Denne protokol demonstrerer sekventiel immunofluorescens og Immunhistokemi på kryosektioner fra tidlige stadier af zebrafiskembryoner, hvilket muliggør præcise samlokaliserings analyser i specifikke cellepopulationer.
Undersøgelse af intercellulære interaktioner kræver ofte diskret mærkning af specifikke cellepopulationer og præcis protein lokalisering. Zebra embryo er et glimrende værktøj til at undersøge sådanne interaktioner med en in vivo model. Hele Mount immunohistokemiske og immunofluorescens assays anvendes hyppigt i Zebra embryoner til at vurdere protein ekspression. Det kan dog være svært at opnå nøjagtig kortlægning af co-lokaliserede proteiner i tre-dimensionelle rum. Desuden kan nogle undersøgelser kræve brug af to antistoffer, der ikke er kompatible med den samme teknik (f. eks. er antistof 1 kun egnet til immun histokemi, og antistof 2 er kun egnet til immunofluorescens). Formålet med den metode, der er beskrevet heri, er at udføre sekventiel immunofluorescens og/eller immun histokemi på individuelle kryosektioner afledt af tidlige stadier af Zebra embryoner. Her beskriver vi brugen af sekventielle runder af immunofluorescens, Imaging, immun histokemi, billeddannelse for en enkelt kryosektion for at opnå præcis identifikation af protein ekspression på enkelt celleniveau. Denne metode er velegnet til enhver undersøgelse i tidlige trin Zebra embryoner, der kræver nøjagtig identifikation af flere protein mål i individuelle celler.
Zebra er en yderst robust model organisme, der i øjeblikket anvendes på tværs af en bred vifte af discipliner i biomedicinsk forskning. Især den hurtige eksterne udvikling og gennemskinnelighed af Zebra-embryoner er et glimrende værktøj til in vivo-undersøgelser. Heri beskrives en metode til sekventiel immunofluorescens (IF) og immunohistokemiske (IHC) analyser af kryosecerede Zebra-embryoner. Denne nye procedure bruger sekventiel anvendelse af to antistoffer på et enkelt dias, hvilket muliggør nøjagtig identifikation af colokaliserede proteiner på cellulært niveau, mens du bevarer vævs sektioner. Denne protokol er især nyttig i forbindelse med undersøgelser med Zebra-modellen, da et relativt lille antal antistoffer er blevet valideret til brug i IF-og/eller IHC-applikationer i Zebra sammenlignet med musemodeller.
Observation af intercellulære interaktioner er et væsentligt element i mange undersøgelser, og kan give vigtig indsigt i molekylære mekanismer, der fungerer på cellulært niveau, som ligger til grund for fænotyper på organismal niveau. Desuden kan protein ekspression give oplysninger om cellulær funktion, især når man undersøger ekspression af flere proteiner samtidigt i cellen (samlokalisering). Selv om hele Mount IHC og hvis er almindeligt anvendte teknikker til at analysere protein ekspression i Zebra embryoner1,2,3,4,5, hele Mount procedurer kan være problematisk for at opnå præcise samlokaliserings data. I vores erfaring kan det være svært at skelne mellem lag af væv og visualisere protein ekspression på enkelt celleniveau i hele Mount prøver. Imaging softwareprogrammer kan generelt ikke være i stand til at skelne mellem overfladefarvning versus dybere farvning. Protein udtryk uden for overflade niveau kan skjules af mere klart udtrykte overflade niveau udtryk, hvilket fører til unøjagtigheder i kvantificering. Desuden er de fleste traditionelle Zebra clearing metoder ganske giftige6 og dermed mindre ønskelig til brug.
Antistof-baserede teknikker, såsom IF og IHC, bruges ofte til at detektere protein ekspression i sektioneret materiale, hvilket forenkler identifikationen af diskrete cellepopulationer, der udtrykker et bestemt protein i komplekse væv. IHC anvendes almindeligvis til samlokalisering, oftest ved hjælp af to forskellige antistoffer, der er konjugeret i forskellige værtsarter og visualiseret med forskellige farvede kromogener4,7,8,9 , 10. men ved hjælp af flere kromogener kan føre til uspecifik baggrunds farvning eller uforenelighed af farver11,12.
Vi har udviklet en ny protokol til påvisning af flere proteiner ved sekventiel hvis og IHC på kryosecerede tidlige stadier af Zebra embryoner. Cryosectioning er særligt velegnet til sarte væv såsom Zebra embryoner, og kryosektioner er overlegne i paraffin-indlejrede sektioner for fluorescens-baserede assays13,14. Vi valgte at optimere kombineret hvis og IHC snarere end Dual-Color hvis eller IHC, at omgå problemet med antistof uforenelighed for en enkelt analysetype. Disse problemer er særligt relevante for forskning, der involverer Zebra på grund af det begrænsede antal kommercielt tilgængelige antistoffer, som er valideret til brug i Zebra. Faktisk viste en undersøgelse af fire store virksomheder, at kommercielt tilgængelige antistoffer til brug i mus var omkring 112.000 versus omkring 5.300 til brug i Zebra15. Endelig valgte vi at udvikle en protokol, der kunne udføres på en enkelt kryosektion, hvilket er vigtigt, når der arbejdes med små eller begrænsede vævsprøver, som stammer fra Zebra-embryoner.
Denne protokol blev designet til at vurdere den proliferativ opførsel af donorceller i 48 h efter befrugtning chimerisk Zebra embryoner, der blev genereret af blastula-til-blastula transplantation som beskrevet af carmany-rampey og MOENS16. Donor embryoner blev injiceret i en celle fase med en fluorescently mærket dextran konjugat før transplantation af donorceller til recipient embryoner. Vi brugte immunofluorescens til ser 10 fosforyleret histone H3 (pH3) til at detektere prolifererende celler efterfulgt af Immunhistokemi for den mærkede dextran til påvisning af donorceller i chimeriske Zebra embryoner. Sekventiel detektion af pH3 og den mærkede dextran inden for en enkelt cryosection gjorde os i stand til at identificere og kvantificere individuelle celler, der udtrykte begge markører.
Denne sekventielle IF/IHC-protokol for cryoseceret Zebra vil give et nyttigt værktøj for Zebra forskere, der ønsker en colokaliserings protokol for protein ekspression. De problemer, som denne protokol er designet til at løse, såsom småvævs prøver og begrænset antistof tilgængelighed, er ikke unikke for Zebra-modellen. Denne metode kan derfor være til nytte for enhver forsker, der ønsker at udføre sekventiel IF/IHC.
ETIK ERKLÆRING:
Alle dyreforsøg blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Vi har præsenteret en ny metode til kombineret immunofluorescens og immun histokemi, som er et vigtigt skridt fremad i gennemførelse af samlokaliserings eksperimenter på kryosecerede Zebra-embryoner. Der er en kritisk mangel på eksisterende samlokaliserings protokoller, der er optimeret til brug med små embryoner og kryoseceret materiale17,18, som begge ellers er almindeligt anvendt i molekylære undersøgelser14. Eksisterende samlokaliserings protokoller fokuserer primært på simultan visualisering af to fluorophorer17,18. Mens disse protokoller kan fungere godt, er deres anvendelighed begrænset af tilgængeligheden af antistoffer, at (i) kan anvendes i Zebra og (II) er forenelige med IF.
Vi mener, at brugen af kryosectioning til Zebra embryoner giver en betydelig fordel i form af konserveret vævs morfologi. Da IHC er mere almindeligt forekommende på paraffin sektioner end kryosektioner7,8, er yderligere udforskning af cryosection-baserede IHC-metoder til påvisning af protein ekspression berettiget. Brugen af hele Mount hvis er en almindelig metode til visualisering af udtryks niveauer i Zebra-embryoner og er mere almindeligt beskrevet i litteraturen, end hvis der anvendes kryosektioner1,2,3,4, 19. Men hele Mount protokoller har begrænsninger, herunder manglen på nøjagtig lokalisering af proteiner udtrykt i dybe væv og potentialet for overflade niveau udtryk til at sløre protein ekspression i dybere væv. Vi har konsekvent observeret fremragende vedligeholdelse af cellulære morfologi efter Kryopreservation, skæring, og sekventiel hvis og IHC. For applikationer, der kræver præcis lokalisering af protein ekspression på enkelt celleniveau, er der en betydelig fordel ved sektions baserede procedurer, som vi har beskrevet i denne protokol. Harpiks indlejring giver en alternativ mulighed for at udføre, hvis eller IHC assays på sektioner fra tidlige Stage Zebra embryoner20. Harpiks sektioner giver overlegen bevarelse af vævs morfologi sammenlignet med kryosektioner, og relativt tyndere vævs sektioner kan forberedes. Fabrikanterne anbefaler dog generelt ikke anvendelse af harpiks sektioner til immuno-baserede assays, da nogle af komponenterne i harpiksen ikke kan fjernes fra sektionerne og kan maskere antistof bindingssteder21.
Mens hele protokollen er afgørende for en nøjagtig og vellykket analyse af udtryks mønstre, er et par specifikke skridt afgørende for eksperimentel succes. Det første kritiske skridt er håndteringen af embryoner under indlejring i okt13,14. Det kan være udfordrende at orientere hvert embryo i samme tværplan, således at sektioner skæres fra omtrent samme område for alle embryoner. Vi har konstateret, at brugen af små måler nåle til at udføre små, bevidste bevægelser gennem det viskøse OLT-medium til embryo orientering er bedre end at bruge pincet, som er for store og fortrænger for meget OLT-medium. Et andet kritisk trin opstår under skæring af frosne blokke, da det kan være svært at opnå høj kvalitet sektioner, der indeholder den ønskede væv (r) uden væsentlig uddannelse og erfaring. Vi anbefaler derfor brug af testprøver, indtil teknikken er behersket. Et tredje kritisk skridt er Cover slip fjernelse, som har potentiale til at forstyrre eller fratage vævsprøver. Vi har fundet ud af, at en kombination af blid agitation for at løsne dæksedlen og den langsomme fjernelse af sliden fra PBS-beholderen er den mest effektive metode til at fjerne dæksedler. En blid og rolig hånd er bedst; forskere kan finde, at nogle forsøg og fejl er nødvendig for at lære at fjerne coverglider effektivt.
Yderligere vigtige skridt i protokollen omfatter antistof optimering (primære og sekundære antistoffer for både hvis og IHC assays) og eksponering af dias til kromogen substrat og kontra plet. Grundig forskning vedrørende primært antistof specificitet og målkoncentration er afgørende; generelt er det bedst at indsamle tilstrækkelige ikke-værdifulde prøver til mindst to separate eksperimenter for IF og IHC, der vil blive udført for at optimere primære antistofkoncentrationer, før de påbegynder IF/IHC-kombinationen. Herunder en kendt positiv og negativ kontrol for hvert primært antistof er afgørende i hvert eksperiment for at sikre, at både hvis og IHC assays klarer sig korrekt. Det kan også være nødvendigt at justere sekundær antistofkoncentration. Det er nødvendigt at optimere eksponeringen af vævs sektioner til det kromogene substrat og kontra pletten til IHC-analysen, da producentens retningslinjer ofte beskriver en lang række mulige eksponeringstider. Ikke alle kromogener kan være kompatible med kontra pletter og endogene vævs pigmentering, hvilket kræver omhyggelig planlægning med hensyn til kromogen udvælgelse.
Der er talrige potentielle modifikationer, der kan anvendes på den beskrevne protokol, og vi har med succes udført denne protokol med andre kombinationer af antistoffer, der ikke begge kunne bruges til hvis. Som nævnt ovenfor har kromogene stoffer en tydelig forenelighed med specifikke kontra pletter. Vi har konstateret, at disse komponenter er let modificerbare i protokollen. Derudover er parametrene for antistof inkubation ret fleksible og kan øges eller mindskes afhængigt af den ønskede farvnings intensitet. Integreringsprocessen kan også ændres. Mens vi har fokuseret på tværgående sektioner, kan embryoner nemt være orienteret i enhver retning for at løse bestemte væv af interesse. Endelig er der flere mulige pausepunkter i denne protokol. Dehydrerede embryoner kan opbevares i 100% MeOH ved-20 °C i et par måneder; frosne blokke kan opbevares ved-80 °C i op til tre måneder; og forberedte slides kan opbevares ved-80 °C i op til ni måneder i en slide boks.
På grund af den relative kompleksitet af denne kombinerede IF/IHC protokol, der er flere mulige kilder til variation eller fejl, der kan kræve fejlfinding, lige fra vævs kvalitet til forsker erfaring til at prøvehåndtering. De fleste af de kritiske trin, der er beskrevet ovenfor, betragtes som kritiske, fordi de enten kræver optimering på det individuelle brugerniveau, eller de kræver særlig fingerfærdighed, dygtighed og erfaring. Men vi har konstateret, at uspecifik baggrunds farvning og lav signalintensitet er de mest betydningsfulde problemer, der kræver optimering. Som med enhver hvis eller IHC protokol, behandle disse spørgsmål kan være tidskrævende og arbejdskrævende, og kan forværres med denne metode, da de to teknikker kombineres. Af denne grund anbefaler vi stærkt optimering af hvis og IHC separat, før du fortsætter med den kombinerede protokol.
Selv om vi forudser, at denne metode vil være nyttig for en bred vifte af eksperimenter, der er potentielle begrænsninger. Vellykket udførelse af denne procedure er afhængig af at opretholde intakt vævsprøver gennem to sekventielle eksperimenter, der omfatter talrige vask trin. Af denne grund vil eventuelle problemer, der opstår under skæring eller vævs håndtering, herunder brug af ældre dias, der kan have forringet kvalitet, betydeligt begrænse forskernes evne til at udføre denne protokol med succes. Selvom slides potentielt kan opbevares ved-80 °C i op til ni måneder, falder vævs tilslutningen til dias over tid, og vi havde den bedste succes med slides, der bruges inden for en måned efter forberedelse eller ideelt, den næste dag. En anden begrænsning er den lille fodaftryk af Zebra embryoner. Mens vi har fundet dette eksperiment til at være nyttigt i visualisering af proteiner, der er relativt rigeligt udtrykt i tidlige stadier embryoner, proteiner, der udtrykkes inkonsekvent eller ved lave niveauer kan være meget vanskeligt at fange i en sektion. Endelig, da protokollen bruger 10 \ u201212 μm kryosektioner, er det bedst egnet til evaluering af protein ekspression i større strukturer, såsom kerner, snarere end mindre sub-cellulære komponenter.
Sammenfattende vil vores kombinerede IF/IHC-protokol være fordelagtig for en lang række undersøgelser i tidlige stadier af Zebra-embryoner og udgør en vigtig nyskabelse i præcis analyse af protein ekspression i sådanne prøver. Vores metode, der vises med succes i figur 5, vil give forskerne mulighed for at bevare den delikate morfologi af tidlige stadier af Zebra embryoner i kryosektioner, mens de arbejder med det noget begrænsede udvalg af aktuelt tilgængelige primære antistoffer, der er godkendt til brug i IF eller IHC i denne art. Denne protokol vil sandsynligvis være nyttig i forbindelse med undersøgelser af andre fisk og amfibie arter (f. eks. Medaka og xenopus spp.), som hæmmes af lignende begrænsninger af antistof tilgængeligheden, og kan være gældende for traditionelle pattedyr modeller som Godt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH Grant 5K01OD021419-02 og NC State University College of Veterinary Medicine.
15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2000 dilution in block buffer for IF |
Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
Background Buster | Innovex | NB306 | |
block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS |
cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
Ethanol | Koptec | V1001 | |
fish gelatin | Sigma | G7041 | |
Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
Methanol | Fisher | A452-4 | |
Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2M KCl |
Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
Permount | Fisher | SP15 | |
1X phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
10X phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
1X PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
sucrose | Amresco | 335 | |
Tween-20 | Fisher | BP337 | |
TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1000 in 1x PBS for IF |
1X Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
1X TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL |