Perineural invasjon er en aggressiv fenotype for hode-og nakke plateepitel celle kreftsvulster og andre svulster. Den dama chorioallantoic membran modellen har blitt brukt for å studere angiogenese, kreft invasjon, og metastasering. Her viser vi hvordan denne modellen kan benyttes for å vurdere Perineural invasjon i vivo.
Perineural invasjon er en fenotype der kreft omgir eller invaderer nervene. Det er forbundet med dårlig klinisk utfall for hode og nakke plateepitelkreft og andre kreftformer. Mekanistisk studier har vist at den molekylære crosstalk mellom nerver og tumorceller oppstår før fysisk interaksjon. Det er bare noen få in vivo-modeller for å studere Perineural invasjon, spesielt for å undersøke tidlig progresjon, før fysisk nerve-tumor interaksjoner oppstår. Den dama chorioallantoic membran modellen har blitt brukt til å studere kreft invasjon, fordi kjelleren membranen av det humant epitel etterligner den menneskelige epitel vev. Her repurposed vi den dama chorioallantoic membran modell for å undersøke Perineural invasjon, pode rotte rygg rot ganglia og menneskehode og nakke plateepitelkreft celler på den humant epitel. Vi har demonstrert hvordan denne modellen kan være nyttig for å evaluere evnen til kreftceller til å invadere nevrale vev in vivo.
Perineural invasjon (PNI) er en lite studert fenotype i kreft, som er forbundet med høy sykdom gjentakelse og dårlig overlevelse hos pasienter med hode og nakke plateepitelkreft (HNC)1. PNI er definert mikroskopisk som tumorceller innenfor eller rundt nervene2,3. Når PNI oppdages, pasienter er sannsynlig å få adjuvant behandling som valgfag nakke disseksjon og/eller strålebehandling4,5. Men disse behandlingene er aggressive, og ikke PNI-spesifikke. Faktisk er det ingen terapi for å blokkere PNI, først og fremst fordi mekanismene underliggende nerve-tumor interaksjoner er fortsatt dårlig forstått.
Ulike molekylære mekanismer har vært innblandet i nerve-tumor attraksjon; svulster og stromal celler løslate nevropeptider og vekstfaktorer for å fremme neuritogenesis6,7. Når kultivert sammen in vitro, HNC celler og rygg rot ganglia (DRG) begge har en robust respons; effekter på tumor celle invasjon og neuritogenesis kan sees etter noen dager i kultur6,8,9. Det er imidlertid en mangel på hensiktsmessig in vivo-modeller for å recapitulate tumor-nerve interaksjoner før invasjonen. Her presenterer vi en in vivo PNI modell for å studere tidlige interaksjoner mellom HNC celler og nerver6. Vi tilpasset Chick chorioallantoic membran (CAM) modell for å inkludere en neural komponent, pode en DRG i CAM, etterfulgt av en pode av kreftceller for å etterligne en innervated svulst mikromiljøet.
CAM-modellen har blitt brukt med hell for å vurdere invasjonen av celler gjennom kjeller membranen, etterligne tidlige invasive stadier av kreftsvulster og melanom10,11,12. The CAM består av øvre, humant epitel, mellomliggende mesenchyme, og lavere allantoic epitel. Den som er det samme epitel er strukturelt ligner menneskelige epitel10,13 i at kollagen-IV-rike kjeller membran simulerer kjeller membranen som skiller den muntlige epitel fra underliggende bindevev. Siden den første svulsten ble utført i cam i 191314, ble mange tilpasninger av metoden utviklet for å muliggjøre vurdering av angiogenese15,16,17, tumorprogresjon, og metastasering18. Viktigere, teknikken med pode svulster på CAM har endret seg svært lite, men søknadene er i stadig utvikling. Analyser av økende kompleksitet har blitt publisert, inkludert narkotika screening19, bein vev engineering20, og nanopartikkel-baserte anticancer narkotika21.
Vårt laboratorium bruker en CAM-DRG modell der en pattedyr DRG er isolert og podet på overflaten av den øvre CAM. Etter at DRG blir innlemmet i CAM, HNC cellene er podet nær DRG og lov til å samhandle med DRG før hele in vivo-systemet er høstet og analysert. Viktigere, systemet tillater ex-vivo visuell observasjon av både DRG og tumor ved fluorescens merking av DRG og tumorceller. Denne protokollen består av flere trinn med ulike nivåer av kompleksitet utført innen 17 dager, fra incubating egg til høsting av CAM (figur 1). Celler uttrykker ulike proteiner av interesse kan testes i denne modellen for å belyse den molekylære trasé ansvarlig for nerve invasjon i kreft, og også for screening narkotika å direkte målrette nevrale invasjon. Celler pre-behandlet med en kandidat stoffet kan være podet på CAM og forekomsten av PNI undersøkt i forhold til ubehandlede kontroller. Faktisk har CAM-modellen blitt brukt til narkotika screening som et mellom trinn mellom in vitro-studier og pre-Clinical in vivo-studier i gnagere19.
Den eksperimentelle designen vil variere med hypotesen. For eksempel, hvis du tester rollen som et bestemt protein på PNI, vil den eksperimentelle gruppen inkludere DRG-podet med tumorceller overexpressing proteinet, mens kontrollgruppen bør inkludere DRG med celler stabilt transfekterte med Tom vektor. Flere ulike eksperimentelle design kan brukes til å ta opp konkrete spørsmål.
Den CAM-DRG in vivo-modellen som presenteres her løser underskudd av tidligere modeller ved å demonstrere nerve-tumor interaksjon før fysisk invasjon av nerve av tumorceller. De fleste in vivo studier av PNI fokus på tumor spredning og hemming av motorisk funksjon, og er avhengig av direkte injeksjon av tumorceller i ischias nerver23,24,25. Den ischias nerven injeksjon er en in vivo modell av PNI der kreftceller injiseres i en mus eller rotte ischias nerven der svulsten senere vokser. Injeksjon modeller er nyttig å vise destruktive tumorprogresjon og smerte som følge av tumorceller i nerver. Den ischias nerven modellen er også egnet for studiet av faktorer som gjør at kreftceller til å trives i nerve, men mangler evnen til å evaluere den tidlige fasen av PNI, fordi den introduserer celler direkte inn i nerve, omgåelsen nerve hylser. I en annen tilnærming, kirurgisk implantert orthotopic tumor er blitt brukt til å karakterisere betydningen av adrenerge og kolinerge nervefibre for å fremme prostatakreft Progresjon, og dermed antyder en fremtredende rolle nerver i tumorprogresjon 26. denne modellen besto av kjemiske ablasjon av murine sympatiske og parasympatiske nerver. Den parasympatiske fibrene infiltrere tumor vev, en prosess knyttet til PNI, men modellen ble ikke spesielt brukt til å vurdere fysisk interaksjon mellom nerve og tumor. CAM-DRG-modellen gjør det mulig å undersøke samspillet mellom nerven og kreften under PNI. Videre er murine modeller dyre og tidkrevende sammenlignet med CAM-modellen. Vi foreslår at du bruker CAM-DRG-modellen for mekanistisk studier av PNI.
Noen fordeler til CAM-DRG tilnærming inkluderer vurdering av PNI og andre fenotyper, slik som tumor vekst, metastasering, og angiogenese. Identifisering av menneskelig DNA på nedre CAM og/eller i leveren kan brukes til påvisning av metastasering av menneskelig kreftcelle linjer10, en mer følsom eksperimentell tilnærming i forhold til vev snitting og farging, som kanskje ikke avslører små metastaser.
CAM-DRG-metoden har noen begrensninger, inkludert den korte observasjons tidsrammen. Immunforsvaret av embryo er fysiologisk aktiv ved dag 1827, når avvisning og en inflammatorisk prosess kan finne sted, begrenser eksperimentell tid. Det er også viktig å vurdere avstanden når pode tumorceller nær DRG; større DRG-kreft avstander kan svekke den molekylære interaksjoner mellom tumorceller og nerve, eller kan forsinke den fysiske kontakten mellom begge komponentene i modellen. Også, hvis embryo er eldre enn fastsatt i denne protokollen, embryo bevegelser kan fortrenge tumorceller. Derfor er det viktig å bruke egg i samsvar med dag 10 post-befruktning for celle pode.
Siden immunsystemet er ikke fullt utviklet før dag 1827, tumor MIKROMILJØET i cam er lik som i aper murine modeller ofte brukt for kreft studier. Derfor er denne modellen ikke er nyttig å vurdere rollen til immunceller i tumorprogresjon. En annen begrensning er begrenset tilgjengelighet av reagenser for kylling arter, slik som antistoffer, cytokiner og primere.
Nøyaktig utføring av denne protokollen krever praksis; men det kan gjøres av et laboratorium medlem uten behov for en spesialisert kjerne anlegget. Boring av eggeskall krever trening. Øve på dagligvarer (ikke-befruktet) egg anbefales før du prøver denne modellen for første gang. Høy embryonale overlevelse og suksess av modellen kan oppnås hvis noen kritiske skritt for å unngå smitte følges: hensiktsmessig antibiotika forebygging av DRGs i 2% penn/strep, arbeider i en laminær Flow kabinett, og unngå spredning av egg Shell partikler på CAM-modulen. Det er også avgjørende å holde stabil fuktighet under den totale egg inkubasjonstiden. Vi anbefaler å øke antall egg per gruppe til teknikken er mestret. De hyppigste problemene for uerfarne laboratoriepersonell er egg forurensning og unøyaktig teknikk for celle pode.
DRG høsting krever også opplæring; praksis i høsting DRGs for in vitro eksperimenter8 før du prøver in vivo-modellen anbefales. Den in vitro DRG kulturen er en mulighet til å optimalisere forholdene og bedre teknikk for å forkorte varigheten av DRG utvinning. Spesiell oppmerksomhet til høsting teknikken er nødvendig når fatte den DRG med tang. DRG skal ikke holdes direkte; Trykk skal påføres under den. Vi anbefaler bruk av forstørrelsesglass for å bedre visualisere DRG under ekstraksjon.
Viktigere, når du utfører denne modellen for første gang, bør alle forhold optimaliseres for ønsket cellelinje. Denne modellen ble optimalisert for rotte DRG og HNC cellelinje UM-SCC-1. Bruk av musen DRG og andre kreftcelle typer kan kreve optimalisering. Med en høyere konsentrasjon av podet celler, svulster tendens til å vokse tykkere og stivere, noe som forenkler tumor målinger. Tatt i betraktning flere egg for hver gruppe og en passende konsentrasjon av celler for hvert egg, flere millioner celler kan være nødvendig for hvert eksperiment. For å lette planleggingen, bør kunnskap om dobling tid av cellene tas i betraktning. For noen kritiske trinn i denne protokollen finnes det en feilsøkings tabell (tabell 1).
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH/NIDCR tilskudd DE027551 og DE022567 (NJD).
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |