Perineural आक्रमण सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और अन्य ट्यूमर के लिए एक आक्रामक phenotype है. लड़की chorioallantoic झिल्ली मॉडल एंजियोजेनेसिस, कैंसर आक्रमण, और मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ हम कैसे इस मॉडल vivo में perineural आक्रमण का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है प्रदर्शन.
Perineural आक्रमण एक phenotype जिसमें कैंसर चारों ओर या नसों पर आक्रमण है. यह सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और अन्य कैंसर के लिए गरीब नैदानिक परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है. यंत्रविज्ञानीय अध्ययनों से पता चला है कि नसों और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच आणविक क्रॉसटॉक शारीरिक संपर्क से पहले होता है। वहाँ केवल विवो मॉडल में कुछ perineural आक्रमण का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं, विशेष रूप से जल्दी प्रगति की जांच करने के लिए, शारीरिक तंत्रिका ट्यूमर बातचीत होने से पहले. चिक कोरियोएलेंटोइक झिल्ली मॉडल का उपयोग कैंसर आक्रमण का अध्ययन करने के लिए किया गया है, क्योंकि कोरियोनिक उपकला की तहखाने झिल्ली मानव उपकला ऊतक की नकल करती है। यहाँ हम chi chorioallantoic झिल्ली मॉडल perineural आक्रमण की जांच करने के लिए repurposed, grafting चूहे पृष्ठीय जड़ Ganglia और मानव सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं को chorionic उपकला पर. हम प्रदर्शन किया है कि कैसे इस मॉडल कैंसर कोशिकाओं की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए विवो में तंत्रिका ऊतक आक्रमण करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
Perineural आक्रमण (PNI) कैंसर में एक understudied phenotype है, जो उच्च रोग पुनरावृत्ति और सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNC)1के साथ रोगियों में गरीब अस्तित्व के साथ जुड़ा हुआ है. पीएनआई को नसों के भीतर या आस – पास की ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में सूक्ष्म रूप से परिभाषित किया गया है2,3. जब पीएनआई का पता चलता है, तो रोगियों को वैकल्पिक गर्दन विच्छेदन और/या विकिरण चिकित्सा4,5 जैसे सहायक चिकित्सा प्राप्त होने की संभावनाहोतीहै। हालांकि, इन उपचारों आक्रामक हैं, और नहीं PNI-विशिष्ट. वास्तव में, पीएनआई को ब्लॉक करने के लिए कोई चिकित्सा नहीं है, मुख्य रूप से क्योंकि तंत्रिका ट्यूमर बातचीत अंतर्निहित तंत्र अभी भी खराब समझ रहे हैं।
विभिन्न आणविक तंत्र तंत्रिका ट्यूमर आकर्षण में फंसाया गया है; ट्यूमर और स्ट्रॉमल कोशिकाएं न्यूरिटोजेनेसिस6,7 को बढ़ावा देने के लिए न्यूरोपेप्टाइड और विकास कारकों को जारी करतीहैं. जब इन विट्रो में एक साथ सुसंस्कृत, HNC कोशिकाओं और पृष्ठीय जड़ Ganglia (DRG) दोनों एक मजबूत प्रतिक्रिया है; ट्यूमर सेल आक्रमण और न्यूरिटोजेनेसिस पर प्रभाव संस्कृति6,8,9में कुछ दिनों के बाद देखा जा सकता है . हालांकि, आक्रमण से पहले ट्यूमर-नेवर बातचीत को recapitulate करने के लिए विवो मॉडल में उपयुक्त की कमी है। यहाँ हम एचएनसी कोशिकाओं और नसों6के बीच प्रारंभिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक में विवो पीएनआई मॉडल प्रस्तुत करते हैं . हम एक तंत्रिका घटक शामिल करने के लिए लड़की chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) मॉडल अनुकूलित, सीएएम में एक DRG grafting, कैंसर कोशिकाओं के एक कलम के बाद एक innervated ट्यूमर microenvironment नकल करने के लिए.
सीएएम मॉडल का उपयोग तहखाने झिल्ली के माध्यम से कोशिकाओं के आक्रमण का आकलन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है , कार्सिनोमा और मेलेनोमा10,11,12के प्रारंभिक आक्रामक चरणों की नकल करते हुए . सीएएम में ऊपरी कोरियोनिक उपकला, मध्यवर्ती मेसेन्काइम, और कम एलान्टोइक उपकला शामिल है। कोरियोनिक उपकला संरचनात्मक रूप से मानव उपकला10,13 के समान है जिसमें कोलेजन-IV-रिच बेसमेंट झिल्ली तहखाने झिल्ली को simulates जो अंतर्निहित संयोजी ऊतक से मौखिक उपकला को अलग करती है। के बाद से पहले ट्यूमर grafts 191314में सीएएम में प्रदर्शन किया गया , विधि के कई रूपांतरों एंजियोजेनेसिस15,16,17, ट्यूमर प्रगति के आकलन के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किए गए थे , और मेटास्टेसिस18| महत्वपूर्ण बात, सीएएम पर ट्यूमर grafting की तकनीक बहुत कम बदल गया है, लेकिन आवेदन लगातार विकसित कर रहे हैं. बढ़ती जटिलता के परख प्रकाशित किया गया है, दवा स्क्रीनिंग19,हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग20,और नैनोकण आधारित कैंसर विरोधी दवाओं21सहित .
हमारी प्रयोगशाला एक सीएएम-डीआरजी मॉडल का उपयोग करती है जिसमें एक स्तनधारी डीआरजी अलग है और ऊपरी सीएएम की सतह पर कलम लगाया जाता है। के बाद DRG सीएएम में शामिल हो जाता है, HNC कोशिकाओं DRG के पास grafted और DRG के साथ बातचीत करने से पहले vivo प्रणाली में पूरी काटा और विश्लेषण की अनुमति दी जाती है. महत्वपूर्ण बात, प्रणाली DRG और ट्यूमर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा DRG और ट्यूमर दोनों के पूर्व-vivo दृश्य अवलोकन की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल में 17 दिनों के भीतर निष्पादित जटिलता के विभिन्न स्तरों केसाथ कई चरणों को शामिल किया गया है, अंडे को इनक्यूबेट करने से लेकर सीएएम (चित्र 1) की कटाई तक। ब्याज के विभिन्न प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को इस मॉडल में परीक्षण किया जा सकता है आणविक रास्ते कैंसर में तंत्रिका आक्रमण के लिए जिम्मेदार स्पष्ट करने के लिए, और भी स्क्रीनिंग दवाओं के लिए सीधे तंत्रिका आक्रमण को लक्षित करने के लिए. एक उम्मीदवार दवा के साथ पूर्व इलाज कोशिकाओं सीएएम पर grafted किया जा सकता है और इलाज नियंत्रण की तुलना में जांच पीएनआई की घटना. वास्तव में, सीएएम मॉडल का उपयोग दवा जांच के लिए इन विट्रो अध्ययनों और कृन्तकों में विवो परीक्षणों में पूर्व-नैदानिक के बीच एक मध्यवर्ती कदम के रूप में किया गयाहै।
प्रयोगात्मक डिजाइन परिकल्पना के साथ अलग अलग होंगे. उदाहरण के लिए, यदि पीएनआई पर एक विशिष्ट प्रोटीन की भूमिका का परीक्षण, प्रयोगात्मक समूह DRG ट्यूमर कोशिकाओं के साथ grafted प्रोटीन overexpressing शामिल होगा, जबकि नियंत्रण समूह खाली वेक्टर के साथ stably transfected कोशिकाओं के साथ DRG शामिल करना चाहिए. कई अलग अलग प्रयोगात्मक डिजाइन विशिष्ट सवालों के पते के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यहाँ प्रस्तुत विवो मॉडल में सीएएम-डीआरजी ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा तंत्रिका के शारीरिक आक्रमण से पहले तंत्रिका ट्यूमर बातचीत का प्रदर्शन करके पिछले मॉडलों की कमी को संबोधित करता है। पीएनआई के अधिकांश अध्ययन में ट्यूमर के प्रसार और मोटर समारोह के निषेध पर ध्यान केंद्रित है , और sciatic नसों में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन पर निर्भर23,24,25. sciatic तंत्रिका इंजेक्शन पीएनआई के एक विवो मॉडल जहां कैंसर की कोशिकाओं को एक माउस या चूहे sciatic तंत्रिका जहां ट्यूमर बाद में बढ़ता में इंजेक्ट कर रहे हैं. इंजेक्शन मॉडल विनाशकारी ट्यूमर प्रगति और नसों के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं से उत्पन्न दर्द को दिखाने के लिए उपयोगी होते हैं। sciatic तंत्रिका मॉडल भी कारकों है कि कैंसर की कोशिकाओं को तंत्रिका में कामयाब होने की अनुमति के अध्ययन के लिए उपयुक्त है, लेकिन पीएनआई के प्रारंभिक चरण का मूल्यांकन करने की क्षमता का अभाव है, क्योंकि यह सीधे तंत्रिका में कोशिकाओं का परिचय, तंत्रिका म्यान को दरकिनार. एक अलग दृष्टिकोण में, शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित orthotopic ट्यूमर grafts प्रोस्टेट कैंसर प्रगति को बढ़ावा देने में adrenergic और कोलीनर्जिक तंत्रिका फाइबर के महत्व की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया, इस प्रकार ट्यूमर प्रगति में नसों की एक प्रमुख भूमिका का सुझाव 26. इस मॉडल में मौरीन सहानुभूतिपूर्ण और परानुकंपी तंत्रिकाओं का रासायनिक अपाहिज होता था . parasympathetic फाइबर ट्यूमर के ऊतकों में घुसपैठ, पीएनआई से संबंधित एक प्रक्रिया है, लेकिन मॉडल विशेष रूप से तंत्रिका और ट्यूमर के बीच शारीरिक बातचीत का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था. सीएएम-डीआरजी मॉडल पीएनआई के दौरान तंत्रिका और कैंसर के बीच बातचीत की जांच की अनुमति देता है। इसके अलावा, murine मॉडल महंगा है और समय लेने वाली जब सीएएम मॉडल की तुलना में कर रहे हैं. हम पीएनआई के मशीनी अध्ययन के लिए सीएएम-डीआरजी मॉडल का उपयोग करने का सुझाव देते हैं।
सीएएम-डीआरजी दृष्टिकोण के कुछ लाभों में पीएनआई और अन्य फीनोटाइप्स का मूल्यांकन शामिल है, जैसे ट्यूमर विकास, मेटास्टेसिस, और एंजियोजेनेसिस। कम सीएएम पर मानव डीएनए की पहचान और / या जिगर में मानव कैंसर सेल लाइनों10के मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है , ऊतक अनुभाग और धुंधला, जो छोटे मेटास्टेसिस प्रकट नहीं हो सकता है की तुलना में एक अधिक संवेदनशील प्रयोगात्मक दृष्टिकोण.
सीएएम-डीआरजी विधि की कुछ सीमाएँ हैं, जिनमें संक्षिप्त अवलोकन समय सीमा भी शामिल है. भ्रूण की प्रतिरक्षा प्रणाली दिन 1827द्वारा शारीरिक रूप से सक्रिय है, जब अस्वीकृति और एक भड़काऊ प्रक्रिया हो सकती है, प्रयोगात्मक समय को सीमित करती है। यह भी दूरी पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है जब DRG के करीब ट्यूमर कोशिकाओं grafting; बड़ा DRG-कैंसर दूरी ट्यूमर कोशिकाओं और तंत्रिका के बीच आणविक बातचीत ख़राब हो सकता है, या मॉडल के दोनों घटकों के बीच शारीरिक संपर्क में देरी हो सकती है. इसके अलावा, अगर भ्रूण इस प्रोटोकॉल में निर्धारित से पुराने हैं, भ्रूण आंदोलनों ट्यूमर कोशिकाओं को विस्थापित हो सकता है. इसलिए, यह सेल grafting के लिए दिन 10 के बाद निषेचन के साथ संगत अंडे का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
चूंकि प्रतिरक्षा प्रणाली पूरी तरह से दिन से पहले विकसित नहीं है 1827, सीएएम में ट्यूमर microenvironment अक्सर कैंसर के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया इम्यूनोसप्रेस्ड murine मॉडल के समान है. इसलिए, इस मॉडल ट्यूमर प्रगति में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका का आकलन करने के लिए उपयोगी नहीं है। एक अन्य सीमा चिकन प्रजातियों के लिए अभिकर्मकों की प्रतिबंधित उपलब्धता है, जैसे एंटीबॉडी, साइटोकिन्स और प्राइमर।
सही ढंग से इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन अभ्यास की आवश्यकता है; हालांकि, यह एक विशेष कोर सुविधा के लिए आवश्यकता के बिना एक प्रयोगशाला सदस्य द्वारा किया जा सकता है. अंडे के खोल की ड्रिलिंग प्रशिक्षण की आवश्यकता है. किराने पर अभ्यास (गैर निषेचित) अंडे पहली बार के लिए इस मॉडल का प्रयास करने से पहले की सिफारिश की है. उच्च भ्रूण अस्तित्व और मॉडल की सफलता प्राप्त किया जा सकता है अगर कुछ महत्वपूर्ण कदम संक्रमण से बचने के लिए पालन कर रहे हैं: 2% पेन / स्ट्रेप में DRGs के उपयुक्त एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस, एक laminar प्रवाह कैबिनेट में काम कर रहे हैं, और अंडे खोल कणों के प्रसार से बचने सीएएम पर. यह भी कुल अंडे ऊष्मायन समय के दौरान स्थिर आर्द्रता रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हम प्रति समूह अंडे की संख्या में वृद्धि की सलाह देते हैं जब तक तकनीक में महारत हासिल है. अनुभवहीन प्रयोगशाला कर्मियों के लिए सबसे अक्सर समस्याओं अंडे संदूषण और सेल grafting के लिए गलत तकनीक हैं.
डीआरजी कटाई के लिए भी प्रशिक्षण की आवश्यकता है; इन विट्रो प्रयोगों के लिए DRGs कटाई में अभ्यास8 में विवो मॉडल का प्रयास करने से पहले की सिफारिश की है. इन विट्रो डीआरजी संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन और DRG निष्कर्षण की अवधि को कम करने के लिए तकनीक में सुधार करने के लिए एक अवसर है। जब डी आर जी को बल के साथ पकड़ते हैं तो कटाई तकनीक पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। डीआरजी को सीधे नहीं रखा जाना चाहिए; दबाव इसके नीचे लागू किया जाना चाहिए. हम बेहतर निष्कर्षण के दौरान DRG कल्पना करने के लिए आवर्धक लेंस के उपयोग की सलाह देते हैं.
महत्वपूर्ण बात, जब पहली बार के लिए इस मॉडल प्रदर्शन, सभी शर्तों वांछित सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस मॉडल चूहा DRG और HNC सेल लाइन UM-SCC-1 के लिए अनुकूलित किया गया था. माउस DRG और अन्य कैंसर सेल प्रकार के उपयोग अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. grafted कोशिकाओं के एक उच्च एकाग्रता के साथ, ट्यूमर मोटा और कठोर हो जाना करते हैं, जो ट्यूमर माप की सुविधा. प्रत्येक समूह के लिए कई अंडे और प्रत्येक अंडे के लिए कोशिकाओं की एक उचित एकाग्रता को ध्यान में रखते हुए, कई लाख कोशिकाओं को प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक हो सकता है. योजना को सुविधाजनक बनाने के लिए, कोशिकाओं के दोहरीकरण के समय के ज्ञान को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरणों के लिए, एक समस्या निवारण तालिका प्रदान की जाती है (तालिका1).
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को NIH/NIDCR अनुदान DE027551 और DE022567 (NJD) द्वारा समर्थित किया गया था।
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |