Summary
Bu protokol, erken evre zebrafit embriyoları belirli hücre popülasyonlarında hassas kolokalizasyon analizlerini sağlayarak, krobölümler üzerinde sıralı immünofluoresesans ve immünhistokimyasayı gösterir.
Abstract
Hücresel etkileşimlerin incelenmesi genellikle belirli hücre nüfus ve hassas protein lokalizasyonu ayrık etiketleme gerektirir. Zebra balığı embriyo bir in vivo modeli ile bu tür etkileşimleri incelemek için mükemmel bir araçtır. Protein ifadesini değerlendirmek için zebra balığı embriyoları içinde tüm monte edilen immünhistokimyasal ve immünofluoresesan bulguları sıklıkla uygulanır. Ancak, üç boyutlu uzayda ortak lokalize proteinlerin doğru haritalama elde etmek zor olabilir. Buna ek olarak, bazı çalışmalar aynı teknikle uyumlu olmayan iki antikorların kullanılmasını gerektirebilir (örn., antikor 1 sadece immünohistokimya ve antikor 2 için uygundur) sadece immunofluorescence için uygundur. Burada açıklanan yöntemin amacı, erken evre zebra balığı embriyolarından elde edilen bireysel kroziller üzerinde sıralı immünofluoresesans ve/veya immünhistokimya gerçekleştirmesi. Burada, tek hücreli seviyede protein ifadesinin kesin olarak tanımlanması için tek bir kriyobölüm için, immünofluoresesans, görüntüleme, immünhistokimya, görüntüleme sıralı turlarında kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bireysel hücrelerde birden fazla protein hedefini doğru şekilde tanımlamayı gerektiren erken evre zebra balığı embriyoları üzerinde herhangi bir çalışma için uygundur.
Introduction
Zebra balığı Şu anda Biyomedikal araştırmalarda çok çeşitli disiplinler arasında kullanılan son derece sağlam bir model organizmadır. Özellikle, zebra balığı embriyoları hızlı dış gelişme ve translusensi in vivo çalışmalar için mükemmel bir araç sağlar. Bu belgede, kriyosec, zebra balığı embriyo 'nın sıralı immünofluoresesans (IF) ve immünhistokimyasal (IHC) analizleri için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yeni prosedür, tek bir slayt üzerinde iki antikorların sıralı uygulamasını kullanır ve doku bölümlerini koruyarak hücre seviyesinde lokalize proteinlerin doğru şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu protokol özellikle zebra balığı modeli ile çalışmalar için yararlıdır, çünkü nispeten az sayıda antikor IF ve/veya zebra balığı 'deki IHC uygulamalarında fare modellerine kıyasla kullanılmak üzere doğrulandı.
Hücresel etkileşimlerin gözlemlenmesi birçok çalışmada temel bir unsurdur ve örgütsel düzeyde fenotürleri altında yatan hücresel düzeyde işleyen moleküler mekanizmalar içine önemli öngörüler sağlayabilir. Ayrıca, protein ifadesi hücresel fonksiyon hakkında bilgi sağlayabilir, özellikle hücre içinde aynı anda birden fazla protein ifadesi incelediğinizde (Co-yerelleştirme). Tüm Mount IFC ve eğer yaygın zebra balığı embriyolar protein ifadesi analiz teknikleri kullanılır rağmen1,2,3,4,5, tüm montaj prosedürleri olabilir hassas colocalization veri elde etmek için sorunlu. Deneyimimizde, doku katmanları arasında ayrım yapmak ve tüm montaj örneklerinde tek hücreli seviyede protein ifadesini görselleştirmek zor olabilir. Görüntüleme yazılımı programları genellikle yüzey boyama ve daha derin boyama arasında ayrım yapamaz olabilir. Yüzey seviyesinde olmayan protein ifadeleri, daha parlak ifade edilen yüzey seviyesi ifadesi ile belirsiz bir şekilde belirsizleştirilebilir. Ayrıca, en geleneksel zebra balığı temizleme yöntemleri oldukça zehirli6 ve böylece kullanım için daha az arzu edilir.
If ve ıFC gibi antikor bazlı teknikler genellikle, karmaşık dokularda belirli bir proteini ifade eden ayrık hücre nüfuslarının tanımlamasına basitleştirmek için, kesikli malzemeden protein ifadesini algılamak için kullanılır. IHC yaygın olarak farklı ev sahibi türlerinde konjuyen iki farklı antikorlar kullanarak ve farklı renkli krokojenler4,7,8,9 ile görselleştirilen, en sık olarak colocalization için kullanılır , 10. ancak, birden çok krojenler kullanarak nonspesifik arka plan boyama veya renk uyumsuzluğu yol açabilir11,12.
Biz, ardışık IF ve IHC tarafından kriyosec, erken evre zebra balığı embriyo üzerinde birden fazla protein tespiti için yeni bir protokol geliştirdik. Cryosectioning özellikle zebra balığı embriyoları gibi hassas dokulara uygundur, ve kriyobölümler floresan bazlı deneyleri13,14için parafin-gömülü bölümlere üstün. Biz tek bir tahlil türü için antikor uyumsuzluğu sorununu aşmak için, kombine IF ve ıHC yerine çift renk If veya ıHC optimize seçti. Bu sorunlar özellikle zebra balığı kullanım için onaylanmış ticari antikorlar sınırlı sayıda nedeniyle zebra balığı içeren araştırma için ilgilidir. Aslında, dört büyük şirketlerin bir çalışma fare kullanımı için ticari olarak mevcut antikorlar yaklaşık 112.000 zebra balığı15kullanımı için yaklaşık 5.300 olduğunu gösterdi. Son olarak, zebra balığı embriyolardan elde edilen küçük veya sınırlı doku örnekleri ile çalışırken gerekli olan tek bir kriyobölüm üzerinde gerçekleştirilebilecek bir protokol geliştirmeye karar verdik.
Bu protokol, donör hücrelerinin proliferatif davranışını değerlendirmek için tasarlanmıştır 48 h sonrası fertilizasyon chimerik zebra balığı embriyoları tarafından oluşturulan Blastula-Blastula nakli tarafından tanımlanan carmany-rampey ve Moens16. Donör embriyoları alıcı embriyolar içine donör hücrelerinin nakli önce floresan etiketli dekstran konjuç ile tek hücreli aşamada enjekte edildi. Chimerik zebra balığı embriyoları içinde donör hücrelerini tespit etmek için etiketlenmiş dekstran için immunohistokimya tarafından izlenen proliferasyon hücrelerini tespit etmek için ser 10 fosforile histon H3 (PH3) için immünofloresan kullandık. PH3 ve tek bir cryosection içinde etiketli dekstran sıralı algılama bizi belirlemek ve her iki işaretçileri ifade bireysel hücreleri ölçmek için etkin.
Kriyosec, zebra balığı için bu sıralı If/IHC Protokolü protein ifadesi için bir kolokalizasyon Protokolü arzu zebra balığı araştırmacılar için yararlı bir araç sağlayacaktır. Bu protokolün küçük doku numuneleri ve sınırlı antikor kullanılabilirliği gibi adrese tasarlanmış sorunları zebra balığı modeline benzersiz değildir. Bu yöntem, bu nedenle herhangi bir araştırmacı ardışık If/ıFC gerçekleştirmek isteyen için kullanılabilir olabilir.
ETIK BEYANı:
Tüm hayvansal çalışmalar kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi, Kuzey Carolina Devlet Üniversitesi, Raleigh, Kuzey Carolina, ABD tarafından onaylandı.
Protocol
1. embriyo hazırlama
- Fix 48 h sonrası fertilizasyon (HPF) chimerik zebra balığı embriyo tarafından oluşturulan Blastula-Blastula nakli arasında AB Wild-tipi zebra balığı embriyoları arasında 4% civarında formaldehite (PFA) gecede 4 °c ' de sallanan ile. 500 μL kullanarak oda sıcaklığında sallanan iki 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin 1x fosfat tamponlu tuz içeren% 0,1 olmayan bir iyonik yüzey (1x PBSt; malzeme tablosunabakın)
Not: Paraformaldehyde toksik ve kanserojen olup, kurumsal düzenlemeler başına düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Paraformaldehit ile çalışma bir kimyasal kaput yapılmalıdır, ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket, ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. - 500 μL% 30,% 50 ve% 70 metanol (MeOH) ile 10 dakika boyunca her biri sallanan oda sıcaklığında 1 PBSt ile seyreltilmiş embriyoların kurutması. En az 14 h için 500 μL/% 100 MeOH-20 °C ' de embriyoları inkük et.
Not: Metanol zehirlidir ve kurumsal düzenlemeler başına düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Metanol ile çalışma bir kimyasal kaput yapılmalıdır, ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket, ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. - 500 μL% 70,% 50 ve% 30 MeOH ile 1 PBSt ile 10 dakika boyunca her oda sıcaklığında sallanan ile seyreltilerek embriyoların rehidrat. Sallanan ile Oda sıcaklığında 1x PBSt 500 μL ile iki 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin.
- 1x PBST çıkarın ve 500 μL in% 30 sakaroz, embriyolar tüpün alt kısmına kadar sallanan ile Oda sıcaklığında deiyonize su ile seyreltilmiş (yaklaşık 1 saat). % 15 balık jelatin/% 25 sakaroz (15/25; malzeme tablosunabakın) 500 μL ile sukrose değiştirin ve gece sallanan ile Oda sıcaklığında inküye.
- 15/25 hacminin yaklaşık yarısını optimum kesme sıcaklığı Orta (OCT orta) ile değiştirin ve embriyolar tüpün alt kısmına kadar sallanan oda sıcaklığında inküye (yaklaşık 1 saat).
- EKIM orta hacminin yaklaşık yarısını değiştirin ve 1 h için sallanan ile Oda sıcaklığında inküye. bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
- 15/25 ve OCT orta ile inkübasyon adımları sırasında, bu reaktifler birleştirmek için gerektiği gibi tüp ters çevirme veya fiske.
2. embriyo gömme ve Kriyobölümlerin hazırlanması
- Embriyoları plastik bir kalıp ( malzeme tablosunabakın) forseps ile aktarın, 15/25-Oct karışımı herhangi bir transfer minimize. EKIM orta ile yaklaşık yarım tam kalıp doldurun ve hafifçe OCT orta embriyolar karıştırın.
- Hazırlamak etiketli plastik kalıplar ve transfer istenen embriyolar (genellikle 1 \ u20123 embriyo) içine boş, etiketli plastik kalıplar, taşıma en aza indirmek EKIM orta. İstenilen embriyolar plastik kalıp içinde ise, yavaşça kalıp üstüne OCT orta ile doldurun.
- Görselleştirme için hafif bir mikroskoptan kullanarak embriyoları istenilen yönde düzenlemek için forseps veya 25 G iğne kullanın (Şekil 1a, B).
- Metal bir platform ile yalıtılmış bir kap içinde kuru buz üzerinde hazırlanmış kalıpları dondurun. Soğuk bir oda oluşturmak için metal platformunun üzerine yavaşça bir buz kovası veya köpük soğutucusu yerleştirin (Şekil 1C, D)
-
-20 °C ' de bir kriyostat seti kullanarak 10 \ u201212 μm kalınlığında kriyobölüm hazırlayın.
- Bir defada bir blok ayarlayın ve bloğu (Şekil 2a) doğru bakacak şekilde bloğun alt kısmına sahip disk/ayna üzerine blok dondurmak için Oct orta kullanın. Kesme işleminden önce bloğun diske tamamen Dondurulmuş olduğundan emin olun (OCT ortamı beyaz olacak) (Şekil 2B).
- Şarj edilmiş cam slaytlara (Şekil 2C, D) kriyobölümler yerleştirin ve hava-kuru gece oda sıcaklığında slaytlar.
3. pH3 için immünofluorescence
- Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynır içinde 1x PBS 'de slaytların üç 5 dakika yıkamaya gerçekleşmesini yapın. Dokuların kaydıra iyi yapışmaz ise, düz bir yüzey üzerinde slaytlar döşeme ve yavaşça pipetleme 500 μL 1 PBS yüzeye üzerine kayar. Yavaşça slaytları açarak yıkanmaları arasında 1x PBS dökün.
- Slaytlar üzerinde sıvı tutmak için bir bariyer kalemi veya balmumu kalem ile bölümler anahat (Şekil 3).
- Slaytları, nemli bir odada düz bir yüzeye ve pipet 200 μL 'ye her bölüm için slaytlar üzerine yerleştirin. Oda sıcaklığında 2 saat veya 4 °C ' de bir gecede blok tamponunun içinde kulbirer atın.
- Birincil antikor seyreltme hazırlayın (tavşan Anti-pH3 antikor, 1:200; bkz. malzeme tablosu) blok tampon ve karışımı iyi pipetleme ile. Blok tamponunu boşaltmak için slaytları hafifçe ucu, nemli odasına dönün ve 200 pipet, slayt üzerine bölüm başına primer antikor çözeltisi μL. Yalnızca ikincil denetim için pipet 200 μL blok arabelleği uygun bölümler üzerine.
- Bir gecede 4 °C ' de, deiyonize su ile dolu nemli bir odada slaytları kulbe etme. Nemi muhafaza etmek için nemli odanın kenarlarını mühürleyin.
- Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynır içinde 1x PBS 'de slaytların üç 5 dakika yıkamaya gerçekleşmesini yapın. Yıkama adımları sırasında, ikincil antikor seyreltme hazırlamak (Anti-tavşan floresan ikincil antikor Konjugat, 1:2000; malzeme tablosunugörmek) blok tampon ve karışımı iyi pipetleme ile.
- Slaytlar üzerinde bir nemli oda ve pipet 200 μL ikincil antikor çözeltisi slayt üzerine bölüm başına düz bir yüzeye yerleştirin. Orta antikor çözeltisi (ler) nda, 30 dakika boyunca ışık korumalı oda sıcaklığında slaytları kulyın.
- Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir kapsayıcıda 1x PBS 'de slaytların üç adet 5 dakika yıkanıyor, ışıktan korunan. Yıkama adımları sırasında, bir nükleer boyama çözeltisi hazırlayın ( malzeme tablosunabakın).
- Slaytları düz bir yüzeye yerleştirin ve her bölüme nükleer boyama çözeltisi için 200 \ u2012500 μL (numune boyutuna bağlı olarak) pipet takın. Nükleer boyama çözeltisi içinde slaytları 10 dakika boyunca ışıktan korunur.
- Nükleer boyama çözeltisi boşaltın ve olmayan sertleştirici floresan montaj medya ve bir cam coverslip ile slaytlar monte. Görüntüleme gerçekleştirilinceye kadar karanlıkta slaytları 4 °C ' de koruyun.
Not: En iyi sonuçlar, slaytlar aynı gün veya ertesi gün görüntülenmiş olduğunda elde edilir. - Eğer 100 x büyütme (10X oküler büyütme ve 10X objektif büyütme) 555 Nm (kırmızı) ve 645 Nm (uzak kırmızı) emisyon filtreleri kullanarak bir konfokal floresan mikroskop ve dijital kamera ile slaytları görselleştirin ve görselleştir. Lazer gücünü görüntüleme boyunca tutarlı tutun.
- Görüntüleme işleminden sonra, slaytları 1x PBS bireysel konteynerlerde yerleştirin ve 4 °C ' de düz olarak saklayın. Slaytları 1x PBS 'ye yerleştirirken, coverslunun çıkarılmasına yardımcı olmak için slaytları yavaşça karıştırın.
Not: Bu bölümlerin kalitesini tehlikeye atabilir gibi lamel magazini üzerine basmayın veya el lamel magazini kaldırmak için girişimi. Coverfiş en az zorunlu hareket ile yatay olarak kaldırılmalıdır.
4. etiketlenen dextran için immünhistokimya
- Coverflar kaldırıldıktan sonra, slaytları bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynır içinde yeni 1x PBS 'ye hafifçe aktarın. 1x PBS kaldırın ve 1x Tris-tamponlu tuz% 0,1 ile üç 5 dk kulkaylar gerçekleştirmek olmayan bir iyonik yüzey (1x TBSt) Oda sıcaklığında.
- Hazırlamak 250 mL 3% hidrojen peroksit (H2O2) deiyonize suda uygun boyutta bir konteyner seyreltilmiş. Slaytları 3% H2O2 ' de oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküle.
Not: Hidrojen peroksit korozif ve düzgün kurumsal düzenlemeler başına bertaraf edilmelidir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. - Hızlı bir şekilde deiyonize su ile slaytlar durulayın. 1x TBSt içinde slaytların üç 5 dk yıkayıcıları gerçekleştirin. dikkatle doku bölümlerinin çevresindeki alanı kurutun ve slaytlar nemli bir odaya düz yerleştirin. Gerekirse bölümlerde sıvı tutmak için bir bariyer kalem veya balmumu kalem ile doku bölümlerini anahat.
- Bir ikincil antikor etiketleme kiti ile sağlanan hazır kullanım 2,5% serum engelleme çözeltisi uygulayın ( malzeme tablosunabakın) her bölüme dropwise. Nemli bir odada, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytları kulyın.
- Antikor seyreltilmiş primer antikor hazırlama (tavşan Anti-etiketli dextran, 1:7500; malzeme tablosunabakın) ve nazik pipetleme ile karıştırın. Blok tamponunu boşaltıp, bölümlerin çevresindeki alanı kurutmak ve slaytları nemli bir odaya yerleştirmek için yavaşça ucu kaydırın.
- Primer antikor çözeltisi uygulamadan önce yıkanmayın. Pipet 200 μL, kesit başına ana antikor çözeltisi slaytlara ve 4 °C ' de nemli bir odada kuluçşurada. Sadece ikincil kontrol için, pipet 200 uygun bölümlere antikor seyreltilme μL.
- Birincil antikor çözeltisi ve bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynırın içinde 1x TBSt 'de yer boşaltmak için slaytları hafifçe uç. 1x TBSt içinde slaytların iki 5 dk yıkayıcıları gerçekleştirin. bölümlerin çevresindeki alanı kurutun ve nemli bir odaya yerleştirin.
- Kullanıma hazır bir arka plan azaltma engelleme reaktif ( malzeme tablosunabakın) her bölüme dropwise uygulayın. Nemli bir odada, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytları kulyın.
- Blok tamponunu boşaltmak için slaytları hafifçe uç, bölümler çevresindeki bölgeyi dikkatlice kurutun ve slaytları nemli bir odaya yerleştirin. İkincil antikor çözeltisi uygulamadan önce yıkanmayın.
- Kullanım hazır ikincil antikor çözeltisi (Anti-tavşan horserpu peroksidaz (HRP) polimer ikincil antikor; malzeme tablosunabakın) her bölüm dropwise ve 30 dakika oda sıcaklığında nemli bir odada inkük.
- İkincil antikor çözeltisi ve bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynır içinde 1x TBSt içinde yer boşaltmak için yavaşça uç slaytlar. 1x TBSt içinde slaytların iki 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin.
- Üreticinin protokolüne göre hemen kullanmadan önce HRP kromojenik substrat hazırlayın ( malzeme tablosunabakın).
- Bölümlerin çevresindeki alanı kurutun, slaytları düz bir yüzeye yerleştirin ve her bölüme HRP kromojenik substrat 200 μL uygulayın. İlk slaytta substrat uygulandığında bir Zamanlayıcı başlatmak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe (Şekil 4).
- Substrat çözeltisi boşaltın ve 1x PBS içeren bir Coplin kavanozunda slaytları kısaca durulayın. Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynerin içinde deiyonize suya slaytlar yerleştirin ve nazik ajitasyon ile deiyonize suda iki 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin.
- 30 sn. ' ye kadar hematoksilen boyama çözeltisi içine yerleştirerek slaytları counterstain.
Not: Hematoksilin zehirlidir ve kurumsal düzenlemelere göre bertaraf edilmelidir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. - Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynerin içinde deiyonize suya slaytlar yerleştirin ve deiyonize suda üç 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin. Slaytları Scott 'ın musluk suyunu içeren bir kapsayıcıya aktarın ( malzeme tablosunabakın) ve 1 dakika boyunca inküye yapın.
- Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynerin içinde deiyonize suya slaytlar yerleştirin ve deiyonize suda üç 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin.
- Bir kimyasal kaput içinde etanol (EtOH) notları (deiyonize suda seyreltilmiş) ve ksilon bir dizi ile slaytlar susuz. 70% EtOH 'da bir 2 dk kuluçk gerçekleştirin,% 95 EtOH 'de iki 1 dak,% 100 EtOH 'da iki 1 dakika inkübasyon ve Ksilin içinde üç adet 1 dak. Ksilden slaytları çıkarın ve kimyasal bir kapta Toluen tabanlı montaj ortamı ile ıslak iken bir lamel magazini yerleştirin.
Not: Ksilon ve Toluen toksik ve yanıcı olup, kurumsal düzenlemeler başına düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Ksilol ve Toluen ile çalışma bir kimyasal kaput yapılmalıdır, ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket, ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. - IFC takipte, 100 x büyütme (10X oküler büyütme ve 10X objektif büyütme) ile bileşik ışık mikroskobu ve dijital kamera ile slaytlar görselleştirin ve görüntü. (Şekil 5).
Representative Results
Bu protokolü, AB Wild tipi zebra balığı embriyoları arasında Blastula-Blastula nakli tarafından oluşturulan 48 h sonrası fertilizasyon kimerik zebra balığı embriyoları içinde bireysel donör hücrelerinde protein ifadesini belirlemek ve analiz etmek amacıyla geliştirdik. Tek hücreli seviyede protein ifadesinin başarılı bir şekilde analiz edilmesi, uygun odaklı embriyolar (Şekil 1 ve Şekil 2) ve dikkatli, IF ve IFC tekniklerinin sıralı olarak uygulanması (Şekil 3 ve Şekil 4). Proliferasyon hücrelerini aynı anda algılamak için spesifik antikorların kullanımı (Anti-PH3, Şekil 5A, B) ve donör hücreleri (Anti-etiketli dextran, Şekil 5D) aktif Proliferasyona olan donör hücreleri belirlemek ve ölçmek için kullanılabilir ( Şekil 5E). Bireysel hücreleri doğru şekilde tanımlamak için her iki IF (Şekil 2a, B) ve IFC (Şekil 2D) sonra yüksek kaliteli görüntüler oluşturmak için esastır. Görüntü yerleşimi gerçekleştirmek için bir görüntü analiz programı kullanılmalıdır (Şekil 5E). Kullanılan görüntü analiz programına bağlı olarak, ölçülmesi istenmesi gereken otomatik etiketli hücrelerin sayısını gerçekleştirmek mümkün olabilir.
Şekil 1: Dondurulmuş Oct blokları hazırlanması. (A) donma için hazırlanan bir kriyojenik kalıp Ekim ayında embriyo 50x mikroskobik görünümü. Kırmızı ok, kalıp alt yüzeyine karşı zebra balığı embriyo konumunun kafasını gösterir; siyah ok kuyruk kullanıcıya doğru işaret gösterir. (B) embriyo ve Ekim ile plastik kalıplar soğutulmuş metal platforma yerleştirilir. (C) dondurma odası oluşturmak için plastik kalıplar üzerine yerleştirilen köpük buz kova. (D) eki blok tamamen donmuş bir kez şeffaf beyaz döner. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Frozen Oct bloklarının Kriyobölümleme. (A), kriyostat disk üzerine taze Oct uygulama ve Oct dondurulmuş blok yerleştirme, blok donma yönünü 180 ° döndürüldü. (B) kesmeli disk için dondurulmuş bloğun yan görünümü. (C) rulo plakalı bölümleme bloğunun konumunu görüntüleyin. (D) kriyostat metal platformundan şarj edilmiş bir slayt kullanarak bölümler pick-up. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Bir slayda yerleştirildikten sonra hazırlanan bölümlerin görünümü. Ok hidrofobik bariyeri gösterir ve noktalı çizgi bariyer çevresi içindeki bölümleri içeren bölgeyi delineates. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: ıHC sırasında kromojenik substrat uygulaması hazırlığı. Slayt, plastik sarma ile kaplı düz bir yüzeye yerleştirilir ve herhangi bir zararlı madde dökülmesi içerirken kromojenik substratın üniforma uygulamasına izin verir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: AB vahşi tip zebra balığı embriyoları arasında Blastula-Blastula nakli tarafından oluşturulan krizülden 48 HPF chimerik zebra balığı embriyo tarafından oluşturulmuş temsilci ve IFC etiketlemesi. (A) Eğer tespit ederseniz ser 10 fosforile histon H3 (Anti-PH3, 1:200) 48 HPF chimerik zebra balığı embriyo ifade. Kırmızı = pH3-pozitif hücreler; mavi = çekirdekler. Sarı oklar pozitif hücrelerin örneklerini gösterir. (B) dijital görüntüdeki mavi nükleer lekenin (ımagej yazılımı) çekilmesi, PH3-Positive hücrelerin ölçülmesi ve görüntü yerleşimi için görselleştirilmesini geliştirir. (C) negatif kontrol (sadece ikincil antikor) için If tahlil cryosec, 48 HPF chimerik zebra balığı embriyo. Ölçek çubuğu 50 μm (tüm paneller için geçerlidir) temsil eder. (D) IFC etiketli dekstran algılamak için (Anti-etiketli Dekstran, 1:7500) chimerik 48 HPF zebra balığı embriyo AB Wild-tipi zebra balığı embriyolar arasında Blastula-Blastula nakli tarafından oluşturulan. Donör embriyoları, blastula-Blastula nakli için kullanmak için önce tek hücreli aşamada floresan etiketli dekstran Konjugat ile enjekte edildi. Kırmızı bir dekstran Konjugat ile etiketli hücreleri gösterir; mavi çekirdekleri gösterir. Sarı oklar pozitif hücrelerin örneklerini gösterir. (E) panel B (PH3 için IF) ve C paneli (IFC etiketli dekstran için) PH3 ifade ve dekstru tek hücrelerde etiketleme kolokalizasyonu gösteren. Sarı oklar çift pozitif hücrelerin örneklerini gösterir. (F) cryosec, 48 HPF chimerik zebra balığı embriyo içinde IHC tahlil için negatif kontrol (sadece ikincil antikor). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Discussion
Cryosec, zebra balığı embriyolarındaki kolokalizasyon deneylerinde önemli bir adımı temsil eden kombine immünofloresan ve immünhistokimya için yeni bir yöntem sunduk. Küçük embriyolar ile kullanılmak üzere optimize edilmiş mevcut colocalization protokollerinin önemli bir eksikliği vardır ve her ikisi de yaygın olarak moleküler çalışmalar14' te kullanılan,17,18, kriyitli malzeme. Mevcut colocalization protokolleri temelde iki fluorophores eşzamanlı görselleştirme odaklanmak17,18. Bu protokoller iyi çalışabilir olsa da, onların kullanışlılığı (i) zebra balığı kullanılabilir ve (ii) If ile uyumludur antikorların kullanılabilirliği ile sınırlıdır.
Biz zebra balığı embriyo için kriyobölümleme kullanımı korunmuş doku morfoloji açısından önemli bir avantaj sağlar hissediyorum. IHC 'nin parafin bölümlerinde daha yaygın olarak gerçekleştirildiği gibi,7,8' de, protein ifadesinin tespiti için kriyobölüm tabanlı ihc yöntemlerinin daha fazla incelenmesi garanti edilir. Tüm Mount kullanımı zebra balığı embriyoları ifade seviyeleri görselleştirilmesi için ortak bir yöntemdir ve daha yaygın cryosections1,2,3,4kullanarak daha literatürde açıklanmıştır 19 yaşında. Ancak, tüm bağlantı protokolleri, derin dokularda ifade edilen proteinlerin doğru lokalizasyonu eksikliği ve yüzey seviyesi ifadesinin daha derin dokuların belirsiz protein ifadesine yönelik potansiyelinin olmaması da dahil olmak üzere sınırlamalara sahiptir. Biz sürekli ağoprezervasyon, sekleme ve sıralı IF ve ıHC aşağıdaki hücresel morfoloji mükemmel bakım gözlemledik. Tek hücreli düzeyde protein ifadesinin kesin lokalizasyonu gerektiren uygulamalar için, bu protokolde açıklandığı gibi bölüm tabanlı prosedürler için önemli bir avantaj vardır. Reçine katıştırma, erken evre zebra balığı embriyoları20' den bölümler üzerinde If veya IFC gösterimleri yapmak için alternatif bir seçenek sağlar. Reçine bölümleri, kriyobölümlere kıyasla doku morfolojisinin üstün korunmasını sağlar ve nispeten daha ince doku bölümleri hazırlanabilir. Ancak, üreticilerin genellikle immüno tabanlı assays için reçine bölümlerinin kullanımını tavsiye etmiyoruz, reçineler bazı bileşenleri bölümlerden kaldırılamaz ve antikor bağlama siteleri maskeleyebilir21.
Tüm protokol ifade desenleri doğru ve başarılı analizi için gerekli olmakla beraber, birkaç özel adımlar deneysel başarı için önemlidir. İlk kritik adım, embriyoların13Ekim14' te gömme sırasında işlenmesi. Her embriyonun aynı enine düzlemde yönlendirmek zor olabilir, böylece bölümler tüm embriyolar için yaklaşık olarak aynı alandan kesilir. Biz küçük gauge iğneleri kullanarak küçük, kasıtlı hareketler embriyo yönü için viskoz Oct orta aracılığıyla gerçekleştirmek için çok büyük ve çok fazla Oct orta yerinden forseps, kullanarak üstün olduğunu bulduk. Önemli bir eğitim ve deneyim olmadan istenilen dokusu (ler) içeren yüksek kaliteli bölümler elde etmek zor olabilir gibi, dondurulmuş blokların bölümleme sırasında ikinci bir kritik adım oluşur. Böylece teknik hakim olana kadar test örneklerinin kullanılmasını öneriyoruz. Üçüncü bir kritik adım, doku örneklerini rahatsız etme veya bölme potansiyeline sahip olan lamel magazini kaldırılmasıdır. Biz yumuşak ajitasyon bir kombinasyonu lamel magazini gevşetmek ve PBS konteyner slayt yavaş çıkarılması için en etkili yaklaşım Cover, kaldırmak için bulduk. Nazik ve istikrarlı bir el en iyisidir; Araştırmacılar bazı deneme ve hata nasıl etkili Cover, kaldırmak için öğrenmek için gerekli olduğunu bulabilirsiniz.
Protokoldeki ek önemli adımlar arasında antikor optimizasyonu (IF ve ıFC için primer ve ikincil antikorlar) ve slaytların kromojenik substrat ve karşı lekeye maruz kalması yer aldı. Primer antikor özgüllüğü ve hedef konsantrasyonu ile ilgili kapsamlı araştırmalar esastır; Genellikle, IF/ıFC kombinasyonu başlamadan önce primer antikor konsantrasyonlarını optimize etmek için gerçekleştirilecek IF ve ıFC için en az iki ayrı deney için yeterli olmayan değerli örnekleri toplamak en iyisidir. Her bir deney için bilinen bir pozitif ve negatif kontrol dahil olmak üzere her denemede hem If hem de ıHC 'nin uygun şekilde performans gösterdiğinden emin olmak gereklidir. İkincil antikor konsantrasyonu ayarlamaları da gerekli olabilir. Üretici kuralları genellikle olası pozlama süreleri geniş bir yelpazede tarif beri ıHC tahlil için kromojenik substrat ve karşı leke doku bölümleri maruz kalma optimizasyonu gereklidir. Tüm kromojeni karşı lekeleri ve endojen doku pigmentasyon ile uyumlu olabilir, renk dokgen seçimi ile ilgili dikkatli planlama gerektirir.
Açıklanan protokole uygulanabilir sayısız potansiyel değişiklikler vardır ve biz başarılı bir şekilde her ikisi de If için kullanılamaz antikorlar diğer kombinasyonları ile bu protokol gerçekleştirdi. Yukarıda belirtildiği gibi, kromojenik maddeler spesifik karşı lekelerle farklı uyumluluğa sahiptir. Bu bileşenlerin protokolde kolayca değiştirilebilir olduğunu bulduk. Ayrıca, antikor inkübasyon parametreleri oldukça esnektir ve istenilen boyama yoğunluğuna bağlı olarak artırılabilir veya azalabilir. Katıştırma işlemi de değiştirilebilir. Biz enine bölümlere odaklanırken, embriyo kolayca ilgi belirli dokulara adres için herhangi bir yönde odaklı olabilir. Son olarak, bu protokolde birden fazla olası duraklatma noktası vardır. Susuz embriyo, birkaç ay boyunca% 100 MeOH-20 °C ' de depolanabilir; Dondurulmuş bloklar-80 °C ' ye kadar üç aya kadar saklanabilir; ve hazırlanan slaytlar-80 °C ' de 9 aya kadar bir slayt kutusunda saklanabilir.
Bu kombine If/ıFC protokolünün göreli karmaşıklığı nedeniyle, doku kalitesinden araştırmacı deneyimine kadar numune elleçlemesi için sorun giderme gerektirebilecek birden fazla olası varyasyon veya hata kaynağı vardır. Yukarıda açıklanan kritik adımların çoğu, bireysel kullanıcı düzeyinde optimizasyon gerektirdiğinden veya belirli bir yetenek, beceri ve deneyime ihtiyaç duydukları için kritik olarak kabul edilir. Ancak, nonspesifik arka plan boyama ve düşük sinyal yoğunluğu optimizasyon gerektiren en önemli konular olduğunu bulduk. Herhangi bir If veya IFC protokolünde olduğu gibi, bu sorunları ele almak zaman alıcı ve emek yoğun olabilir ve iki teknik birleştirilir bu yana bu yöntemle bileşik. Bu nedenle, birleştirilmiş protokole devam etmeden önce IF ve ıHC 'i ayrı olarak optimize etmenizi öneririz.
Bu yöntemin geniş bir deney yelpazesi için yararlı olacağını tahmin ederken, potansiyel sınırlamalar vardır. Bu prosedürün başarılı performansı, çok sayıda yıkama adımını içeren iki sıralı deney yoluyla bozulmamış doku örneklerinin sürdürülmesinde bağlıdır. Bu nedenle, bölümleme veya doku işleme sırasında ortaya çıkan herhangi bir sorun, kalitedeki bozulabilecek eski slaytların kullanımı da dahil olmak üzere, araştırmacıların bu protokolü başarıyla gerçekleştirme yeteneğini önemli ölçüde kısıtlayacaktır. Slaytlar potansiyel olarak dokuz aya kadar-80 °C ' ye kadar saklanabilse de, slaytlara doku uyumu zamanla düşer ve bir ay içinde kullanılan Kaydıraklar ile en iyi başarıyı aldık ya da ideal olarak, ertesi gün. İkinci bir sınırlama, zebra balığı embriyoları küçük bir ayak izi. Bu denemeyi, erken evre embriyolar içinde nispeten hafif bir şekilde ifade edilen proteinlerin görselleştirilmesi konusunda yararlı hale getirirken, tutarsız veya düşük seviyelerde ifade edilen proteinler bir bölümde yakalamak çok zor olabilir. Son olarak, protokol 10 \ u201212 μm kriyobölümler kullandığından, daha küçük alt hücresel bileşenler yerine, çekirdekler gibi büyük yapılarda protein ifadesinin değerlendirilmesi için en uygundur.
Özetle, kombine If/IFC protokolüdür erken evre zebra balığı embriyoları içinde çok çeşitli çalışmalar için avantajlı olacak ve bu tür örneklerinde hassas protein ifadesi analizinde önemli bir yenilik temsil eder. Şekil 5' te başarılı bir şekilde gösterilen yöntemimiz, araştırmacılar Şu anda mevcut primer antikorların biraz sınırlı aralığı ile çalışırken kriyolojide erken evre zebra balığı embriyo narin morfolojisi korumak için izin verecektir Bu türün If veya ıFC 'de kullanılmak üzere doğrulanır. Bu protokol muhtemelen antikor mevcudiyeti için benzer sınırlamalar tarafından engel olan diğer balık ve Anzenal türler (örneğin, Medaka ve Xenopus spp.), çalışmalar için yararlı olacaktır ve geleneksel memelilerinin modelleri için geçerli olabilir iyi.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NıH Grant 5K01OD021419-02 ve NC Devlet Üniversitesi veterinerlik Koleji tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from: http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf (2013).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. Guille, M. , 127th ed, Humana Press. New York. 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , Bios Scientific Publishers. New York. (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition. , University of Oregon Press. Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Spector and Goldman, editors (2006).
- Torres, E. The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B.
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
- JB-4 Embedding Kit. [Internet]. Polysciences, Inc. , Available from: http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/ (2018).
