Summary
Denne protokollen demonstrerer sekvensiell immunofluorescence og immunhistokjemi på cryosections fra tidlig stadium sebrafisk embryo som muliggjør presise colocalization analyser i spesifikke celle populasjoner.
Abstract
Gransking av intercellulære interaksjoner krever ofte diskret merking av bestemte celle populasjoner og presis protein lokalisering. Det sebrafisk embryo er et utmerket verktøy for å undersøke slike interaksjoner med en in vivo-modell. Hel-Mount immunhistokjemiske og immunofluorescence analyser er ofte brukt i sebrafisk embryo å vurdere protein uttrykk. Imidlertid kan det være vanskelig å oppnå nøyaktig kartlegging av co-lokaliserte proteiner i tredimensjonale rommet. I tillegg kan enkelte studier kreve bruk av to antistoffer som ikke er kompatible med samme teknikk (f. eks antistoff 1 er bare egnet for immunhistokjemi og antistoff 2 er bare egnet for immunofluorescence). Formålet med metoden som er beskrevet her, er å utføre sekvensielle immunofluorescence og/eller immunhistokjemi på individuelle cryosections avledet fra tidlig stadium sebrafisk embryo. Her beskriver vi bruken av sekvensielle runder med immunofluorescence, bildebehandling, immunhistokjemi, bildebehandling for en enkelt cryosection for å oppnå presis identifisering av protein uttrykk på enkelt cellenivå. Denne metodikken er egnet for enhver studie i tidlig stadium sebrafisk embryo som krever nøyaktig identifisering av flere protein mål i individuelle celler.
Introduction
Sebrafisk er en ekstremt robust modell organisme som i dag brukes over et bredt spekter av disipliner i biomedisinsk forskning. Spesielt den raske eksterne utvikling og gjennomskinnelighet av sebrafisk embryo gir et utmerket verktøy for in vivo studier. Heri beskriver vi en metode for sekvensiell immunofluorescence (IF) og immunhistokjemiske (IHC) analyser av cryosectioned sebrafisk embryo. Denne romanen prosedyren bruker sekvensiell anvendelse av to antistoffer på et enkelt lysbilde, slik at nøyaktig identifisering av colocalized proteiner på cellenivå samtidig bevare vev seksjoner. Denne protokollen er spesielt nyttig for studier med sebrafisk-modellen, ettersom et relativt lite antall antistoffer er validert for bruk i IF-og/eller IHC-applikasjoner i sebrafisk sammenlignet med musemodeller.
Observasjon av intercellulære interaksjoner er et vesentlig element i mange studier, og kan gi viktig innsikt i molekylære mekanismer fungerer på cellenivå som ligger til grunn fenotyper på organismal nivå. I tillegg kan protein uttrykk gi informasjon om cellulær funksjon, spesielt når du undersøker uttrykk for flere proteiner samtidig i cellen (co-lokalisering). Selv om hel-Mount IHC og hvis er ofte brukt teknikker for å analysere protein uttrykk i sebrafisk embryo1,2,3,4,5, hele Mount prosedyrer kan problematisk for å oppnå presise colocalization data. I vår erfaring, kan det være vanskelig å skille mellom lag av vev og visualisere protein uttrykk på enkelt cellenivå i hel-Mount eksemplarer. Imaging-programmer kan vanligvis ikke skille mellom overflate flekker og dypere farging. Ikke-overflate protein uttrykk kan skjules av mer lys uttrykt overflatenivå uttrykk, noe som fører til unøyaktigheter i kvantifisering. I tillegg er de fleste tradisjonelle sebrafisk clearing metoder ganske giftig6 og dermed mindre ønskelig for bruk.
Antistoff-baserte teknikker, for eksempel IF og IHC, brukes ofte til å påvise protein uttrykk i delt materiale, noe som forenkler identifisering av diskrete celle populasjoner som uttrykker et bestemt protein innenfor komplekst vev. IHC brukes vanligvis til colocalization, oftest ved å bruke to forskjellige antistoffer som bøyes likt i forskjellige verts arter og med forskjellige fargede kromogener4,7,8,9 , 10. imidlertid kan bruk av flere kromogener føre til uspesifisert bakgrunns farging eller inkompatibilitet av farger11,12.
