Detta protokoll visar sekventiell immunofluorescens och immunohistokemi på kryosektioner från sebrafiskembryon från tidigt stadium, vilket möjliggör exakta samlokalisering analyser i specifika cellpopulationer.
Undersökning av intercellulära interaktioner kräver ofta diskret märkning av specifika cellpopulationer och exakt protein lokalisering. Zebrafiskar embryo är ett utmärkt verktyg för att undersöka sådana interaktioner med en in vivo-modell. Helmonterade immunohistokemiska och immunofluorescensanalyser används ofta i Zebrafiskembryon för att bedöma proteinuttryck. Emellertid, det kan vara svårt att uppnå exakt kartläggning av co-lokaliserade proteiner i tredimensionellt utrymme. Dessutom kan vissa studier kräva användning av två antikroppar som inte är förenliga med samma teknik (t. ex. är antikropp 1 endast lämpad för immunohistokemi och antikropp 2 är endast lämplig för immunofluorescens). Syftet med den metod som beskrivs häri är att utföra sekventiell immunofluorescens och/eller immunohistokemi på enskilda kryosektioner som härrör från embryon från zebrafiskar i början av stadiet. Här beskriver vi användningen av sekventiella rundor av immunofluorescens, Imaging, immunohistokemi, avbildning för en enda kryosektion för att uppnå exakt identifiering av proteinuttryck på encellig nivå. Denna metod är lämplig för alla studier i tidig Stadium zebrafiskar embryon som kräver korrekt identifiering av flera protein mål i enskilda celler.
Zebrafiskar är en extremt robust modellorganism som för närvarande används inom en mängd olika discipliner inom biomedicinsk forskning. I synnerhet, den snabba externa utvecklingen och translucens av zebrafiskar embryon ger ett utmärkt verktyg för in vivo studier. Häri beskriver vi en metod för sekventiell immunofluorescensanalys (IF) och immunohistokemiska (IHC) analyser av kryosektionerade Zebrafiskembryon. Denna roman förfarande använder sekventiell tillämpning av två antikroppar på en enda bild, vilket möjliggör korrekt identifiering av colokaliserade proteiner på cellnivå samtidigt bevara vävnad sektioner. Detta protokoll är särskilt användbart för studier med zebrafiskar-modellen, eftersom ett relativt litet antal antikroppar har validerats för användning i IF-och/eller IHC-tillämpningar i zebrafiskar jämfört med musmodeller.
Observation av intercellulära interaktioner är en viktig del i många studier, och kan ge viktiga insikter i molekylära mekanismer som fungerar på cellnivå som ligger bakom fenotyper på den organismers nivå. Dessutom kan proteinuttryck ge information om cellulär funktion, särskilt när man undersöker uttryck av flera proteiner samtidigt i cellen (samlokalisering). Även om hela Mount IHC och om används ofta tekniker för att analysera proteinuttryck i zebrafiskar embryon1,2,3,4,5, hela monteringsprocedurer kan problem för att uppnå exakta colocalization data. Enligt vår erfarenhet, det kan vara svårt att skilja mellan lager av vävnad och visualisera proteinuttryck på Single-cellnivå i hel-Mount prover. Bildhanteringsprogram kan i allmänhet inte skilja mellan ytfärgning och djupare färgning. Proteinuttryck som inte är ytnivå kan skymmas av tydligare uttryck på ytnivå, vilket leder till felaktigheter i kvantifieringen. Dessutom är de flesta traditionella zebrafiskar clearing metoder ganska giftiga6 och därmed mindre önskvärt för användning.
Antikroppsbaserad teknik, såsom IF och IHC, används ofta för att detektera proteinuttryck i sektionerat material, vilket förenklar identifieringen av diskreta cellpopulationer som uttrycker ett visst protein i komplexa vävnader. IHC används ofta för samlokalisering, oftast genom att använda två olika antikroppar konjugerade i olika värdarter och visualiseras med olika färgade kromogener4,7,8,9 , 10. men med hjälp av flera kromogener kan leda till ospecifik bakgrunds färgning eller inkompatibilitet av färger11,12.
Vi utvecklade ett nytt protokoll för detektion av flera proteiner genom sekventiell IF och IHC på kryosektionerade tidigt sebrafiskembryon. Kryosektionering är särskilt väl lämpad för känsliga vävnader såsom zebrafiskar embryon, och kryosektioner är överlägsna paraffin-inbäddade sektioner för fluorescens-baserade analyser13,14. Vi valde att optimera kombinerade om och IHC snarare än Dual-Color IF eller IHC, att kringgå problemet med antikropp inkompatibilitet för en enda assay typ. Dessa problem är särskilt relevanta för forskning som involverar zebrafisk på grund av det begränsade antalet kommersiellt tillgängliga antikroppar som validerats för användning i zebrafiskar. I själva verket visade en studie av fyra stora företag att kommersiellt tillgängliga antikroppar för användning i mus var ca 112 000 jämfört med ca 5 300 för användning i zebrafiskar15. Slutligen valde vi att utveckla ett protokoll som skulle kunna utföras på en enda kryosektion, vilket är viktigt när man arbetar med små eller begränsade vävnadsprover som erhålls från zebrafiskar embryon.
Detta protokoll har utformats för att bedöma det proliferativa beteendet hos givar celler i 48 h postfertilisering chimär zebrafiskar embryon som genererades av blastula-till-blastula transplantation som beskrivs av carmany-rampey och Moens16. Donatorembryon injicerades vid encells-stadiet med ett fluorescensmärkt dextran-konjugat före transplantation av givar celler till mottagar embryon. Vi använde immunofluorescens för ser 10 fosforylerad histone H3 (pH3) för att detektera prolifererande celler följt av immunohistokemi för den märkta dextran för att upptäcka donator celler i chimär zebrafiskar embryon. Sekventiell detektering av pH3 och den märkta dextran inom en enda kryosektion möjligt för oss att identifiera och kvantifiera enskilda celler som uttryckte båda markörer.
Detta sekventiella IF/IHC protokoll för kryosektionerade zebrafisk kommer att ge ett användbart verktyg för zebrafiskar forskare som önskar en colocalization protokoll för proteinuttryck. De problem som detta protokoll utformades för att ta itu med, såsom små vävnadsprov och begränsad tillgång till antikroppar, är inte unika för zebrafiskar-modellen. Denna metod kan därför vara till nytta för alla forskare som önskar utföra sekventiell IF/IHC.
ETIK UTTALANDE:
Alla djurstudier godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Vi har presenterat en ny metod för kombinerad immunofluorescens och immunohistokemi som utgör ett viktigt steg framåt i utförandet av samlokalisering experiment på kryosektionerade zebrafiskar embryon. Det finns en kritisk brist på befintliga samlokalisering protokoll som är optimerade för användning med små embryon och kryosektionerat material17,18, som båda är annars vanligen används i molekylära studier14. Befintliga colocalization protokoll fokuserar främst på samtidig visualisering av två fluoroforer17,18. Även om dessa protokoll kan fungera bra, är deras användbarhet begränsad av tillgången på antikroppar som (i) kan användas i zebrafiskar och (II) är förenliga med IF.
Vi anser att användning av kryosektionering för zebrafiskar embryon ger en betydande fördel i form av konserverad vävnadmorfologi. Eftersom IHC är vanligare utförs på paraffin sektioner än kryosektioner7,8, ytterligare utforskning av cryosection-baserade IHC metoder för detektion av proteinuttryck är motiverad. Användning av hela Mount om är en vanlig metod för att visualisera uttrycks nivåer i zebrafiskar embryon, och är mer allmänt beskrivs i litteraturen än om att använda kryosektioner1,2,3,4, 19. Dock har hela monterings protokoll begränsningar, inklusive bristen på exakt lokalisering av proteiner uttryckta i djupa vävnader och potentialen för ytnivå uttryck för att dölja proteinuttryck i djupare vävnader. Vi har genomgående observerat utmärkt underhåll av cellulär morfologi efter cryopreservation, snittning, och sekventiella om och IHC. För program som kräver exakt lokalisering av proteinuttryck på encellig nivå, finns det en betydande fördel för avsnitt-baserade förfaranden som vi har beskrivit i detta protokoll. Harts inbäddning ger ett alternativ för att utföra IF eller IHC analyser på sektioner från tidigt stadium zebrafiskar embryon20. Harts sektioner ger överlägsen bevarande av vävnadmorfologi jämfört med kryosektioner, och relativt tunnare vävnad sektioner kan förberedas. Emellertid, tillverkare rekommenderar generellt inte användning av harts sektioner för Immuno-baserade analyser, eftersom vissa komponenter i hartser inte kan avlägsnas från avsnitten och kan maskera antikroppar bindningsställen21.
Även om hela protokollet är viktigt för korrekt och framgångsrik analys av uttrycksmönster, är några specifika steg avgörande för experimentell framgång. Det första kritiska steget är hanteringen av embryon under inbäddning i13oktober,14. Det kan vara svårt att orientera varje embryo i samma tvärgående plan så att snitt skärs från ungefär samma område för alla embryon. Vi har funnit att använda små gauge nålar för att utföra små, avsiktliga rörelser genom trögflytande OCT medium för embryonal orientering är överlägsen med hjälp av pinps, som är för stora och förskjuter för mycket OCT medium. Ett andra kritiskt steg inträffar under snittning av frysta block, eftersom det kan vara svårt att få högkvalitativa sektioner som innehåller önskad vävnad (er) utan betydande utbildning och erfarenhet. Vi rekommenderar därför användning av testprover tills tekniken behärskas. Ett tredje kritiskt steg är täckslip avlägsnande, som har potential att störa eller remsor av vävnadsprover. Vi har funnit att en kombination av mild agitation för att lossa täckglas och långsam borttagning av bilden från PBS-behållaren är den mest effektiva metoden för att ta bort täcklappar. En mild och stadig hand är bäst; forskare kan finna att vissa Trial and error är nödvändigt att lära sig att ta bort täckglas effektivt.
Ytterligare viktiga steg i protokollet inkluderar antikropps optimering (primära och sekundära antikroppar för både IF och IHC-analyser) och exponering av diabilder till det kromogena substratet och motfläcken. Grundlig forskning om primär antikroppselektivitet och målkoncentration är nödvändig. Generellt är det bäst att samla in tillräckligt med icke-dyrbara prover för minst två separata experiment för IF och IHC som kommer att utföras för att optimera primära antikropps koncentrationer innan du påbörjar kombinationen om/IHC. Inklusive en känd positiv och negativ kontroll för varje primär antikropp är viktigt i varje experiment för att säkerställa att både IF och IHC analyser fungerar på lämpligt sätt. Justeringar av sekundär antikroppskoncentration kan också behövas. Optimering av exponeringen av Vävnadsdelar till kromogent substrat och motfärgning för IHC-analysen krävs, eftersom tillverkarens riktlinjer ofta beskriver ett brett spektrum av möjliga exponeringstider. Inte alla kromogener kan vara förenliga med motfläckar och endogena vävnad pigmentering, kräver noggrann planering med avseende på kromogen urval.
Det finns många potentiella ändringar som kan tillämpas på det beskrivna protokollet, och vi har framgångsrikt utfört detta protokoll med andra kombinationer av antikroppar som inte kunde båda användas för IF. Som nämnt ovan, kromogena ämnen har distinkt kompatibilitet med specifika motfläckar. Vi har funnit att dessa komponenter är lätt modifierbara i protokollet. Dessutom är parametrarna för antikropps inkubation ganska flexibla, och kan ökas eller minskas beroende på önskad Färgnings intensitet. Inbäddnings processen kan också ändras. Medan vi har fokuserat på tvärgående sektioner, kan embryon lätt orienteras i någon riktning för att ta itu med särskilda vävnader av intresse. Slutligen finns det flera möjliga paus punkter i det här protokollet. Dehydratiserade embryon kan lagras i 100% MeOH vid-20 ° c i några månader; frysta block kan förvaras vid-80 ° c i upp till tre månader; och förberedda diabilder kan förvaras vid-80 ° c i upp till nio månader i en bildruta.
På grund av den relativa komplexiteten i detta kombinerade IF/IHC-protokoll finns det flera möjliga källor till variation eller fel som kan kräva felsökning, alltifrån vävnads kvalitet till forskar erfarenhet till provhantering. De flesta av de kritiska stegen som beskrivs ovan anses vara kritiska eftersom de antingen kräver optimering på individuell användarnivå eller att de kräver särskild fingerfärdighet, skicklighet och erfarenhet. Vi har dock funnit att ospecifik bakgrunds färgning och låg signalintensitet är de mest betydelsefulla frågor som kräver optimering. Som med alla IF eller IHC protokoll, ta itu med dessa frågor kan vara tidskrävande och arbetsintensiva, och kan förvärras med denna metod eftersom de två teknikerna kombineras. Av denna anledning rekommenderar vi starkt att optimera om och IHC separat innan du fortsätter med det kombinerade protokollet.
Även om vi förutspår att denna metod kommer att vara användbar för ett brett spektrum av experiment, det finns potentiella begränsningar. Lyckad prestanda för denna procedur är beroende av att bibehålla intakt vävnadsprover genom två sekventiella experiment som innehåller många tvättsteg. Av denna anledning, eventuella problem som uppstår vid snittning eller vävnads hantering, inklusive användning av äldre bilder som kan ha försämrad kvalitet, kommer att avsevärt begränsa forskarnas förmåga att utföra detta protokoll framgångsrikt. Även om diabilder kan potentiellt lagras vid-80 ° c i upp till nio månader, vävnad följsamhet till bilder minskar med tiden och vi hade den bästa framgången med bilder som används inom en månad av förberedelser eller helst, nästa dag. En andra begränsning är den lilla fotavtryck av zebrafiskar embryon. Även om vi har funnit detta experiment för att vara användbar för att visualisera proteiner som är relativt rikligt uttrycks i tidigt skede embryon, proteiner som uttrycks inkonsekvent eller på låga nivåer kan vara mycket svårt att fånga i ett avsnitt. Slutligen, eftersom protokollet använder 10 \ u201212 μm kryosektioner, är det bäst lämpad för utvärdering av proteinuttryck i större strukturer, såsom kärnor, snarare än mindre sub-cellulära komponenter.
Sammanfattningsvis kommer vårt kombinerade IF/IHC-protokoll att vara fördelaktigt för en mängd olika studier på embryon från zebrafiskar på tidigt stadium, och utgör en viktig innovation i exakt analys av proteinuttryck i sådana prover. Vår metod, som visas framgångsrikt i figur 5, kommer att göra det möjligt för forskare att bevara den känsliga morfologin hos embryon av sebrafisk i tidig fas i kryosektioner medan de arbetar med det något begränsade utbudet av för närvarande tillgängliga primära antikroppar som är validerats för användning i IF eller IHC hos denna art. Detta protokoll kommer sannolikt att vara användbart för studier på andra arter av fisk och grodddjur (t. ex. Medaka och Xenopus spp.), som hämmas av liknande begränsningar av tillgängligheten till antikroppar och kan tillämpas för traditionella däggdjurs modeller som Väl.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH Grant 5K01OD021419-02 och NC State University College of Veterinary Medicine.
15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2000 dilution in block buffer for IF |
Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
Background Buster | Innovex | NB306 | |
block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS |
cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
Ethanol | Koptec | V1001 | |
fish gelatin | Sigma | G7041 | |
Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
Methanol | Fisher | A452-4 | |
Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2M KCl |
Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
Permount | Fisher | SP15 | |
1X phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
10X phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
1X PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
sucrose | Amresco | 335 | |
Tween-20 | Fisher | BP337 | |
TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1000 in 1x PBS for IF |
1X Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
1X TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL |