقي فتحات (الشكل 3A-B).
- أولاً، حدد ارتباط الجنين النامي بـ CAM كسفينة متحركة داكنة ملحقة بغشاء البويضة وضع علامة على هذه المنطقة لتجنب التدخلات في هذه المنطقة.
- ثانياً، اختر منطقة نافذة التشغيل كمنطقة ذات أوعية دموية على الأقل 2 سم من مرفق الجنين وارسم دائرة قطرها 1.5 سم. تقريبا 1 سم من نافذة التشغيل، ورسم مربع 0.5 سم في منطقة أقل الأوعية الدموية.
- ثالثا، رسم منطقة كيس الهواء لاستبعادها من منطقة العملية. وضع علامة في منتصف كيس الهواء مع الصليب.
- مع أداة دوارة والحفر الحفر، 3 ملم في القطر، حفر قذيفة البيض في مربع ملحوظ (الشكل 3C). استخدام ملقط حادة لإزالة قشرة البيض دون إزالة غشاء قشرة البيض الخارجي (الغشاء الأبيض الحق تحت قذيفة) (الشكل3D). العمل بعناية لتجنب ثقب عرضي لهذا الغشاء.
- باستخدام نفس الحفر كما في الخطوة 3.3، وجعل ثقب دقيق في الصليب ملحوظ في منطقة كيس الهواء للسماح تدفق الهواء في البيض (الشكل 3E). يجب الحرص على عدم تطبيق الكثير من الضغط على البيضة، لتجنب كسر أو إتلافها.
- وضع 30 ميكرولتر من HBSS في فتحة مربعة، على الغشاء قشرة البيض الخارجي سليمة (الشكل3E). مع إبرة حقنة 30-G، وجعل ثقب دقيق في الغشاء الخارجي في هذه المنطقة المربعة (الشكل 3F).
- ضع البيضة في مصدر الضوء لتصور الكيس الهوائي. تطبيق الضغط على لمبة المطاط الشافطة ووضعها في ثقب صغير في منطقة كيس الهواء (الخطوة 3.4). الضغط الافراج عن المصباح حتى ترى فصل الأغشية اثنين في منطقة نافذة التشغيل (الشكل 3G)؛ كرر هذه الخطوة عدة مرات كما كنت في حاجة لتحقيق فصل كامل من الأغشية في منطقة نافذة التشغيل.
- كرر الخطوات 3.1-3.6 لجميع البيض.
- باستخدام نفس الحفر كما في الخطوة 3.3، حفر نافذة التشغيل الدائري مع الحرص على عدم تمزق غشاء قذيفة البيض الخارجي (الشكل 3H). تنظيف سطح البيض عن طريق الالتصاق بلطف شريط لاصق لإزالة جميع الجسيمات فضفاضة.
- مع ملقط حادة، وإزالة قذيفة البيض من منطقة حفر (الشكل 3I-J). المقبل، مع الملقط نفسه، وإزالة غشاء قذيفة البيض الخارجي (الشكل3K)،مع الحرص على عدم إدخال جزيئات قذيفة صغيرة داخل البيض لتقليل التلوث.
- تحديد CAM تقريبا في عمق 1 سم من سطح البيض. تغطية كل بيضة فتحت مؤقتا مع غشاء شمع البارافين لتجنب التلوث (الشكل3L).
- كرر الخطوات 3.8-3.10 لجميع البيض. ضع البيض مرة أخرى في حاضنة البيض دون دوران حتى تكون DRGs جاهزة للتطعيم.
4. تطعيم DRG على CAM (توقيت يقدر: 40 دقيقة، اليوم 8)
- إعداد طبق ثقافة 6 سم مع HBSS المتوسطة، لغسل DRGs قبل زرع. جلب البيض أعدت إلى مجلس الوزراء تدفق الصفيح ة ثقافة الخلية. إزالة غشاء البارافين من البيضة (الشكل 4A).
- مع ملقط معقمة غرامة، قبض بلطف واحد DRG من داخل وسط الثقافة. اغمسها في وسط HBSS لإزالة الوسط الزائد الذي يحتوي على صبغة الفلورسنت. عقد DRG بلطف جدا؛ وإلا، فإنه سوف التمسك الملقط.
