Summary
社区内的大多数植物可能是由丛枝菌根 (AM) 真菌相互关联的, 但它们对植物相互作用的介导主要是通过种植与不生长菌根的植物进行的。我们提出了一种方法来操纵常见的菌根网络之间的菌根植物, 以研究它们对植物相互作用的后果。
Abstract
丛枝菌根真菌 (AM) 影响植物矿物养分的吸收和生长, 因此, 它们有可能影响植物的相互作用。它们的影响力量在于在根附近发现的营养枯竭区之外的硬质菌丝体, 最终将个体连接在一个共同的菌根网络 (CMN) 中。然而, 大多数实验都研究了 AM 真菌在植物相互作用中的作用, 通过种植植物与不种植菌根真菌, 这种方法未能明确解决 Cmn 的作用。在这里, 我们提出了一种方法来操纵 Cmn, 以研究它们在植物相互作用中的作用。我们的方法使用改进的容器与锥形底部与尼龙网和/或疏水材料覆盖开槽开口, 15n 肥料, 和营养差的间质砂。Cmn 要么在相互作用的个体之间保持完整, 要么因容器的旋转而被切断, 要么被固体屏障阻止形成。我们的研究结果表明, 旋转容器足以破坏 Cmn, 并防止它们对植物在 Cmn 之间的相互作用的影响。我们的方法是有利的, 因为它模仿自然的各个方面, 如幼苗挖掘已经建立的 Cmn 和使用一套 AM 真菌, 可能会提供不同的好处。尽管我们的实验仅限于研究处于苗期的植物, 但使用我们的方法可以检测到 Cmn 之间的植物相互作用, 因此可以应用于研究有关 Cmn 在生态系统中的功能的生物学问题。
Introduction
丛枝菌根真菌 (AM) 辅助植物在4.6亿年前的土地殖民, 今天, 他们是无处不在的共生关系的大多数植物 2, 为他们提供了重要的矿物营养物质的生长。AM 真菌的薄的、线状的菌丝在根系附近营养物质枯竭区以外寻找矿物质, 经常在 "常见的菌根网" (CMN) 中遇到和殖民邻近植物的根系。常见的菌根网也可能形成真菌芽业加入建立的网络3, 或当 am 菌丝融合 (吻合) 与康特异性菌丝4,5,6, 7.这些体外菌丝在土壤中的作用范围是巨大的, 在草原和牧场土壤中, 体外菌种占土壤微生物总生物量的20% 至 30%, 在未受干扰的草地上拉伸 111 m-3 .
常见的菌根网络在相互连接的相邻植物之间划分矿物养分 10,11,12,13。植物可从 AM 真菌中获得高达80% 的磷和25% 的氮需求, 同时向真菌提供高达20% 的固定碳, 作为回报14。最近的体外根系培养研究发现, cmn 优先交换矿物营养素与宿主根, 为真菌提供最多的碳11,12.此外, 不同种类的 AM 真菌作为共生伙伴的质量可能不同, 一些真菌交换更多的磷与更少的碳比其他15.虽然根器官培养是研究 AM 共生的有益模型, 因为它们提供了精心控制的环境和直接观察菌丝相互联系的能力, 但它们不包括影响的光合作用芽重要的生理过程, 如光合作用, 蒸腾作用, 日变化, 以及构成碳和矿物质营养汇。
在自然界中, 幼苗很可能会进入已经建立的 Cmn。然而, 直到最近, 科学家们还只研究了 AM 真菌对植物营养的影响, 因为种植的植物有 am 真菌, 而且通常是用单一种类的 AM 真菌生长。尽管这项工作为我们理解丛枝菌根提供了大量信息, 但这种方法忽略了 Cmn 在互联宿主植物之间的相互作用中可能具有的潜在关键作用。特别是, 高度依赖 am 真菌生长的植物在没有 am真菌 16,17 的情况下相互作用最小, 这可能混淆了我们对 am 真菌介导的相互作用的解释, 当用作基线的 "控制" 时参考。
我们提出了一个旋转核心的方法来调查 Cmn 在植物相互作用和人口结构中的作用。我们的方法模仿了 am 共生的组成部分, 因为整个植物加入了既定的 Cmn, 所有的植物都是用 AM 真菌生长的。通过去除根系相互作用, 我们的方法特别关注 am 真菌介导的相互作用, 同时跟踪 Cmn 内的矿物养分运动。我们的方法建立在以前的工作基础上, 这些工作在现场和温室中都使用了旋转的核心来理解 AM 的实际运作。
旋转核心方法已在文献中确立为一种方法来操纵过度的菌丝18,19, 20,21, 它已经有几个轮回取决于它的目的在过去的二十年里最初, 网袋或允许菌丝生长的屏障被用来提供无根隔间, 以量化土壤中的丛枝菌根菌丝的数量 22,23。然后, 开发了封闭在刚性水管或塑料管中的土体圆柱形岩心, 其槽被尼龙网覆盖, 但不能被菌丝穿透, 但不能被根部穿透。这些可以很容易地旋转, 以扰乱外菌丝体18,24,25。旋转岩心在植物之间放置, 土壤每克土壤的包骨长度 18, 13c 通量为硬外菌丝体24, 或对无植物岩心的磷吸收进行了定量的 18。这种核心的另一个用途是在田间种植植物, 通过频繁的菌丝破坏作为灭菌或使用杀菌剂的替代方法, 减少 AM 真菌对根系的定植, 这两者都对土壤有机物质产生间接影响物质和其他微生物18。
在 cmn 之间, 采用了菌丝网格屏障法研究营养分配和植物相互作用, 但采用矩形微宇宙而不是旋转的核心。Walder 等人26 通过利用 am 真菌根瘤菌中的同位素追踪矿物养分进行碳交换, 研究了亚麻(亚麻) 和高粱(高粱) 之间的相互作用不规则的或毛沙毛花26。他们研究中的微观成分包括由网状屏障隔开的植物隔间、只有菌根菌丝袋才能进入的菌丝隔间, 以及含有放射性和稳定同位素的标记的菌丝隔间。作为对照, 该研究使用了不含菌根真菌的治疗方法。Song 等人 (song等人) 也采用了类似的方法, 发现只有当一种植物被真菌病原体感染时, 植物信号才能在一种植物的既定 cmn 中携带。另外, 与 Walder 等人26 相似, Merrild 等人. 28人在用网状方式分开的各个隔间中种植植物, 以研究由 cmn 连接到一个大黄瓜的番茄幼苗的植物性能黄瓜(黄瓜) 植物, 代表着丰富的碳源。他们还使用了不含菌根真菌的治疗方法, 而不是切断 Cmn28。在第二个相关实验中, 用带有32p. 微生物标记的微生物袋进行了磷交换检测, 该网袋带有连字符屏障, Junos 等人在29岁时使用了 cmn 切断作为治疗方法稀树树种桉树幼苗与雨林树--------- --------------------------------------------------------------- -----------------在这项研究中, Janos等人 29岁举起了一个几厘米长的幼苗, 滑动的网层相互对抗,以打破菌丝连接29。
旋转核心方法演变的最后一步是在锅或微观世界20、30内的岩心内生长植物。Wyss30使用旋转岩心来确定从供体或 "护士" 寄主植物--罗望子植物中繁殖时, 亚木耳外是否能对小松幼苗进行菌落幼苗的菌落繁殖, 以及外外的外菌根真菌会影响幼苗的性能。微宇宙内的大型商用管状幼苗容器 (材料表) 要么是固体塑料 (无 cmn), 要么是开槽并覆盖着疏水膜。开槽苗容器要么没有旋转 (完整的 Cmn), 要么旋转, 以分离建立的 Cmn, Babikova 等人使用不同网层屏障尺寸的旋转核心研究 Vicia之间通过 Cmn 的地下信号蚕豆(豆) 植物。在他们的研究中, 一个直径30厘米的中央供体植物通过根部和菌丝 (无屏障) 或仅通过通过40微米网建立的 Cmn 相互连接。中心植物通过网状封闭岩心的旋转与相邻植物的相互作用而被切断, 或者 Cmn 被包围核心的0.5μm 细网网阻止。
在这里, 我们提出了一个方法, 结合以前的旋转核心方法的各个方面来检查 Cmn 对植物直接相互作用的影响, 结合稳定的同位素追踪。我们的方法采用了 "目标植物" 的方法, 其中感兴趣的中心植物被邻近的植物包围。植物生长在可旋转的幼苗容器内, 这些容器的开槽和覆盖上有尼龙丝网、疏水膜, 或者是非改性固体塑料。常见的菌根网每周被切断一次或保持完整, 15个n 个稳定同位素追踪氮从邻居的旋转核心向中心目标植物的运动。通过比较植物大小与矿物质和稳定的同位素吸收, 我们评估哪些植物可能受益于或遭受 Cmn 在宿主植物之间的相互作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 可旋转芯的建造和组装
- 修改商用管状幼苗容器 (后来称为 "容器");材料表)有19毫米宽 x 48 厘米长的开口。
- 使用带19毫米孔锯的钻压机, 没有中央, 飞行员扭转钻, 削减两个孔, 一个高于另一个, 在一个容器的两侧 (2.5 厘米直径 x 12.1 厘米长), 使孔之间约1厘米的距离。将容器固定在钻床上的围栏上, 并在钻孔时使用一个短的销钉, 将其安装在容器内, 以帮助将其固定在适当的位置。使用带有柔性塑料的容器, 以防止开裂。
- 用剪刀、线切割机或锡片 (用于刚性塑料使用佩锯) 在孔之间切割剩余的薄薄的塑料片, 使一个拉长的开口约2厘米宽, 5 厘米长。
- 重复步骤1.1.1 –1.1.2 在容器的另一侧。
- 用尼龙网和/或疏水膜覆盖插槽 (图 1 a)。
- 将带有40μm 毛孔的尼龙网切割成 9.5 cm x 8.5 厘米的碎片。切割的碎片和容器一样多。
- 将尼龙网外部粘附在容器上, 使织物中的两个开口都有一些轻微的重叠, 使用高强度的工业热胶。
- 如果需要防止水的流动, 例如在使用水溶性营养物质或稳定的同位素时, 用疏水膜 31, 32 (材料表) 覆盖尼龙网层31,32 (材料表), 使 am 真菌菌丝通过, 但只有水蒸气的运动, 而不是液态水。
- 将热胶放在容器上的开口周围, 并沿着尼龙网的长边放置。将容器滚动到织物上, 以避免手指燃烧。在网格边缘重叠的织物边缘添加一层胶水。按下一些纸板的边缘, 将其牢固地密封。始终一致地在一个方向滚动, 这将是相同的方向, 完成容器的旋转在锅或微宇宙, 这样重叠的网格边缘不会被推入潜在的挖掘到基板。
- 一旦胶水冷却, 将织物的顶部和底部贴在容器上, 以防止松散的边缘和撕裂使用灵活的胶带, 如电工的胶带。
- 使用与步骤1.2.5 相同的胶带, 覆盖每个容器的锥形端两侧 (而不是底部尖端的孔) 上的小孔, 以防止根部从容器中生长到锅的其他部分。
- 为了防止土壤流失, 同时提供排水, 在每个容器的底部放置一个玻璃大理石。
- 对于不涉及 CMN 在植物之间形成任何可能的控制处理, 请使用固体、未经修改的容器 (图 1a)。
2. 将锅或微型航天器组装在一起, 以适应容器的锥形末端
- 为了确保容器在固定的位置垂直站立, 并有适当的排水, 翻转锅, 使底部朝上。在锅底周围剪下, 用佩锯留下一个小嘴唇作为支撑。
- 聚苯乙烯泡沫的制备
- 切割聚苯乙烯泡沫, 约36毫米厚, 到相同的直径锅底部使用带锯与圆环切割夹具。
- 在容器的位置模式中, 使用钻床和19毫米孔锯 (不带中央麻花钻) 钻孔到泡沫中。
- 对于目标植物实验, 为周围的相邻个体钻一个具有相同间距孔的中心孔。对于直径15.5 厘米的锅, 在直径11厘米的圆的周长周围间隔6个孔12毫米 (图 1 b)。
- 将孔六边形或方形数组 (图 1c, d) 放置在一个微宇宙实验中。
3. 将容器和锅装满土壤和沙子混合物
- 选择所需的土壤混合物, 并通过与土壤均匀混合切碎的根片 (1-2 厘米长), 将 am 真菌现场采集或盆栽接种到土壤中。将所需的土壤与不孕硅砂或玻璃珠混合, 以降低植物可用的矿物质养分的浓度。
- 将填充的容器放置在钻孔泡沫或微孔底部, 并用不孕的基板填充间隙空间。
- 用营养差的硅砂混合物填充容器之间的间隙空间, 使用漏斗来帮助填充小空间。为确保充分排水和模仿土壤的质地, 混合中颗粒大小的沙子, 如 6-20级, 与小颗粒大小的沙子, 如 30-65级, 在水泥搅拌机。
4. 在整个坑/微宇宙中建立 Cmn
- 植物预处理 "护士" 植物的所需物种到每个容器, 以维持 AM 真菌, 使他们可以传播在容器之间, 并建立 Cmn。
- 当所有容器都建立了幼苗, 通过剪裁去除芽, 使每个容器中只剩下一个单独的。
- 工厂生长和 CMN 建立允许2-3个月。
5. 建立实验植物和处理方法
- 通过播种或移植到容器中播种实验植物。如果播种, 等待, 直到所有容器有一个发芽的幼苗, 然后通过修剪他们的芽删除预处理护士植物。如果移植, 在移植实验苗之前, 应夹住所有预处理设备, 以防止意外的竞争影响。
- 建立 CMN 处理方法, 要么在实验期间不移动容器 (完整的 Cmn), 要么每周轮换容器, 使其在修改后的容器 (被切断的 Cmn) 中延伸;图 1a)。在切断 Cmn 时, 通过一次完全旋转旋转每个容器, 以避免无意中改变地面上的相互作用, 特别是对于各向同性植物。
- 重水所有的锅或微宇宙旋转后立即重建之间的间隙基板和容器的两侧接触。
6. 追踪 Cmn 上的矿物养分运动
- 用 0.5% 15n 富色 kno 3 和 nh 4 cl对邻近植物进行施肥。
- 用浓度相等的14n肥料给目标个体施肥。
7. 监测和维持实验
- 在实验过程中, 定期 (至少每月) 重新随机化锅或微宇宙的位置。
- 每周测量生长, 如高度或最长的叶子长度 (草), 以监测生长何时开始放缓, 因为在植物开始根系之前收获是很重要的。
8. 收获的实验
- 将所有地上组织夹在一起, 并将单个植物放入标记的信封中, 以识别它们的处理、锅或缩影和位置。
- 在60°c 下干燥地面组织, 使其重量恒定。测量每个植物组织的干重。
- 在提取容器和收获根部之前, 让土壤干燥。
- 从根系上精心擦掉尽可能多的土壤, 用平底锅或在250微米孔径的筛子上的温和水流下清洗。
- 让根部风干, 称量整个根系。
- 随意夹紧根系, 并将根系片段储存在50% 乙醇中。在它们被染色33 后, 使用这些片段使用网格线交集方法 34对根定植进行量化。
- 重新称重剩余的根系, 并将其存放在贴有标签的纸包中, 在60°c 下干燥, 以评估干重。使用以下公式计算整个根系的重量:
9. 矿物养分和稳定同位素分析
- 如果组织数量太低, 消化对测定矿物质养分的最低要求, 则按生物量将幼苗分为 "十分位数" 或10组、"八角" 或8组、"四分位" 或4组等, 按重量排序浓度。
- 将叶面样本送往承包实验室进行矿物营养和稳定同位素分析 (材料表)。
- 使用以下习惯表达式描述同位素丰度:
其中r表示样品或标准 n 的 15 n/14 氮比. - 使用未经修改的固体容器处理作为控制背景 15 n 比率在以下质量平衡方程时, 量化 15 n 的数量占目标植物在断线或完整的 cmn 处理:
其中15 n 表示无 cmn 处理中目标、邻居和目标植物的同位素丰度, x 表示目标植物从添加标签的邻居容器中获得的氮百分比 (作为十进制分数)。为每个目标工厂的组合邻居获取 15 n邻居的值。
- 使用以下习惯表达式描述同位素丰度:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了确定 Cmn 如何通过养分分配影响植物性能, 我们在一个目标植物实验中种植了占主导地位的草原草--安德罗戈恩·杰拉迪·维特曼, 该实验有6个间隔相等的邻居, 并被切断, 或者没有 cmn。我们发现, 切断或防止 Cmn 减少目标的地上干重 (图 2), 这表明完整的 cmn 促进了植物的生长。Cmn 被切断并防止 Cmn 的植物对其处理的反应与它们的处理相似, 这表明容器每周轮换一次成功地减轻了 Cmn 的影响。然而, 被切断的 CMN 处理可能更受欢迎, 因为在完整和被切断的处理中, 尼龙网 (在本实验中被疏水膜覆盖) 可能会影响水动力学, 如开槽容器的土壤 (旋转)或不) 干燥速度比未经改装的容器更快。
在完整的 CMN 处理中发现了竞争, 其中一个个体的成长抑制了附近另一个个体的生长, 但在被切断或没有 Cmn 的治疗中没有发现。我们发现, 只有当 Cmn 完好无损时, 才会出现目标, 并将邻域大小求和到线性回归所证明的负关系 (图 3)。被切断的 Cmn 处理方法和没有 Cmn 的处理没有什么不同, 在一起, 它们的坡度与零没有明显的差异。因此, 它们与完整 Cmn 处理的负斜率有显著差异 (图 3)。此外, 我们发现, 基尼系数, 一个大小不等式的度量, 范围从零到一个零反映完全相等的大小分布, 不同的处理。完整的 cmn 治疗有最大的不平等 10,35,36。规模不平等受到人口内部竞争的影响, 特别是当大个人主导资源获取, 从而不成比例地抑制小个人的增长时, 也被称为不对称竞争37,38岁
矿物营养素是否受生长限制, cmn 是否有助于加剧对这些营养素的竞争, 通过比较矿物营养物叶组织浓度与植物大小来确定。在所有测定的矿物质营养物质中, 我们发现在所有处理过程中, 只有锰叶片组织浓度与地面上的目标植物干重呈正相关, 在坡度之间没有显著差异, 这表明锰的含量可能有限。在所有治疗中的增长 (图 4)。然而, 回归线升高, 这表明治疗之间的平均浓度的差异, 受到 CMN 切断和预防的影响。CMN 处理对叶面 N 浓度的影响不大, 但 n 浓度随着目标植物的地上干重而显著下降, 这表明植物大小对组织 N39有潜在的 "稀释效应",40. 因此, 在我们的实验中, n 不可能是限制生长的矿物质。在另一个类似的实验中, CMN 处理对平均叶面磷有显著影响, 但与 Cmn35完整植物的植物大小相比, 也表现出稀释效果。
为了检测 Cmn 是否在相互关联的个体之间不同比例地划分矿物质营养物质, 我们评估了叶片组织中15 n 与植物大小的目标植物组织。我们只在邻居的容器上添加了15个n 标签。我们发现, 与其他两种处理方法相比, cmn 完整的目标植物的氮浓度较高, 但它们之间没有差异 (图 5a)。虽然地面上的目标干重与从邻居容器中获得的氮含量有关, 但完整的 Cmn 与被切断的 Cmn 处理相比, 具有强烈的正斜率, 明显不同于被切断的 Cmn(图 5b)。这些结果表明, 大型植物, 可能具有丰富的光合产物, 获得更多的 15 n 从 cmn 到达邻近的容器比小目标个体。我们的研究结果还表明, 疏水膜成功地防止了锅内的游离水 (以及随后的 15n) 运动。
在另一项旋转核心目标植物试验中, 番石榴 (番石榴) 树苗生长在巨大的幼苗容器中, 埋在大锅里, 所有的人 (包括大花盆) 都充满了同样相对营养丰富的土壤混合物。当 Cmn 在没有邻居的情况下被旋转切断时, 植物生长显著减少到与固体容器内的植物相同的大小, 这表明旋转的植物只是减少了获得大型锅的全部土壤体积的机会 (图 6)).当目标植物有任意数量的邻域时, 植物大小会减少到相似的大小, 并且切断 Cmn 的任何统计检测效果都消失了 (图 6)。
在用 PVC 管制成的旋转芯进行的现场试验中, 我们中的一个人在 Soapberry (Saponaria .) 幼苗的田间试验中研究了产业外菌丝体对植物性能的影响 (图 7)。虽然在十一个月的实验中, 管道以外的外菌丝体对植物生长影响不大, 但通过管道旋转切断, 减少了叶面 N、P 和铜的浓度 (增加25% 或更多)。
图1。容器在完整、断开或对照处理中的实验设置 (A)、目标植物实验中的锅 (b) 或容器的六角形 (C) 或方形 (D) 布局的微宇宙。修改后的容器上的深色椭圆形斑点是进入容器的一个开口, 容器上覆盖着一个40μm 的尼龙网, 用于真菌菌丝渗透 (a)。常见的菌根网络保持完整, 没有旋转的容器, 被旋转切断, 或被阻止建立一个坚实的塑料容器 (a)。在目标工厂盆栽实验中, 容器可以放在放置容器的泡沫底部 (b)。对于一个缩影实验, 底部可以用一个六角形阵列布置, 每个 "目标" 个体 (c) 有六个等距的、最近的邻居, 或者是一个正方形的数组, 有四个最近的邻居, 另外四个, 稍远一点的对角线每个 "目标" (d) 的邻居。B 小组的修改来自 Weremijewicz 等人。请点击这里查看此图的较大版本.
图2。 在常见的菌根网络治疗中, 目标手田和地下干重 (g) 的平均值 (±se)。地面干重显示为横坐标上方的正值, 地下干重值为横坐标下方的正值。在地上干重条顶部由同一字母没有区别的图基的 "真的显著差异"后的测试在 = 0.05。地下干重在不同的处理中没有区别, 因此, 也没有字母顶部。这一数字是根据 Weremijewicz 等人的10人修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.老罗多戈戈生殖地植物的总邻居 (g) 与地面上目标植物干重 (g).具有完整的普通菌根网 (Cmn) 的植物由深色三角形和实线表示, 用灰色正方形和虚线切断 Cmn, 没有白色钻石和虚线的 Cmn。这一数字是根据 Weremijewicz 等人的10人修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图4。目标地上干重 (g) 与叶面锰浓度 (μg·g--1) 的目标. 具有完整的普通菌根网 (cmn) 的植物由黑暗三角形和实线表示, 用灰色正方形和虚线切断 Cmn, 没有 CMN 由白色钻石和虚线表示。这一数字是根据 Weremijewicz 等人的10人修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图5。15 n() ±se 目标仙人掌个体 (a) 具有完整的普通菌根网络 (cmn; 黑条), 被切断的 cmn (灰色条), 没有 cmn (白条) 和百分比氮从邻近容器土壤的植物获得的氮。在环境阳光 (三角形) 或阴影 (灰色正方形) 中的完整 Cmn 相对于地面上的干重 (g;A 组中顶部有相同字母的条形图与图基的 "显著差异" 后应测试 "= 0.05 没有什么不同。这些数字是根据 Weremijewicz 等人的10人修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图6。 在常见的菌根网 (cmn) 和邻域治疗中, 目标番石榴个体的地上和地下干重 (g) 均值 (±se)。沿横坐标, 无邻居治疗以 "0N" 表示, 一个邻居以 "1N" 等表示, 而没有 Cmn (接种固体容器, 没有邻居) 的控制处理则以浅色和字母 "c" 表示。具有完整 Cmn 的植物的生物量由实心条表示, 而具有被切断的 Cmn 的植物的生物量则被处理。地面干重显示为横坐标上方的正值, 地下干重值为横坐标下方的正值。在 = 0 . 05 的情况下 , 图基的真的显著差异后测试 ( = 0 . 05 ) 对同一字母顶部的条形没有差异。控制治疗的地面和地下干重量只与没有邻居的完整和被切断的 CMN 处理进行了比较 (用希腊文表示), 因为控制不包括邻居作为治疗的一个额外因素。请点击这里查看此图的较大版本.
图7。将旋转核心方法推广到田间试验 (A) 和具有代表性的13个月大的 Saponaria saponaria l. 幼苗, 具有完整 (不旋转) 和切断 (旋转) 常见的菌根网 (b)。聚氯乙烯管 (直径9厘米 x 20 厘米高) 与孔锯钻了四个5.3 厘米直径孔在两个对。这些孔覆盖着一个尼龙丝网网, 毛孔为 30μm, 通过这种网孔, 外菌丝体可以从和延伸到从种植地点 (a) 充满土壤的岩心中。常见的菌根网络保持完整或切断旋转使用一个大的管道扳手。在位于 Lychee 小树林 (a) 的实验地块中, 成对旋转和非旋转岩心的位置 (相距约20厘米) 每2米沿五个横断面标记一旗。b中标记为 "旋转" 的氯植物显示了减少 N、p 和铜吸收的外菌丝体吸收中断的证据。请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们的研究结果证实, 我们的旋转核心方法可以突出 Cmn 在地下植物相互作用中的作用。但是, 协议中有几个关键步骤, 如果进行更改, 有可能影响检测 CMN 影响的能力。用营养差的培养基填充容器周围的间隙区域是至关重要的。在我们不成功的、旋转的、核心的番石榴树幼苗目标植物实验中, 虽然在任何数量的邻居在场的情况下, 目标生长明显减少, 但没有发现 Cmn 对地下竞争的影响, 可能是因为整个盆栽的矿物质营养供应。相反, 在旋转的核心之间使用营养差的培养基可以确保菌丝必须到达邻近的容器中, 这些容器中通常同时充满菌丝和根部 (特别是在使用根密集的草时)。因此, 相邻容器中的外部菌丝与根系直接竞争, 必须在连接到 CMN 的植物之间划分从这种 "斑块" 中获得的矿物质。在使地下相互作用被检测到的另一个关键组成部分是避免地面竞争。我们的番石榴实验表明, 当目标植物没有邻居时, 额外的土壤体积通道的效果在目标幼苗被邻居遮挡的情况下基本上被消除。使用主要垂直生长的草, 或修剪幼苗叶冠, 以防止重叠, 将有助于减轻地上的相互作用。
使用一些刚性容器而不是网袋, 对于保持一个长期的实验, 易于通过旋转切断 Cmn 是至关重要的。在 CMN 实验的早期尝试中, 试图在网袋之间拔刀切断 Cmn, 不仅导致根系可能突出的损坏袋, 而且似乎有利地增加了土壤曝气, 从而显著提高了植物生长。Cmn 被切断。由于旋转的核心方法轻轻地将每个容器移动到一个不变的位置 (由于锅底部或微孔的支撑位置孔), 它最大限度地减少了周围的基板中断和潜在的曝气。然而, 它是绝对重要的是, 彻底浇灌锅旋转后的容器返回低肥力, 间质砂基板密切接触容器。
提出的旋转核心方法可以通过多种方式进行修改, 以回答有关 Cmn 和硬膜外菌丝体功能的各种问题。例如, 可供宿主植物提供 Cmn 的碳含量可以通过遮阳10来减少.用经过改良的幼苗保护器包裹的遮阳布成功地减少了碳供应给 Cmn, 从而从 Cmn10中吸收了 15个n。此外, 种群结构可以在由许多植物组成的大缩影 (图 1C, d) 中进行研究, 每个植物都在一个单独的旋转容器中。但是, 必须指出, 在这样做的时候, 必须注意避免伪重复 41.单个植物肯定不是 "复制" 的, 因为它们并不独立于一个缩影中的其他植物。相反, 整个实验单元 (锅或微观世界) 是一个复制, 这就是为什么我们使用平均或总计邻居植物大小每个锅之前运行方差或线性回归的分析。
我们的方法可以修改为实地研究, 以排除根竞争和调查完整的 Cmn 的影响。通过用 PVC 管件替换容器, 这些管件上覆盖着尼龙丝网, 旋转的核心可以承受恶劣的现场条件, 如 Soapberry 实验中所示。然而, 与我们的番石榴锅实验类似, 切断潜在 Cmn 的效果不能简单地限制土壤体积, 从而获得矿物养分。
我们的方法提供了一个有控制的, 仔细的比较植物之间的相互作用之间的 cmn 与菌根植物, 没有持续的相互联系 (而不是植物完全缺乏菌根)。因此, 它模仿自然的各个方面, 如加入已建立的 Cmn 的幼苗, 以及使用一套 AM 真菌。最近的研究表明, 不同的 AM 真菌物种可能是不同的质量合作伙伴的植物, 并在根系上存在第二种 AM 真菌可以诱导一个 "不合作" 的真菌物种提供更多的磷回报碳比单独时, 在根系 42。此外, 不同种类的真菌可能为植物宿主提供矿物养分获取以外的好处, 如耐旱和耐盐性或免受病原体的侵害2。这些发现强调了使用一套真菌来建立 Cmn 的重要性. 尽管它具有现实性, 但我们的方法的一个明显局限性是实验持续时间。容器或 PVC 管的大小限制了植物根系形成之前的时间长度, 因此往往将焦点限制在幼苗或幼苗上。然而, 我们认为, 在目标植物旋转核心实验的设计中, 有相当大的灵活性, 在这些实验中, 目标或两个目标和邻居都可以通过多种方式进行操作, 以了解 Cmn 的作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢两位匿名评论家的建议。我们还感谢众多本科生帮助建造了锅、微宇宙和开槽容器, 并协助进行了维护和收获实验。我们还感谢中北部学院的启动资金 (给 JW) 和现有设施, 并感谢 Ashley Wojciechowski 获得了北中央学院里克斯特赠款, 支持使用这些方法进行的实验。这项工作的一部分由国家科学基金会博士论文改进补助金 (deb-1401677) 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial tubular seedlings container (called 'containers' in the manuscript) | Stuewe and Sons, Inc | Ray Leach Cone-tainer ™ | RLC3U |
| Course glass beads | Industrial Supply, Inc. | 12/20 sieve | Size #1 |
| Course silica sand | Florida Silica Sand | 6/20 50lb bags | None |
| Fine glass beads | Black Beauty | Black Beauty FINE Crushed Glass Abrasive (50 lbs) | BB-Glass-Fine |
| Hydrophobic membrane | Gore-tex | None | None |
| Large commercial tubular seedling containers | Stuewe and Sons, Inc. | Deepot ™ | D16L |
| Medium silica sand | Florida Silica Sand | 30/65 50 lb bags | None |
| Nylon mesh | Tube Lite Company, Inc. | Silk screen | LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER |
| Soil and foliar nutrient analysis facility | Kansas State University Soil Testing Lab | None | None |
| Stable isotope core facility | University of Miami | None | None |
References
- Remy, W., Taylor, T. N., Hass, H., Kerp, H. Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (25), 11841-11843 (1994).
- Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , 3 edn, Academic Press. (2008).
- Giovannetti, M., Avio, L., Sbrana, C. Mycorrhizal Networks. , Springer. 41-67 (2015).
- Giovannetti, M., Sbrana, C. Cell Biology of Plant and Fungal Tip Growth. Vol. 328. Nato Science Series, Sub-Series I: Life and Behavioural Sciences. Cresti, A., Heath, M., Geitmann, I. B. , 221-231 (2001).
- Giovannetti, M., Sbrana, C., Avio, L., Strani, P. Patterns of below-ground plant interconnections established by means of arbuscular mycorrhizal networks. New Phytologist. 164 (1), 175-181 (2004).
- Avio, L., Pellegrino, E., Bonari, E., Giovannetti, M. Functional diversity of arbuscular mycorrhizal fungal isolates in relation to extraradical mycelial networks. New Phytologist. 172 (2), 347-357 (2006).
- Giovannetti, M., et al. At the root of the wood wide web: self recognition and nonself incompatibility in mycorrhizal networks. Plant Signaling & Behavior. 1 (1), 1-5 (2006).
- Miller, R., Kling, M. J. The importance of integration and scale in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant and Soil. 226 (2), 295-309 (2000).
- Miller, R., Jastrow, J., Reinhardt, D. R. External hyphal production of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in pasture and tallgrass prairie communities. Oecologia. 103 (1), 17-23 (1995).
- Weremijewicz, J., Sternberg, L. dS. L. O., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify competition by preferential mineral nutrient allocation to large host plants. New Phytologist. , (2016).
- Fellbaum, C. R., et al. Fungal nutrient allocation in common mycorrhizal networks is regulated by the carbon source strength of individual host plants. New Phytologist. 203 (2), 646-656 (2014).
- Lekberg, Y., Hammer, E. C., Olsson, P. A. Plants as resource islands and storage units--adopting the mycocentric view of arbuscular mycorrhizal networks. FEMS Microbiol Ecol. 74 (2), 336-345 (2010).
- Jakobsen, I., Hammer, E. C. Mycorrhizal Networks. , Springer. 91-131 (2015).
- Jakobsen, I., Rosendahl, L. Carbon flow into soil and external hyphae from roots of mycorrhizal cucumber plants. New Phytologist. 115 (1), 77-83 (1990).
- Kiers, E. T., et al. Reciprocal rewards stabilize cooperation in the mycorrhizal symbiosis. Science. 333 (6044), 880-882 (2011).
- Hartnett, D. C., Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T. Mycorrhizal influence on intra- and interspecific neighbour interactions among co-occuring prairie grasses. Journal of Ecology. 81 (4), 787-795 (1993).
- Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T., Todd, T. C. Differential responses of C3 and C4 grasses to mycorrhizal symbiosis, phosphorus fertilization, and soil microorganisms. Canadian Journal of Botany. 68 (3), 461-467 (1990).
- Johnson, D., Leake, J. R., Read, D. J. Novel in-growth core system enables functional studies of grassland mycorrhizal mycelial networks. New Phytologist. 152 (3), 555-562 (2001).
- Leake, J. R., et al. Networks of power and influence: the role of mycorrhizal mycelium in controlling plant communities and agroecosystem functioning. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 82 (8), 1016-1045 (2004).
- Babikova, Z., et al. Underground signals carried through common mycelial networks warn neighbouring plants of aphid attack. Ecology Letters. 16 (7), 835-843 (2013).
- Schüepp, H., Miller, D. D., Bodmer, M. A new technique for monitoring hyphal growth of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi through soil. Transactions of the British Mycological Society. 89 (4), 429-435 (1987).
- Miller, D. D., Bodmer, M., Schüepp, H. Spread of endomycorrhizal colonization and effects on growth of apple seedlings. New Phytologist. 111 (1), 51-59 (1989).
- Jakobsen, I., Gazey, C., Abbott, L. K. Phosphate transport by communities of arbuscular mycorrhizal fungi in intact soil cores. New Phytologist. 149 (1), 95-103 (2001).
- Johnson, D., Leake, J., Ostle, N., Ineson, P., Read, D. J. In situ 13CO2 pulse‐labelling of upland grassland demonstrates a rapid pathway of carbon flux from arbuscular mycorrhizal mycelia to the soil. New Phytologist. 153 (2), 327-334 (2002).
- Johnson, D., Leake, J., Read, D. J. Transfer of recent photosynthate into mycorrhizal mycelium of an upland grassland: short-term respiratory losses and accumulation. of 14C. Soil Biology and Biochemistry. 34 (10), 1521-1524 (2002).
- Walder, F., et al. Mycorrhizal networks: Common goods of plants shared under unequal terms of trade. Plant Physiology. 159 (June 2012), 789-797 (2012).
- Song, Y. Y., et al. Interplant communication of tomato tlants through underground common mycorrhizal networks. Plos One. 5 (10), e13324 (2010).
- Merrild, M. P., Ambus, P., Rosendahl, S., Jakobsen, I. Common arbuscular mycorrhizal networks amplify competition for phosphorus between seedlings and established plants. New Phytologist. 200 (1), 229-240 (2013).
- Janos, D. P., Scott, J., Aristizábal, C., Bowman, D. M. J. S. Arbuscular-mycorrhizal networks inhibit Eucalyptus tetrodonta seedlings in rain forest soil microcosms. Plos One. 8 (2), e57716 (2013).
- Wyss Lozano Hoyos, T. Pinus elliottii var. densa Seedling Performance Reflects Ectomycorrhizas, Soil Nutrient Availability and Root Competition. , (2010).
- Mäder, P., Vierheilig, H., Alt, M., Wiemken, A. Boundries between soil compartments formed by microporous hydrophobic membranes (GORE-TEX) can be crossed by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi but not by ions in the soil solution. Plant and Soil. 152, 201-206 (1993).
- Mäder, P., et al. Transport of 15N from a soil compartment separated by a polytetrafluoroethylene membrane to plant roots via the hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 146 (1), 155-161 (2000).
- Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture. , (1996).
- McGonigle, T. P., Miller, M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L., Swan, J. A. A new method which gives an objective-measure of colonization of roots by vesicular arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 115 (3), 495-501 (1990).
- Weremijewicz, J., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify size inequality in Andropogon gerardii monocultures. New Phytologist. 198 (1), 203-213 (2013).
- Weremijewicz, J., O’Reilly, L. dS. L., Janos, D. P. Arbuscular common mycorrhizal networks mediate intra-and interspecific interactions of two prairie grasses. Mycorrhiza. , 1-13 (2017).
- Weiner, J. Asymmetric competition in plant populations. Tree. 5 (11), 360-364 (1990).
- Damgaard, C., Weiner, J. Describing inequality in plant size or fecundity. Ecology. 81 (4), 1139-1142 (2000).
- Johnson, C. R., Joiner, J. N., Crews, C. E. Effects of N, K, and Mg on growth and leaf nutrient composition of 3 container grown woody ornamentals inoculated with mycorrhizae. Journal of the American Society for Horticultural Science. 105 (2), 286-288 (1980).
- Estrada-Luna, A. A., Davies, F. T., Egilla, J. N. Mycorrhizal fungi enhancement of growth and gas exchange of micropropagated guava plantlets (Psidium guajava L.) during ex vitro acclimatization and plant establishment. Mycorrhiza. 10 (1), 1-8 (2000).
- Hurlbert, S. H. Pseudoreplication and the design of ecological field experiments. Ecological Monographs. 54 (2), 187-211 (1984).
- Argüello, A., et al. Options of partners improve carbon for phosphorus trade in the arbuscular mycorrhizal mutualism. Ecology Letters. 19 (6), 648-656 (2016).
