Summary
De meeste planten binnen gemeenschappen waarschijnlijk zijn onderling verbonden door arbusculaire mycorrhiza (AM) schimmels, maar bemiddeling van plant interacties door hen voornamelijk door het kweken van planten met versus zonder mycorrhiza heeft onderzocht. Presenteren we een methode om te manipuleren gemeenschappelijk mycorrhiza netwerken onder bijzondere planten te onderzoeken van de gevolgen daarvan voor de plant interacties.
Abstract
Arbusculaire mycorrhiza (AM) schimmels beïnvloeden plant minerale opname van voedingsstoffen en groei, vandaar, ze hebben het potentieel om te beïnvloeden plant interacties. De kracht van hun invloed is in extraradical mycelia die verspreid buiten nutriënten uitputting zones gevonden in de buurt van de wortels naar uiteindelijk interconnect individuen binnen een gemeenschappelijke mycorrhiza netwerk (CMN). Meeste experimenten, hebben echter de rol van AM schimmels in plant interacties onderzocht door het kweken van planten met versus zonder Mycorrhiza schimmels, een methode die niet expliciet inspelen op de rol van CMNs. Hier stellen wij een methode die manipuleert CMNs om te onderzoeken op hun rol in de plant interacties. Onze methode maakt gebruik van gemodificeerde containers met conische bodems met een nylon gaas en/of hydrofoob materiaal voor slotted openingen, 15N-meststof en een nutriënt-armen interstitiële zand. CMNs zitten hetzij intact tussen interagerende individuen, verbroken door rotatie van containers, of verhinderd door een stevige barrière vormen. Onze bevindingen suggereren dat roterende containers voldoende is om de CMNs te verstoren en hun effecten op de interacties van de plant voorkomen in CMNs. Onze aanpak is gunstig omdat het bootst aspecten van aard, zoals zaailingen tappen in reeds gevestigde CMNs en het gebruik van een suite van AM-schimmels die verschillende voordelen kunnen bieden. Maar ons experiment beperkt is tot het onderzoeken van planten in de groeifase, worden plant interacties over CMNs opgespoord met behulp van onze aanpak die dan ook kan worden toegepast op het onderzoeken van biologische vragen over de werking van CMNs in ecosystemen.
Introduction
Arbusculaire mycorrhiza (AM) schimmels planten bijgestaan in de kolonisatie van land 460 miljoen jaar geleden1 en vandaag, ze zijn alomtegenwoordige symbionten voor de meeste planten2, hen te voorzien van vitale minerale voedingsstoffen voor groei. De dunne, draad-achtige schimmeldraden van AM schimmels voedergewassen voor minerale voedingsstoffen na uitputting van de voedende zones in de buurt van wortels, vaak geconfronteerd met en koloniseren wortelstelsel van naburige planten in een "gemeenschappelijke mycorrhiza netwerk" (CMN). Gemeenschappelijke mycorrhiza netwerken ook kunnen uitmaken wanneer schimmel germlings join gevestigd netwerken3, of wanneer ben schimmeldraden zekering met conspecific schimmeldraden4,,5,,6,7(anastomose). De omvang van deze extraradical schimmeldraden in de bodem is enorm, met extraradical schimmeldraden vormt 20% tot 30% van totale bodem microbiële biomassa in de prairie en weide gronden8 en stretching voor 111 m·cm-3 in ongestoorde grasland9 .
Gemeenschappelijke mycorrhiza netwerken partitioneren minerale voedingsstoffen onder onderling verbonden naburige planten10,11,12,13. Planten kunnen ontvangen maximaal 80% van hun fosfor en 25 procent van hun behoefte van de stikstof uit AM schimmels, terwijl het verstrekken van maximaal 20% van hun totale vaste koolstof de schimmels in retourneren14. Recent in vitro wortel orgel cultuur werk heeft gevonden dat de CMNs bij voorkeur minerale voedingsstoffen met wortels van de host waarmee de meeste koolstof tot de schimmels11,12uitwisselen. Bovendien, verschillende soorten AM schimmels kunnen verschillen in hun kwaliteit als symbiotische partners, samen met sommige schimmels meer fosfor voor minder koolstof dan anderen uit te wisselen15. Hoewel wortel orgel culturen gunstig modellen zijn voor het bestuderen van de AM-symbiose omdat deze zorgvuldig gecontroleerde omgevingen en de mogelijkheid om rechtstreeks observeren hyphal interconnecties, bevatten ze geen photosynthesizing scheuten die van invloed zijn op belangrijke fysiologische processen zoals fotosynthese en transpiratie dagverloop veranderingen, zo goed als samenstellende koolstof en minerale voedingsstoffen putten.
In de natuur aanboren zaailingen waarschijnlijk reeds opgerichte CMNs. Tot voor kort echter hebben wetenschappers alleen onderzocht het effect van AM schimmels op de voeding van planten door het kweken van planten met en zonder AM schimmels, vaak met een soort van AM schimmel. Hoewel dit werk enorm informatieve aan ons begrip van arbusculaire mycorrhiza is geweest, heeft deze methode de potentieel cruciale rol die CMNs in interacties tussen onderling verbonden gastheerplanten wellicht over het hoofd gezien. Met name werken planten die sterk afhankelijk van AM schimmels voor groei zijn minimaal zonder AM schimmels16,17, mogelijk verstorende onze interpretatie van AM schimmel-gemedieerde interacties wanneer gebruikt als 'besturingselementen' voor baseline referentie.
Wij stellen een gedraaid-core aanpak voor onderzoek van de rol van CMNs in de plant interacties en structurering van de bevolking. Onze aanpak bootst componenten van de AM-symbiose in de natuur omdat er hele planten join dat cmns en alle planten worden geteeld met AM schimmels. Door het verwijderen van wortel interacties, onze methodologie richt zich specifiek op interacties gemedieerd door AM schimmels terwijl ook het bijhouden van minerale voedingsstoffen verkeer binnen CMNs. Onze benadering bouwt voort op eerdere werkzaamheden die gedraaide kernen zowel in het veld en in de serre heeft gebruikt om te begrijpen AM werking realistisch.
De gedraaide core-methode in de literatuur is opgericht als een methode om te manipuleren extraradical schimmeldraden18,19,20,21, en het heeft verschillende reïncarnaties afhankelijk van het doel via de afgelopen twee decennia. Aanvankelijk, mesh zakken of belemmeringen waardoor in-groei van schimmeldraden werden gebruikt om wortel-vrije compartimenten om te kwantificeren van het bedrag van de bijzondere schimmeldraden van de arbusculaire in de bodem22,23. Vervolgens, cilindrische kernen van de bodem omsloten door starre leidingen voor water of kunststof buizen met "slots" vallende in een nylon gaas penetrable schimmeldraden, maar geen wortels, werden ontwikkeld. Dit kunnen gemakkelijk worden gedraaid verstoort of extraradical mycelia18,24,25. De gedraaide kernen werden geplaatst tussen planten en bodem hyphal lengtes per gram bodem18, 13C fluxen te extraradical mycelia24, fosfor opname van plant-vrije kernen werden gekwantificeerde18. Een ander gebruik van dergelijke kernen moest planten groeien binnen hen in het veld om de kolonisatie van de wortels door AM schimmels door frequente hyphal verstoring als alternatief voor sterilisatie of de toepassing van fungiciden, die beide indirecte effecten op de bodem organische hebben deeltjes en andere microben18.
De aanpak van de barrière van hyphal mesh is gebruikt om te onderzoeken nutriënten partitioneren en plant interacties over CMNs, maar in rechthoekige microkosmos in plaats van met gedraaide cores. Walder et al.26 interacties tussen Linum usitatissimum (vlas) en Sorghum bicolor (sorghum) onderzocht door het traceren van minerale voedingsstof voor koolstof-uitwisseling met behulp van isotopen in CMNs van een van de schimmels AM Rhizophagus irregularis of Funneliformis mosseae26. De microkosmos in hun studie omvatte plant compartimenten gescheiden door gaas belemmeringen, hyphal compartimenten enkel toegankelijk voor mycorrhiza schimmeldraden en gelabelde hyphal compartimenten die radioactieve en stabiele isotopen. De studie gebruikt als besturingselementen, behandelingen zonder Mycorrhiza schimmels. Song et al.27 gebruikt een vergelijkbare aanpak te vinden die fabriek signalen kunnen alleen onder de vastgestelde CMNs van F. mosseae hoeven worden meegenomen wanneer één plant watertje septisch tegen een schimmel pathogeen. Ook, op dezelfde manier Walder et al.26, Merrild et al.28 planten in afzonderlijke compartimenten gescheiden groeide door gaas te onderzoeken van de prestaties van de centrale van Solanum lycopersicum (tomaten) zaailingen door CMNs gekoppeld aan een grote Cucumis sativus (komkommer) plant die vertegenwoordigd een overvloedige koolstofbron. Ze gebruikt ook behandelingen zonder Mycorrhiza schimmels in plaats van het verbreken van de CMNs28. In een tweede, verwante experiment, koolstof voor fosfor uitwisseling werd onderzocht met behulp van mesh zakken gemarkeerd met 32P. microkosmos met hyphal mesh belemmeringen en CMN versnijden als behandeling werden gebruikt door Janos et al.29, die concurrerende onderzocht interacties tussen de zaailingen van de savanne boomsoorten Eucalyptus tetrodonta en plantgoed van de boom van het regenwoud, Litsea glutinosa. In die studie, Janos et al.29 compartimenten met zaailingen enkele centimeters, lagen van gaas tegen elkaar opgeheven te breken hyphal interconnecties29glijden.
De laatste stap in de evolutie van de gedraaide kern methode geweest om te groeien planten binnen kernen die binnen potten of microkosmos20,30. Wyss30 gedraaide kernen gebruikt om na te gaan als extraradical AM mycelium Pinus elliottii zaailingen koloniseren kan wanneer ze zich verspreiden van een donor of 'verpleegkundige' AM waardplant Tamarindus indicaen hoe extraradical mycelium van ectomycorrhizal schimmels invloeden zaailing prestaties. Grote commerciële buisvormige zaailing containers (Tabel van materialen) in microkosmos waren beide stevige kunststof (geen CMNs) of sleuven en bedekt met een hydrofobe membraan. Slotted zaailing containers waren ofwel niet gedraaide (intact CMNs) of draaien om de gevestigde CMNs. gedraaide kernen met verschillende maaswijdte barrière maten werden gebruikt door Babikova et al.20 te onderzoeken ondergrondseruimtes signalering via CMNs onder Vicia verbreken faba (Boon) planten. In hun studie, een centrale donor-fabriek in 30 cm diameter mesocosms was met elkaar verbonden door wortels en schimmeldraden (geen barrière) of alleen door CMNs opgericht door een maaswijdte van 40 μm. Centrale planten werden gescheiden van interacties met naburige planten door middel van rotatie van de mesh-omsloten kernen of CMNs werden verhinderd door een fijne maaswijdte van 0,5 μm bijvoeging van de kern.
Hier presenteren we een methode die aspecten van voorafgaande gedraaid-core benaderingen combineert te onderzoeken van de invloed van CMNs op directe plant interacties gecombineerd met stabiele isotoop tracering. Onze methode gebruikt een 'doel plant' aanpak, waarin de centrale plant van belang is omgeven door naburige planten. Planten worden geteeld in draaibare zaailing containers die worden sleuven en bedekt met nylon zeefdruk gaas, hydrofobe membraan, of zijn niet-gemodificeerde stevig plastic. Gemeenschappelijke mycorrhiza netwerken worden losgemaakt eenmaal per week of intact gehouden, en 15N stabiele isotopen sporen het verkeer van stikstof uit buren gedraaide kernen aan de centrale doelstelling plant. Door vergelijking van de grootte van de plant met minerale voedingsstoffen en stabiele isotoop opname, beoordelen wij welke planten kunnen profiteren of CMNs lijden in interacties tussen waardplanten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. constructie en assemblage van draaibare kernen
- Wijzigen van commerciële buisvormige zaailing containers (later genaamd 'containers'; Tabel van materialen) dat 19 mm breed x 48 cm lengte openingen.
- Met behulp van een boor-pers met een 19 mm gat zag zonder een centrale, pilot twist drill, Knip twee gaten, ene boven het andere, in de zijkanten van een container (2,5 cm diameter x 12,1 cm lengte) zodat de gaten ongeveer 1 cm uit elkaar zijn. Houd de container tegen een hek op de boor pers en hebben een stop met een korte deuvel die binnen de container past om te helpen het op zijn plaats te houden tijdens het boren. Een container met flexibel plastic gebruiken om te voorkomen dat kraken.
- Knip de resterende dun stukje plastic tussen de gaten met een schaar, een draadknipper of tin snips (voor hard plastic gebruiken een sabel-zaag) langwerpige zodat een opening van ongeveer 2 cm breed en 5 cm lang.
- Herhaal stap 1.1.1 – 1.1.2 aan de andere kant van de container.
- Dekking van de sleuven met nylon gaas en/of hydrofobe membraan (figuur 1A).
- Nylon gaas met 40 μm poriën in 9,5 x 8,5 cm stukken gesneden. Knip zo veel stukken als er "opslagplaatsen zijn".
- Lijm de nylon gaas extern op de containers ter dekking van de beide openingen met enige lichte overlap in de structuur met behulp van hoge sterkte, industriële hete lijm.
- Als de preventie van water beweging nodig is, ben zulke zoals wanneer u in water oplosbare voedingsstoffen of stabiele isotopen, dekken de nylon mesh laag met een hydrofobe membraan31,32 (Tabel of Materials) waarmee schimmel schimmeldraden te doorgeeft, maar alleen het verkeer van waterdamp en geen vloeibaar water.
- Plaats de hete lijm rond de openingen voor de container en langs de lange randen van de nylon gaas. Rol de container op de stof om te voorkomen dat de vingers te branden. Het toevoegen van een laagje lijm langs de rand van de stof waar de Maas overlapping randen. Druk op de rand op een aantal karton te stevig verzegelen het. Altijd consequent een samenvatting in één richting die dezelfde richting van de rotatie van de afgewerkte containers in potten of microkosmos worden zal, zodat de overlappende mesh rand zal niet worden geduwd te potentieel graven in het substraat.
- Zodra de lijm is afgekoeld, tape de uiteinden van het boven- en onderkant van de stof naar de container om losse randen en rippen met een flexibel lint, zoals elektricien de tape te voorkomen.
- Met behulp van de dezelfde tape zoals in stap 1.2.5, betrekking hebben op de kleine gaatjes aan de zijkanten van de conische einde (niet het gat aan het uiteinde van de bodem) van elke container om te voorkomen dat de wortelgroei uit de container in de rest van de pot/microkosmos.
- Om bodemverlies te voorkomen terwijl het verstrekken van drainage, een glazen knikker in de bodem van elke container te plaatsen.
- Gebruik voor een controle-behandeling die geen eventuele voor een CMN te vormen tussen planten, solide, ongewijzigde containers (figuur 1A).
2. assemblage van potten of microkosmos te passen de conische uiteinden van de containers
- Containers in een vaste positie rechtop staan en hebben goede drainage te garanderen, flipover een pot zodat de bodem boven ligt. Gesneden rond de onderkant van de pot, verlaten van een kleine lip voor steun, met behulp van een sabel-zaag.
- Bereiding van piepschuim
- Piepschuim, ongeveer 36 mm dik, op dezelfde diameter als de bodem van de pot een bandzagen met een cirkel-snijden mal gesneden.
- Boorgaten in het schuim met behulp van een boor pers en 19 mm gat zag (zonder een centrale twist drill) in het patroon waarin de containers wordt geplaatst.
- Voor een doel plant experiment, boor een gat in het midden even verdeelde rijggat voor naburige individuen eromheen. Ruimte zes gaten voor een pot met een 15,5 cm diameter, 12 mm van elkaar rond de omtrek van een cirkel met een diameter 11 cm (figuur 1B).
- Lay-out de gaten hexagonally of in een vierkante matrix (Figuur 1 c, D) voor een microkosmos-experiment.
3. vullen van de recipiënten en de potten met grond en zand mengsels
- Selecteer een gewenste bodem-mengsel en voeg ben schimmel veld-verzameld of pot gekweekte entmateriaal op de bodem door het mengen van uniform gehakte wortel stukjes (1-2 cm lang) grondig met de bodem. Meng de gewenste bodem met een onvruchtbaar silica zand of glas kralen te verminderen de concentratie van minerale voedingsstoffen beschikbaar voor planten.
- Plaats de gevulde containers in de geboorde schuim of microkosmos bodem en de interstitiële ruimte opvullen met een onvruchtbaar Substraat.
- Vul de interstitiële ruimte tussen containers met nutriënt-armen silica zand mengsel met behulp van een trechter om te helpen bij het invullen van kleine ruimtes. Om te zorgen voor voldoende afwatering en de textuur van de bodem na te bootsen, meng middellange deeltjesgrootte zand, zoals 6-20 rang, met kleine deeltjesgrootte zand, zoals 30-65 rang, in een cementmolen.
4. oprichting van CMNs in de hele potten/microkosmos
- Voorbehandelingsplatformen 'verpleegkundige' planten van de gewenste soorten planten in elke container te handhaven AM schimmels zodat ze kunnen onder de containers verspreiden en CMNs.
- Wanneer alle containers hebben vastgesteld zaailingen, verwijderen schiet door het knippen zodat die slechts één persoon in iedere container blijft.
- Laat 2-3 maanden voor de plantengroei en CMN opstelling.
5. oprichting van experimentele installaties en behandelingen
- Zaaien experimentele installaties door zaaien of verplanten in containers. Als zaaien, wacht tot alle containers een gekiemd zaailing hebben voordat u verwijdert voorbehandeling verpleegkundige planten door knippen hun scheuten. Als verplanten, clip alle voorbehandeling planten vóór het transplanteren van experimentele zaailingen om te voorkomen dat onbedoelde concurrerende effecten.
- Tot stand brengen CMN behandelingen of verlaten van de containers niet voor de duur van het experiment (intact CMNs) verplaatst of gedraaid per te fysiek verbreken schimmeldraden uitbreiding onder de gewijzigde containers (afgehakte CMNs; Figuur 1A). Wanneer het versnijden van CMNs, draaien elke container via één volledige omwenteling om te voorkomen dat per ongeluk wijzigen van bovengrondse interacties, met name voor heliotropic planten.
- Zwaar water alle potten of microkosmos onmiddellijk na de rotatie naar het herstellen van contacten tussen de interstitiële substraat en de zijkanten van containers.
6. opsporen van minerale voedingsstoffen verkeer in CMNs
- Bemesten van naburige planten met 0,5% 15N KNO3 en NH4Cl verrijkt.
- Het doel individu met een 14N-meststof van gelijke concentratie bevrucht.
7. monitoring en onderhoud van experiment
- Regelmatig (bij minste maandelijks) willekeurig opnieuw de posities van de potten of microkosmos in de loop van het experiment.
- Wekelijks meten van de groei, zoals hoogte of langste blad lengte (voor grassen) om te controleren wanneer de groei begint te vertragen, omdat het belangrijk is om te oogsten voordat de planten wortel-gebonden worden.
8. de oogst van het experiment
- Clip van alle bovengrondse weefsel en afzonderlijke fabrieken in gelabelde enveloppen waarmee hun behandeling, pot of microkosmos en positie plaatsen.
- Droge bovengrondse weefsels bij 60 ° C tot constant gewicht. Meten van het drooggewicht van elke plant weefsel.
- Laat de grond te drogen voor het extraheren van de containers en de wortels oogsten.
- Fijn afborstelen zo veel mogelijk van de root-systemen in de bodem en ze in een pan water of een zachte stroom van water op een zeef van 250 micron poriegrootte was.
- Laat de wortels drogen en weeg de hele root systeem.
- Clip van het wortelsysteem lukraak en opslaan van de fragmenten van de wortel in 50% ethanol. Nadat ze zijn gekleurd33, gebruikt u deze fragmenten voor kwantificering van wortel kolonisatie met behulp van de methode van rasterlijn doorsnede34.
- Opnieuw wegen de resterende wortelsysteem en op te slaan in een envelop gelabelde papier gebruikt om te drogen op 60 ° C voor de beoordeling van het drooggewicht. De volgende vergelijking gebruiken voor het berekenen van het gewicht van de gehele root systeem:
9. minerale voedingsstoffen en stabiele isotoop analyses
- Groeperen op de zaailingen biomassa in "salaris" of 10 groepen, "octiles" of 8 groepen, "kwartielen" of vier groepen, etc. na de rang-bestellen ze door gewicht als de hoeveelheid weefsel te laag voor Minimumeisenvoor spijsvertering is om minerale voedingsstoffen concentraties.
- Naalden monsters verzenden een gecontracteerde lab voor minerale voedingsstoffen en stabiele isotoop analyses (Tabel van materialen).
- Beschrijven van isotopische overvloed met de volgende gebruikelijke expressie:
waarbij R staat voor de 15N /14N-verhouding van een monster of van de norm die is van atmosferische N. - Gebruik de niet-gemodificeerde, solide container behandeling om te dienen als een besturingselement voor achtergrond 15N verhoudingen in de volgende vergelijking van de massabalans wanneer kwantificeren van het bedrag van 15N in beslag genomen door een doel plant in verbroken of intact CMN behandelingen:
waar δ15N vertegenwoordigt de isotopische overvloed van doelstellingen, geburen, en planten in de geen CMN-behandeling, en x vertegenwoordigt (als een decimale breuk) het percentage stikstof verkregen door de plant van de doelstelling van buurman-containers waarnaar label werd toegevoegd. Waarden voor δ15Nburen voor elke doel plant de luminantie buren worden verkregen.
- Beschrijven van isotopische overvloed met de volgende gebruikelijke expressie:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te bepalen hoe CMNs invloed kunnen zijn op de prestaties van de centrale door nutriënten partitioneren, groeiden we Andropogon Rus Vitman, een machtspositie prairie gras, in een doel plant experiment met 6 gelijkelijk verdeelde buren en intact, afgehakte, of geen CMNs. We vonden dat het verbreken of verhinderen van de CMNs verminderd doelen bovengrondse droge gewichten (Figuur 2), suggereren dat intact CMNs plantengroei bevorderd. Planten met afgehakte CMNs en voorkomen CMNs gereageerd met name ook tot hun behandelingen, wat suggereert dat de rotatie van containers eenmaal per week succesvol was bij het verzachten van de gevolgen van CMNs. De afgehakte CMN-behandeling, kan evenwel aangewezen als een besturingselement omdat de nylon gaas (die werd overdekt door een hydrofobe membraan in dit experiment) in zowel intact en afgehakte behandelingen van invloed kan zijn op de dynamiek van water zoals de bodem van slotted containers (gedraaid of niet) drogen sneller dan die in niet-gemodificeerde containers.
Competitie, waarin de groei van één enkel individu de groei van een ander in de buurt van individu onderdrukt, werd ontdekt in de intact CMN-behandeling, maar niet in de afgehakte of geen CMNs behandelingen. Wij vonden dat alleen wanneer de CMNs intact waren richten en opgeteld buurman maten hebben een negatieve relatie, zoals aangetoond door middel van lineaire regressie (Figuur 3). De afgehakte en geen behandelingen CMNs niet van elkaar verschillen, en samen hun hellingen niet significant afwijken van nul. Vandaar, zij verschilde aanzienlijk van de negatieve helling van de intact CMNs behandeling (Figuur 3). Bovendien vonden we dat een maatregel van grootte ongelijkheid die van nul tot één in welke nul varieert Gini coëfficiënten, een perfect gelijk grootteverdeling, verschilden tussen behandelingen weerspiegelt. De intacte CMNs behandeling had de grootste ongelijkheid10,35,,36. Grootte ongelijkheden worden beïnvloed door de concurrentie binnen de bevolking, vooral wanneer grote individuen resource verwerving domineren, daardoor onevenredig onderdrukken van de groei van kleine personen, ook bekend als asymmetrische competitie37 , 38.
Of minerale voedingsstoffen werden beperking van de groei, en als CMNs hebben bijgedragen aan werd intensivering van de concurrentie voor nutriënten vastgesteld door vergelijking van minerale voedingsstoffen blad weefsel concentraties ten opzichte van de grootte van de plant. Van alle minerale voedingsstoffen beoordeeld, vonden we dat alleen Mn blad weefsel concentraties werden positief geassocieerd met doel plant bovengronds droge gewichten over alle behandelingen, met geen significante verschillen tussen hellingen, suggereren dat Mn mogelijk beperkte groei onder alle behandelingen (Figuur 4). Niettemin, regressie lijn waterstand, waarin verschillen in de gemiddelde concentraties onder behandelingen worden voorgesteld, werden getroffen door CMN versnijden en preventie. Bedoel naalden N concentraties niet aanzienlijk beïnvloed door CMN behandelingen, maar N-concentratie aanzienlijk daalde met bovengronds droog gewicht van de planten, suggereren een potentieel 'verwateringseffect' van de grootte van de plant op weefsel N39, 40. Daarom N niet was waarschijnlijk de groei beperken minerale voedingsstoffen in ons experiment. In een ander soortgelijk experiment, betekenen naalden P was sterk beïnvloed door CMN behandeling, maar ook bleek een verwateringseffect in vergelijking met plant grootte voor planten met intact CMNs35.
Om te onderzoeken als CMNs partition differentieel minerale voedingsstoffen uit onderling verbonden personen, beoordeeld wij plant doelweefsel voor 15N in blad weefsels ten opzichte van de grootte van de plant. Wij hadden 15N-label alleen toegevoegd aan buren containers. We vonden dat planten met intact CMNs had hogere concentraties van 15N in vergelijking met de beide andere behandelingen, die niet van elkaar (figuur 5A verschillen). Hoewel het doel bovengrondse drooggewicht werd geassocieerd met de hoeveelheid stikstof die zijn verkregen uit buren containers over zowel intact en afgehakte CMNs behandelingen, had intact CMNs een helling van het sterk positief, afwijkt van die van de afgehakte CMNs behandeling (figuur 5B). Deze resultaten suggereren dat grote installaties, potentieel met overvloedige photosynthate, meer 15N CMNs verkregen in het naburige containers dan kleine doel personen te bereiken. Onze resultaten suggereren ook dat de hydrofobe membraan met succes voorkomen gratis water (en latere 15N) verkeer in potten.
In een ander gedraaid-core doel plant experiment, guave (guave) boom zaailingen werden gekweekt in grote zaailing containers ingebed in grote potten en alle (met inbegrip van de grote potten) waren gevuld met de dezelfde relatief voedselrijke bodem mengsel. Wanneer CMNs werden verbroken door rotatie in de afwezigheid van buren, plantengroei aanzienlijk afgenomen tot dezelfde grootte als de planten binnen solide containers, suggereren dat gedraaide planten gewoon hadden teruggebracht toegang tot het volume van de volledige bodem van de grote potten (Figuur 6 ). Wanneer planten had een willekeurig aantal buren, plant grootte daalde tot vergelijkbare capaciteit en eventuele statistisch aantoonbaar effect van het versnijden van CMNs verdwenen (Figuur 6).
In een veld experiment met gedraaid-cores gemaakt van PVC pijp, onderzocht een van ons de invloed van extraradical mycelium op de prestaties van de centrale in de experiment van een veld met Soapberry (Zeepnotenboom saponaria L.) zaailingen (Figuur 7). Hoewel extraradical mycelium buiten pijpen had weinig effect op de groei van de planten tijdens de dertien maanden durende experiment, verminderd het versnijden door rotatie van buizen naalden N, P en Cu concentraties aanzienlijk (met 25% of meer).
Figuur 1. Experimenteren setup van containers in intact, verbroken, of controle behandelingen (A), potten in een doel plant experimenteren (B), of microkosmos met een hexagonaal (C) of vierkante (D) lay-out van containers. Donkere ovale vlekken op gewijzigde containers zijn een opening in de container is voorzien van een 40 µm nylon gaas voor schimmel schimmeldraden te penetreren (A). Gemeenschappelijke mycorrhiza netwerken blijft intact met geen rotatie van de containers, zijn verbroken door rotatie of tot stand te brengen met een stevige plastic container (A) worden voorkomen. In een doel plant pot experiment, kunnen containers worden geplaatst in een schuim bodem dat hen (B standpunten). Voor een microkosmos experiment, kan de bodem door gelegd die in een zeshoekig matrix met zes equidistante, dichtstbijzijnde buren voor elke individuele 'target' (C), of in een vierkante matrix met vier dichtstbijzijnde buren en een andere vier, iets meer verre, diagonale buren voor elke 'target' (D). Deelvenster B wordt gewijzigd van Weremijewicz et al.,10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Betekenen (± SE) bovengronds en ondergronds droog gewicht (g) van doel Andropogon Rus individuen onder gemeenschappelijke mycorrhiza netwerk behandelingen. Bovengronds droge gewichten worden weergegeven als positieve waarden boven de abscis en ondergronds droge gewichten zijn positieve waarden onder de abscis. Bovengrondse droge halterstangen bekroond door dezelfde letter onderling niet verschillen van Tukey eerlijk Significant verschil post-hoc test op ɑ = 0,05. Ondergrondseruimtes droge gewichten niet verschilt de behandelingen en zijn dus niet bekroond door brieven. Dit cijfer wordt gewijzigd van Weremijewicz et al.,10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Totale buurman (g) versus doel plant bovengronds droge gewicht (g voor Andropogon Rus planten). Planten met intact gemeenschappelijk mycorrhiza netwerken (CMNs) worden vertegenwoordigd door donkere driehoeken en een ononderbroken lijn, met afgehakte CMNs door grijze vierkanten en een onderbroken lijn, en geen CMNs door witte diamanten en een stippellijn. Dit cijfer wordt gewijzigd van Weremijewicz et al.,10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Target bovengrondse droge gewicht (g) versus naalden mangaan concentraties (µg·g-1) van Andropogon Rus. Planten met intact gemeenschappelijk mycorrhiza netwerken (CMNs) worden vertegenwoordigd door donkere driehoeken en een ononderbroken lijn, met afgehakte CMNs door grijze vierkanten en een onderbroken lijn, en geen CMN door witte diamanten en een stippellijn. Dit cijfer wordt gewijzigd van Weremijewicz et al.,10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Δ15N (‰) ± SE van doel Andropogon Rus individuen (A) met intact gemeenschappelijk mycorrhiza netwerken (CMNs; zwarte balken), verbroken CMNs (grijze balken), en geen CMN (witte balken) en het percentage stikstof buurman container bodem verkregen door planten met intact CMNs in de zon (driehoeken) of schaduw (grijze vierkanten) versus doel bovengrondse droge gewicht (g; B). Bars bekroond door dezelfde letter in deelvenster A onderling niet verschillen van Tukey eerlijk Significant verschil post-hoc test op ɑ = 0,05. Deze cijfers worden gewijzigd van Weremijewicz et al.,10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Betekenen (± SE) bovengronds en ondergronds droog gewicht (g) van doel guave individuen onder gemeenschappelijk mycorrhiza netwerken (CMNs) en buurman behandelingen. Langs de abscis, een geen buurman behandeling wordt vertegenwoordigd door "0N", een buurman door "1N," enz., terwijl de behandeling van een besturingselement met geen CMNs (geënte solide container en geen buren) wordt vertegenwoordigd door lichte arcering en de letter "C". Biomassa van planten met intact CMNs worden vertegenwoordigd door solide bars, terwijl die met afgehakte CMNs zijn hachured. Bovengrondse droge gewichten worden weergegeven als positieve waarden boven de abscis en ondergronds droge gewichten zijn positieve waarden onder de abscis. Bars bekroond door dezelfde letter onderling niet verschillen van Tukey eerlijk Significant verschil post-hoc test op ɑ = 0,05. Bovengronds en ondergronds droog gewicht van de controle-behandeling werden alleen vergeleken met intact en afgehakte CMN behandelingen met geen neighbors zijn (aangegeven door de Griekse letters) omdat het besturingselement geen buren als een bijkomende factor in de behandeling bevatte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7. Uitbreiding van de gedraaide core-methode voor een veld experiment (A) en representatieve 13-maand-oude Zeepnotenboom saponaria L. zaailingen met intact (niet gedraaid) en verbroken (gedraaide) gemeenschappelijke mycorrhiza netwerken (B). Polyvinylchloride pijpen (9 cm diameter x 20 cm hoogte) werden geboord met een gat-zagen dat vier 5,3 cm diameter gaten in twee tegen paren. De gaten waren bedekt met een nylon zeefdruk gaas met 30 µm poriën via welke extraradical mycelium van zowel in de kernen die voorheen waren opgevuld met bodem van de aanplantrechten site (A) kon uitbreiden. Gemeenschappelijke mycorrhiza netwerken bleven intact of afgehakte door rotatie met behulp van een grote pijp-moersleutel. Posities van gedraaide gekoppeld en worden gemarkeerd als niet-geroteerd kernen (ongeveer 20 cm uit elkaar) door vlaggen transecten elke 2 m langs vijf in het experimentele perceel gelegen in een bosje met Lychee (A). Bewijs van de verstoring van extraradical mycelium vermindering van N, P en Cu opname wordt weergegeven door de chlorotic planten met het label "gedraaid" in Bweergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze resultaten bevestigen dat onze methode gedraaide kern scherp op de rol van CMNs in ondergrondseruimtes plant interacties concentreren kan. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol, echter die als gewijzigd, potentie hebben om invloed op de mogelijkheid om te detecteren CMN effecten. Het is essentieel om te vullen de omringende interstitiële ruimte-containers met een nutriënt-armen medium. In onze mislukte, gedraaid-core doel plant experiment met guave boom zaailingen, hoewel er een duidelijke vermindering van de doelstelling groei in aanwezigheid van een willekeurig aantal buren was, geen effecten van CMNs op de ondergrondseruimtes concurrentie werden gedetecteerd, waarschijnlijk omwille van minerale voedingsstoffen beschikbaarheid gedurende de potten. Daarentegen is het gebruik van een medium nutriënt-armen tussen gedraaide kernen zorgt ervoor dat schimmeldraden bereiken moeten in het naburige containers die vaak zijn gevuld met zowel schimmeldraden en wortels (vooral bij het werken met wortel-intensieve grassen). Extraradical schimmeldraden in naburige containers zo zijn in rechtstreekse concurrentie met wortelstelsel en minerale voedingsstoffen verworven van dergelijke 'patches' onder planten die zijn aangesloten op een CMN moeten partitioneren. Een ander essentieel onderdeel bij het maken van ondergronds interacties detecteerbare is om bovengrondse concurrentie te vermijden. Onze guava experiment bleek dat het effect van extra bodem volume toegang duidelijk toen de planten geen buren in wezen werd uitgeschakeld toen doel zaailingen werden beschaduwd door buren. Met behulp van grassen die meestal verticaal groeien, of beperken van zaailing blad kronen te voorkomen van overlapping zou helpen te verzachten bovengrondse interacties.
Het gebruik van enigszins rigide containers in plaats van mesh zakken, is van cruciaal belang bij het handhaven van een lange experiment met gemak van breken CMNs door middel van rotatie. In een vroege poging om een experiment CMN, proberen te trekken van een mes tussen mesh zakken te verbreken CMNs niet alleen geresulteerd in beschadigde zakken waaruit wortels kon uitsteken, maar ook leek te gunstig verhogen bodem beluchting resulterend in sterk verbeterde plantengroei wanneer CMNs werden verbroken. Omdat de aanpak van de gedraaide kern beweegt zachtjes elke container in een invariant positie (met dank aan de ondersteunende positie gaatjes onderin de pot of de microkosmos), minimaliseert het omliggende substraat verstoring en potentiële beluchting. Het is echter cruciaal, grondig de potten water na rotatie van containers om terug te keren van lage-vruchtbaarheid, interstitiële zand substraat om nauw contact met de containers.
De voorgestelde gedraaide core-methode kan worden gewijzigd in een aantal manieren om te beantwoorden van allerlei vragen over de werking van CMNs en extraradical mycelia. Bijvoorbeeld, kan de hoeveelheid koolstof beschikbaar voor waardplanten te verstrekken van de CMNs worden verminderd door arcering10. Schaduw doek gewikkeld rond gemodificeerde zaailing beschermers te omsingelen van de individuele containers was succesvol te verminderen koolstof inrichten tot CMNs en dus 15N-opname van CMNs10. Bovendien, de bevolkingsstructuur in grote microkosmos (Figuur 1 c, D) kan worden onderzocht met veel planten, elk in een afzonderlijke, geroteerde container. Het is belangrijk op te merken echter dat zorg moet worden genomen ter voorkoming van pseudoreplication41 wanneer doen. Individuele planten zijn zeker niet 'repliceert' omdat ze niet onafhankelijk van de andere planten in een microkosmos. In plaats daarvan is de gehele experimentele eenheid (pot of microkosmos) een kopie, dat is waarom wij gemiddeld of getotaliseerd buurman plant maten per pot voordat u variantie-analyses of lineaire regressies gebruikt.
Onze aanpak kan worden gewijzigd voor veldstudies uit te sluiten van wortel competitie en onderzoeken van de invloed van intact CMNs. Door substitueren containers met PVC pijp stukken met grote gaten bedekt met nylon zeefdruk mesh, gedraaide kernen harde veldomstandigheden, zoals in het Soapberry experiment kunnen weerstaan. Gelijkaardig aan onze guava pot experiment, echter het effect van het versnijden van potentiële CMNs kon niet worden onderscheiden van gewoon het beperken van het volume van de bodem waaruit minerale voedingsstoffen kunnen worden verworven.
Onze aanpak biedt een gecontroleerde, zorgvuldige vergelijking van planten interactie over CMNs versus bijzondere planten die niet voortdurend met elkaar verbonden zijn (in plaats van planten volledig ontbreekt mycorrhiza). Vandaar, het bootst aspecten van de natuur, zoals zaailingen CMNs, alsmede het gebruik van een suite van AM schimmels toetreding vastgesteld. Recent werk heeft aangetoond dat verschillende AM schimmel soorten mogelijk verschillende kwaliteit partners te planten, en dat de aanwezigheid van een tweede soort van AM schimmel op een wortelsysteem kan veroorzaken een soort 'niet-coöperatieve' schimmel te bieden meer fosfor in ruil voor koolstof dan wanneer alleen op de wortelsysteem42. Bovendien kunnen verschillende soorten schimmels opleveren dan minerale voedingsstoffen overname te planten hosts, zoals droogte en zoutgehalte tolerantie of bescherming tegen ziekteverwekkers2. Deze bevindingen onderstrepen het belang van het gebruik van een suite van schimmels op te richten CMNs. Ondanks zijn realisme, een opvallende beperking van onze aanpak is de duur van het experiment. De grootte van de containers of PVC-buizen beperkt de lengte van tijd voordat de planten root gebonden worden, en dus de neiging tot wilt beperken focus alleen zaailingen of jonge aanplant. Toch dienen we dat er aanzienlijke flexibiliteit in het ontwerp van de doel-plant gedraaid-core experimenten waarin één van beide of beide doelstellingen en buren in een breed scala aan manieren om te begrijpen van de rol van CMNs kunnen worden gemanipuleerd is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken de twee Anoniem reviewers voor hun suggesties. Wij danken ook de vele studenten die hebben geholpen met de bouw van potten, microkosmos, en sleuven van containers en die hebben geholpen met onderhoud en oogsten van experimenten. Wij danken ook North Central College voor opstarten middelen (JW) en de huidige faciliteiten, evenals Ashley Wojciechowski voor het verkrijgen van een North Central College Richter subsidie ter ondersteuning van een experiment met behulp van deze methoden. Onderdeel van dit werk werd gefinancierd door een National Science Foundation doctorale proefschrift verbetering Grant (DEB-1401677).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial tubular seedlings container (called 'containers' in the manuscript) | Stuewe and Sons, Inc | Ray Leach Cone-tainer ™ | RLC3U |
| Course glass beads | Industrial Supply, Inc. | 12/20 sieve | Size #1 |
| Course silica sand | Florida Silica Sand | 6/20 50lb bags | None |
| Fine glass beads | Black Beauty | Black Beauty FINE Crushed Glass Abrasive (50 lbs) | BB-Glass-Fine |
| Hydrophobic membrane | Gore-tex | None | None |
| Large commercial tubular seedling containers | Stuewe and Sons, Inc. | Deepot ™ | D16L |
| Medium silica sand | Florida Silica Sand | 30/65 50 lb bags | None |
| Nylon mesh | Tube Lite Company, Inc. | Silk screen | LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER |
| Soil and foliar nutrient analysis facility | Kansas State University Soil Testing Lab | None | None |
| Stable isotope core facility | University of Miami | None | None |
References
- Remy, W., Taylor, T. N., Hass, H., Kerp, H. Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (25), 11841-11843 (1994).
- Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , 3 edn, Academic Press. (2008).
- Giovannetti, M., Avio, L., Sbrana, C. Mycorrhizal Networks. , Springer. 41-67 (2015).
- Giovannetti, M., Sbrana, C. Cell Biology of Plant and Fungal Tip Growth. Vol. 328. Nato Science Series, Sub-Series I: Life and Behavioural Sciences. Cresti, A., Heath, M., Geitmann, I. B. , 221-231 (2001).
- Giovannetti, M., Sbrana, C., Avio, L., Strani, P. Patterns of below-ground plant interconnections established by means of arbuscular mycorrhizal networks. New Phytologist. 164 (1), 175-181 (2004).
- Avio, L., Pellegrino, E., Bonari, E., Giovannetti, M. Functional diversity of arbuscular mycorrhizal fungal isolates in relation to extraradical mycelial networks. New Phytologist. 172 (2), 347-357 (2006).
- Giovannetti, M., et al. At the root of the wood wide web: self recognition and nonself incompatibility in mycorrhizal networks. Plant Signaling & Behavior. 1 (1), 1-5 (2006).
- Miller, R., Kling, M. J. The importance of integration and scale in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant and Soil. 226 (2), 295-309 (2000).
- Miller, R., Jastrow, J., Reinhardt, D. R. External hyphal production of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in pasture and tallgrass prairie communities. Oecologia. 103 (1), 17-23 (1995).
- Weremijewicz, J., Sternberg, L. dS. L. O., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify competition by preferential mineral nutrient allocation to large host plants. New Phytologist. , (2016).
- Fellbaum, C. R., et al. Fungal nutrient allocation in common mycorrhizal networks is regulated by the carbon source strength of individual host plants. New Phytologist. 203 (2), 646-656 (2014).
- Lekberg, Y., Hammer, E. C., Olsson, P. A. Plants as resource islands and storage units--adopting the mycocentric view of arbuscular mycorrhizal networks. FEMS Microbiol Ecol. 74 (2), 336-345 (2010).
- Jakobsen, I., Hammer, E. C. Mycorrhizal Networks. , Springer. 91-131 (2015).
- Jakobsen, I., Rosendahl, L. Carbon flow into soil and external hyphae from roots of mycorrhizal cucumber plants. New Phytologist. 115 (1), 77-83 (1990).
- Kiers, E. T., et al. Reciprocal rewards stabilize cooperation in the mycorrhizal symbiosis. Science. 333 (6044), 880-882 (2011).
- Hartnett, D. C., Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T. Mycorrhizal influence on intra- and interspecific neighbour interactions among co-occuring prairie grasses. Journal of Ecology. 81 (4), 787-795 (1993).
- Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T., Todd, T. C. Differential responses of C3 and C4 grasses to mycorrhizal symbiosis, phosphorus fertilization, and soil microorganisms. Canadian Journal of Botany. 68 (3), 461-467 (1990).
- Johnson, D., Leake, J. R., Read, D. J. Novel in-growth core system enables functional studies of grassland mycorrhizal mycelial networks. New Phytologist. 152 (3), 555-562 (2001).
- Leake, J. R., et al. Networks of power and influence: the role of mycorrhizal mycelium in controlling plant communities and agroecosystem functioning. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 82 (8), 1016-1045 (2004).
- Babikova, Z., et al. Underground signals carried through common mycelial networks warn neighbouring plants of aphid attack. Ecology Letters. 16 (7), 835-843 (2013).
- Schüepp, H., Miller, D. D., Bodmer, M. A new technique for monitoring hyphal growth of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi through soil. Transactions of the British Mycological Society. 89 (4), 429-435 (1987).
- Miller, D. D., Bodmer, M., Schüepp, H. Spread of endomycorrhizal colonization and effects on growth of apple seedlings. New Phytologist. 111 (1), 51-59 (1989).
- Jakobsen, I., Gazey, C., Abbott, L. K. Phosphate transport by communities of arbuscular mycorrhizal fungi in intact soil cores. New Phytologist. 149 (1), 95-103 (2001).
- Johnson, D., Leake, J., Ostle, N., Ineson, P., Read, D. J. In situ 13CO2 pulse‐labelling of upland grassland demonstrates a rapid pathway of carbon flux from arbuscular mycorrhizal mycelia to the soil. New Phytologist. 153 (2), 327-334 (2002).
- Johnson, D., Leake, J., Read, D. J. Transfer of recent photosynthate into mycorrhizal mycelium of an upland grassland: short-term respiratory losses and accumulation. of 14C. Soil Biology and Biochemistry. 34 (10), 1521-1524 (2002).
- Walder, F., et al. Mycorrhizal networks: Common goods of plants shared under unequal terms of trade. Plant Physiology. 159 (June 2012), 789-797 (2012).
- Song, Y. Y., et al. Interplant communication of tomato tlants through underground common mycorrhizal networks. Plos One. 5 (10), e13324 (2010).
- Merrild, M. P., Ambus, P., Rosendahl, S., Jakobsen, I. Common arbuscular mycorrhizal networks amplify competition for phosphorus between seedlings and established plants. New Phytologist. 200 (1), 229-240 (2013).
- Janos, D. P., Scott, J., Aristizábal, C., Bowman, D. M. J. S. Arbuscular-mycorrhizal networks inhibit Eucalyptus tetrodonta seedlings in rain forest soil microcosms. Plos One. 8 (2), e57716 (2013).
- Wyss Lozano Hoyos, T. Pinus elliottii var. densa Seedling Performance Reflects Ectomycorrhizas, Soil Nutrient Availability and Root Competition. , (2010).
- Mäder, P., Vierheilig, H., Alt, M., Wiemken, A. Boundries between soil compartments formed by microporous hydrophobic membranes (GORE-TEX) can be crossed by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi but not by ions in the soil solution. Plant and Soil. 152, 201-206 (1993).
- Mäder, P., et al. Transport of 15N from a soil compartment separated by a polytetrafluoroethylene membrane to plant roots via the hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 146 (1), 155-161 (2000).
- Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture. , (1996).
- McGonigle, T. P., Miller, M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L., Swan, J. A. A new method which gives an objective-measure of colonization of roots by vesicular arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 115 (3), 495-501 (1990).
- Weremijewicz, J., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify size inequality in Andropogon gerardii monocultures. New Phytologist. 198 (1), 203-213 (2013).
- Weremijewicz, J., O’Reilly, L. dS. L., Janos, D. P. Arbuscular common mycorrhizal networks mediate intra-and interspecific interactions of two prairie grasses. Mycorrhiza. , 1-13 (2017).
- Weiner, J. Asymmetric competition in plant populations. Tree. 5 (11), 360-364 (1990).
- Damgaard, C., Weiner, J. Describing inequality in plant size or fecundity. Ecology. 81 (4), 1139-1142 (2000).
- Johnson, C. R., Joiner, J. N., Crews, C. E. Effects of N, K, and Mg on growth and leaf nutrient composition of 3 container grown woody ornamentals inoculated with mycorrhizae. Journal of the American Society for Horticultural Science. 105 (2), 286-288 (1980).
- Estrada-Luna, A. A., Davies, F. T., Egilla, J. N. Mycorrhizal fungi enhancement of growth and gas exchange of micropropagated guava plantlets (Psidium guajava L.) during ex vitro acclimatization and plant establishment. Mycorrhiza. 10 (1), 1-8 (2000).
- Hurlbert, S. H. Pseudoreplication and the design of ecological field experiments. Ecological Monographs. 54 (2), 187-211 (1984).
- Argüello, A., et al. Options of partners improve carbon for phosphorus trade in the arbuscular mycorrhizal mutualism. Ecology Letters. 19 (6), 648-656 (2016).