- وضع DRG على CAM، مع الحرص على عدم ثقب الغشاء (الشكل 4B-C). إذا لزم الأمر، استخدم زوج آخر من الملقط للمساعدة في فصل DRG من طرف الملقط عند وضعه على CAM.
ملاحظة: إن الحفاظ على رطوبة DRG مع متوسط HBSS سوف يسهل أيضا انفصال عن الملقط. - تغطية البيضة مع خلع الملابس فيلم شفاف معقمة. تغطية جميع النوافذ والثقوب المصنوعة في قشرة البيض لتجنب التلوث البكتيري (الشكل4D).
- بعد تطعيم DRGs في جميع البيض، احتضان البيض في حاضنة ترطيب في 38 درجة مئوية والرطوبة 54٪ لمدة 2 أيام، دون التناوب.
5. تطعيم الخلايا السرطانية على CAM (توقيت يقدر: 1 ح 30 دقيقة، اليوم 10)
- في 48 ساعة قبل تطعيم الخلايا، لوحة الخلايا اللازمة في لوحات الثقافة. حساب 0.5 إلى 1 X 106 خلايا لكل بيضة لخلايا UM-SCC-1 من أجل توليد أورام ثلاثية الأبعاد في CAM. يجب أن تدرك أن رقم الخلية قد تختلف حسب خط الخلية.
- يستنشق وسط ويضاف [دتم] ثقافة وسط يكمّل مع 1% قلم/[سترب] بالإضافة إلى 10% [فس] و2.5 [غ/مل] من صبغ خضراء [فلورسنت]. احتضان لمدة 1 ح في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية. ثم، تحقق من شدة الفلورسنت على المجهر، ومتوسطة استنشق، وغسل مرة واحدة مع 1X PBS، وإضافة 0.25٪ التربسين لمدة تصل إلى 10 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي في 250 x ز لمدة 4 دقائق لتشكيل بيليه الخلية. يستنشق DMEM المتوسطة وإعادة تعليق في HBSS لغسل صبغة الفلورسنت الزائدة. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيتومتر.
- جلب البيض إلى مجلس الوزراء تدفق الصفيح ة ثقافة الخلية. مع مقص وملقط، وفتح خلع الملابس الفيلم الشفاف الذي يغطي البيض (الشكل 4E-F).
- جهاز طرد مركزي العدد المحسوب من الخلايا مرة أخرى، يستنشق متوسط HBSS وإعادة تعليق في تركيز نهائي من 0.5 إلى 1X106 خلايا لكل 5 ميكرولتر من نفس الوسط (الشكل4G). إعداد الكمية اللازمة لمجموع عدد البيض (5 μL من تعليق الخلية لكل بيضة).
- ضع 5 ميكرولتر من محلول الخلية على كاميرا كام، حوالي 2 مم من DRG (الشكل4H). الحفاظ على مسافات موحدة بين DRG والخلايا. يجب الحرص الشديد على عدم إزعاج البيضة لتقليل انتشار الخلايا.
ملاحظة: لبدء زرع الخلايا، اختر البيض الذي يكون سطح CAM جافًا بصريًا عليه. إذا كان السطح رطباً جداً، يمكن أن تنتشر الخلايا ولا تشكل أوراماً منتظمة. - تغطية البيضة مع خلع الملابس فيلم جديد كما هو الحال في الخطوة 4.4. زرع الخلايا في جميع البيض. احتضان البيض في حاضنة ترطيب في 38 درجة مئوية و الرطوبة 54٪ لمدة 7 أيام، دون التناوب.
6. حصاد CAM (توقيت تقديري: 1 ساعة لعشرات البيض، اليوم 17)
- إعداد لوحات 6 جيدا مع 4٪ PFA (بارافورمالديهايد) pH7.0، بئر واحد لكل بيضة، 2 مل في البئر.
- أحضر البيض إلى مقعد المختبر. باستخدام إبرة تعلق على حقنة لثقب خلع الملابس الفيلم، إسقاط حوالي 300 ميكرولتر من PFA على CAM لتشديد قليلا كام، وبالتالي تسهيل عملية الحصاد. كرر هذا لجميع البيض.
- مع مقص، وإزالة النصف العلوي من قذيفة البيض (حيث يقع نافذة التشغيل) مع CAM تعلق عليه (الشكل 4ط). خفض حجم هذا النصف إلى ما يقرب من 3 سم في القطر، والحفاظ على جزء من CAM حيث تم تطعيم DRG والخلايا السرطانية في المركز (الشكل4J). امسك CAM مع ملقط غرامة وفصله من قذيفة البيض في حين وضعه في PFA. توجيه DRG والخلايا السرطانية التي تواجه صعودا (الشكل 4K-L).
ملاحظة: يجب أن تتضمن منطقة 3 سم كل من DRG والخلايا. ويعتبر DRG بسهولة على أنها كتلة صغيرة تعلق على CAM، ولكن الخلايا السرطانية من الصعب في بعض الأحيان لتحديد في الامتحان الإجمالي. - بدلا من ذلك، مع مقص، وتوسيع نافذة التشغيل إزالة قذيفة البيض من الجزء العلوي من البيض مع الحفاظ على CAM في مكانها؛ إزالة ما يقرب من 1 سم وراء إطار التشغيل (الشكل4M)وتحديد DRG والخلايا على CAM (الشكل4N-O). مع ملقط دقيق، عقد كام في واحدة من الحواف ورفعه بلطف. مع مقص دقيق حاد، وقطع بلطف كام لإزالة منطقة دائرية، ما يقرب من 3 سم في القطر (الشكل4P)،ووضع CAM في PFA مع DRG والخلايا السرطانية التي تواجه صعودا.
ملاحظة: تجنب التمدد أو عقد CAM مع ملقط في أماكن متعددة لتقليل تلف الأنسجة التي قد تولد التحف المجهرية. - ضع كل غشاء كام في بئر واحد (الشكل 4L). فهم بلطف حواف CAM لنشر الأنسجة المفتوحة في PFA أو هز بلطف لوحة حتى يتم الكشف عن CAM، لتجنب القطع الأثرية أضعاف.
- التموي على الجنين (اليوم 17) عن طريق قطع الرأس السريع. إصلاح الأنسجة المقطوعة في PFA لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت، استبدل PFA بـ 1x PBS وخزن الأنسجة في PBS عند 4 درجة مئوية حتى يتم تضمينها في البارافين للتقسيم. تجنب الإفراط في التثبيت التي من شأنها أن تضر الأوعية الدموية الحساسة من CAM.
- باستخدام المجهر الاستريوني، تصوير الأغشية في غضون 2 أيام بعد الحصاد لتجنب فقدان إشارات الفلورسنت.
Representative Results
عند تحسينها، فإن هذه الطريقة لديها تكامل DRG بالقرب من 100% في CAM. النتائج التمثيلية لتكامل DRG مبينة في الشكل 5A-B. دمج DRG في CAM مهم لأنه يوفر القدرة على البقاء للأنسجة DRG خلال التجربة. مجهريا، وينظر إلى DRG داخل النسيج الضام من CAM (H & E وصمة عار). وغالبا ما ينظر إلى الأوعية الدموية داخل أنسجة DRG, مما يشير إلى أن إمدادات الدم CAM هو رعاية الأنسجة المطعمة. يتم تحديد الأورام المزروعة أيضا على CAM من قبل H & E; اعتمادا على مدى الغزو الحاضر، قد تقدم الأورام مع لا شيء إلى العديد من الجزر الورم غزو النسيج الضام (الشكل5C-D). ممثل الشكل 5E-F يظهر CAM حصادها على التصوير برايتفيلد والفلورسنت المدمجة. UM-SCC-1 الخلايا المبالغة في التعبير عن مستقبلات Galanin 2 قدمت زيادة غزو DRG بالمقارنة مع الخلايا السيطرة (الشكل 5G-H). ويلاحظ التفاعل بين السرطان وDRG كخلايا سرطانية تقدم غزو الاتجاه نحو DRG (الشكل 5H).
يتم إجراء تحليل البيانات بطرق مختلفة. ويلاحظ الغزو الاتجاهي للخلايا السرطانية نحو DRG كمتغير ثنائي وعدد من البيض عرض هذا النمط من الغزو يتم حسابها في كل مجموعة. يتم حساب الاختلافات الإحصائية بين المجموعات باستخدام اختبار ذو حدين للنسب. يتم قياس القرب بين الخلايا السرطانية وDRG، ومنطقة الورم باستخدام ImageJ6 ويتم تقييم الاختلافات بين المجموعات باستخدام اختبار الطالب t. لضمان الدقة مع تحليل ImageJ، يجب أن تؤخذ جميع الصور من نفس التجربة على ضوء على قدم المساواة وإعدادات التعرض. بعد ضبط عتبة الصورة وسطوع جميع الصور باستخدام نفس المعايير، يتم استخدام أداة تحليل الجسيمات لقياس منطقة الورم وأداة القياس الخطي يقيس مسافات الورم-DRG. من المهم استخدام الإعداد المستمر لحجم الجزيئات التي تم تحليلها لجميع الصور عبر مجموعات مختلفة. في بعض الحالات، تنمو الأورام أكثر سمكاويمكن قياسها يدويا ً مع الفرجار الرقمي، مما يسمح بقياس الحجم.
يمكن استخدام أقسام من الأنسجة كام جزءا من البارافين، H & E وصمة عار أو المناعية للخلايا الظهارية (مضاد اتلاف مضاد رد الفعل للأنواع البشرية)، مما يسمح لتقييم الغزو داخل النسيج الضام. يتم تحديد حجم الغزو كعدد الجزر الورم في النسيج الضام لكل بيضة. يمكن استخدام الفلور المناعي للكولاجين الرابع لتسليط الضوء على غشاء الطابق السفلي. أيضا، إذا كان استخدام الخلايا السرطانية التي تحمل علامة GFP، يتم تسهيل تحديد هذه الخلايا في أقسام الأنسجة دون كيمياء مناعية للسيتوكيراتين. يتم مناقشة الانبثاث وتحليل تكوين الأوعية في تجارب CAM في أماكن أخرى10,17.
الشكل 1: الجدول الزمني للتجربة بما في ذلك الخطوات الرئيسية في الأيام 0 و 8 و 10 و 17. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استخراج DRG في اليوم 8 . أ. مخطط الجرذان يوضح الموقع التشريحي للعمود الفقري. ب. رسم تخطيطي لتكوين فقرات الفئران يظهر مناطق مختلفة من الجسم؛ الأخضر لعنق الرحم، والأزرق الداكن لالصدر، والبرتقال للأسفل والأزرق الفاتح للفقرات العجزية. جيم - دال الجانب البطني من العمود الفقري الفئران بعد الختان الجراحية. فصل المناطق كما هو موضح في B. هـ. - تشريح الفقرات لفتح قناة الحبل الشوكي، وفصل الفقرات إلى قسمين جانبيين يحتويان على الغازات النخاعية، وينبغي أن يقطع القسم الجانب الظهري والبطني لكل عظمة فقرية في خط الوسط. الجانبالإجمالي من العمود الفقري الصدري المفتوح. بعدأن يتم تشريد الحبل الشوكي، يمكن رؤية DRGs بسهولة في القنوات الفقرية (رؤوس الأسهم التي تشير إلى 3 DRGs). H.صورة مجهرية واحدة DRG (السهم) مع حزم محور المقابلة (رأس السهم). أشرطة المقياس: C، D، F، و G، 1 سم؛ H,1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إعداد البيض في اليوم 8. أ-بي. تحديد الأوعية الدموية البيض والعلامات قبل الإجراء. الأسهم على نقطة إلى كيس الهواء التي تحدث بشكل طبيعي. جيم - دال حفر وافتتاح قذيفة البيض على علامة افتتاح مربع. السهم على D يشير إلى غشاء قشرة البيض الخارجي سليمة بعد إزالة قذيفة مع مساعدة من ملقط حادة. E.يتم ثقب الصليب ملحوظ على كيس الهواء مع الحفر للسماح تدفق الهواء في البيض (رأس السهم). يتم وضع 30 لتر من الخلايا المتوسطة على غشاء قشرة البيض الخارجي على الفتحة المربعة. F.مع إبرة حقنة غرامة، يتم ثقب غشاء قشرة البيض الخارجي حيث وضعت HBSS سابقا. G.يتم تطبيق الضغط على لمبة الشافطة المطاطية في حين تعلق على ثقب حفر على كيس الهواء. عندما يتم تحرير ضغط الاصبع، يتم تفريغ الهواء، وتوليد كيس الهواء الاصطناعي (الأسهم البيضاء) التي ينبغي أن تمتد إلى نافذة التشغيل. H.يتم حفر حواف نافذة التشغيل في موقف مواز تقريبا لقذيفة البيض، لتجنب ثقب عرضي. I-J. إزالة قشرة البيض مع ملقط حادة. K.إزالة غشاء قشرة البيض الخارجي مع ملقط حادة، مع الحرص على عدم إدخال الجسيمات على CAM (لاحظ في سم تحت السطح). يتمتغطية البيض بشكل مؤقت مع غشاء شمع البارافين ووضعها مرة أخرى في الحاضنة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تطعيم DRG، والخلايا، وحصاد CAM: في اليوم 8: A. CAM لاحظ بسهولة بعد إزالة غشاء الشمع البارافين. باء - جيم مع ملقط غرامة، يتم وضع DRG على CAM. D.. البيض مغطى بملابس الفيلم ووضعها في الحاضنة. الأسهم تشير إلى الفتحات التي يتم تغطيتها. في اليوم 10: E-F. تتم إزالة خلع الملابس الفيلم ويقع DRG (رأس السهم على F). G-H. يتم إسقاط 5 μL من حل الخلية على CAM على مسافة ~2 مم من DRG. في اليوم 17: I-L وM-P تظهر نهجين مختلفين تستخدم لحصاد CAM. يتمفتح قشرة البيض مع مقص غرامة بدءا من كيس الهواء حفر ثقب حتى يتم إزالة النصف العلوي من البيض. ي.يتم تخفيض قذيفة البيض التي تحتوي على CAM في الحجم إلى ما يقرب من 3 سم. مع ملقط غرامة، يتم فصل CAM من قذيفة البيض ووضعها في PFA. M-O. يتم تنفيذ توسيع نافذة التشغيل لتصور DRG والخلايا السرطانية على CAM. يشير السهم إلى الورم والسهم يشير إلى DRG. P.وCAM هو استيعابها مع ملقط غرامة، وقطع مع مقص حاد، ووضعها في PFA كما هو مبين في L. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية. A. قسم H & E تبين التكامل بين DRG في CAM. ب. تكبير أعلى من A; السهام تظهر الأوعية الدموية CAM في DRG. C.UM-SCC-1 الخلايا تطعيم على CAM وحصادها بعد أربعة أيام من تطعيم (H & E وصمة عار). D.التكبير العالي من C تظهر الجزر الورم الغازية في النسيج الضام CAM (السهام). E.صورة استريوميكروي إجمالي من CAM تطعيم مع خلايا UM-SCC-1-GALR2 والفئران DRG، حصادها في اليوم 17. F.دمج الفلورسنت والصور brightfield تسليط الضوء على DRG المسمى في الخلايا الحمراء والسرطان وصفت باللون الأخضر. G-H. ميكروميكروسكوب الفلورسنت من CAM تطعيمها مع DRG وUM-SCC-1-GALR2 مقابل خلايا التحكم، مما يوضح غزو الاتجاه من الخلايا UM-SCC-1-GALR2 إلى DRG (H). أشرطة المقياس: A-D،500 ميكرومتر؛ E-H,2 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خطوه | المشكله | السبب | حل | ||||||
| 3-2-1 | غير قادر على تحديد مرفق الجنين. | موقف المرفق من الصعب أن نرى في حين أن البيض لا يزال. | تدوير البيضة بسرعة جانبية لتكون قادرة على رؤية وعاء طويل تعلق على غشاء البيض. | ||||||
| 3.3 و 3.8 | ثقب غشاء قشرة البيض الخارجي أثناء الحفر. | تحديد موقع خاطئ للحفر. | ضع المثقاب بالتوازي مع قشرة البيض أثناء الحفر. إذا كان الغشاء مثقبا ً في الخطوة 3.3 ، فلا حاجة إلى إجراء المزيد من الثقب مع إبرة كما هو مذكور في الخطوة 3.5. إذا حدث نزيف، تجاهل البيضة. | ||||||
| 4.3 | DRG العصي على ملقط. | DRG جافة. | DRG الرطب مرة أخرى في HBSS و / أو استخدام إبرة غرامة للمساعدة في فصل DRG من ملقط. | ||||||
| 5.2 | الخلايا ليست تماما وصفت مع صبغة الفلورسنت. | وقت الحضانة. تتطلب بعض الخلايا المزيد من الوقت لتسمية. | احتفظ بالخلايا لمدة ساعة إضافية في الوسائط مع صبغة الفلورسنت. | ||||||
| 5.6 | فقاعة الهواء على قطرة الخلية. | استخدام كل السائل في طرف الماصة. | تحميل 1μL أكثر من حجم المطلوب ولا تستخدم ميكرولتر النهائي من الماصة عند زرع الخلايا. وهذا سوف تجنب فقاعات الهواء في مزيج الخلايا. | ||||||
| 6.3 | غير قادر على تحديد DRG أو الخلايا عند حصاد CAM. | (الخلايا السرطانية تنتشر | إذا لم يتم رؤية DRG، حصاد مساحة أكبر من CAM ووضعها في وعاء أكبر لتثبيت. تحقق من DRG ووضع الخلية تحت الفلورسنت في المجهر ستيريو، ومن ثم تقليم كام إلى حجم أصغر لتضمين البارافين. | ||||||
الجدول 1: جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها
Discussion
وCAM-DRG في نموذج الحي قدم هنا يعالج العجز من النماذج السابقة من خلال إظهار التفاعل العصبي والورم قبل الغزو المادي للعصب من قبل الخلايا السرطانية. معظم الدراسات في الجسم الحي من PNI التركيز على انتشار الورم وتثبيط وظيفة الحركية، وتعتمد على الحقن المباشر للخلايا السرطانية في الأعصاب الوركية23،24،25. حقن العصب الوركي هو نموذج في الجسم الحي من PNI حيث يتم حقن الخلايا السرطانية في الماوس أو العصب الوركي الفئران حيث ينمو الورم في وقت لاحق. نماذج الحقن مفيدة لإظهار تطور الورم المدمر والألم الناجم عن الخلايا السرطانية داخل الأعصاب. نموذج العصب الوركي هو أيضا مناسبة لدراسة العوامل التي تسمح للخلايا السرطانية لتزدهر في العصب ولكن يفتقر إلى القدرة على تقييم المرحلة المبكرة من PNI، لأنه يدخل الخلايا مباشرة في العصب، وتجاوز الأغلفة العصبية. في نهج مختلف، تم استخدام الطعوم الورم تقويم الرحم المزروعة جراحيا لوصف أهمية الألياف العصبية الأدرينالية والكولينية في تعزيز تطور سرطان البروستاتا، مما يشير إلى دور بارز للأعصاب في تطور الورم 26. يتكون هذا النموذج من الاستئصال الكيميائي للأعصاب القوية واللاتعاطفية. وتسللت الألياف اللاتعاطفية إلى أنسجة الورم، وهي عملية تتعلق بـ PNI، ولكن النموذج لم يستخدم على وجه التحديد لتقييم التفاعلات الجسدية بين العصب والورم. يسمح نموذج CAM-DRG بالتحقيق في التفاعلات بين العصب والسرطان أثناء PNI. وعلاوة على ذلك, نماذج مورين مكلفة وتستغرق وقتا طويلا بالمقارنة مع نموذج CAM. نقترح استخدام نموذج CAM-DRG للدراسات الميكانيكية من PNI.
بعض المزايا لنهج CAM-DRG تشمل تقييم PNI وغيرها من الأنماط الظاهرية، مثل نمو الورم، الانبثاث، وتولد الأوعية الدموية. يمكن استخدام تحديد الحمض النووي البشري على الحد الأدنى و/أو في الكبد للكشف عن الانبثاث في خطوط الخلايا السرطانية البشرية10، وهو نهج تجريبي أكثر حساسية مقارنة بتقسيم الأنسجة وتلطيخها، والتي قد لا تكشف عن الانبثاث اتس.
وطريقة CAM-DRG لها بعض القيود، بما في ذلك الإطار الزمني للمراقبة القصيرة. الجهاز المناعي للجنين نشط من الناحية الفسيولوجية بحلول اليوم 1827، عندما قد يحدث الرفض وعملية التهابية ، مما يحد من الوقت التجريبي. ومن المهم أيضا أن تنظر في المسافة عند تطعيم الخلايا السرطانية بالقرب من DRG; أكبر مسافات سرطان DRG قد يضعف التفاعلات الجزيئية بين الخلايا السرطانية والأعصاب، أو يمكن أن تؤخر الاتصال الجسدي بين كل من مكونات النموذج. أيضا، إذا كانت الأجنة أقدم من المنصوص عليها في هذا البروتوكول، قد حركات الجنين إزاحة الخلايا السرطانية. لذلك، من المهم استخدام البيض بما يتفق مع اليوم 10 بعد الإخصاب لتطعيم الخلايا.
منذ لم يتم تطوير الجهاز المناعي بشكل كامل قبل يوم 1827, والورم microenvironment في CAM يشبه ذلك من نماذج المورين المثبطة للمناعة غالبا ما تستخدم لدراسات السرطان. ولذلك، هذا النموذج ليس مفيدا لتقييم دور الخلايا المناعية في تطور الورم. وهناك قيد آخر هو محدودية توافر الكواشف لأنواع الدجاج، مثل الأجسام المضادة والسيتوكينات والتمهيديات.
ويقتضي تنفيذ هذا البروتوكول ممارسة ًا دقيقة؛ ومع ذلك، يمكن أن يتم ذلك من قبل عضو مختبر دون الحاجة إلى منشأة أساسية متخصصة. الحفر من قشرة البيض يتطلب التدريب. ينصح بممارسة على البقال (غير المخصب) البيض قبل محاولة هذا النموذج للمرة الأولى. يمكن تحقيق بقاء الجنين العالي ونجاح النموذج إذا تم اتباع بعض الخطوات الحاسمة لتجنب العدوى: الوقاية المناسبة من المضادات الحيوية DRGs في 2% القلم / العقدة، والعمل في مجلس الوزراء تدفق الصفيح، وتجنب تشتت جزيئات قذيفة البيض على كام. ومن الأهمية بمكان أيضا للحفاظ على الرطوبة مستقرة خلال الوقت حاضنة البيض مجموع. نوصي بزيادة عدد البيض لكل مجموعة حتى يتم إتقان هذه التقنية. المشاكل الأكثر شيوعا ً بالنسبة للعاملين في المختبرات عديمي الخبرة هي تلوث البيض وتقنية غير دقيقة لتطعيم الخلايا.
كما يتطلب حصاد مجموعة DRG التدريب؛ الممارسة في حصاد DRGs للتجارب في المختبر8 قبل محاولة نموذج في الجسم الحي ينصح. ثقافة DRG في المختبر هو فرصة لتحسين الظروف وتحسين تقنية لتقصير مدة استخراج DRG. مطلوب اهتمام خاص لتقنية الحصاد عند استيعاب DRG مع ملقط. ولا ينبغي أن تعقد مجموعة الـ DRG مباشرة؛ يجب أن يتم الضغط تحته. نوصي باستخدام العدسة المكبرة لتصور أفضل DRG أثناء الاستخراج.
الأهم من ذلك، عند تنفيذ هذا النموذج لأول مرة، يجب أن تكون جميع الشروط الأمثل لخط الخلية المطلوب. تم تحسين هذا النموذج للفأر DRG وخط الخلية HNC UM-SCC-1. قد يتطلب استخدام DRG الماوس وأنواع الخلايا السرطانية الأخرى التحسين. مع تركيز أعلى من الخلايا المطعمة، والأورام تميل إلى النمو أكثر سمكا وأكثر صلابة، مما يسهل قياسات الورم. مع الأخذ في الاعتبار بيض اتلال متعددة لكل مجموعة والتركيز المناسب للخلايا لكل بيضة، قد تكون هناك حاجة إلى عدة ملايين من الخلايا لكل تجربة. ولتيسير التخطيط، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار معرفة وقت مضاعفة الخلايا. بالنسبة لبعض الخطوات الهامة في هذا البروتوكول، يتم توفير جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول1).
Disclosures
ولم يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل من خلال منح المعهد الوطني للصحة/المعهد الوطني للتنمية الوطنية للشرطة الوطنية للتنمية في مجال مكافحة المخدرات DE027551 وDE022567 (NJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
| ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
| CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
| CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
| Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
| DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
| DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
| Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
| Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
| Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
| Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
| Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
| Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
| HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
| HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
| Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
| PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
| PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
| Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
| Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
References
- Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D'Silva, N. J. Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of dental research. 97 (7), 742-750 (2018).
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer: a review of the literature. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Schmitd, L. B., et al. Redefining Perineural Invasion: Integration of Biology With Clinical Outcome. Neoplasia (New York, N.Y). 20 (7), 657-667 (2018).
- Chinn, S. B., et al. Impact of perineural invasion in the pathologically N0 neck in oral cavity squamous cell carcinoma. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 149 (6), 893-899 (2013).
- Tai, S. K., Li, W. Y., Yang, M. H., Chu, P. Y., Wang, Y. F. Perineural invasion in T1 oral squamous cell carcinoma indicates the need for aggressive elective neck dissection. The American journal of surgical pathology. 37 (8), 1164-1172 (2013).
- Scanlon, C. S., et al. Galanin modulates the neural niche to favour perineural invasion in head and neck cancer. Nature communications. 6, 6885 (2015).
- Amit, M., et al. Upregulation of RET induces perineurial invasion of pancreatic adenocarcinoma. Oncogene. 36 (23), 3232-3239 (2017).
- Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (119), (2017).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. The Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Busch, C., Krochmann, J., Drews, U. The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion. PloS one. 8 (1), e53970 (2013).
- Li, M., et al. The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (104), (2015).
- Ota, I., Li, X. Y., Hu, Y., Weiss, S. J. Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20318-20323 (2009).
- Murphy, J. B. TRANSPLANTABILITY OF TISSUES TO THE EMBRYO OF FOREIGN SPECIES : ITS BEARING ON QUESTIONS OF TISSUE SPECIFICITY AND TUMOR IMMUNITY. The Journal of experimental medicine. 17 (4), 482-493 (1913).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nature. 1 (1), 85-91 (2006).
- Auerbach, R., Arensman, R., Kubai, L., Folkman, J. Tumor-induced angiogenesis: lack of inhibition by irradiation. International journal of cancer. 15 (2), 241-245 (1975).
- Banerjee, R., et al. The G protein-coupled receptor GALR2 promotes angiogenesis in head and neck cancer. Molecular cancer therapeutics. 13 (5), 1323-1333 (2014).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer research. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Moreno-Jimenez, I., et al. The chorioallantoic membrane (CAM) assay for the study of human bone regeneration: a refinement animal model for tissue engineering. Scientific reports. 6, 32168 (2016).
- Vu, B. T., et al. Chick chorioallantoic membrane assay as an in vivo model to study the effect of nanoparticle-based anticancer drugs in ovarian cancer. Scientific reports. 8 (1), 8524 (2018).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC research notes. 9, 82 (2016).
- Cavel, O., et al. Endoneurial macrophages induce perineural invasion of pancreatic cancer cells by secretion of GDNF and activation of RET tyrosine kinase receptor. Cancer research. 72 (22), 5733-5743 (2012).
- Guo, K., et al. Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling. Molecular cancer therapeutics. 12 (3), 264-273 (2013).
- Deborde, S., et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. Journal of visualized experiments : JoVE. (134), (2018).
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. 341 (6142), Science. New York, N.Y. 1236361 (2013).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