Vi utviklet en ny protokoll for påvisning av flere proteiner ved sekvensiell IF og IHC på cryosectioned tidlig stadium sebrafisk embryo. Kryosnitt er spesielt velegnet til delikate vev som sebrafisk embryo, og cryosections er overlegne i snitt for para fin integrerte seksjoner for fluorescens analyser13,14. Vi valgte å optimalisere kombinert IF og IHC snarere enn dual-farge IF eller IHC, for å omgå problemet med antistoff inkompatibilitet for en enkelt analysetype. Disse problemene er spesielt relevante for forskning som involverer sebrafisk på grunn av det begrensede antall kommersielt tilgjengelige antistoffer som er validert for bruk i sebrafisk. Faktisk viste en studie av fire store selskaper som kommersielt tilgjengelige antistoffer for bruk i musen var ca 112 000 versus ca 5 300 for bruk i sebrafisk15. Til slutt valgte vi å utvikle en protokoll som kunne utføres på en enkelt cryosection, noe som er viktig når du arbeider med små eller begrensede vevsprøver som er innhentet fra sebrafisk embryo.
Denne protokollen ble utviklet for å vurdere proliferativ atferden til donor celler i 48 h post-befruktning chimeric sebrafisk embryo som ble generert av Blastulastadiet-til-Blastulastadiet transplantasjon som beskrevet av Carmany-Rampey og moens16. Donor embryo ble injisert på en celle scenen med en fluorescensmerkete merket dextran bøye før transplantasjon av donor celler i mottaker embryo. Vi brukte immunofluorescence for ser 10 fosforylert histone H3 (pH3) å oppdage voksende celler etterfulgt av immunhistokjemi for merket dextran å oppdage donor celler i chimeric sebrafisk embryo. Sekvensiell påvisning av pH3 og de merkede dextran innenfor en enkelt cryosection gjorde det mulig for oss å identifisere og kvantifisere enkeltceller som uttrykte begge markørene.
Denne sekvensielle IF/IHC-protokollen for cryosectioned sebrafisk vil gi et nyttig verktøy for sebrafisk forskere som ønsker en colocalization protokoll for protein uttrykk. Problemene som denne protokollen ble utviklet for å henvende seg, slik som små vevsprøver og begrenset antistoff tilgjengelighet, er ikke unike for sebrafisk modellen. Denne metoden kan derfor være til nytte for enhver forsker som ønsker å utføre sekvensiell IF/IHC.
ETIKK ERKLÆRING:
Alle dyrestudier ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Protocol
1. forberedelse av embryo
- Fix 48 h post-befruktning (hpf) chimeric sebrafisk embryo generert av Blastulastadiet-til-Blastulastadiet transplantasjon mellom AB vill-type sebrafisk embryo i 4% paraformaldehyde (PFA) over natten med rocking ved 4 ° c. Utfør to 5 min vask med rocking ved romtemperatur med 500 μL av 1x fosfat bufret saltvann som inneholder 0,1% av et ikke-ioniske overflateaktivt middel (1x PBSt; se tabell over materialer)
Merk: Paraformaldehyde er giftig og et kreftfremkallende stoff og må avhendes i henhold til institusjonelle forskrifter. Arbeid med paraformaldehyde bør utføres i en kjemisk hette, og egnet personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) bør alltid brukes. - Tørke embryo ved å vaske sekvensielt med 500 μL på 30%, 50% og 70% metanol (MeOH) fortynnet med 1x PBSt i 10 minutter hver ved romtemperatur med rocking. Ruge embryo i 500 og μL av 100% MeOH ved-20 ° c i minst 14 timer.
Merk: Metanol er giftig og må avhendes på riktig måte i henhold til institusjonelle forskrifter. Arbeid med metanol bør utføres i en kjemisk hette, og egnet personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) bør alltid brukes. - Rehydrate embryo ved å vaske sekvensielt med 500 μL av 70%, 50% og 30% MeOH fortynnet med 1x PBSt i 10 minutter hver ved romtemperatur med rocking. Utfør to 5 min vasker med 500 μL av 1x PBSt ved romtemperatur med rocking.
- Fjern 1x PBSt og ruge i 500 μL av 30% sukrose fortynnet med deionisert vann ved romtemperatur med rocking til embryo synke til bunnen av røret (ca 1 h). Erstatt sukrose med 500 μL av 15% fisk gelatin/25% sukrose (15/25; se tabell over materialer) og ruge ved romtemperatur med rocking over natten.
- Erstatt omtrent halvparten av volumet av 15/25 med optimal skjæring temperatur medium (OCT medium) og ruge ved romtemperatur med rocking til embryo synke til bunnen av røret (ca 1 h).
- Erstatt omtrent halvparten av volumet med OCT medium og ruge ved romtemperatur med rocking for 1 t. Gjenta dette trinnet én gang.
- Under inkubasjons trinn med 15/25 og OCT medium, invertere eller flick røret som nødvendig for å kombinere disse reagensene.
2. embryo embedding og utarbeidelse av Cryosections
- Overfør embryo til en plast mold (se tabell over materialer) med tang, minimere enhver overføring av 15/25-Oct blanding. Fyll mold omtrent halvparten full med OCT medium og bland forsiktig embryo i OCT medium.
- Forbered merket plast muggsopp og overføre ønsket embryo (vanligvis 1 \ u20123 embryo) i den tomme, merket plast muggsopp, minimere bære-over av OCT medium. Når ønsket embryo er i plast mold, forsiktig fylle med OCT medium til toppen av mold.
- Bruk tang eller 25 G nåler for å arrangere embryo til ønsket orientering, ved hjelp av en lys stereomikroskopet for visualisering (figur 1a, B).
- Frys forberedt muggsopp på tørr is i en isolert container med en metall plattform. Plasser en is bøtte eller skum kjøler forsiktig over metall plattformen for å skape et kaldt kammer (figur 1C, D)
-
Forbered 10 \ u201212 μm tykke cryosections ved hjelp av et kryostaten sett ved-20 ° c.
- Sett opp en blokk om gangen og bruk OCT medium for å fryse blokken på platen/Chuck med bunnen av blokken vendt mot bladet (figur 2a). Kontroller at blokken er helt frosset til platen (OCT-mediet blir hvitt) før snitting begynner (fig. 2b).
- Plasser cryosections på ladet glass lysbilder (figur 2C, D) og lufttørke lysbildene over natten ved romtemperatur.
3. Immunofluorescence for pH3
- Utfør tre 5 min vask av lysbildene i 1x PBS i en passende beholder, for eksempel en Coplin jar. Hvis vevet ikke er godt festet til raset, Utfør vasker ved å legge lysbilder på et flatt underlag og forsiktig pipettering 500 μL av 1x PBS på overflaten. Hell av 1x PBS mellom vask ved å vippe forsiktig på lysbildene.
- Omriss delene med en barriere penn eller voks blyant for å holde væsken på lysbildene (Figur 3).
- Legg lysbildene på et flatt underlag i et fuktig kammer og Pipetter 200 μL av blokk buffer per seksjon på lysbildene. Ruge i blokk buffer for 2 t ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° c.
- Klargjør den primære antistoff fortynning (kanin anti-pH3 antistoff, 1:200; se tabell over materialer) i blokk buffer og bland godt av pipettering. Tipp forsiktig lysbildene for å drenere blokk bufferen, gå tilbake til det fuktige kammeret og Pipetter 200 μL av primær antistoff løsning per seksjon på lysbildene. For den sekundære kontrollen, Pipetter 200 μL av blokk buffer på de aktuelle seksjonene.
- Ruge lysbildene ved 4 ° c over natten i et fuktig kammer fylt med deionisert vann. Forsegle kantene av fuktig kammer for å holde på fuktigheten.
- Utfør tre 5 min vask av lysbildene i 1x PBS i en passende beholder, for eksempel en Coplin jar. Under vask trinn, forberede sekundære antistoff fortynning (anti-kanin fluorescerende sekundære antistoff bøye, 1:2000; se tabell over materialer) i blokk buffer og bland godt av pipettering.
- Legg lysbildene på et flatt underlag i et fuktig kammer og Pipetter 200 μL av sekundær antistoff oppløsning per seksjon på lysbildene. Ruge lysbildene i sekundære antistoff oppløsning (er) ved romtemperatur, skjermet fra lys, i 30 min.
- Utfør tre 5 min vask av lysbildene i 1x PBS i en passende beholder, for eksempel en Coplin krukke, skjermet fra lys. Under vasketrinn, utarbeide en kjernefysisk farge løsning (se tabell over materialer).
- Plasser lysbildene på et flatt underlag og Pipetter 200 \ u2012500 μL (avhengig av størrelsen på prøven) på den kjernefysiske farge løsningen på hver seksjon. Ruge lysbildene i den kjernefysiske farge løsningen i 10 minutter, skjermet fra lys.
- Drain av kjernefysisk farging løsning og montere lysbildene med ikke-herding fluorescerende montering Media og et glass dekkglass. Oppretthold lysbildene i mørket ved 4 ° c til bildebehandling er utført.
Merk: De beste resultatene oppnås når lysbildene er avbildet på samme dag eller neste dag. - Følgende IF, visualisere og bilde lysbildene med en konfokalmikroskopi fluorescens mikroskop og digitalkamera med 555 NM (rød) og 645 NM (langt-rødt) utslipps filtre på 100 x forstørrelse (10x øye forstørrelse og 10x objektiv forstørrelse). Hold laser strømmen konsekvent gjennom bildebehandling.
- Etter bildebehandling plasserer du lysbildene i individuelle beholdere med 1x PBS og lagrer flatt ved 4 ° c over natten for å klargjøre for dekkglass fjerning. Når du plasserer lysbildene i 1x PBS, må du forsiktig agitere lysbildene for å hjelpe til med fjerningen av dekkglass.
Merk: Ikke trykk ned dekkglass eller forsøk å fjerne dekkglass manuelt, da dette kan kompromittere kvaliteten på seksjonene. Coverslips må fjernes horisontalt med minimal tvungen bevegelse.
4. immunhistokjemi for merket Dextran
- Etter at coverslips er fjernet, må du forsiktig overføre lysbildene til en ny 1x PBS i en passende beholder, for eksempel en Coplin-krukke. Fjern 1x PBS og utfør tre 5 min incubations av lysbildene i 1x Tris-bufret saltvann med 0,1% av et ikke-ioniske overflateaktivt middel (1x TBSt) ved romtemperatur.
- Forbered 250 mL 3% hydrogen peroxide (H2O2) fortynnet i deionisert vann i en passende størrelse container. Ruge lysbildene i 3% H2O2 -løsning ved romtemperatur i 15 minutter.
Merk: Hydrogenperoksid er etsende og må avhendes på riktig måte i henhold til institusjonelle forskrifter. Egnet personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) skal alltid brukes. - Skyll raskt lysbildene med deionisert vann. Utfør tre 5 min vasker av lysbildene i 1x TBSt. Tørk forsiktig området rundt vevs delene og plasser lysbildene flatt i et fuktig kammer. Omriss vevet seksjoner med en barriere penn eller voks blyant for å holde væske på seksjonene hvis nødvendig.
- Påfør en klar-til-bruk 2,5% serum blokkerings løsning som følger med et sekundært antistoff merkings sett (se tabellen materialer) dråpevis til hver seksjon. Ruge lysbildene i et fuktig kammer ved romtemperatur i 20 min.
- Forbered det primære antistoff fortynnet i antistoff fortynningsmiddel (kanin anti-merket dextran, 1:7500; se tabell over materialer) og bland med milde pipettering. Tipp forsiktig lysbildene for å drenere blokk bufferen, tørk området rundt delene og plasser lysbildene flatt i et fuktig kammer.
- Ikke vask før du påfører den primære antistoff løsningen. Pipetter 200 μL av primær antistoff løsning per seksjon på lysbildene og ruge i et fuktig kammer ved 4 ° c over natten. For den sekundære kontrollen, Pipetter 200 μL av antistoff fortynningsmiddel på de aktuelle seksjonene.
- Tipp forsiktig lysbildene for å drenere den primære antistoff løsningen og plasser i 1x TBSt i en passende beholder, for eksempel en Coplin krukke. Utfør to 5 min vasker av lysbildene i 1x TBSt. Tørk området rundt seksjonene og plasser flatt i et fuktig kammer.
- Påfør en ferdig-å-bruke background-reduserende blokkering reagens (se tabell av materialer) dråpevis til hver seksjon. Ruge lysbildene i et fuktig kammer ved romtemperatur i 20 min.
- Tipp forsiktig lysbildene for å drenere blokk bufferen, tørk forsiktig av området rundt delene og plasser lysbildene flatt i et fuktig kammer. Ikke vask før du påfører den sekundære antistoff oppløsningen.
- Påfør en klar til bruk sekundære antistoff løsning (anti-kanin pepperrot peroksidase (HRP) polymer sekundær antistoff; se tabell over materialer) til hver del dråpevis og ruge i et fuktig kammer ved romtemperatur i 30 min.
- Tipp forsiktig lysbildene for å drenere den sekundære antistoff oppløsningen og plasser i 1x TBSt i en passende beholder, for eksempel en Coplin krukke. Utfør to 5 min vasker av lysbildene i 1x TBSt.
- Klargjør HRP kromogen substrat rett før bruk i henhold til produsentens protokoll (se tabell over materialer).
- Tørk området rundt seksjonene, plasser lysbildene på en flat overflate, og påfør 200 μL av HRP kromogen substrat i hver seksjon. Ruge ved romtemperatur i 3 minutter, starter en tidtaker når underlaget er påført det første lysbildet (Figur 4).
- Drain av underlaget løsningen og skyll lysbildene kort i en Coplin krukke som inneholder 1x PBS. Plasser lysbildene i deionisert vann i en passende beholder, for eksempel en Coplin krukke, og utføre to 5 min vasker i deionisert vann med milde agitasjon.
- Counterstain lysbildene ved å plassere dem i hematoksylin farge løsning i opptil 30 s.
Merk: Hematoksylin er giftig og må avhendes i henhold til institusjonelle forskrifter. Egnet personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) skal alltid brukes. - Plasser lysbildene i deionisert vann i en passende beholder, for eksempel en Coplin krukke, og utfør tre 5 min vasker i deionisert vann. Overfør lysbildene til en beholder som inneholder Scotts vann fra springen (se tabell over materialer) og ruge i 1 min.
- Plasser lysbildene i deionisert vann i en passende beholder, for eksempel en Coplin krukke, og utfør tre 5 min vasker i deionisert vann.
- Tørke lysbildene gjennom en serie etanol (EtOH) karakterer (fortynnet i deionisert vann) og xylen i en kjemisk hette. Utfør en 2 min inkubasjons i 70% EtOH, to 1 min incubations i 95% EtOH, to 1 min incubations i 100% EtOH, og tre 1 min incubations i xylen. Fjern lysbildene fra xylen og Legg en dekkglass mens den er våt med et toluen festemiddel i en kjemisk hette.
Merk: Xylen og toluen er giftige og brannfarlige og må avhendes på riktig måte i henhold til institusjonelle forskrifter. Arbeid med xylen og toluen bør utføres i en kjemisk hette, og egnet personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk, og vernebriller) bør alltid brukes. - Etter IHC, visualisere og bilde lysbildene med en sammensatt lys mikroskop og digitalkamera på 100 x forstørrelse (10x øye forstørrelse og 10x objektiv forstørrelse). (Figur 5).
Representative Results
Vi utviklet denne protokollen for å identifisere og analysere protein uttrykk i individuelle donor celler i 48 h post-befruktning chimeric sebrafisk embryo som ble generert av Blastulastadiet-til-Blastulastadiet transplantasjon mellom AB vill-type sebrafisk embryo. Vellykket analyse av protein uttrykk på ett cellenivå kreves utarbeidelse av cryosections med hensiktsmessig orientert embryo (figur 1 og figur 2) og forsiktig, sekvensiell anvendelse av IF og IHC teknikker til disse cryosections (Figur 3 og Figur 4). Bruk av spesifikke antistoffer for å samtidig oppdage voksende celler (anti-pH3, figur 5a, B) og giver celler (anti-merket dextran, figur 5D) kan brukes til å identifisere og kvantifisere donor celler som er aktivt voksende ( Figur 5e). Det er viktig å generere bilder av høy kvalitet etter både IF (figur 2a, B) og IHC (figur 2D) for å nøyaktig identifisere enkeltceller. Et bildeanalyse program bør brukes til å utføre bildeoverlegg (figur 5e). Avhengig av bildet analyseprogrammet som brukes, kan det være mulig å utføre automatiserte tellinger av merket celler bør kvantifisering være ønsket.
Figur 1: Utarbeidelse av FROSNE Oct blokker. (A) 50x mikroskopisk syn på EMBRYO i Oct i en kryogene mold forberedt for frysing. Rød pil indikerer leder av sebrafisk embryo posisjon mot den nederste overflaten av mold; svart pil viser at halen peker opp mot brukeren. (B) plast muggsopp med EMBRYO og Oct plassert på kjølt metall plattform. (C) skum is bøtte plassert over plast former for å skape frysekammeret. (D) Oct svinger hvitt fra gjennomsiktig når blokken er helt frosset. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kryosnitt av FROSNE Oct blokker. (A), anvendelse av ferske Oct på kryostaten plate og plassering av frossen blokk på Oct, rotert 180 ° fra frysing orientering av blokken. (B) side visning av blokk frosset til skjæreplate. (C) visning av skjære blokk med rulle plate i posisjon. (D) henting av seksjoner ved hjelp av et ladet lysbilde fra metall plattformen til kryostaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Visning av klargjorte inndelinger etter plassering på et lysbilde. Arrow indikerer hydrofobe barriere, og stiplede linjen delineates sonen som inneholder seksjoner innenfor barriere omkrets. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: forberedelse til kromogen av underlaget under IHC. Raset er plassert på et flatt underlag dekket med plastfolie for å tillate ensartet anvendelse av kromogen substrat samtidig som det inneholder søl av farlig materiale. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Representant IF og IHC merking av cryosectioned 48 hpf chimeric sebrafisk embryo generert av Blastulastadiet-til-Blastulastadiet transplantasjon mellom AB vill-type sebrafisk embryo. (A) hvis å oppdage ser 10 fosforylert histone H3 (anti-pH3, 1:200) uttrykk i 48 hpf chimeric sebrafisk embryo. Rød = pH3-positive celler; blå = kjerner. Gule piler viser eksempler på positive celler. (B) subtraksjon av den blå kjernefysiske flekken i det digitale bildet (ImageJ programvare) forbedrer visualisering av pH3-positive celler for kvantifisering og bildeoverlegg. (C) negativ kontroll (kun sekundært antistoff) for If-analysen i cryosectioned 48 hpf chimeric sebrafisk embryo. Scale bar representerer 50 μm (gjelder for alle paneler). (D) IHC å oppdage merket dextran (anti-merket dextran, 1:7500) i chimeric 48 hpf sebrafisk embryo generert av Blastulastadiet-til-Blastulastadiet TRANSPLANTASJON mellom AB vill-type sebrafisk embryo. Donor embryo ble injisert med en fluorescensmerkete merket dextran bøye på en celle scenen før bruk for Blastulastadiet-til-Blastulastadiet transplantasjon. Rød indikerer celler merket med en dextran bøy; blå indikerer kjerner. Gule piler viser eksempler på positive celler. (E) overlapping av panel B (if for pH3) og panel C (IHC for merket dextran) som viser Colocalization av pH3 uttrykk og dextran merking i individuelle celler. Gule piler viser eksempler på doble positive celler. (F) negativ kontroll (kun sekundært antistoff) for IHC analysen i cryosectioned 48 hpf chimeric sebrafisk embryo. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi har presentert en ny metode for kombinerte immunofluorescence og immunhistokjemi som representerer et viktig skritt framover i å utføre colocalization eksperimenter på cryosectioned sebrafisk embryo. Det er en kritisk mangel på eksisterende colocalization protokoller som er optimalisert for bruk med små embryo og cryosectioned materiale17,18, som begge er ellers ofte brukt i molekylær studier14. Eksisterende colocalization protokoller fokuserer hovedsakelig på samtidig visualisering av to fluorophores17,18. Selv om disse protokollene kan fungere godt, er nytten begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer som (i) kan brukes i sebrafisk og (II) er kompatible med IF.
Vi føler at bruk av kryosnitt for sebrafisk embryo gir en betydelig fordel i forhold til bevarte vev morfologi. Som IHC er mer vanlig utført på parafin seksjoner enn cryosections, er videre utforskning av cryosection-baserte IHC metoder for påvisning av protein uttrykk berettiget. Bruk av hele Mount hvis er en vanlig metode for å visualisere uttrykks nivåer i sebrafisk embryo, og er mer vanlig beskrevet i litteraturen enn om bruk av cryosections1,2,3,4, 19i denne. Men hele Mount protokoller har begrensninger, inkludert mangel på nøyaktig lokalisering av proteiner uttrykt i dype vev og potensialet for overflatenivå uttrykk for å skjule protein uttrykk i dypere vev. Vi har konsekvent observert utmerket vedlikehold av cellulær morfologi etter kryonisk bevaring, snitting, og sekvensiell IF og IHC. For programmer som krever presis lokalisering av protein uttrykk på enkelt cellenivå, er det en betydelig fordel for Seksjons BAS ert prosedyrer som vi har beskrevet i denne protokollen. Resin embedding gir et alternativt alternativ for å utføre IF eller IHC analyser på seksjoner fra tidlig stadium sebrafisk embryo20. Resin seksjoner gir overlegen bevaring av vev morfologi i forhold til cryosections, og relativt tynnere vev seksjoner kan være forberedt. Men produsentene generelt ikke anbefaler bruk av harpiks seksjoner for Immuno analyser, som noen komponenter av harpiks ikke kan fjernes fra seksjonene og kan maskere antistoff bindende nettsteder21.
Mens hele protokollen er avgjørende for nøyaktig og vellykket analyse av uttrykks mønstre, noen konkrete skritt er avgjørende for eksperimentell suksess. Det første kritiske trinnet er håndteringen av embryo under innebygging i oktober13,14. Det kan være utfordrende å orientere hvert embryo i samme tverrgående planet slik at seksjonene er kuttet fra omtrent samme område for alle embryo. Vi har funnet at bruk av små gauge nåler for å utføre små, bevisste bevegelser gjennom tyktflytende OCT medium for embryo orientering er overlegen til å bruke tang, som er for store og fortrenge for mye OCT medium. Et annet kritisk trinn oppstår under snitting av frosne blokker, da det kan være vanskelig å få tak i høy kvalitet seksjoner som inneholder ønsket vev (r) uten betydelig opplæring og erfaring. Vi anbefaler derfor bruk av testprøver til teknikken er mestret. Et tredje kritisk trinn er dekkglass fjerning, som har potensial til å forstyrre eller fjerne vevsprøver. Vi har funnet at en kombinasjon av skånsom agitasjon for å løsne dekkglass og langsom fjerning av raset fra PBS beholderen er den mest effektive tilnærmingen for å fjerne coverslips. En mild og stødig hånd er best; Forskerne kan oppleve at noen prøving og feiling er nødvendig for å lære å fjerne coverslips effektivt.
Ytterligere viktige trinn i protokollen inkluderer antistoff optimalisering (primære og sekundære antistoffer for både IF og IHC analyser) og eksponering av lysbilder til kromogen substrat og counterstain. Grundige undersøkelser om primære antistoff spesifisitet og mål konsentrasjon er avgjørende; Generelt er det best å samle inn tilstrekkelige ikke-dyrebare prøver for minst to separate eksperimenter for IF og IHC som skal utføres for å optimalisere primære antistoff konsentrasjoner før du starter IF/IHC kombinasjon. Å inkludere en kjent positiv og negativ kontroll for hvert primære antistoff er essensielt i hvert eksperiment for å sikre at både IF-og IHC-analysene fungerer riktig. Justeringer av sekundær antistoff konsentrasjon kan også være nødvendig. Optimalisering av eksponering av vevs deler til kromogen substrat og counterstain for IHC-analysen er nødvendig, siden produsentens retningslinjer ofte beskriver et bredt spekter av mulige eksponeringstider. Ikke alle kromogener kan være kompatible med counterstains og endogene vev pigmentering, som krever nøye planlegging med hensyn til kromogen utvalg.
Det er mange potensielle endringer som kan anvendes på protokollen som er beskrevet, og vi har utført denne protokollen med andre kombinasjoner av antistoffer som ikke kunne begge brukes for IF. Som antydet ovenfor, kromogen stoffer har distinkte kompatibilitet med bestemte counterstains. Vi har funnet ut at disse komponentene er lett å modifisere i protokollen. I tillegg er parametrene for antistoff inkubasjons ganske fleksible, og kan økes eller reduseres avhengig av ønsket farge intensitet. Prosessen for innebygging kan også endres. Mens vi har fokusert på tverrgående seksjoner, kan embryo lett bli orientert i alle retninger for å ta opp bestemte vev av interesse. Til slutt er det flere mulige pause punkter i denne protokollen. Dehydrert embryo kan lagres i 100% MeOH ved-20 ° c for et par måneder; frosne blokker kan oppbevares ved-80 ° c i opptil tre måneder; og preparerte lysbilder kan lagres ved-80 ° c i opptil ni måneder i en lysbilde boks.
På grunn av den relative kompleksiteten av denne kombinerte IF/IHC-protokollen, finnes det flere mulige kilder til variasjon eller feil som kan kreve feilsøking, alt fra vevs kvalitet til forsker opplevelse for å prøvehåndtering. De fleste av de kritiske trinnene som er beskrevet ovenfor, anses som kritiske fordi de enten krever optimalisering på det individuelle bruker nivået, eller de krever spesiell fingerferdighet, ferdighet og erfaring. Vi har imidlertid funnet at spesifikk bakgrunn farging og lav signal intensitet er de viktigste problemene som krever optimalisering. Som med enhver IF-eller IHC-protokoll, kan det å ta opp disse problemene være tidkrevende og arbeidsintensiv, og kan bli forsterket med denne metoden siden de to teknikkene kombineres. Av denne grunn anbefaler vi på det sterkeste å optimalisere IF og IHC separat før du fortsetter med den kombinerte protokollen.
Selv om vi spår at denne metoden vil være nyttig for et bredt spekter av eksperimenter, er det potensielle begrensninger. Vellykket utførelse av denne prosedyren er avhengig av å opprettholde intakt vevsprøver gjennom to sekvensielle eksperimenter som inkluderer en rekke vasketrinn. Av denne grunn vil eventuelle problemer som oppstår under snitting eller vevs håndtering, inkludert bruk av eldre lysbilder som kan ha dårligere kvalitet, i betydelig grad begrense forskerne evne til å utføre denne protokollen vellykket. Selv om lysbildene kan lagres ved-80 ° c i opptil ni måneder, reduseres vevs overholdelse over tid, og vi hadde den beste suksessen med lysbilder som brukes innen en måned med forberedelser eller ideelt, neste dag. En annen begrensning er den lille fotavtrykk av sebrafisk embryo. Selv om vi har funnet dette eksperimentet til å være nyttig for å visualisere proteiner som er relativt rikelig uttrykt i tidlig stadium embryo, kan proteiner som uttrykkes inkonsekvent eller ved lave nivåer være svært vanskelig å fange i en seksjon. Til slutt, siden protokollen bruker 10 \ u201212 μm cryosections, er det best egnet for evaluering av protein uttrykk i større strukturer, for eksempel kjerner, snarere enn mindre sub-cellulære komponenter.
Oppsummert vil vår kombinerte IF/IHC-protokoll være en fordel for en rekke studier i tidlig stadium sebrafisk embryo, og representerer en viktig innovasjon i presise protein uttrykk analyse i slike eksemplarer. Vår metode, vist med suksess i figur 5, vil tillate forskere å bevare den delikate morfologi av tidlig stadium sebrafisk embryo i cryosections mens du arbeider med noe begrenset utvalg av tiden tilgjengelig primære antistoffer som er godkjent for bruk i IF eller IHC i denne arten. Denne protokollen vil trolig være nyttig for studier i andre fiske-og amfibier arter (f. eks Medaka og Xenopus spp.), som er hemmet av lignende begrensninger for antistoff tilgjengelighet, og kan være aktuelt for tradisjonelle pattedyr modeller som Godt.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant 5K01OD021419-02 og NC State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from: http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf (2013).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. Guille, M. , 127th ed, Humana Press. New York. 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , Bios Scientific Publishers. New York. (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition. , University of Oregon Press. Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Spector and Goldman, editors (2006).
- Torres, E. The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B.
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
- JB-4 Embedding Kit. [Internet]. Polysciences, Inc. , Available from: http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/ (2018).
