Perineural invasion er en aggressiv fænotype for hoved-og nakke planocellulære karcinomer og andre tumorer. Kyllingen chlorioallantoismembranerne membran model er blevet brugt til at studere angiogenese, kræft invasion, og metastaser. Her demonstrerer vi, hvordan denne model kan udnyttes til at vurdere perineural invasion in vivo.
Perineural invasion er en fænotype, hvor kræft omgiver eller invaderer nerverne. Det er forbundet med dårligt klinisk resultat for hoved-og nakke planocellulært karcinom og andre kræftformer. Mekanistiske undersøgelser har vist, at den molekylære kryds stilk mellem nerver og tumorceller forekommer før fysisk interaktion. Der er kun få in vivo modeller til at studere perineural invasion, især for at undersøge tidlig progression, før fysiske nerve-tumor interaktioner forekomme. Kyllingen chlorioallantoismembranerne membran model er blevet brugt til at studere kræft invasion, fordi kælderen membran af den chorioniske epitel efterligner den af humant epitelial væv. Her har vi repurposed chick chlorioallantoismembranerne membran model til at undersøge perineural invasion, podet rotte rygrod ganglier og menneskelige hoved og hals pladecellekarcinom celler på den chorioniske epitel. Vi har demonstreret, hvordan denne model kan være nyttigt at vurdere kræftcellers evne til at invadere neurale væv in vivo.
Perineural invasion (PNI) er en understuderet fænotype i kræft, som er forbundet med høj sygdom recidiv og dårlig overlevelse hos patienter med hoved-og nakke planocellulært karcinom (HNC)1. PNI defineres mikroskopisk som tumorceller i eller omkring nerverne2,3. Når PNI detekteres, vil patienterne sandsynligvis få adjuverende behandlinger såsom elektiv hals dissektion og/eller strålebehandling4,5. Men, disse behandlinger er aggressive, og ikke PNI-specifikke. Faktisk er der ingen terapi til at blokere PNI, primært fordi de mekanismer, der underliggende nerve-tumor interaktioner er stadig dårligt forstået.
Forskellige molekylære mekanismer har været impliceret i nerve-tumor tiltrækning; tumorer og stromale celler frigive neuropeptider og vækstfaktorer for at fremme neuritogenesis6,7. Når de er dyrket sammen in vitro, har HNC-celler og dorsalrodsganglier (DRG) en robust respons; virkninger på tumor celle invasion og neuritogenesis kan ses efter et par dage i kultur6,8,9. Men, der er en mangel på passende in vivo modeller til at rekapitulere tumor-nerve interaktioner før invasionen. Her præsenterer vi en in vivo PNI model til at studere tidlige interaktioner mellem HNC-celler og nerver6. Vi tilpassede chick chlorioallantoismembranerne membran (CAM) model til at omfatte en neurale komponent, podning en DRG i cam, efterfulgt af et transplantat af kræftceller til at efterligne en innerveret tumor mikromiljø.
CAM-modellen er blevet brugt med succes til at vurdere invasionen af celler gennem kælderen membran, der efterligner tidlige invasive stadier af carcinomer og melanom10,11,12. CAM består af øvre chorioniske epitel, mellemliggende mesenchyme, og lavere allantois epitel. Den chorioniske epitel er strukturelt ligner humant epitel10,13 i, at kollagen-IV-rige kælder membran simulerer kælderen membran, der adskiller det orale epitel fra det underliggende bindevæv. Da den første tumor grafts blev udført i cam i 191314, mange tilpasninger af metoden blev udviklet for at give mulighed for vurdering af angiogenese15,16,17, tumorprogression, og metastase18. Det er vigtigt, at teknikken med pode tumorer på CAM-modulet har ændret sig meget lidt, men applikationerne er i konstant udvikling. Der er offentliggjort analyser af stigende kompleksitet, herunder lægemiddel screening19, knoglevæv Engineering20og nanopartikel baserede anticancerlægemidler21.
Vores laboratorium bruger en CAM-DRG-model, hvor et pattedyrs DRG isoleres og podes på overfladen af det øvre CAM. Når DRG bliver inkorporeret i CAM-modulet, podes HNC-cellerne i nærheden af DRG og får lov til at interagere med DRG, før hele in vivo-systemet høstes og analyseres. Vigtigere, systemet tillader ex-vivo visuel observation af både DRG og tumor ved fluorescens mærkning af DRG og tumorceller. Denne protokol omfatter flere trin med forskellige kompleksitetsniveauer, der udføres inden for 17 dage, fra inkuering af æg til høst af CAM (figur 1). Celler, der udtrykker forskellige interesse proteiner, kan testes i denne model for at belyse de molekylære veje, der er ansvarlige for nerve invasion i kræft, og også for screening af lægemidler til direkte at målrette neurale invasion. Celler, der forbehandles med et kandidatstof, kan podes på CAM og forekomsten af PNI undersøgt i forhold til ubehandlet kontrol. CAM-modellen er faktisk blevet anvendt til lægemiddel screening som et mellemliggende trin mellem in vitro-undersøgelser og prækliniske in vivo-forsøg hos gnavere19.
Den eksperimentelle design vil variere med hypotesen. For eksempel, hvis test af rollen som et specifikt protein på PNI, den eksperimentelle gruppe vil omfatte DRG podet med tumorceller overudtrykker proteinet, mens kontrolgruppen bør omfatte DRG med celler stabilt transficeret med Tom vektor. Flere forskellige eksperimentelle designs kan bruges til at løse specifikke spørgsmål.
CAM-DRG in vivo model præsenteret her omhandler underskud af tidligere modeller ved at demonstrere nerve-tumor interaktion før fysisk invasion af nerve af tumorceller. De fleste in vivo-studier af PNI fokuserer på tumor spredning og hæmning af motorisk funktion, og afhænger af direkte injektion af tumorceller i sciatiske nerver23,24,25. Den iskiatiske nerve injektion er en in vivo model af PNI, hvor kræftceller injiceres i en mus eller rotte sciatiske nerve, hvor tumoren efterfølgende vokser. Injektion modeller er nyttige til at vise destruktive tumorprogression og smerter som følge af tumorceller i nerver. Den sciatiske nerve model er også velegnet til studiet af faktorer, der tillader kræftceller til at trives i nerven, men mangler evnen til at vurdere den tidlige fase af PNI, fordi det introducerer celler direkte ind i nerve, omgåelse nerve sakse. I en anden tilgang, kirurgisk implanteret ortotopic tumor grafts blev brugt til at karakterisere betydningen af adrenerge og kolinerge nervefibre i at fremme prostatacancer progression, hvilket tyder på en fremtrædende rolle af nerver i tumorprogression 26. denne model bestod af kemisk ablation af murine sympatiske og parasympatiske nerver. De parasympatiske fibre infiltreret tumor væv, en procesrelateret til PNI, men modellen blev ikke specifikt brugt til at vurdere fysiske interaktioner mellem nerve og tumor. CAM-DRG-modellen gør det muligt at undersøge interaktioner mellem nerve og kræft under PNI. Desuden er murine modeller dyre og tidskrævende i forhold til CAM-modellen. Vi foreslår at bruge CAM-DRG modellen til mekanistiske studier af PNI.
Nogle fordele ved CAM-DRG tilgang omfatter vurdering af PNI og andre fænotyper, såsom tumorvækst, metastaser, og angiogenese. Identifikation af humant DNA på den nedre CAM og/eller i leveren kan anvendes til påvisning af metastaser af humane Cancer cellelinjer10, en mere følsom eksperimentel tilgang sammenlignet med vævs skæring og farvning, som ikke kan afsløre små metastaser.
CAM-DRG-metoden har nogle begrænsninger, herunder den korte observations tidsramme. Embryoets immunsystem er fysiologisk aktivt på dag 1827, når afstødning og en inflammatorisk proces kan finde sted, hvilket begrænser forsøgs tiden. Det er også vigtigt at overveje afstanden, når pode tumorceller tæt på DRG; større DRG-Cancer afstande kan forringe de molekylære interaktioner mellem tumorceller og nerve, eller kan forsinke den fysiske kontakt mellem begge komponenter i modellen. Også, hvis embryonerne er ældre end fastsat i denne protokol, embryo bevægelser kan fortrænge tumorcellerne. Derfor er det vigtigt at bruge æg i overensstemmelse med dag 10 post-befrugtning for celletransplantation.
Da immunsystemet ikke er fuldt udviklet før dag 1827, tumor mikromiljø i cam svarer til den immunsupprimerede murine modeller ofte anvendes til kræft undersøgelser. Derfor, denne model er ikke nyttigt at vurdere den rolle, immunceller i tumorprogression. En anden begrænsning er den begrænsede tilgængelighed af reagenser til kyllinge arter, såsom antistoffer, cytokiner og primere.
Det kræver øvelse at udføre denne protokol nøjagtigt. Det kan dog gøres af et laboratorie medlem uden behov for en specialiseret kerne facilitet. Boring af ægskallen kræver træning. Øve på købmand (ikke-befrugtede) æg anbefales, før du forsøger denne model for første gang. Høj embryonal overlevelse og succes af modellen kan opnås, hvis nogle kritiske skridt til at undgå infektion følges: passende antibiotika profylakse af DRG i 2% pen/STREP, arbejder i en laminar flow kabinet, og undgå spredning af æg Shell partikler på CAM-modulet. Det er også afgørende at holde stabil luftfugtighed under den samlede æginkubationstid. Vi anbefaler at øge antallet af æg pr gruppe, indtil teknikken er mestret. De hyppigste problemer for uerfarne laboratoriepersonale er ægkontaminering og unøjagtig teknik til celletransplantation.
DRG høst kræver også uddannelse; praksis ved høst af Drg’er til in vitro-eksperimenter8 før forsøg med in vivo-modellen anbefales. Den in vitro DRG kultur er en mulighed for at optimere forholdene og forbedre teknikken til at forkorte varigheden af DRG udvinding. Særlig opmærksomhed på høst teknik er nødvendig, når gribe DRG med pincet. DRG bør ikke holdes direkte; Tryk skal påføres nedenunder. Vi anbefaler brug af Forstørrelsesglas for bedre at kunne visualisere DRG under udsugning.
Vigtigt, når du udfører denne model for første gang, bør alle betingelser være optimeret til den ønskede cellelinje. Denne model blev optimeret til rotte DRG og HNC cellelinje Umm-SCC-1. Brugen af mus DRG og andre kræft celletyper kan kræve optimering. Med en højere koncentration af podede celler, tumorer tendens til at vokse tykkere og stivere, hvilket letter tumor målinger. Når der tages hensyn til flere æg for hver gruppe og en passende koncentration af celler for hvert æg, kan der kræves flere millioner celler for hvert forsøg. For at lette planlægningen bør der tages hensyn til kendskabet til fordoblings tiden for cellerne. Der findes en fejlfindings tabel for nogle vigtige trin i denne protokol (tabel 1).
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH/NIDCR tilskud DE027551 og DE022567 (NJD).
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |