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Biology

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Published: May 14, 2019 doi: 10.3791/59344
Automatic Translation
,
1Department of Population Health and Pathobiology, NC State University College of Veterinary Medicine

Summary

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Abstract

Die Untersuchung interzellulärer Wechselwirkungen erfordert oft eine diskrete Kennzeichnung bestimmter Zellpopulationen und eine präzise Proteinlokalisierung. Der Zebrafisch-Embryo ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, um solche Wechselwirkungen mit einem In-vivo-Modell zu untersuchen. Ganzkörper-Immunhistochemikalien und Immunfluoreszenz-Assays werden häufig in Zebrafischembryonen angewendet, um die Proteinexpression zu bewerten. Es kann jedoch schwierig sein, eine genaue Kartierung von kolokalisierten Proteinen im dreidimensionalen Raum zu erreichen. Darüber hinaus können einige Studien die Verwendung von zwei Antikörpern erfordern, die nicht mit der gleichen Technik kompatibel sind (z. B. ist Antikörper 1 nur für die Immunhistochemie geeignet und Antikörper 2 ist nur für Immunfluoreszenz geeignet). Der Zweck der hier beschriebenen Methode ist die sequenzielle Immunfluoreszenz und/oder Immunhistochemie an einzelnen Kryosektionen, die von Zebrafischembryonen im Frühstadium abgeleitet wurden. Hier beschreiben wir die Verwendung von sequenziellen Runden der Immunfluoreszenz, Bildgebung, Immunhistochemie, Bildgebung für eine einzelne Kryosektion, um eine präzise Identifizierung der Proteinexpression auf einzelzeller Ebene zu erreichen. Diese Methode eignet sich für jede Studie an Zebrafischembryonen im Frühstadium, die eine genaue Identifizierung mehrerer Proteinziele in einzelnen Zellen erfordert.

Introduction

Der Zebrafisch ist ein extrem robuster Modellorganismus, der derzeit in den verschiedensten Disziplinen der biomedizinischen Forschung eingesetzt wird. Insbesondere die schnelle externe Entwicklung und Transluzenz von Zebrafischembryonen ist ein hervorragendes Werkzeug für In-vivo-Studien. Hierin beschreiben wir eine Methode zur sequenziellen Immunfluoreszenz (IF) und immunhistochemischen (IHC) Analysen von kryosektionierten Zebrafischembryonen. Dieses neuartige Verfahren verwendet die sequenzielle Anwendung von zwei Antikörpern auf einem einzigen Dia, was eine genaue Identifizierung von kolokalisierten Proteinen auf zellulärer Ebene ermöglicht und gleichzeitig Gewebeabschnitte konserviert. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für Studien mit dem Zebrafischmodell, da eine relativ kleine Anzahl von Antikörpern für den Einsatz in IF- und/oder IHC-Anwendungen bei Zebrafischen im Vergleich zu Mausmodellen validiert wurde.

Die Beobachtung interzellulärer Wechselwirkungen ist ein wesentliches Element in vielen Studien und kann wichtige Einblicke in molekulare Mechanismen liefern, die auf zellulärer Ebene funktionieren und Phänotypen auf Der Organismusebene zugrunde liegen. Darüber hinaus kann die Proteinexpression Informationen über die zelluläre Funktion liefern, insbesondere bei der Untersuchung der Expression mehrerer Proteine gleichzeitig innerhalb der Zelle (Kolokalisierung). Obwohl Vollmontage-IHC und IF häufig verfahren zur Analyse der Proteinexpression in Zebrafischembryonen1,2,3,4,5, ganze Mount-Verfahren für die Erzielung präziser Kolokalisierungsdaten problematisch. Unserer Erfahrung nach kann es schwierig sein, zwischen Gewebeschichten zu unterscheiden und die Proteinexpression auf einzelzeller Ebene in ganzmontierten Proben zu visualisieren. Imaging-Softwareprogramme können in der Regel nicht zwischen Oberflächenfärbung und tieferer Färbung unterscheiden. Proteinausdrücke auf Nicht-Oberflächenebene können durch heller ausgedrückte Oberflächenebenenausdrücke verdeckt werden, was zu Ungenauigkeiten bei der Quantifizierung führt. Darüber hinaus sind die meisten traditionellen Zebrafisch-Clearing-Methoden ziemlich giftig6 und daher weniger wünschenswert für den Einsatz.

Antikörperbasierte Techniken wie IF und IHC werden häufig verwendet, um die Proteinexpression in geschnittenem Material zu erkennen, was die Identifizierung diskreter Zellpopulationen vereinfacht, die ein bestimmtes Protein in komplexen Geweben ausdrücken. IHC wird häufig für die Kolokalisierung verwendet, am häufigsten durch die Verwendung von zwei verschiedenen Antikörpern konjugiert in verschiedenen Wirtsarten und visualisiert mit verschiedenen farbigen Chromogenen4,7,8,9 , 10. Die Verwendung mehrerer Chromogene kann jedoch zu unspezifischen Hintergrundfärbungen oder Inkompatibilitäten der Farben11,12führen.

Wir entwickelten ein neuartiges Protokoll zum Nachweis mehrerer Proteine durch sequenzielle IF und IHC an kryosectionierten Zebrafischembryonen im Frühstadium. Kryosektionen eignen sich besonders gut für empfindliche Gewebe wie Zebrafischembryonen, und Kryosektionen sind Paraffin-eingebetteten Abschnitten für Fluoreszenz-basierte Assays13,14überlegen. Wir haben uns dafür entschieden, kombinierte IF und IHC anstelle von zweifarbigen IF oder IHC zu optimieren, um das Problem der Antikörperinkompatibilität für einen einzelnen Assay-Typ zu umgehen. Diese Probleme sind besonders relevant für die Forschung mit Zebrafischen aufgrund der begrenzten Anzahl kommerziell erhältlicher Antikörper, die für den Einsatz in Zebrafischen validiert sind. Tatsächlich zeigte eine Studie von vier großen Unternehmen, dass kommerziell erhältliche Antikörper für den Einsatz in der Maus etwa 112.000 gegenüber etwa 5.300 für den Einsatz in Zebrafischen15betrugen. Schließlich haben wir uns für die Entwicklung eines Protokolls entschieden, das auf einer einzigen Kryosektion durchgeführt werden könnte, was bei der Arbeit mit kleinen oder begrenzten Gewebeproben, wie sie von Zebrafischembryonen gewonnen werden, unerlässlich ist.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das proliferative Verhalten von Spenderzellen in 48 h chimieren Zebrafischembryonen nach der Befruchtung zu bewerten, die durch Blastula-zu-Blastula-Transplantation erzeugt wurden, wie von Carmany-Rampey und Moens16beschrieben. Spenderembryonen wurden im Einzellstadium mit einem fluoreszierend gekennzeichneten Dextran-Konjugat injiziert, bevor Spenderzellen in Empfängerembryonen transplantiert wurden. Wir verwendeten Immunfluoreszenz für Ser 10 phosphorylierten Histon H3 (pH3), um vermehrende Zellen zu detektieren, gefolgt von Immunhistochemie für den markierten Dextran, um Spenderzellen in chimären Zebrafischembryonen zu erkennen. Die sequenzielle Detektion von pH3 und dem beschrifteten Dextran innerhalb eines einzigen Kryoabschnitts ermöglichte es uns, einzelne Zellen zu identifizieren und zu quantifizieren, die beide Marker exprimierten.

Dieses sequenzielle IF/IHC-Protokoll für kryosectioned Zebrafish wird ein nützliches Werkzeug für Zebrafischforscher sein, die ein Kolokalisierungsprotokoll für die Proteinexpression wünschen. Die Probleme, die dieses Protokoll angehen sollte, wie kleine Gewebeproben und begrenzte Antikörperverfügbarkeit, sind nicht nur für das Zebrafischmodell bestimmt. Diese Methode kann daher für jeden Forscher von Nutzen sein, der sequenzielleIFielleIFe IF/IHC durchführen möchte.

ETHICS STATEMENT:

Alle Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA genehmigt.

Protocol

1. Embryonenzubereitung

  1. Fix 48 h Post-Fertilisation (hpf) chimäre Zebrafisch-Embryonen durch Blastula-zu-Blastula-Transplantation zwischen AB Wild-Typ-Zebrafisch-Embryonen in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht mit Schaukeln bei 4 °C. Führen Sie zwei 5 min Waschungen mit Schaukeln bei Raumtemperatur mit 500 l 1x phosphatgepufferter Salzsäure durch, die 0,1% eines nichtionischen Tensids enthält (1x PBSt; siehe Tabelle der Materialien)
    HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig und krebserregend und muss gemäß den institutionellen Vorschriften ordnungsgemäß entsorgt werden. Die Arbeit mit Paraformaldehyd sollte in einer chemischen Kapuze durchgeführt werden, und es sollte immer eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Labormantel und Schutzbrille) verwendet werden.
  2. Dehydrieren Sie Embryonen, indem Sie sie sequenziell mit 500 l 30 %, 50 % und 70 % Methanol (MeOH) bei Raumtemperatur mit Schaukeln mit 1x PBSt verdünnt. Inkubieren Sie Embryonen in 500 l von 100% MeOH bei -20 °C für mindestens 14 h.
    HINWEIS: Methanol ist giftig und muss gemäß den institutionellen Vorschriften ordnungsgemäß entsorgt werden. Die Arbeit mit Methanol sollte in einer chemischen Kapuze durchgeführt werden, und es sollte immer eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Labormantel und Schutzbrille) verwendet werden.
  3. Rehydrieren Sie Embryonen durch sequenzielles Waschen mit 500 l 70%, 50% und 30% MeOH verdünnt mit 1x PBSt für jeweils 10 min bei Raumtemperatur mit Schaukeln. Führen Sie zwei 5 min Wässerungen mit 500 l von 1x PBSt bei Raumtemperatur mit Schaukeln durch.
  4. Entfernen Sie den 1x PBSt und inkubieren Sie in 500 l von 30% Saccharose, das mit entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur mit Schaukeln verdünnt wird, bis die Embryonen auf den Boden des Rohres sinken (ca. 1 h). Ersetzen Sie Saccharose durch 500 l von 15% Fischgelatine/25% Saccharose (15/25; siehe Materialtabelle) und bei Raumtemperatur mit Schaukeln über Nacht bebrüten.
  5. Ersetzen Sie etwa die Hälfte des Volumens von 15/25 durch ein optimales Schnitttemperaturmedium (OCT-Medium) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit Schaukeln, bis die Embryonen auf den Boden des Rohres sinken (ca. 1 h).
  6. Ersetzen Sie etwa die Hälfte des Volumens mit OCT-Medium und inkubieren Bei Raumtemperatur mit Schaukeln für 1 h. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  7. Während der Inkubationsschritte mit 15/25 und OCT-Medium, invertieren oder flicken Sie das Rohr nach Bedarf, um diese Reagenzien zu kombinieren.

2. Embryo-Einbettung und Zubereitung von Kryosektionen

  1. Übertragen Sie Embryonen mit Zangen auf eine Kunststoffform (siehe Materialtabelle),wodurch jede Übertragung des 15/25-OCT-Gemischs minimiert wird. Füllen Sie die Form etwa halb voll mit OCT Medium und mischen Sie die Embryonen vorsichtig in OCT Medium.
  2. Bereiten Sie markierte Kunststoffformen vor und übertragen Sie gewünschte Embryonen (in der Regel 1-u20123 Embryonen) in die leeren, markierten Kunststoffformen, wodurch die Übertragung von OCT-Medium minimiert wird. Sobald die gewünschten Embryonen in der Kunststoffform sind, vorsichtig mit OCT-Medium bis zur Oberseite der Form füllen.
  3. Verwenden Sie Zangen oder 25 G Nadeln, um Embryonen auf die gewünschte Ausrichtung anzuordnen, mit einem Licht-Stereomikroskop zur Visualisierung (Abbildung 1A,B).
  4. Einfrieren der vorbereiteten Formen auf Trockeneis in einem isolierten Behälter mit einer Metallplattform. Legen Sie einen Eiskübel oder Schaumkühler sanft über die Metallplattform, um eine kalte Kammer zu schaffen (Abbildung 1C, D)
  5. Bereiten Sie 10-u201212 m dicke Kryosektionen mit einem Kryostat vor, das auf -20 °C eingestellt ist.
    1. Richten Sie jeweils einen Block ein und verwenden Sie OCT-Medium, um den Block auf die Scheibe/das Futter einzufrieren, wobei die Unterseite des Blocks auf das Blatt zugeht (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass der Block vollständig auf der Disc eingefroren ist (das OCT-Medium wird weiß), bevor Sie mit dem Schnitt beginnen (Abbildung 2B).
    2. Legen Sie Kryosektionen auf geladene Glasschlitten (Abbildung 2C, D) und trocknen Sie die Dias über Nacht bei Raumtemperatur.

3. Immunfluoreszenz für pH3

  1. Führen Sie drei 5 min Waschungen der Dias in 1x PBS in einem geeigneten Behälter durch, z. B. einem Coplin-Glas. Wenn Gewebe nicht gut an der Folie befestigt sind, führen Sie Wälwass durch, indem Sie Rutschen auf eine flache Oberfläche legen und sanft 500 l 1x PBS auf die Oberfläche leiten. Gießen Sie 1x PBS zwischen den Wähen ab, indem Sie die Dias sanft kippen.
  2. Umreißen Sie die Abschnitte mit einem Barrierestift oder Wachsstift, um Flüssigkeit auf den Dias zu halten (Abbildung 3).
  3. Legen Sie die Dias auf eine flache Oberfläche in einer feuchten Kammer und Pipette 200 l Blockpuffer pro Abschnitt auf die Dias. Im Blockpuffer für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  4. Bereiten Sie die primäre Antikörperverdünnung (Kaninchen Anti-pH3-Antikörper, 1:200; siehe Tabelle derMaterialien) in Blockpuffer und mischen Sie gut durch Pipettieren. Kippen Sie die Dias vorsichtig, um den Blockpuffer abzuleiten, kehren Sie zur feuchten Kammer zurück und führen Sie die Pipette 200 l primärer Antikörperlösung pro Abschnitt auf die Dias zurück. Für die reine Sekundärsteuerung die Pipette 200 L des Blockpuffers auf die entsprechenden Abschnitte.
  5. Inkubieren Sie die Dias bei 4 °C über Nacht in einer feuchten Kammer, die mit entionisiertem Wasser gefüllt ist. Versiegeln Sie die Ränder der feuchten Kammer, um Feuchtigkeit zu halten.
  6. Führen Sie drei 5 min Waschungen der Dias in 1x PBS in einem geeigneten Behälter durch, z. B. einem Coplin-Glas. Während der Waschschritte die sekundäre Antikörperverdünnung (Anti-Kaninchen fluoreszierendes Sekundärantikörperkonjugat, 1:2.000; siehe Tabelle derMaterialien) im Blockpuffer vorbereiten und durch Pipettieren gut vermischen.
  7. Legen Sie die Dias auf eine flache Oberfläche in einer feuchten Kammer und Pipette 200 l Sekundärantikörperlösung pro Abschnitt auf die Dias. Inkubieren Sie die Dias in sekundären Antikörperlösungen bei Raumtemperatur, vor Licht abgeschirmt, für 30 min.
  8. Führen Sie drei 5 min Waschungen der Dias in 1x PBS in einem geeigneten Behälter durch, z. B. einem Coplin-Glas, das vor Licht geschützt ist. Bereiten Sie während der Waschschritte eine nukleare Färbelösung vor (siehe Tabelle der Materialien).
  9. Legen Sie die Dias auf eine flache Oberfläche und Pipette 200-u2012500 l (je nach Größe der Probe) der Kernfärbunglösung auf jeden Abschnitt. Inkubieren Sie die Dias in der kerntechnischen Färbelösung für 10 min, vor Licht abgeschirmt.
  10. Entleeren Sie die Kernfärbungslösung und montieren Sie die Dias mit nicht härtenden fluoreszierenden Montagemedien und einem Glasdeckel. Halten Sie die Dias im Dunkeln bei 4 °C, bis die Bildgebung durchgeführt wird.
    HINWEIS: Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Folien am selben Tag oder am nächsten Tag abgebildet werden.
  11. Im Anschluss an IF können Sie die Dias mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop und einer Digitalkamera mit 555 nm (rot) und 645 nm (far-red) Emissionsfiltern bei 100-facher Vergrößerung (10x Augenvergrößerung und 10-fache Objektivvergrößerung) visualisieren und abbilden. Halten Sie die Laserleistung während der gesamten Bildgebung konsistent.
  12. Legen Sie die Dias nach der Bildgebung in einzelne Behälter mit 1x PBS und lagern Sie flach bei 4 °C über Nacht, um sich auf die Abdeckschlupfentfernung vorzubereiten. Wenn Sie die Dias in 1x PBS platzieren, rühren Sie die Dias vorsichtig, um das Entfernen des Deckellipses zu unterstützen.
    HINWEIS: Drücken Sie nicht auf den Deckelnachdruck und versuchen Sie nicht, den Deckelzettel manuell zu entfernen, da dies die Qualität der Abschnitte beeinträchtigen kann. Die Abdeckungen müssen bei minimaler Zwangsbewegung horizontal entfernt werden.

4. Immunhistochemie für markierte dextran

  1. Nachdem die Abdeckungen entfernt wurden, übertragen Sie die Dias vorsichtig in neue 1x PBS in einem geeigneten Behälter, z. B. einem Coplin-Glas. Entfernen Sie die 1x PBS und führen Sie drei 5 min Inkubationen der Dias in 1x Tris-gepufferter Salin mit 0,1% eines nichtionischen Tensids (1x TBSt) bei Raumtemperatur durch.
  2. 250 ml 3% Wasserstoffperoxid (H2O2 ) in entionisiertem Wasser in einem entsprechend großen Behälter verdünnt vorbereiten. Inkubieren Sie die Dias in 3% H2O2 Lösung bei Raumtemperatur für 15 min.
    HINWEIS: Wasserstoffperoxid ist ätzend und muss gemäß den institutionellen Vorschriften ordnungsgemäß entsorgt werden. Es sollte immer eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Labormantel und Schutzbrille) verwendet werden.
  3. Spülen Sie die Dias schnell mit entionisiertem Wasser. Führen Sie drei 5 min Wäsche der Dias in 1x TBSt durch. Trocknen Sie den Bereich um die Gewebeabschnitte sorgfältig und legen Sie die Dias flach in eine feuchte Kammer. Umreißen Sie die Gewebeabschnitte mit einem Barrierestift oder Wachsstift, um bei Bedarf Flüssigkeit auf den Abschnitten aufzubewahren.
  4. Wenden Sie eine gebrauchsfertige 2,5 %-Serumblockierungslösung an, die mit einem sekundären Antikörper-Etikettierungskit (siehe Tabelle derMaterialien) für jeden Abschnitt bereitgestellt wird. Inkubieren Sie die Dias in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 20 min.
  5. Bereiten Sie den primären Antikörper in Antikörperverdünnung verdünnt (Kaninchen Anti-Label-Dextran, 1:7,500; siehe Tabelle der Materialien) und mischen durch sanfte Pipettierung. Kippen Sie die Dias vorsichtig, um den Blockpuffer abzutropfen, trocknen Sie den Bereich um die Abschnitte herum und legen Sie die Dias flach in eine feuchte Kammer.
  6. Waschen Sie nicht vor dem Auftragen der primären Antikörperlösung. Pipette 200 l Primärantikörperlösung pro Abschnitt auf die Dias und in kubischer Kammer bei 4 °C über Nacht inkubieren. Für die reine Sekundärkontrolle die Pipette 200 l des Antikörperverdünnungsmittels auf die entsprechenden Abschnitte.
  7. Kippen Sie die Dias vorsichtig, um die primäre Antikörperlösung abzutropfen und in 1x TBSt in einen geeigneten Behälter, wie z. B. ein Coplin-Glas, zu geben. Führen Sie zwei 5 min Wäsche der Rutschen in 1x TBSt. Trocknen Sie den Bereich um die Abschnitte und legen Sie flach in eine feuchte Kammer.
  8. Wenden Sie ein gebrauchsfertiges, hintergrundreduzierendes Blockierreagenz (siehe Materialtabelle) tropfenweise auf jeden Abschnitt an. Inkubieren Sie die Dias in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 20 min.
  9. Kippen Sie die Rutschen vorsichtig, um den Blockpuffer abzutropfen, trocknen Sie den Bereich um die Abschnitte sorgfältig und legen Sie die Dias flach in eine feuchte Kammer. Waschen Sie nicht vor dem Auftragen der sekundären Antikörperlösung.
  10. Tragen Sie eine gebrauchsfertige Sekundärantikörperlösung (Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase (HRP)-Polymer-Sekundärantikörper auf jeden Abschnitt tropfenweise auf und inkubieren Sie in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur 30 min.
  11. Kippen Sie die Dias vorsichtig, um die sekundäre Antikörperlösung abzutropfen und in 1x TBSt in einen geeigneten Behälter, wie z. B. ein Coplin-Glas, zu geben. Führen Sie zwei 5 min Wähvorgänge der Dias in 1x TBSt durch.
  12. Bereiten Sie das hrP-Chromogensubstrat unmittelbar vor der Verwendung gemäß dem Herstellerprotokoll vor (siehe Tabelle der Materialien).
  13. Trocknen Sie den Bereich um die Abschnitte, legen Sie die Dias auf eine flache Oberfläche, und tragen Sie 200 l des hrP-Chromogensubstrats auf jeden Abschnitt auf. Inkubieren Bei Raumtemperatur für 3 min, starten Sie einen Timer, wenn das Substrat auf den ersten Schlitten aufgebracht wurde (Abbildung 4).
  14. Die Substratlösung abtropfen lassen und die Dias kurz in einem Coplin-Glas mit 1x PBS abspülen. Legen Sie die Dias in entionisiertem Wasser in einen geeigneten Behälter, wie z. B. ein Coplin-Glas, und führen Sie zwei 5 min Waschungen in entionisiertem Wasser mit sanfter Rührung durch.
  15. Gegenstain die Dias durch Stellen sie in Hämatoxylin-Färbung Lösung für bis zu 30 s.
    HINWEIS: Hämatoxylin ist giftig und muss nach institutionellen Vorschriften entsorgt werden. Es sollte immer eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Labormantel und Schutzbrille) verwendet werden.
  16. Legen Sie die Dias in entionisiertem Wasser in einen geeigneten Behälter, wie z. B. ein Coplin-Glas, und führen Sie drei 5 min Waschungen in entionisiertem Wasser durch. Übertragen Sie die Dias in einen Behälter mit Scotts Leitungswasser (siehe Materialtabelle)und brüten Sie 1 Min. inkubieren.
  17. Legen Sie die Dias in entionisiertem Wasser in einen geeigneten Behälter, wie z. B. ein Coplin-Glas, und führen Sie drei 5 min Waschungen in entionisiertem Wasser durch.
  18. Dehydrieren Sie die Dias durch eine Reihe von Ethanol (EtOH) Qualitäten (in deionisiertem Wasser verdünnt) und Xylol in einer chemischen Haube. Führen Sie eine 2 min Inkubation in 70% EtOH, zwei 1 min Inkubationen in 95% EtOH, zwei 1 min Inkubationen in 100% EtOH und drei 1 min Inkubationen in Xylol durch. Entfernen Sie die Dias von Xylol und legen Sie einen Deckelschlupf, während nass mit einem Tolulu-basierten Montagemedium in einer chemischen Haube.
    HINWEIS: Xylol und Toluen sind giftig und entzündlich und müssen gemäß den institutionellen Vorschriften ordnungsgemäß entsorgt werden. Die Arbeit mit Xylol und Tolulol sollte in einer chemischen Kapuze durchgeführt werden, und es sollte immer eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Labormantel und Schutzbrille) verwendet werden.
  19. Visualisieren und fotografieren Sie die Dias nach IHC mit einem zusammengesetzten Lichtmikroskop und einer Digitalkamera bei 100-facher Vergrößerung (10-fache Augenvergrößerung und 10-fache Objektivvergrößerung). (Abbildung 5).

Representative Results

Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um die Proteinexpression in einzelnen Spenderzellen in 48 h cheurischen Zebrafischembryonen nach der Befruchtung zu identifizieren und zu analysieren, die durch Blastula-zu-Blastula-Transplantation zwischen AB-Wild-Zebrafischembryonen erzeugt wurden. Erfolgreiche Analyse der Proteinexpression auf Einzellebene erforderte die Vorbereitung von Kryosektionen mit entsprechend orientierten Embryonen (Abbildung 1 und Abbildung 2) und eine sorgfältige, sequenzielle Anwendung von IF- und IHC-Techniken auf diese Kryosektionen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Die Verwendung spezifischer Antikörper zum gleichzeitigen Nachweis von proliferierenden Zellen (Anti-pH3, Abbildung 5A, B) und Spenderzellen (Anti-Label-Dextran, Abbildung 5D) können verwendet werden, um Spenderzellen zu identifizieren und zu quantifizieren, die sich aktiv vermehren ( Abbildung 5E). Es ist wichtig, qualitativ hochwertige Bilder nach IF (Abbildung 2A, B) und IHC ( Abbildung2D) zu erzeugen, um einzelne Zellen genau zu identifizieren. Ein Bildanalyseprogramm sollte verwendet werden, um Bild-Overlay durchzuführen (Abbildung 5E). Je nach verwendetem Bildanalyseprogramm kann es möglich sein, automatisierte Zählungen von markierten Zellen durchzuführen, wenn quantifizifiziert werden soll.

Figure 1
Abbildung 1: Herstellung von gefrorenen OCT-Blöcken. (A) 50x mikroskopische Ansicht von Embryonen in OCT in einer kryogenen Form, die zum Einfrieren vorbereitet wird. Roter Pfeil zeigt Kopf des Zebrafisch embryo Position gegen die untere Oberfläche der Form; schwarzer Pfeil zeigt den Schwanz an, der auf den Benutzer zeigt. (B) Kunststoffformen mit Embryonen und OCT auf gekühlter Metallplattform platziert. (C) Schaumeiskübel über Kunststoffformen gelegt, um Gefrierkammer zu schaffen. (D) OCT wird weiß von transparent, sobald der Block vollständig eingefroren ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Kryosektionen von gefrorenen OCT-Blöcken. (A), Anwendung des frischen OCT auf Diekostatscheibe und Platzierung des gefrorenen Blocks auf OCT, gedreht um 180° von der Gefrierausrichtung des Blocks. (B) Seitenansicht des Blocks, der auf Schnittscheibe eingefroren ist. (C) Ansicht des Schnittblocks mit Rollenplatte in Position. (D) Abholung von Abschnitten mit einem geladenen Schlitten von der Metallplattform des Kryostats. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ansicht der vorbereiteten Abschnitte nach der Platzierung auf einer Folie. Pfeil zeigt hydrophobe Barriere, und gepunktete Linie zeigt die Zone mit Abschnitten innerhalb barriereum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Vorbereitung auf die Anwendung von chromogenem Substrat während IHC. Der Schlitten wird auf einer flachen Oberfläche platziert, die mit Einer Kunststofffolie bedeckt ist, um eine gleichmäßige Anwendung des chromogenen Substrats zu ermöglichen und gleichzeitig das Verschütten von gefahrgefährlichem Material zu enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative IF- und IHC-Kennzeichnung von kryosectionierten 48-hpf-Chimer-Zebrafisch-Embryonen, die durch Blastula-zu-Blastula-Transplantation zwischen AB-Wild-Zebrafischembryonen erzeugtwerden. (A) IF zum Nachweis der expression Ser 10 phosphorylierter Histone H3 (Anti-pH3, 1:200) in 48 hpf chimärem Zebrafisch-Embryo. Rot = pH3-positive Zellen; blau = Kerne. Gelbe Pfeile zeigen Beispiele für positive Zellen an. (B) Die Subtraktion des blauen Kernflecks im digitalen Bild (ImageJ-Software) verbessert die Visualisierung von pH3-positiven Zellen zur Quantifizierung und Bildüberlagerung. (C) Negative Kontrolle (nur sekundärer Antikörper) für IF-Assay in kryosectioned 48 hpf chimeric Zebrafisch embryo. Die Skalenstange entspricht 50 m (gilt für alle Panels). (D) IHC zum Nachweis von markiertem Dextran (Anti-Label-Dextran, 1:7.500) in chimärem 48-hpf Zebrafisch-Embryo, der durch Blastula-zu-Blastula-Transplantation zwischen AB-Wild-Zebrafischembryonen erzeugt wird. Spenderembryonen wurden im Einzellstadium vor der Verwendung für blastula-to-blastula-Transplantation mit einem fluoreszierend gekennzeichneten Dextran-Konjugat injiziert. Rot zeigt Zellen an, die mit einem Dextran-Konjugat beschriftet sind; blau zeigt Kerne an. Gelbe Pfeile zeigen Beispiele für positive Zellen an. (E) Überlagerung von Panel B (IF für pH3) und Panel C (IHC für beschrifteten Dextran) mit Kolokalisierung der pH3-Expression und Dextran-Beschriftung in einzelnen Zellen. Gelbe Pfeile zeigen Beispiele für doppelt positive Zellen an. (F) Negative Kontrolle (nur sekundärer Antikörper) für IHC-Assay in kryosectioned 48 hpf chimeric Zebrafisch embryo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Wir haben eine neuartige Methode für kombinierte Immunfluoreszenz und Immunhistochemie vorgestellt, die einen wichtigen Schritt nach vorn bei der Durchführung von Kolokalisierungsexperimenten an kryosektionierten Zebrafischembryonen darstellt. Es gibt einen kritischen Mangel an bestehenden Kolokalisierungsprotokollen, die für die Verwendung mit kleinen Embryonen und kryosectioniertem Material17,18optimiert sind, die beide sonst häufig in molekularen Studien verwendet werden14. Bestehende Kolokalisierungsprotokolle konzentrieren sich hauptsächlich auf die gleichzeitige Visualisierung von zwei Fluorophoren17,18. Obwohl diese Protokolle gut funktionieren können, wird ihre Nützlichkeit durch die Verfügbarkeit von Antikörpern eingeschränkt, die (i) in Zebrafischen verwendet werden können und (ii) mit IF kompatibel sind.

Wir sind der Meinung, dass die Verwendung von Kryosektionen für Zebrafischembryonen einen signifikanten Vorteil in Bezug auf die konservierte Gewebemorphologie bietet. Da IHC häufiger auf Paraffinabschnitten als Kryosections7,8durchgeführt wird, ist eine weitere Erforschung von Kryosektions-basierten IHC-Methoden zum Nachweis der Proteinexpression gerechtfertigt. Die Verwendung von ganzer Halterung IF ist eine gängige Methode zur Visualisierung von Expressionsniveaus in Zebrafischembryonen und wird in der Literatur häufiger beschrieben als IF mit Kryosektionen1,2,3,4, 19. Allerdings haben ganze Mount-Protokolle Grenzen, einschließlich des Mangels an genauer Lokalisierung von Proteinen, die in tiefen Geweben exprimiert werden, und des Potenzials für eine Expression auf Oberflächenebene, um die Proteinexpression in tieferen Geweben zu verschleiern. Wir haben konsequent eine ausgezeichnete Wartung der zellulären Morphologie nach Kryokonservierung, Schnitt und sequenzielleife IF und IHC beobachtet. Bei Anwendungen, die eine präzise Lokalisierung der Proteinexpression auf einzelzeller Ebene erfordern, hat dies einen erheblichen Vorteil für abschnittsbasierte Verfahren, wie wir sie in diesem Protokoll beschrieben haben. Die Harzeinbettung bietet eine alternative Option für if- oder IHC-Assays an Abschnitten von Zebrafischembryonen im Frühstadium20. Harzabschnitte bieten eine überlegene Konservierung der Gewebemorphologie im Vergleich zu Kryosektionen, und relativ dünnere Gewebeabschnitte können vorbereitet werden. Die Hersteller empfehlen jedoch generell nicht die Verwendung von Harzprofilen für immunbasierte Assays, da einige Komponenten der Harze nicht aus den Abschnitten entfernt werden können und Antikörperbindungsstellen maskieren können21.

Während das gesamte Protokoll für eine genaue und erfolgreiche Analyse von Ausdrucksmustern unerlässlich ist, sind einige spezifische Schritte entscheidend für den experimentellen Erfolg. Der erste kritische Schritt ist der Umgang mit Embryonen während der Einbettung in OCT13,14. Es kann schwierig sein, jeden Embryo in der gleichen Querebene so auszurichten, dass Abschnitte aus etwa der gleichen Fläche für alle Embryonen geschnitten werden. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung kleiner Nadeln, um kleine, absichtliche Bewegungen durch das viskose OCT-Medium zur Embryoorientierung durchzuführen, besser ist als die Verwendung von Zangen, die zu groß sind und zu viel OCT-Medium verdrängen. Ein zweiter kritischer Schritt tritt beim Schnitt von gefrorenen Blöcken auf, da es schwierig sein kann, hochwertige Abschnitte zu erhalten, die das gewünschte Gewebe enthalten, ohne signifikante Sanierung und Erfahrung. Wir empfehlen daher die Verwendung von Testproben, bis die Technik gemeistert ist. Ein dritter kritischer Schritt ist die Abdeckungsrutschentfernung, die das Potenzial hat, Gewebeproben zu stören oder abzustreifen. Wir haben festgestellt, dass eine Kombination aus sanfter Rührung zum Lösen des Deckels und dem langsamen Entfernen des Schlittens aus dem PBS-Behälter der effektivste Ansatz zum Entfernen von Abdeckungen ist. Eine sanfte und ruhige Hand ist am besten; Forscher können feststellen, dass einige Versuch und Fehler notwendig ist, um zu lernen, wie man Abdeckungen effektiv zu entfernen.

Weitere wichtige Schritte im Protokoll sind die Optimierung von Antikörpern (primäre und sekundäre Antikörper für IF- und IHC-Assays) und die Exposition von Dias gegenüber dem chromogenen Substrat und Gegenfleck. Eine gründliche Forschung in Bezug auf primäre Antikörperspezifität und Zielkonzentration ist von wesentlicher Bedeutung; Im Allgemeinen ist es am besten, genügend nicht-edelproben für mindestens zwei separate Experimente für IF und IHC zu sammeln, die durchgeführt werden, um primäre Antikörperkonzentrationen zu optimieren, bevor die IF/IHC-Kombination beginnt. Die Einbeziehung einer bekannten positiven und negativen Kontrolle für jeden primären Antikörper ist in jedem Experiment unerlässlich, um sicherzustellen, dass sowohl IF- als auch IHC-Assays angemessen funktionieren. Anpassungen der sekundären Antikörperkonzentration können ebenfalls erforderlich sein. Eine Optimierung der Exposition von Gewebeabschnitten gegenüber dem chromogenen Substrat und Gegenfleck für den IHC-Test ist erforderlich, da Herstellerrichtlinien oft eine Vielzahl möglicher Expositionszeiten beschreiben. Nicht alle Chromogene sind möglicherweise mit Gegenflecken und endogener Gewebepigmentierung kompatibel, was eine sorgfältige Planung in Bezug auf die Chromogenauswahl erfordert.

Es gibt zahlreiche mögliche Modifikationen, die auf das beschriebene Protokoll angewendet werden können, und wir haben dieses Protokoll erfolgreich mit anderen Kombinationen von Antikörpern durchgeführt, die nicht beide für IF verwendet werden konnten. Wie bereits erwähnt, weisen chromogene Stoffe eine ausgeprägte Verträglichkeit mit spezifischen Gegenflecken auf. Wir haben festgestellt, dass diese Komponenten im Protokoll leicht veränderbar sind. Darüber hinaus sind die Parameter für die Antikörperinkubation recht flexibel und können je nach gewünschter Färbeintensität erhöht oder verringert werden. Der Einbettungsprozess kann ebenfalls geändert werden. Während wir uns auf Querabschnitte konzentriert haben, können Embryonen leicht in jede Richtung ausgerichtet werden, um bestimmte Gewebe von Interesse anzusprechen. Schließlich gibt es mehrere mögliche Pausenpunkte in diesem Protokoll. Dehydrierte Embryonen können in 100% MeOH bei -20 °C für einige Monate gelagert werden; gefrorene Blöcke können bis zu drei Monate bei -80 °C gelagert werden; und vorbereitete Dias können bei -80 °C bis zu neun Monate in einer Diabox gelagert werden.

Aufgrund der relativen Komplexität dieses kombinierten IF/IHC-Protokolls gibt es mehrere mögliche Variations- oder Fehlerquellen, die eine Fehlerbehebung erfordern können, von der Gewebequalität über die Erfahrung von Forschern bis hin zur Probenhandhabung. Die meisten der oben beschriebenen kritischen Schritte werden als kritisch betrachtet, da sie entweder eine Optimierung auf der ebenerdigen Benutzerebene erfordern oder eine besondere Geschicklichkeit, Fertigkeit und Erfahrung erfordern. Wir haben jedoch festgestellt, dass unspezifische Hintergrundfärbung und niedrige Signalintensität die wichtigsten Probleme sind, die optimiert werden müssen. Wie bei jedem IF- oder IHC-Protokoll kann die Behandlung dieser Probleme zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein und kann mit dieser Methode kombiniert werden, da die beiden Techniken kombiniert werden. Aus diesem Grund empfehlen wir dringend, IF und IHC separat zu optimieren, bevor Sie mit dem kombinierten Protokoll fortfahren.

Während wir vorhersagen, dass diese Methode für eine breite Palette von Experimenten nützlich sein wird, gibt es potenzielle Einschränkungen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens hängt von der Aufrechterhaltung intakter Gewebeproben durch zwei sequenzielle Experimente ab, die zahlreiche Waschschritte umfassen. Aus diesem Grund werden alle Probleme, die während der Schnitt- oder Gewebehandhabung auftreten, einschließlich der Verwendung älterer Dias, die in der Qualität beeinträchtigt haben, die Fähigkeit der Forscher, dieses Protokoll erfolgreich durchzuführen, erheblich einschränken. Obwohl Dias möglicherweise bis zu neun Monate bei -80 °C gelagert werden können, nimmt die Gewebehaftung an Dias im Laufe der Zeit ab und wir hatten den besten Erfolg mit Dias, die innerhalb eines Monats nach der Vorbereitung oder idealerweise am nächsten Tag verwendet werden. Eine zweite Einschränkung ist der geringe Fußabdruck von Zebrafischembryonen. Während wir dieses Experiment für nützlich bei der Visualisierung von Proteinen gefunden haben, die relativ häufig in Embryonen im Frühstadium exprimiert werden, können Proteine, die inkonsistent oder auf niedrigem Niveau exprimiert werden, in einem Abschnitt sehr schwierig zu erfassen sein. Da das Protokoll 10-u201212-M-Kryosections verwendet, eignet es sich am besten für die Bewertung der Proteinexpression in größeren Strukturen, wie Z. B. Kernen, anstatt kleinerer subzellulärer Komponenten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser kombiniertes IF/IHC-Protokoll für eine Vielzahl von Studien an Zebrafischembryonen im Frühstadium von Vorteil sein wird und eine wichtige Innovation bei der präzisen Proteinexpressionsanalyse in solchen Proben darstellt. Unsere Methode, die in Abbildung 5erfolgreich gezeigt wird, wird es den Forschern ermöglichen, die delikate Morphologie von Zebrafischembryonen im Frühstadium in Kryosektionen zu erhalten, während sie mit dem etwas begrenzten Bereich der derzeit verfügbaren Primärantikörper arbeiten, die für die Verwendung in IF oder IHC bei dieser Art validiert. Dieses Protokoll wird wahrscheinlich für Studien an anderen Fisch- und Amphibienarten (z. B. Medaka und Xenopus spp.) nützlich sein, die durch ähnliche Beschränkungen der Verfügbarkeit von Antikörpern behindert werden und für traditionelle Säugetiermodelle als brunnen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium 5K01OD021419-02 und das NC State University College of Veterinary Medicine unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15/25 N/A N/A 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O
Alexa 555 secondary antibody Invitrogen A21429 used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF
Antibody Diluent Dako S3022
Background Buster Innovex NB306
block buffer (IF) N/A N/A 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS
cellSens imaging software Olympus cellSens imaging software used with compound light microscope
chimeric zebrafish embryos N/A N/A AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf 
Compound light microscope Olympus BX51 used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC
Confocal fluorescence microscope Leica DM 2500 used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF
Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm Ted Pella 27147-2
Digital camera, light microscope Olympus DP27
Digital camera, fluorescence microscope Leica TCS SPE
Ethanol Koptec V1001
Fish gelatin Sigma G7041
Glass slides Fisher 12-550-15
Hydrogen peroxide, 30% Fisher H325-100
ImmPRESS HRP Polymer detection kit Vector MP-7401 anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer
Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software Leica LAS AF 2.3.6 imaging software used with confocal fluorescence microscope
Methanol Fisher A452-4
Modified Meyer's Hematoxylin Thermo 72804
Normal Goat Serum MP Biomedical 191356
OCT medium Tissue-Tek/Fisher 4583/4585
anti-Oregon Green antibody Molecular Probes/Life Technologies A889 used at 1:7500 dilution for IHC
Oregon Green Dextran Invitrogen P7171 used at 2.5% in 0.2 M KCl
Paraformaldehyde, 4% Acros Organics 416780030 made in lab in 1x PBS
Permount Fisher SP15
1x phosphate-buffered saline made in lab N/A 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O
10x phoshpate-buffered saline made in lab N/A use Cold Spring Harbor protocol
1x PBSt made in lab N/A 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O
anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody Santa Cruz sc-8656-R used at 1:500 dilution for IF
Scott's Tap Water Electron Microscopy Sciences 26070-06 have used other brands successfully in addition to EMS
Sucrose Amresco 335
Tween-20 Fisher BP337
TO-PRO3 Invitrogen T3605 used at 1:1,000 in 1x PBS for IF
1x Tris-buffered saline made in lab N/A 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O
10x Tris-buffered saline made in lab N/A 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O
1x TBSt made in lab N/A 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O
Triton X-100 Acros Organics 327371000
Vectashield Vector H-1000 non-hardening mounting media
Vector NovaRed substrate Vector SK-4800 HRP substrate
Xylene Fisher X3P-1GAL

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References

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Biologie Ausgabe 147 Zebrafische Embryonen Immunhistochemie Immunfluoreszenz Kolokalisierung interzelluläre Interaktion
Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen
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Ferguson, J. L., Shive, H. R.… More

Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (147), e59344, doi:10.3791/59344 (2019).

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