Summary
A maioria das plantas dentro das comunidades prováveis estão interligados por fungos de micorrizas arbusculares (AM), mas mediação de interações planta por eles foi investigada principalmente pelo cultivo de plantas com versus sem fungo. Apresentamos um método para manipular redes micorrízicas comuns entre plantas micorrízicas para investigar as suas consequências para as interações planta.
Abstract
(AM) micorriza arbusculares influenciam o crescimento e absorção de nutrientes minerais vegetais, portanto, eles têm o potencial para influenciar as interações planta. O poder da sua influência em micélios extra-radiculares que se espalhou para além de zonas de esgotamento de nutrientes encontra-se perto de raízes para, finalmente, interligar os indivíduos dentro de uma rede micorrízica comum (CMN). A maioria dos experimentos, no entanto, têm investigado o papel dos fungos de Micorrizas arbusculares em interações planta pelo cultivo de plantas com versus sem fungos micorrízicos, um método que não aborda explicitamente o papel de CMNs. Aqui, propomos um método que manipula o CMNs para investigar seu papel nas interações planta. Nosso método usa modificados recipientes com fundo cónico com uma malha de nylon e/ou material hidrofóbico, cobrindo os orifícios entalhados, fertilizante 15N e uma areia intersticial pobres em nutrientes. CMNs são também deixou intacto entre indivíduos interagindo, cortada pela rotação dos recipientes, ou impedidos de se formar por uma barreira sólida. Nossos resultados sugerem que recipientes de giro é suficiente para perturbar o CMNs e evitar os seus efeitos sobre interações planta entre as CMNs. Nossa abordagem é vantajosa porque imita os aspectos da natureza, tais como mudas tocando em CMNs já estabelecidos e o uso de um conjunto de fungos que podem fornecer benefícios de diversos. Embora nossa experiência é limitada para investigar as plantas na fase de plântula, planta interações entre CMNs podem ser detectadas usando nossa abordagem que, por conseguinte, pode ser aplicada para investigar questões biológicas sobre o funcionamento da CMNs nos ecossistemas.
Introduction
(AM) micorriza arbusculares assistida plantas na colonização da terra 460 milhões de anos atrás1 e hoje, eles são simbiontes onipresentes da maioria das plantas2, fornecendo-lhes nutrientes minerais vitais para o crescimento. As hifas finas, como fio de fungos de Micorrizas arbusculares forragem para nutrientes minerais além de zonas de esgotamento de nutrientes perto de raízes, muitas vezes encontrando e colonizar sistemas da raiz de plantas em uma "rede micorrízica comum" de vizinhos (CMN). Redes micorrízicas comuns também podem formar quando fungos germlings junção estabeleceu redes3, ou quando estou hifas fusível (anastomose) com hifas coespecíficas4,5,6,7. A extensão destas hifas extra-radiculares no solo é enorme, com hifas extra-radiculares constituindo 20% a 30% da biomassa microbiana do solo total na pradaria e solos de pastagem8 e estendendo-se por 111-m·cm-3 na pastagem imperturbada9 .
Redes micorrízicas comuns partição nutrientes minerais entre interconectadas vizinhas plantas10,de11,de12,13. As plantas podem receber até 80% de seu fósforo e 25% das suas necessidades de nitrogênio de fungos de Micorrizas arbusculares, proporcionando até 20% do seu total fixada carbono dos fungos em retorno14. Recente trabalho de cultura in vitro de raiz órgão encontrou que CMNs preferencialmente troquem nutrientes minerais com raízes de anfitrião que fornecem o maioria carbono aos fungos11,12. Além disso, diferentes espécies de fungos de Micorrizas arbusculares podem diferir em sua qualidade como parceiros simbióticos, com alguns fungos trocando mais fósforo para menos carbono do que os outros15. Embora as culturas de órgão raiz são benéficos modelos para estudar a simbiose AM porque eles apresentam ambientes cuidadosamente controlados e a capacidade de observar diretamente as interconexões das hifas, não incluem fotossíntese brotos que afectam processos fisiológicos importantes como a fotossíntese, transpiração e variações diurnas, coletores de nutriente, bem como representativos de carbono e minerais.
Na natureza, mudas mais prováveis canaliza CMNs já estabelecidos. Até recentemente, no entanto, cientistas apenas examinaram o impacto dos fungos de Micorrizas arbusculares na nutrição das plantas pelo cultivo de plantas com e sem fungos, muitas vezes com uma única espécie de fungo de AM. Embora este trabalho tenha sido tremendamente informativo à nossa compreensão do fungo de micorrizas, este método tem negligenciado o papel potencialmente crucial que CMNs podem ter nas interações entre plantas hospedeiras interconectadas. Em particular, as plantas que são altamente dependentes de fungos de Micorrizas arbusculares para crescimento minimamente interagem sem AM fungos16,17, possivelmente confundir a nossa interpretação das interações mediadas por fungo AM quando utilizado como 'controles' de linha de base referência.
Propomos uma abordagem girado-núcleo de investigação do papel da CMNs em interações planta e estruturação da população. Nossa abordagem imita componentes dos simbiose AM na natureza porque toda junção de plantas estabelecidas que cmns e todas as plantas são crescidas com fungos de Micorrizas arbusculares. Removendo as interações de raiz, nossa metodologia centra-se especificamente na interações mediadas por fungos de Micorrizas arbusculares enquanto o rastreamento também a circulação de nutrientes mineral na CMNs. Nossa abordagem baseia-se em trabalhos anteriores que tem usado núcleos girados tanto no campo como na estufa para entender AM funcionamento realisticamente.
O método de núcleo girado foi estabelecido na literatura como um método para manipular hifas extra-radiculares18,19,20,21, e teve diversas reencarnações dependendo de seu propósito sobre nas últimas duas décadas. Inicialmente, sacos de malha ou barreiras, permitindo o crescimento das hifas foram usadas para fornecer livre de raiz compartimentos para quantificar a quantidade de hifas de micorrizas arbusculares no.22,o solo23. Em seguida, núcleos cilíndricos de solo entre tubos rígidos de água ou plástico, tubo com ranhuras cobertas de uma malha de nylon penetrável por hifas, mas não as raízes, foram desenvolvidos. Estas poderiam facilmente ser giradas para perturbar os micélios extra-radiculares18,24,25. Os núcleos girados foram colocados entre as plantas, e comprimentos das hifas solo por grama de solo18, 13C fluxos de micélios extra-radiculares24, ou a absorção de fósforo de planta livre núcleos foram quantificados18. Um outro uso de tais núcleos era crescer plantas dentro no campo para reduzir a colonização de raízes por fungos de Micorrizas arbusculares através de frequentes interrupções hifal como alternativa à esterilização ou a aplicação de fungicidas, os quais têm efeitos indirectos em solo orgânico matéria e outros micróbios18.
A abordagem de barreira de malha hifal serviu para investigar o particionamento de nutrientes e interações da planta através de CMNs, mas em microcosmos retangulares em vez de com núcleos girados. Walder et al26 investigado interações entre Linum usitatissimum (linho) e Sorghum bicolor (sorgo) traçando nutriente mineral para troca de carbono utilizando isótopos através de CMNs de qualquer um dos fungos de Micorrizas arbusculares Rhizophagus irregularis ou Funneliformis mosseae26. Os microcosmos em seus compartimentos de planta do estudo composto separados por malha de barreiras, compartimentos hifais acessíveis apenas às hifas micorrízicas e rotulado de compartimentos hifais que continha isótopos radiativos e estáveis. Como controles, o estudo utilizou tratamentos sem fungos micorrízicos. Song et al27 usado uma abordagem semelhante para encontrar essa planta sinais poderiam ser feitos apenas entre CMNs estabelecidas de F. mosseae quando uma planta foi infectada por um patógeno fúngico. Também, da mesma forma a Walder et al26, Merrild et al.28 cresceu plantas em compartimentos individuais, separados por mesh para investigar o desempenho da planta de plântulas de Solanum lycopersicum (tomate) ligados por CMNs para um grande de Cucumis sativus planta (pepino) que representou uma fonte abundante de carbono. Eles também usaram tratamentos sem fungos micorrízicos em vez de cortar CMNs28. Em um experimento de segundo, relacionado, carbono para troca de fósforo foi examinado usando sacos de malha rotulados com 32P. microcosmos com malha hifal barreiras e CMN separando como tratamento foram usado por Janos et al.29, que investigou competitiva interações entre mudas das espécies arbóreas savana tetrodonta de eucalipto e mudas de árvore de floresta tropical, Litsea glutinosa. Nesse estudo, Janos et al29 levantado compartimentos contendo mudas alguns centímetros, deslizamento de camadas de malha um contra o outro para quebrar interconexões hifal29.
A etapa final da evolução do método girado núcleo tem sido de cultivar plantas dentro de núcleos que estão dentro de potes ou microcosmos de20,30. Wyss30 usado núcleos girados para verificar se o micélio extra-radicular do AM poderia colonizar mudas de Pinus elliottii quando espalhar de um doador ou planta hospedeira de 'enfermeira' AM, Tamarindus indicae micélio extra-radicular como de ectomicorrízicos desempenho de plântulas de influências fungos. Mudas tubulares comerciais grandes recipientes (Tabela de materiais) dentro microcosmos foram de qualquer plástico sólido (sem CMNs) ou entalharam e coberto com uma membrana hidrofóbica. Recipientes de mudas com fenda foram ou não girados (CMNs intactas) ou girada para cortar estabelecidos núcleos CMNs. rotacionada com barreira de malha de diferentes tamanhos foram usados por Babikova et al.20 para investigar belowground sinalização através de CMNs entre Vicia faba plantas (feijão). Em seu estudo, uma planta central doador em mesocosmos de 30 cm de diâmetro foi interligada por raízes e hifas (sem barreira) ou apenas por CMNs estabelecidas através de uma malha de 40 μm. Centrais plantas estavam cortadas de interações com as plantas vizinhas através de rotação dos núcleos de malha fechada, ou CMNs foram impedidos por uma malha fina de 0,5 μm envolvendo o núcleo.
Aqui, apresentamos um método que combina aspectos de prévias girado-núcleo abordagens para examinar a influência da CMNs sobre interações planta direto combinado com rastreamento de isótopo estável. Nosso método utiliza uma abordagem de 'planta de destino', em que a planta central de interesse está rodeada por plantas vizinhas. As plantas são crescidas dentro de recipientes de mudas rotativos que são encaixados e cobertos com tela de nylon do silk-screen, membrana hidrofóbica, ou são de plástico sólido não modificado. Redes micorrízicas comuns são cortadas uma vez por semana ou mantidas intactas, e isótopos estáveis de 15N rastrear o movimento do nitrogênio de núcleos girado dos vizinhos para a planta do alvo central. Comparando o tamanho da planta com captação do isótopo estável e nutrientes minerais, avaliamos que as plantas podem beneficiar ou sofrem de CMNs nas interações entre plantas hospedeiras.
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Protocol
1. construção e montagem de núcleos rotativos
- Modificar a recipientes de mudas tubular comercial (posteriormente chamado de 'embalagens'; Tabela de materiais) ter 19 mm de largura x aberturas de comprimento de 48 cm.
- Usando uma furadeira com um buraco de 19mm viu sem uma central, piloto broca de torção, faça dois buracos, um acima do outro, em um dos lados de um recipiente (2,5 cm de diâmetro x 12,1 cm de comprimento) para que os furos são cerca de 1 cm distante. Mantenha o recipiente contra uma vedação na imprensa de broca e tem uma parada com uma cavilha curta que vai caber dentro do recipiente para ajudar a segurá-lo no lugar durante a perfuração. Use um recipiente com plástico flexível para evitar rachaduras.
- Corte o pedaço fino de plástico entre os furos com uma tesoura, um cortador de fio ou tesoura (para plástico rígido use uma serra de sabre) fazer um alongado abrindo cerca de 2 cm de largura e 5 cm de comprimento.
- Repita os passos de 1.1.1 – 1.1.2 no lado oposto do recipiente.
- Cobrir as ranhuras com malha de nylon e/ou membrana hidrofóbica (figura 1A).
- Corte a malha de nylon com 40 μm de poros em 9,5 x 8,5 cm. Corte em pedaços como muitos como existem recipientes.
- Cola o engranzamento de nylon externamente para os recipientes para cobrir ambas as aberturas com alguma sobreposição ligeira no tecido usando cola quente de alta resistência, industrial.
- Se a prevenção do movimento da água é necessário, tal como quando usando nutrientes solúveis em água ou isótopos estáveis, cubra a camada de malha de nylon com uma membrana hidrofóbica31,32 (Tabela de materiais) que permite que sou hifas do fungo para Passe, mas apenas o movimento do vapor de água e água não líquida.
- Coloque a cola quente ao redor das aberturas do recipiente e ao longo das bordas longas da malha de nylon. Role o recipiente para o tecido para evitar queimar os dedos. Adicione uma camada de cola ao longo da borda do tecido onde a malha bordas de sobreposição. Pressione a borda sobre um papelão para selá-lo com firmeza. Sempre rolo consistentemente em uma direção que vai ser o mesmo sentido de rotação dos recipientes terminados dentro de potes ou microcosmos, para que a borda de malha sobreposta não será empurrada para potencialmente cavar o substrato.
- Uma vez que a cola tiver arrefecido, tape as extremidades superior e inferior da tela para o recipiente para evitar que as bordas soltas e rasgando usando uma fita flexível, tais como a fita do eletricista.
- Usando a mesma fita como na etapa 1.2.5, cobrir os buracos pequenos nos lados da extremidade cônica (não o orifício na ponta da parte inferior) de cada recipiente para evitar o crescimento da raiz para fora do recipiente para o resto do pote/microcosmo.
- Para evitar a perda de solo, proporcionando drenagem, coloque uma bola de gude de vidro na parte inferior de cada recipiente.
- Para um tratamento de controle que não envolve qualquer potencial para uma CMN para formar entre as plantas, use recipientes sólidos, sem modificações (figura 1A).
2. conjunto de panelas ou de microcosmos para caber as pontas cônicas dos recipientes
- Para garantir recipientes fica em pé em uma posição fixa e tem a drenagem apropriada, vire um pote para que o fundo é voltada para cima. Corte em torno do fundo da panela, deixando um pequeno lábio para suporte, usando uma serra de sabre.
- Preparação de espuma de poliestireno
- Corte a espuma de poliestireno, cerca de 36 mm de espessura, para o fundo da panela usando uma serra de fita com um gabarito de corte círculo com o diâmetro.
- Faça furos na espuma usando uma furadeira e 19mm buraco viram (sem uma broca de torção central) no padrão em que os recipientes serão posicionados.
- Para um experimento de planta alvo, faça um furo central com furos igualmente espaçados para os vizinhos indivíduos ao seu redor. Para um pote com um diâmetro de 15,5 cm, espaço seis furos 12mm separado em torno da circunferência de um círculo de 11 cm de diâmetro (figura 1B).
- Esquematize os buracos hexagonalmente ou em uma matriz quadrada (Figura 1, D) para um experimento de microcosmo.
3. enchimento dos recipientes e potes com misturas de solo e areia
- Selecione uma mistura de solo desejado e adicionar sou fungo campo coletado ou inóculo pot-cultivadas ao solo misturando uniformemente picado pedaços de raiz (1 – 2 cm de comprimento) completamente com o solo. Misture o solo desejado com uma sílica inférteis grânulos de vidro ou areia para diminuir a concentração de minerais nutrientes disponíveis às plantas.
- Posicione os recipientes cheios no fundo perfurado espuma ou microcosmo e preencher o espaço intersticial com um substrato estéril.
- Preencha o espaço intersticial entre recipientes com mistura de areia de sílica de nutriente-pobres usando um funil para auxiliar no preenchimento de pequenos espaços. Para garantir a drenagem adequada e imitar a textura do solo, misture média areia tamanho de partícula, tais como grau de 6-20, com pequena tamanho de partícula areia, tais como grau de 30-65, em um misturador de cimento.
4. estabelecimento de CMNs ao longo de panelas/microcosmos
- Plantar plantas de pré-tratamento 'enfermeira' da espécie desejada para cada recipiente para sustentar os fungos de Micorrizas arbusculares para que eles possam se espalhou entre os recipientes e estabelecer CMNs.
- Quando todos os recipientes estabeleceram mudas, remova brotos por recorte para que apenas uma pessoa permanece em cada recipiente.
- Permitir que 2-3 meses para o crescimento de planta e estabelecimento do CMN.
5. estabelecimento de plantas experimentais e tratamentos
- Semear plantas experimentais por semeadura ou transplante em recipientes. Se semear, espere até que todos os recipientes têm uma plântulas germinadas antes de remover o pré-tratamento enfermeira plantas pelos seus brotos de recorte. Se transplantar, clip plantas tudo pré-tratamento antes de transplantar mudas experimentais para evitar efeitos indesejados do competidor.
- Estabelecer tratamentos CMN também deixando os recipientes não mudou-se para a duração do experimento (CMNs intactas) ou girados semanal para separar fisicamente as hifas estendendo-se entre os containers modificados (CMNs cortadas; Figura 1A). Quando cortando CMNs, gire cada recipiente através de uma rotação completa, para evitar que inadvertidamente alterar interações na superfície, particularmente para as plantas heliotropic.
- Água fortemente todos os potenciômetros ou microcosmos imediatamente após a rotação para restabelecer o contato entre o substrato intersticial e os lados dos recipientes.
6. rastreamento de movimento de nutrientes mineral através de CMNs
- Fertilizar as plantas vizinhas com 0,5% 15N enriquecido KNO3 e NH4Cl.
- Fertilize o indivíduo alvo com um fertilizante de 14N de igual concentração.
7. acompanhamento e manutenção do experimento
- Regularmente (no mínimo mensal) re-randomize as posições dos potenciômetros ou microcosmos ao longo do experimento.
- Semanalmente, medir o crescimento, tais como altura ou folha mais longo comprimento (para gramíneas) para monitorar quando crescimento começa a desacelerar, porque é importante para a colheita antes que as plantas se tornam raiz-limitam.
8. colheita do experimento
- Clip de todo o tecido na superfície e colocar plantas individuais nos envelopes rotulados que identificam o seu tratamento, pote ou microcosmo e posição.
- Tecidos na superfície secos a 60 ° C, até peso constante. Medir o peso seco de cada tecido de planta.
- Permitir que o solo secar antes de extrair os recipientes e colheita das raízes.
- Delicadamente escove fora como tanto do solo quanto possível de sistemas da raiz e lavá-los em uma panela de água, ou sob uma ligeira corrente de água sobre uma peneira de 250 microns de tamanho de poro.
- Permitir que as raízes secar ao ar e pesar todo o sistema da raiz.
- Clip do sistema da raiz ao acaso e armazenar os fragmentos de raiz em etanol a 50%. Depois que eles estiverem manchados33, use estes fragmentos para quantificação da colonização de raiz usando a linha de grade interseção método34.
- Re-pesar o restante sistema de raiz e armazená-lo em um envelope de papel etiquetados para secar a 60 ° C para avaliação do peso seco. Use a seguinte equação para calcular o peso de todo o sistema de raiz:
9. análises de isótopos estáveis e nutrientes mineral
- Agrupar as mudas por biomassa em "decis" ou 10 grupos, "octiles" ou 8 grupos, "quartis" ou quatro grupos, etc, depois rank-ordenando-os em peso se a quantidade de tecido é muito baixa para os requisitos mínimos para a digestão determinar o nutriente mineral concentrações.
- Envie amostras foliares para um laboratório contratado para análises de isótopos estáveis e nutrientes minerais (Tabela de materiais).
- Descreva a abundância isotópica usando a seguinte expressão habitual:
onde R representa a 15N /14N ratio de uma amostra ou da norma que é n atmosférico. - Uso o não-modificadas, tratamento de sólidos recipiente para servir como um controle para rácios de 15N fundo na seguinte equação de balanço de massa quando quantificar a quantidade de 15N ocupada por uma planta de alvo em cortada ou tratamentos intactos do CMN:
onde δ15N representa a abundância isotópica de alvos, vizinhos e alvo de plantas no tratamento não CMN, e x representa (como uma fração decimal) o nitrogênio por cento obtidos pela planta alvo de recipientes vizinho ao qual foi adicionado o rótulo. Para δ15Nvizinhos obtidos são para compostos vizinhos do cada planta alvo.
- Descreva a abundância isotópica usando a seguinte expressão habitual:
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Representative Results
Para determinar como CMNs podem influenciar o desempenho da planta através de particionamento de nutrientes, crescemos Andropogon gerardii Vitman, uma grama de pradarias dominante, em um experimento de planta alvo com 6 vizinhos igualmente espaçados e intacta, decepada ou não CMNs. Achamos que o rompimento ou impedindo CMNs diminuída pesos secos dos destinos, acima do solo (Figura 2), sugerindo que CMNs intactas promoveu o crescimento da planta. Plantas com CMNs decepadas e impedidos CMNs responderam notavelmente semelhante a seus tratamentos, sugerindo que a rotação de recipientes de uma vez por semana era bem sucedida na mitigação dos efeitos da CMNs. O tratamento decepado do CMN, no entanto, pode ser preferido como um controle porque a malha de nylon (que estava coberta por uma membrana hidrofóbica neste experimento) em tratamentos intactas e cortadas pode afetar a dinâmica de água, tais como o solo de recipientes ranhurados (girado ou não) secar mais rapidamente do que em recipientes não-modificadas.
Concorrência, em que o crescimento de um indivíduo suprime o crescimento de outro nas proximidades do indivíduo, foi detectada no tratamento CMN intacto, mas não na cortada ou não tratamentos CMNs. Achamos que só quando CMNs estavam intactos alvo e vizinho resumiu tamanhos têm uma relação negativa, como demonstrado por regressão linear (Figura 3). A cortada e sem tratamentos CMNs não diferiram entre si, e juntos, suas encostas não diferiu significativamente de zero. Daí, diferiram significativamente da inclinação negativa do tratamento CMNs intacto (Figura 3). Além disso, nós encontramos que coeficientes de Gini, uma medida de desigualdade de tamanho que varia de zero para uma na qual zero reflete uma distribuição perfeitamente igual tamanho, diferiu entre os tratamentos. O tratamento CMNs intacto tinha a maior desigualdade10,35,36. Desigualdades de tamanho são afetadas pela competição dentro das populações, particularmente quando indivíduos grandes dominam a aquisição de recursos, desse modo desproporcionalmente a suprimir o crescimento de pequenos indivíduos, também conhecido como competição assimétrica37 , 38.
Se nutrientes minerais eram limitação de crescimento, e se CMNs contribuiu para intensificar a concorrência para esses nutrientes foi determinada através de comparações das concentrações de tecido folha nutriente mineral versus tamanho de planta. De todos os nutrientes minerais avaliados, encontramos que apenas Mn folha tecido as concentrações foram positivamente associadas com pesos secos na superfície de destino planta sobre todos os tratamentos, sem diferenças significativas entre encostas, sugerindo que a Mn pode ter limitado crescimento entre todos os tratamentos (Figura 4). Não obstante, as elevações de linha de regressão, que sugerem diferenças nas concentrações médios entre tratamentos, foram afetadas pela CMN separando e prevenção. Quer dizer a concentrações de N foliares não foram significativamente afetadas pelos tratamentos do CMN, mas concentração N diminuiu significativamente com peso de plantas de alvo, sugerindo um potencial 'efeito de diluição' do tamanho da planta em tecido N39, silo seco 40. portanto, N não era provavelmente o nutriente mineral limitação de crescimento em nosso experimento. Em outro experimento semelhante, dizer P foliar foi significativamente afetado pelo tratamento do CMN, mas também mostrou um efeito de diluição quando comparado com o tamanho para plantas com intacto CMNs35da planta.
Para examinar se CMNs diferencialmente particionar nutrientes minerais entre indivíduos interconectados, avaliamos o tecido de planta alvo para 15N nos tecidos da folha contra o tamanho da planta. Nós tínhamos adicionado 15N-rótulo apenas para recipientes dos vizinhos. Descobrimos que plantas de alvo com CMNs intactos tinham 15N umas concentrações mais elevadas em comparação com os dois outros tratamentos, que não diferiram entre si (Figura 5A). Embora o peso seco na superfície-alvo foi associado com a quantidade de azoto obtida da recipientes dos vizinhos sobre tratamentos de CMNs intactos e cortados, CMNs intactas tinham uma inclinação fortemente positiva, significativamente diferente dos CMNs decepadas tratamento (Figura 5B). Estes resultados sugerem que plantas grandes, potencialmente com abundante fotossintato, obteve mais 15N de CMNs atingindo em vizinhos recipientes do que indivíduos alvo pequeno. Nossos resultados também sugerem que a membrana hidrofóbica impediu com sucesso água livre (e subsequente 15N) movimento dentro de potes.
Em outro experimento girado-núcleo alvo de planta, mudas de árvores de goiaba (Psidium guajava) foram cultivadas em recipientes grandes mudas incorporados em potes grandes, e todos (incluindo as panelas grandes) foram preenchidos com o mesmo solo relativamente ricos em nutrientes mistura. Quando CMNs estavam cortados por rotação na ausência de vizinhos, o crescimento das plantas significativamente reduzido para o mesmo tamanho que as plantas dentro de recipientes sólidos, sugerindo que plantas giradas simplesmente tinham reduzido acesso ao volume total do solo dos potenciômetros grandes (Figura 6 ). Quando as plantas alvo tinham qualquer número de vizinhos, diminuiu de tamanho de planta de tamanhos semelhantes, e qualquer efeito estatisticamente detectável de cortar CMNs desapareceu (Figura 6).
Em um experimento de campo usando girado-núcleos feitos de tubo de PVC, um de nós investigou a influência de micélio extra-radicular no desempenho da planta em um experimento de campo com mudas Soapberry (Sapindus saponaria L.) (Figura 7). Embora o micélio extra-radicular além de tubos teve pouco efeito sobre o crescimento das plantas durante o experimento de treze meses, separar isso pela rotação de tubos reduzido foliar N, P e Cu concentrações substancialmente (em 25% ou mais).
Figura 1. Experimentar a instalação de contentores em intacta, cortado, ou controle tratamentos (A), panelas em uma planta alvo experimentar (B), ou microcosmos com um hexagonal (C) ou quadrado (D) layout de contêineres. Manchas ovais em recipientes modificados são uma abertura para o recipiente coberto com uma malha de nylon de 40 µm para hifas fúngicas penetrar o (A). Redes micorrízicas comuns permanecem intactas com nenhuma rotação dos recipientes, estão rompidas por rotação ou são impedidas de estabelecer com um recipiente de plástico sólido (A). Em um experimento de potenciômetro planta alvo, recipientes podem ser colocados em um fundo de espuma que posiciona-los (B). Para um experimento de microcosmo, o fundo pode por colocado fora em uma matriz hexagonal com seis equidistantes, mais próximo de vizinhos para cada individual 'destino' (C), ou em uma matriz quadrada com quatro vizinhos mais próximos e mais quatro, um pouco mais distante, diagonal vizinhos para cada 'destino' (D). Painel B é modificado de Weremijewicz et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Quer dizer (± SE) na superfície e belowground seco pesos (g) dos indivíduos de Andropogon gerardii alvo entre tratamentos comuns de rede micorrízica. Pesos secos na superfície são mostrados como valores positivos acima a abscissa e belowground pesos secos são valores positivos abaixo a abscissa. Barras de peso seco na superfície cobertas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de post-hoc de Tukey honestamente diferença significativa no ɑ = 0,05. Belowground pesos secos não diferiu entre tratamentos e assim, não são cobertos por cartas. Esta figura é modificada de Weremijewicz et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Vizinho total (g) contra peso seco na superfície (g)-planta alvo para plantas de Andropogon gerardii . Plantas com redes micorrízicas comuns intactas (CMNs) são representadas por triângulos escuros e uma linha sólida, com CMNs decepadas por quadrados cinzento e uma linha tracejada e não CMNs por diamantes brancos e uma linha pontilhada. Esta figura é modificada de Weremijewicz et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Alvo na superfície secos pesos (g) contra as concentrações de manganês foliar (µg·g-1) do Andropogon gerardii. Plantas com redes micorrízicas comuns intactas (CMNs) são representadas por triângulos escuros e uma linha sólida, com CMNs decepadas por quadrados cinzento e uma linha tracejada e não CMN por diamantes brancos e uma linha pontilhada. Esta figura é modificada de Weremijewicz et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Δ15N (‰) ± SE de indivíduos de Andropogon gerardii de destino (A) com intactas redes micorrízicas comuns (CMNs; barras pretas), cortada CMNs (barras cinza) e não CMN (barras brancas) e o nitrogênio por cento obtidos de solo de contêiner do vizinho por plantas com CMNs intactos no ambiente sol (triângulos) ou sombra (quadrados cinzas) contra peso seco na superfície do alvo (g; B). bares encimadas pela mesma letra no painel A não diferem entre si pelo teste de post-hoc de Tukey honestamente diferença significativa no ɑ = 0,05. Estas figuras são modificadas de Weremijewicz et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Quer dizer (± SE) na superfície e belowground seco pesos (g) dos indivíduos de Psidium guajava alvo entre redes micorrízicas comuns (CMNs) e tratamentos de vizinho. As abcissas, um tratamento não vizinho é representado por "0N", um vizinho por "1N", etc., enquanto um tratamento controle com nenhum CMNs (recipiente sólido inoculado e sem vizinhos) é representado pela luz de sombreamento e a letra "C". Biomassa de plantas com CMNs intactas são representados por barras sólidas, enquanto aqueles com CMNs cortadas são tracejadas. Pesos secos na superfície são mostrados como valores positivos acima a abscissa e belowground pesos secos são valores positivos abaixo a abscissa. Bares encimadas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de post-hoc de Tukey honestamente diferença significativa no ɑ = 0,05. Pesos secos na superfície e belowground do tratamento controle só foram comparados com tratamentos de CMN intactos e cortados com sem vizinhos (indicados por letras gregas) porque o controle não incluiu os vizinhos como um fator adicional no tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Extensão do método núcleo girado para um experimento de campo (A) e representante 13 meses Sapindus saponaria L. mudas com intacto (não rodado) e cortada redes micorrízicas comuns (giradas) (B). Tubos de policloreto de vinila (9 cm diâmetro x 20 cm de altura) foram perfurados com um buraco-de-serra para ter quatro furos de diâmetro de 5,3 cm em dois pares opostos. Os buracos foram cobertos com uma tela de silk-screen de nylon com 30 µm poros através da qual micélio extra-radicular poderia estender de e para os núcleos que foram preenchidos com solo do local do plantio (A). Redes micorrízicas comuns foram mantidas intactos ou cortada pela rotação usando um alicate grande. Posições de emparelhado girado e não girada núcleos (cerca de 20 centímetros distante) são marcados por bandeiras cada 2 m ao longo de cinco transectos na parcela experimental localizada em um bosque de lichia (A). Evidência de interrupção de micélio extra-radicular redução de N, P e absorção de Cu é mostrada pelas plantas mancha rotuladas "girado" mostrado na B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nossos resultados afirmam que nosso método de núcleo girado agudamente pode se concentrar sobre o papel da CMNs em interações planta belowground. Existem vários passos críticos no protocolo, no entanto, que se alterou, têm potencial para influenciar a capacidade de detectar os efeitos do CMN. É fundamental para encher os recipientes de área intersticial circundante com um meio nutriente-pobres. Na nossa experiência de planta alvo malsucedido, girado-núcleo com mudas de árvores de goiaba, embora tenha havido uma acentuada redução do crescimento na presença de qualquer número de vizinhos, sem efeitos de CMNs na competição belowground foram detectados, provavelmente por causa de disponibilidade de nutrientes mineral em toda as panelas. Em contraste, o uso de um meio nutriente-pobres entre núcleos girados garante que as hifas devem atingir em vizinhos recipientes que são enchidos frequentemente com hifas e as raízes (especialmente quando se trabalha com raiz-intensivo gramíneas). Hifas extra-radiculares em recipientes vizinhas assim em concorrência directa com os sistemas de raiz e devem particionar nutrientes minerais adquiridas de tais 'patches' entre plantas conectadas a um CMN. Outro componente crítico em fazer interações belowground detectável é de evitar a concorrência à superfície. Nossa experiência de goiaba revelou que o efeito de acesso de volume de solo adicional evidente quando as plantas alvo tinham sem vizinhos essencialmente foi eliminado quando mudas de alvo foram sombreadas por vizinhos. Usando ervas que a maioria delas crescem verticalmente, ou restringindo a coroas de folhas de mudas para evitar sobreposição contribuiria para atenuar as interações na superfície.
A utilização de recipientes um pouco rígidas, em vez de sacos de malha, é fundamental na manutenção de uma longa experiência com facilidade de CMNs rompem através de rotação. Em uma tentativa de início de um experimento do CMN, tentando puxar uma faca entre sacos de malha para cortar CMNs não só resultou em sacos danificados da qual raízes poderiam sobressair, mas também pareciam favorável aumentar a aeração de solo, resultando em crescimento de planta dramaticamente melhorada quando CMNs foram danificadas. Porque a abordagem girado núcleo move-se suavemente cada recipiente numa posição invariável (graças aos buracos de posição de apoio no fundo do pote ou microcosmo), minimiza o rompimento de substrato circundante e aeração potencial. É absolutamente crítico, no entanto, a água completamente as panelas depois da rotação de recipientes para retornar a baixa fertilidade, intersticial substrato de areia para perto, entre em contato com os recipientes.
O método de núcleo girado proposto pode ser modificado em um número de maneiras de responder a uma variedade de questões relacionadas com o funcionamento do CMNs e micélios extra-radiculares. Por exemplo, a quantidade de carbono disponível para as plantas hospedeiras fornecer CMNs pode ser reduzida por sombreamento10. Pano da máscara enrolado protetores de plântulas modificados para cercar recipientes individuais foi bem sucedido na redução de carbono provisionamento para CMNs e, portanto, a absorção de 15N de CMNs10. Além disso, a estrutura da população pode ser investigada em microcosmos grandes (Figura 1, D) composto por muitas plantas, cada um em um recipiente individual, girado. É importante observar, no entanto, que deve ter cuidado para evitar pseudoreplication41 , ao fazê-lo. Plantas individuais são certamente não 'Replica' porque eles não são independentes das outras plantas em um microcosmo. Em vez disso, toda a unidade experimental (potenciômetro ou microcosmo) é idêntico, é por isso que usamos o vizinho em média ou totalizou tamanhos de planta por vaso antes da execução de análises de variância ou regressões lineares.
Nossa abordagem pode ser modificada para estudos de campo excluir a concorrência de raiz e investigar a influência de CMNs intactas. Por substituir recipientes com pedaços de tubo de PVC com grandes buracos cobertos com Silk-Screen de nylon de malha, girados núcleos podem suportar condições de campo duro, como o experimento Soapberry. Semelhante ao nosso experimento de pote de goiaba, no entanto, o efeito de cortar CMNs potenciais poderia não ser distinguido simplesmente restringir o volume de solo do qual nutrientes minerais podem ser adquiridos.
Nossa abordagem fornece uma comparação controlada, cuidadosa de plantas interagindo através de CMNs contra plantas micorrizas que persistentemente não estão interligadas (em vez de plantas inteiramente desprovido de fungo). Daí, que imita os aspectos da natureza, tais como mudas juntando estabelecido CMNs, bem como o uso de um conjunto de fungos de Micorrizas arbusculares. Trabalho recente demonstrou que diferentes espécies de fungo do AM podem ser parceiros qualidade diferentes de plantas, e que a presença de uma segunda espécie de fungo do AM em um sistema de raiz pode induzir uma espécie de fungo 'colaborar' para fornecer mais fósforo por carbono do que quando sozinho sobre o sistema radicular42. Além disso, diferentes espécies de fungos podem fornecer benefícios além de aquisição de nutrientes mineral para plantar hosts, como seca e tolerância salinidade ou proteção contra patógenos2. Esses achados sublinham a importância do uso de um conjunto de fungos para estabelecer CMNs. não obstante o seu realismo, uma evidente limitação da nossa abordagem é duração do experimento. O tamanho dos recipientes ou tubos de PVC limita o comprimento de tempo antes que as plantas se tornem raiz limitada e, portanto, tende a restringir o foco apenas plântulas ou mudas jovens. Não obstante, nos submeter que existe considerável flexibilidade no design de experimentos de girado-núcleo alvo-planta em que um ou ambos os alvos e os vizinhos podem ser manipulados em uma grande variedade de maneiras de compreender os papéis de CMNs.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer os dois revisores anônimos para suas sugestões. Agradecemos também os inúmeros alunos de graduação que ajudava na construção de potes, microcosmos e entalhou recipientes e quem tem assistido com manutenção e colheita de experimentos. Agradecemos também North Central College para inicialização fundos (JW) e instalações atuais, bem como Ashley Wojciechowski para a obtenção de uma subvenção de Richter, do Norte, de Central College apoiando um experimento usando estes métodos. Parte deste trabalho foi financiado por um nacional Science Foundation doutorado dissertação melhoria Grant (DEB-1401677).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial tubular seedlings container (called 'containers' in the manuscript) | Stuewe and Sons, Inc | Ray Leach Cone-tainer ™ | RLC3U |
| Course glass beads | Industrial Supply, Inc. | 12/20 sieve | Size #1 |
| Course silica sand | Florida Silica Sand | 6/20 50lb bags | None |
| Fine glass beads | Black Beauty | Black Beauty FINE Crushed Glass Abrasive (50 lbs) | BB-Glass-Fine |
| Hydrophobic membrane | Gore-tex | None | None |
| Large commercial tubular seedling containers | Stuewe and Sons, Inc. | Deepot ™ | D16L |
| Medium silica sand | Florida Silica Sand | 30/65 50 lb bags | None |
| Nylon mesh | Tube Lite Company, Inc. | Silk screen | LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER |
| Soil and foliar nutrient analysis facility | Kansas State University Soil Testing Lab | None | None |
| Stable isotope core facility | University of Miami | None | None |
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