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Immunology and Infection

मानव कोलोनॉइड Monolayers रोगजनकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, Commensals, और मेजबान आंत्र उपकला

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59357
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Department of Internal Medicine, University of New Mexico Health Science Center, 2Department of Medicine, Division of Gastroenterology & Hepatology, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम संस्कृति मानव एंटॉइड या कोलोनॉइड monolayers कि अक्षुण्ण समारोह के लिए सेलुलर और जैव रासायनिक स्तर पर मेजबान उपकला माइक्रोबायोटा बातचीत का अध्ययन बरकरार है एक प्रोटोकॉल मौजूद है ।

Abstract

मानव 3 आयामी (3 डी) एंटेरॉइड या कोलोनॉइड तहखाना आधार स्टेम सेल से व्युत्पंन संस्कृतियों वर्तमान में आंतों उपकला के सबसे उंनत पूर्व vivo मॉडल हैं । उनके बंद संरचनाओं और महत्वपूर्ण extracellular मैट्रिक्स का समर्थन करने के कारण, 3 डी संस्कृतियों मेजबान रोगज़नक़ अध्ययन के लिए आदर्श नहीं हैं । आंत्रशोथ या कोलोनोइड पारगम्य ऊतक संस्कृति झिल्ली पर उपकला monolayers के रूप में उगाया जा सकता है दोनों luminal और basolateral सेल सतहों और साथ तरल पदार्थ के हेरफेर की अनुमति । यह बढ़ाया luminal सतह पहुंच के लिए कालोनी उपकला पर enteroरक्तस्रावी ई. कोलाई (ehec) की बलगम अपमानजनक क्षमता जैसे बैक्टीरियल-होस्ट उपकला बातचीत मॉडलिंग की सुविधा । कन्फ्लुएंसी और भेदभाव की दिशा में प्रगति की निगरानी करने के लिए 3 डी कल्चर विखंडन, मोनोलेयर सीडिंग, और ट्रांसपीथेलियल इलेक्ट्रिकल प्रतिरोध (TER) मापन के लिए एक विधि बताई गई है । कोलोनॉइड मोनोलेयर विभेद की पैदावार बलगम स्रावित करता है जिसे इमयूनोफ्लुएसेंस या इमॉनोफ्लोटिंग तकनीकों द्वारा अध्ययन किया जा सकता है । अधिक आम तौर पर, एंटीरॉइड या कोलोनॉइड monolayers एक भौतिक-प्रासंगिक मंच सक्षम करने के लिए विशिष्ट कोशिका आबादी है कि रोगजनक या सहभोजी माइक्रोबायोटा द्वारा लक्षित किया जा सकता है मूल्यांकन ।

Introduction

आंत्र ऑर्गेनाइड्स, enteroids, और colonoids स्टेम सेल व्यवहार को समझने में कई अग्रिमों के लिए नेतृत्व किया है, आंत्र विकास, बाधा/परिवहन समारोह, और सेलुलर भेदभाव. 1 तथापि, 3 डी संस्कृति मेजबान उपकला-रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन को सीमित करता है क्योंकि लुमेन बैक्टीरिया या विउलेंस कारकों के लिए सीधे सुलभ नहीं है जब तक बंद संरचनाओं microinjection के अधीन हैं । 2 , 3 इसके अलावा, छोटे अणुओं, प्रोटीन, या बलगम के रूप में स्रावित सामग्री आसानी से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए 3 डी संस्कृति से जांचा नहीं जा सकता । उपकला बैरियर समारोह4 और आयन परिवहन5 पर रोगजनक एजेंटों के प्रभाव फ्लोरोसेंट रंजक और समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर 3 डी संस्कृति में मूल्यांकन किया गया है, लेकिन monolayers पारगम्य ऊतक संस्कृति का समर्थन करने के लिए उत्तरदायी हैं अतिरिक्त तकनीकों जैसे कि TER माप और Ussing कक्ष/वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग । 6 , 7

कई प्रकाशनों का वर्णन किया है प्रोटोकॉल के लिए 2 डी या monolayer संस्कृति के enteroids/ उपकला कोशिका लगाव को बढ़ावा देने के लिए पाया सामग्री कोलेजन hydrogels,8,9 ०.१% जिलेटिन,10 पतली परत म्यूरिन सार्कोमा-व्युत्पन्न तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (bmm),11,12, शामिल 13 और मानव कोलेजन चतुर्थ । 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 सीडिंग दृष्टिकोण, trypsin,10,11 का उपयोग कर सेल आसंजन कारकों के6,14,15 और/ dispase,13 या edta । 9 कुछ प्रोटोकॉलों में बीज बोने के लिए अभेद्य ऊतक संवर्धन प्लास्टिवेयर का उपयोग होता है, लेकिन यह बासोलेटरल अभिगम को प्रतिबंधित करता है, इसलिए अधिकांश अनुप्रयोग पारगम्य ऊतक संस्कृति आवेषण पर निर्भर करते हैं । स्थिर संगामी monolayer गठन और रखरखाव के प्रलेखन प्रकाशनों के बीच व्यापक रूप से बदलता है । इसके अतिरिक्त, मानव संस्कृतियों के लिए विकास और भेदभाव मीडिया रचनाओं विभिंन समूहों के बीच अलग है और अधिक शोधकर्ताओं को अपनाने और उनके आवेदन और उपलब्ध संसाधनों के अनुरूप पद्धति को समायोजित के रूप में विकसित करने के लिए जारी है ।

मेजबान में 3 डी आंत्र उपकला संस्कृति की सीमाओं का पता-रोगज़नक़ इंटरेक्शन अध्ययन, हम एक monolayer करने के लिए 3 डी मानव enteroids या colonoids परिवर्तित करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल मौजूद । एक तहखाना की तरह अपरिपक्व राज्य में कन्फ्लुएंसी को प्राप्त करने के बाद, विकास कारकों की वापसी WNT3A, RSPO1 और inhibitors ए-83-01 और SB २०२१९० छोटे आंत्र विलस या सतह कालोनी उपकला का भेदभाव प्रतिनिधि की ओर जाता है । हम आदर्श मैट्रिक्स का वर्णन, मानव कोलेजन प्रकार चतुर्थ, आवेषण कोट और चढ़ाना के लिए एक समान एंटॉइड या colonoid टुकड़े प्राप्त करते हैं । हम प्रदर्शित करते है कि इस प्रोटोकॉल एक उच्च स्तर के साथ एक संगामी monolayer पैदा करता है । कोलोनॉइड monolayers एक मोटी शीर्ष बलगम परत स्रावी, रोगज़नक़ के पूर्व vivo अध्ययन के लिए अनुमति-immunoblotting या immunoblotting के माध्यम से बलगम बातचीत. Immunostaining के लिए कालोनी बलगम परत को संरक्षित करने के लिए एक संशोधित निर्धारण प्रक्रिया भी वर्णित है. इस विधि के लिए एक सुविधाजनक मॉडल प्रदान करने के लिए जल्द ही आंत्र मेजबान के संक्रमण पर रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करना है ।

Protocol

यह प्रोटोकॉल पहले लेखकों द्वारा प्रकाशित अध्ययनों पर आधारित है । 6 , 7 , 14 , 15 , 16 उचित असेप्टिक तकनीकों का प्रयोग करते हुए जैव सुरक्षा मंत्रिमंडल में निम्नलिखित उपाय किए जाने चाहिए । मानव नमूनों को शामिल सभी तरीकों जॉन्स हॉपकिंस यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (IRB NA_00038329) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. कोट कोशिका संस्कृति extracellular मैट्रिक्स के साथ आवेषण

  1. १०० मिमी एसिटिक एसिड में स्टॉक कोलेजन चतुर्थ समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) की 5 मिलीलीटर तैयार करें । चलो लगभग 4 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर खड़े करने के लिए पूरी तरह से हाइड्रेट/
  2. 4 डिग्री सेल्सियस (≤ 1 महीना) या-20 डिग्री सेल्सियस (> 1 महीने) में कोलेजन चतुर्थ स्टॉक समाधान और स्टोर Aliquot ।
  3. कोटिंग करने से पहले तुरंत, ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी में कोलेजन चतुर्थ स्टॉक समाधान ३४ μg/मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पतला । 24 के लिए अच्छी तरह से थाली सेल संस्कृति आवेषण, कोट समाधान के १०० μL के साथ प्रत्येक डालने, जो 10 μg/
  4. एक मानक सह2 ऊतक संस्कृति इनपर में थाली ≥ 2 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, या सुविधा के लिए सेते, पैराफिन फिल्म के साथ प्लेट किनारों मुहर और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में सेते या 1 सप्ताह तक ।

2.3 डी संस्कृति से एंविलॉइड/

नोट: enteroids या colonoids दाता बायोप्सी से स्थापित कर रहे है और मानक प्रोटोकॉल पहले वर्णित के अनुसार 3 डी संस्कृति में बनाए रखा । 14 , 18 संक्षेप में, भभक आंत्र बायोप्सी या केलेशन और यांत्रिक आंदोलन के माध्यम से resections से काटा जाता है । भभक धो रहे हैं, काटा, और BMM में चढ़ाया । विस्तार मीडिया (चरण ४.२ में वर्णित) संस्कृति में जोड़ा और हर 2 दिन बदल दिया है । 3 डी संस्कृति गठन चढ़ाना के बाद घंटे के भीतर दिखाई दे रहा है ।

  1. 24-well थाली से संस्कृति मध्यम महाप्राण और 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड संचयन समाधान के साथ बदलें ( सामग्री की मेजदेखें) प्रति अच्छी तरह से ।
  2. एक मिनी सेल खुर का उपयोग करने के लिए हटाना और तोड़ने के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गोली, अच्छी तरह से किनारों के पास किसी भी सामग्री के लिए विशेष रूप से ध्यान दे ।
  3. लगभग २०० rpm, 30-45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर पर थाली आंदोलन ।

3. असंबद्ध 3D एंड्लॉइड/

  1. सेल निलंबन के लिए एक P200 सिंगल चैनल पिपेट या बाँझ फिल्टर सुझावों के साथ फिट एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करें ।
  2. एक 15 मिलीलीटर शंकु की शीशी में सेल निलंबन (ओं) पूल । कुल निलंबन मात्रा 6 मिलीलीटर > है, तो एकाधिक विल्स का प्रयोग करें ।
  3. एक समान मात्रा में उन्नत DMEM/F12 मध्यम जिसमें 10 मिमी HEPES, L-alanyl-L-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड (1x), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x) (wash मध्यम) शामिल हैं । ट्यूब 3-4 बार मिश्रण करने के लिए उलटा । ३०० एक्स जी, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज ।
    1. वैकल्पिक रूप से, धोने के माध्यम महाप्राण और ०.५ मिलीलीटर/अच्छी तरह ट्रिप् सिन के साथ की जगह ( सामग्री की मेजदेखें) । एक P200 pipette, टोपी ट्यूब और एक ३७ ° c पानी स्नान में लगभग 2 मिनट के लिए जगह के साथ Resuspend कॉलोनाइड्स । तुरंत ट्यूब निकालें, 10 मिलीलीटर की एक अंतिम खंड के लिए धोने के माध्यम जोड़ें, और चरण में ३.३ के रूप में केंद्रापसारक दोहराएँ ।
      नोट: यह कदम अगर एक समान आकार टुकड़ों में परिणाम नहीं है, तो बेहतर हो सकता है ।

4. एंटॉरॉइड चढ़ाना/

  1. यदि लेपित आवेषण 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया, एक ३७ डिग्री सेल्सियस/5% सह2 ऊतक संस्कृति इनयूबेटर में कम से 30 मिनट के लिए सेल चढ़ाना से पहले equilibrate ।
  2. प्रत्येक डालने के लिए चढ़ाया जा करने के लिए, 1 मिलीलीटर गर्म (25-37 डिग्री सेल्सियस के बीच) विस्तार मध्यम (EM) तैयार है और 10 μM Y-२७६३२ और 10 μM चियर ९९०२१ जोड़ें ।
    नोट: EM उन्नत DMEM/F12 युक्त है B27 (1x), ५०% WNT3A वातानुकूलित माध्यम, 15% RSPO1 वातानुकूलित मध्यम, 10% Noggin वातानुकूलित मध्यम, ५० एनजी/एमएल मानव EGF, ५०० एनएम A-83-01, 10 μM SB २०२१९०, एंटीबायोटिक/एंटीमाइक्रोकोटिक कॉकटेल (1x), 10 मिमी HEPES, L-alanyl-L-glutamine डिपेप्टाइड (1x), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x) ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  3. इस ट्यूब से धोने के माध्यम महाप्राण सेल गोली और उंहें पर्याप्त उपज के लिए एक मात्रा में resuspend से कम १०० μL/
  4. महाप्राण प्रत्येक डालने से कोलेजन चतुर्थ समाधान और डालने के प्रति धोने के माध्यम के १५० μL के साथ दो बार धो लें ।
  5. पीपेट प्रत्येक डालने के नीचे अंतरिक्ष में EM के ६०० μL ।
  6. प्रत्येक सम्मिलित में सेल निलंबन के Pipet १०० μL.
  7. टिशू कल्चर इनयूबेटर को प्लेट लौटाएं और बिना किसी बाधा के कम से 12 एच के लिए छोड़ दें ।
    नोट: सम्मिलित झिल्ली पर कोलोनॉइड टुकड़ों के असमान वितरण को रोकने के लिए थाली झुकाव या मिलाते हुए तेजी से बचें.
  8. मॉनिटर सेल लगाव और एक चरण पर थाली रखकर एक संगामी monolayer फार्म के लिए प्रसार-विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोप एक 2.5 x-10x उद्देश्य लेंस के तहत ।
  9. 1-2 दिनों के बाद, सबसे टुकड़े कोलेजन मैट्रिक्स का पालन करना चाहिए । संस्कृति मध्यम ताज़ा करें और वाई के साथ इलाज बंद २७६३२ और चिर ९९०२१ । संगामी तक हर 2-3 दिन मध्यम ताज़ा करने के लिए जारी रखें । कन्फ्लुएंसी आम तौर पर 7-10 दिनों में पहुंच गया है ।

5. ट्रान्सपीथेलीयल विद्युत प्रतिरोध का उपाय

  1. इलेक्ट्रोड सुराग और शक्ति उपकला voltohmmeter पर (EVOM) देते हैं. सत्यापित करें कि माप फ़ंक्शन ohms करने के लिए सेट किया गया है ।
  2. डिप इलेक्ट्रोड टिप्स संक्षेप में ७०% इथेनॉल में और एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ सूखी पोंछ । लगभग 5 मिनट के लिए धोने के माध्यम के 5 मिलीलीटर में इलेक्ट्रोड Equilibrate ।
  3. डालने के माध्यम में छोटे इलेक्ट्रोड टिप विसर्जित और निचली अच्छी तरह से थाली में अब इलेक्ट्रोड टिप ओरिएंट. एक पूर्ण ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में इलेक्ट्रोड बनाए रखने तक EVOM पढ़ने अपेक्षाकृत स्थिर है, या के लिए ६० एस से अधिक नहीं है.
    नोट: यदि इलेक्ट्रोड विधानसभा ऊर्ध्वाधर से दूर झुका हुआ है, या टिप ऊंचाई अनुचित तरीके से समायोजित किया जाता है, छोटे टिप के साथ संपर्क में आ सकता है और कोशिका monolayer बाधित.
  4. एक सेल से प्राप्त मूल्य के लिए इवोम माप की तुलना करें मुक्त संस्कृति माध्यम में जलमग्न डालने कन्फ्लुएंसी या भेदभाव की ओर प्रगति का मूल्यांकन ।

6. संगामी enteroid/कोलोनॉइड मोनोलयेर्स का विभेदन

  1. विभेदन माध्यम (DM) के लिए एक्सचेंज EM, और दिन 5 तक हर दो दिन मीडिया को ताज़ा करने के लिए जारी है । डीएम उंहें WNT3A, RSPO1, A-83-01, और SB २०२१९० का अभाव है ।
  2. करने के लिए सत्यापित करें कि भेदभाव के रूप में अपेक्षित आगे बढ़ रहा है TER की निगरानी करने के लिए जारी रखें । TER के लिए भिंनता के दिनों 1-5 के दौरान वृद्धि जारी रहेगी । Monolayers को बढ़ाने के लिए जारी रख सकते है और 5-6 दिन से परे व्यवहार्यता बनाए रखने लेकिन अधिक से अधिक और सबसे reproducible परिणाम प्रदर्शन जब 5-6 दिन में इस्तेमाल किया ।

7. कोमेन्सल या रोगजनक ई. कोलाई के साथ जीवाणु संक्रमण

  1. संक्रमण को बाहर ले जाने से पहले एक दिन, धोने और एंटीबायोटिक मुक्त EM या डीएम के साथ monolayers फ़ीड ।
  2. एक माइक्रोबायोलॉजी पाश का उपयोग करने के लिए धीरे से एक जमे हुए जीवाणु ग्लिसरॉल स्टॉक की सतह परिमार्जन और पौंड शोरबाट के 2 मिलीलीटर inocक्युलेट । 12-16 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मानक मिलाते हुए मशीन के लिए ट्यूब हस्तांतरण ।
  3. स्टार्टर कल्चर के ५० μL को 5 मिलि फ्रेश पौंड शोरब (1:100) में पतला करें और ९० मिनट के लिए मिलाते हुए ऊष्मायन जारी रखें । यह 105-106 कॉलोनी बनाने इकाइयों (cfu)/mlके घनत्व के साथ एक लॉग चरण संस्कृति उपज जाएगा ।
    1. वैकल्पिक रूप से, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में ६०० एनएम (OD600) पर ऑप्टिकल घनत्व माप द्वारा बैक्टीरियल एकाग्रता की पुष्टि करें ।
  4. 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर बैक्टीरियल संस्कृति नीचे स्पिन, supernatant हटाने, और एंटीबायोटिक में resuspend बैक्टीरिया मुक्त EM या डीएम 107 cfu/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ।
  5. डालने के लिए बैक्टीरियल निलंबन के 10 μL जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 106 cfu/एमएल) । पिपेट धीरे मिश्रण करने के लिए और extracellular बलगम परत परेशान से बचें ।
  6. वांछित संक्रमण अवधि के लिए एक ऊतक संस्कृति इनयूबेटर के लिए थाली लौटें ।

8. संरक्षण और immunostain बलगम के लिए निर्धारण

  1. 24-well थाली से सेल संस्कृति आवेषण लिफ्ट, एक प्रयोगशाला ऊतक कागज पर ध्यान से उलटा करने के लिए शीर्ष माध्यम को हटाने, और दूर डालने के लिए बाहरी तरल पकड़ पोंछ ।
  2. एक नया 24 में अच्छी तरह से थाली, पूर्ण इथेनॉल में ग्लेशियल एसिटिक एसिड की एक 1:3 समाधान में डालने विसर्जित (क्लार्क समाधान) कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ।
  3. सम्मिलित करने के लिए लगानेवाला हटाने और 10 मिनट के लिए 1x pbs में कोशिकाओं rehydrate. मानक immunostaining प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें.
  4. सम्मिलित झिल्ली की परिधि के चारों ओर काटने के लिए एक रेवर ब्लेड का प्रयोग करें । एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड को संदंश का उपयोग कर और बढ़ते माध्यम के साथ एक कवरग्लास को जोड़ना ।

9. इम्युनोलॉटिंग के लिए सेल लिसेट्स की तैयारी

नोट: बर्फ पर या ठंडे कमरे में निम्न चरणों का पालन करें ।

  1. महाप्राण मध्यम और धोने डालने PBS के साथ एक बार ।
  2. जोड़ें १५० μL lysis बफर से युक्त protease अवरोधकों (सामग्री की मेज देखें) डालने के लिए और चलो खड़े 5-10 min. Lysis बफर शामिल ५० मिमी Tris पीएच 8, १५० मिमी NaCl, 1% IGEPAL सीए-६३०, ०.५% सोडियम डिऑक्सीकोलेट, ०.१% एसडीएस, 1:100 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल.
  3. डालने से कोशिकाओं को हटाने के लिए एक मिनी सेल स्क्रैपर का प्रयोग करें, तो एक P200 पिपेट का उपयोग करने के लिए संक्षेप में निलंबन और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण trत्रात ।
  4. एक microtip जांच का उपयोग कर 20% आयाम पर 5 x 1 एस दालों के साथ निलंबन Sonicate ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  5. जोड़ें SDS-पृष्ठ लोड हो रहा है बफर अगर तुरंत electrophoresis, या aliquot प्रदर्शन और स्टोर lysates-20 डिग्री सेल्सियस पर ।

Representative Results

मानव एंड्रॉइड और कोलोनॉइड संस्कृतियों 3 डी संरचनाओं के रूप में बड़े हो रहे हैं, तो वियोजित और खंडित मानव कोलेजन चतुर्थ लेपित सेल संस्कृति आवेषण पर चढ़ाना के लिए । Monolayer गठन की प्रगति आसानी से उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एक दैनिक आधार पर नजर रखी है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (चित्रा 1), और transepithelial विद्युत प्रतिरोध (TER) में एक स्थिर वृद्धि द्वारा (चित्रा 2), जो दर्शाता है जेनों के लिए तंग जंक्शनों की पारगम्यता और monolayer कन्फ्लुएंसी के साथ संबद्ध । एक खाली 24-well डालने का तेर लगभग 50-100 Ω · सेमी2, और कन्फ्लुएंसी तक पहुंचने पर लगभग 400-500 ω · सेमी2है । संगामी monolayers में सभी उपकला कोशिकाओं को कोशिका परिधि में एफ actin अंगूठी द्वारा पता लगाया जंक्शन परिसरों से जुड़े रहे हैं (चित्रा 1). पूर्ण विकास कारक मीडिया में monolayers के प्रफलन crypt की तरह उपकला का प्रतिनिधित्व मुख्य रूप से सक्रिय रूप से कोशिकाओं है कि न्यूक्लिओसाइड एनालॉग EdU (चित्रा 2) को शामिल विभाजन की रचना की । विकास कारकों की वापसी WNT3A और RSPO1 भेदभाव को बढ़ावा देता है, villus के लिए अग्रणी-संस्कृतियों की तरह है कि कोशिकाओं की कमी proliferating । विभेदित monolayers शामिल enterocytes (एंटरोइड) या colonocytes (कोलोनोइड) और विकसित विशेष आंत्र उपकला कोशिकाओं के रूप में 3 डी संस्कृतियों में दिखाया गया है,18 जाम और enteroendocrine कोशिकाओं सहित. 15 विभेदित monolayers भी TER में एक महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित (≫ १००० Ω · सेमी2) (चित्रा 2), परिपक्व तंग जंक्शनों का संकेत है ।

सामान्य मानव शरीर विज्ञान में, आंत्र उपकला परत पोषक तत्वों और रोगाणु सेरोसल वातावरण से सूक्ष्म-समृद्ध लुमिनल अंतरिक्ष को अलग करती है । उपकला कसकर इन दो डिब्बों के बीच पार बात को नियंत्रित करता है । एंटेरॉइड और कोलोनॉइड मोनोलेयर्स इस महत्वपूर्ण कम्पार्टमेंज़ेशन संपत्ति को संरक्षित करते हैं जैसा कि तालिका 1 में प्रोटॉमिक एनालिसिस द्वारा दिखाया गया है । विभेदित एंटेरॉयड मोनोलेयर्स से एकत्र किए गए ऐपिकल और बेसोलेटरल वातानुकूलित मीडिया में प्रोटीन संघटन के बीच पर्याप्त अंतर हैं । दोनों शीर्ष और basolateral पक्ष तक पहुंच एक समय पर निर्भर तरीके से दोनों supernatants के संग्रह के लिए अनुमति देता है जैसे साइटोकिंस और chemokines जैसे अंय अणुओं के विभेदक स्राव के मापन के लिए । 15 , 17

Monolayers सुविधाजनक और अत्यधिक प्रतिशोधी मॉडल दोनों immunoblotting और immunoblotting का उपयोग कर प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने के लिए कर रहे हैं । इस प्रकार, श्ना पछाड़ना (KD) द्वारा श्लेष्मरस 2 (MUC2) अभिव्यक्ति में परिवर्तन दोनों तकनीकों का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है (चित्रा 3) । Shrna पारक्रमण 3 डी colonoids पर प्रदर्शन किया और एंटीबायोटिक चयन मीडिया में बनाए रखा गया था । केडी की पुष्टि करने के बाद, colonoids लगातार 3 डी संस्कृतियों और/या प्रायोगिक प्रयोजनों के लिए monolayers के रूप में चढ़ाया के रूप में रखा जा सकता है । इसके अलावा, MUC2 KD जंगली प्रकार पैतृक colonoid लाइन की तुलना में monolayer गठन की दक्षता को प्रभावित नहीं करता है । Immunoblotting के लिए monolayers का संग्रह सरल और मानव उपकला adenocarcinoma-व्युत्पन्न सेल लाइनों के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के समान है । आमतौर पर, लगभग ५० μg या अधिक कुल प्रोटीन के एक एकल ०.३३ सेमी2 डालने के monolayer से निकाला जा सकता है । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, MUC2 बमुश्किल (उद) wt colonoid monolayers में detectable है, लेकिन अत्यधिक विभेदित (DF) wt monolayers में व्यक्त की है । MUC2 दोनों उड और DF कोलोनॉइड monolayers में पता लगाने के स्तर से नीचे है MUC2 shRNA के साथ transduced ।

महत्वपूर्ण बात, monolayers एक उपयुक्त मॉडल को एपिथेलिया की सतह पर मेजबान माइक्रोबियल बातचीत का अध्ययन कर रहे हैं । कोलोनॉइड monolayers एक मोटी संलग्न MUC2-भेदभाव पर सकारात्मक बलगम परत जो आसानी से सहभोजी ई. कोलाई एच एस बैक्टीरिया (चित्रा 4), क्या सामांय मानव बृहदांत्र में सुझाव दिया गया है के समान से रिस नहीं है पर फार्म । 19 तथापि, एक मानव कालोनी रोगज़नक़ enteroरक्तस्रावी ई. कोलाई (ehec), एपिथेलियम के ऊपरी सतह तक पहुंचने के लिए MUC2-समृद्ध संलग्न बलगम परत को नष्ट करने की क्षमता है दिखाया गया है (चित्रा 4). 14 , 20 शेष MUC2 केवल जाम कोशिकाओं के अंदर मौजूद है ।

Figure 1
चित्रा 1: मानव एंटॉरॉइड/कोलोनॉइड मोनोलायर्स की स्थापना । (क) बीएमएम और त्रिकरण के विघटन के बाद कोलोनॉइड अंशों का उदाहरण । (B) कोलोनॉइड अंशों को चढ़ाना के तुरंत बाद डालने का उदाहरण । स्केल पट्टी (A-B) = २०० μm. प्रतिनिधि (ग) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण और (घ) संगत ओर्थोगोनल अनुमानों के साथ संनाभि ऑप्टिकल Z-खंड कि कॉलोनॉइड टुकड़े मानव कोलेजन चतुर्थ लेपित फिल्टर पर वरीयता प्राप्त कई monolayer द्वीपों फार्म 2-4 दिनों बाद सीडिंग । सेल मुक्त क्षेत्रों (तारांकन) दोनों परमाणु (hoechst ३३३४२, नीला) और शीर्ष एफ actin (phalloidin, हरी) दोनों सी और डी में धुंधला के अभाव से पहचाने जाने योग्य हैं । प्रतिनिधि (ङ) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण और (च) संनाभि ऑप्टिकल इसी ओर्थोगोनल प्रक्षेपणों के साथ अनुभाग एक संगामी-actin immunostaining लगभग 1 सप्ताह के बाद सीडिंग द्वारा पता चलता है सतत रूप से पिकल सतह के साथ एक कोलोनॉइड monolayer दिखा । (छ) एक प्रतिनिधि अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के उच्च इज़ाफ़ा और (एच) संगत लांबिक अनुमानों के साथ संनाभि ऑप्टिकल अनुभाग बताते है कि संगामी colonoid monolayers में कोशिकाओं के रूप में एफ actin परिजंक्शनल छल्ले (व्हाइट ऐरोहेड) और एक अपरिपक्व शीर्ष ब्रश सीमा (पीला तीर सिर) । स्केल पट्टी (C-H) = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: एंटॉरॉयड/कोलोनॉइड मोनोलेयर विभेद का मूल्यांकन । (क) EdU (लाल) निगमन, जेजुनाल मोनोलेयर विभेद के दौरान प्रसार की उत्तरोत्तर हानि को दर्शाता है । (ख) विस्तार या विभेदन माध्यम में संगामी जेजुनल मोनोलयर्स में औसत तेर माप. त्रुटि पट्टियां SEM. UD का प्रतिनिधित्व करती हैं, अविभेदित; DF, differentiated । संख्याएं निर्दिष्ट स्थिति के अंतर्गत दिनों के अनुरूप होती हैं; UD1 कन्फ्लुएंसी का पहला दिन था, लगभग 1 सप्ताह के बाद सीडिंग । (ग) उद ज्ज्नल मोनोलयेर्स में लोमो डे 5 जेज्नल मोनोलायर्स की तुलना में व्यापक, छोटे सेल और कम परिपक्व ऐपिकल ऐक्टिन आधारित ब्रुश बॉर्डर हैं । स्केल पट्टी (A, C) = ५० μm. सभी monolayers कम से 1 सप्ताह के बाद बोने का चित्रण किया गया और संगामी से पहले भेदभाव शुरू कर रहे थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: जंगली प्रकार colonoids और shRNA (केडी) colonoids प्रत्येक फार्म संगामी monolayers के लिए knockduced । (क) वन्य प्रकार (डब्ल्यूटी) मानव संगामी कोलोनॉइड मोनोलेयर के प्रतिनिधि चित्र 5 दिनों के लिए विभेदित और (ख) इसी प्रकार उगाए गए मोनोलायर्स MUC2 केडी कोलोनॉइड संस्कृतियों से प्राप्त होते हैं । स्केल पट्टी (A-B) = ५० μm (C) उपनिवेशी संस्कृतियों के प्रतिनिधि immunoblot के साथ transduced शरना या MUC2 shrna दर्शाता है कि केडी के कारण प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन immunoblot द्वारा quantitated किया जा सकता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: एन्ड्रॉइड/कोलोनॉइड मोनोलयेर्स ल्यूमिनल माइक्रोबे-होस्ट इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मॉडल हैं । (क) एक कोलोनॉइड मोनोलेयर का प्रतिनिधि अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण और लांबिक ऑप्टिकल सेक्शन मोटा शीर्ष MUC2-धनात्मक बलगम परत को दर्शाता है जो ई-कोलाई एच एस (ब्लैक ऐरोहेड) के लिए पारगम्य नहीं है जो शीर्ष बलगम पर बैठा होता है । सतह. मोनोलेयर 106 Cfu/एमएल एच एस के साथ 6 घंटे के लिए संक्रमित था । (ख) मानव कोलोनॉइड मोनोलेयर का प्रतिनिधि अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण जो एएचईसी (106 सीएफयू/एमएल, 6 घंटे) से संक्रमित होता है । स्केल पट्टी (A-B) = ५० μm. (ग) MUC2 इमयूनोफ्लोरेसेंस तीव्रता मापन असंक्रमित नियंत्रणों की तुलना में एएचईसी-संक्रमित कोलोनॉइड मोनोलयेर्स में MUC2 में महत्वपूर्ण कमी दर्शाते हैं । त्रुटि सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रोटीन परिग्रहण संख्या पेप्टाइड बाहुल्य
आधारबाहु मीडिया
फैटी एसिड-बाध्यकारी प्रोटीन, जिगर [होमो sapiens] NP_ 001434.1 १२९९
profilin-1 [होमो sapiens] NP_ 005013.1 ७९७
अपलीपोप्रोटीन ए-चतुर्थ प्रणेता [होमो सपियंस] NP_ 000473.2 ७४४
ecto-ADP-राइबोसिल्ट्रांस्टेनेज 4 पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 066549.2 ६३३
ग्लिसलरडिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज आइसोफार्म 1 [होमो sapiens] NP_ 002037.2 (+ 1) ६१६
serotransferrin पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 001054.1 (+ 1) ५७२
विटामिन डी बाध्यकारी प्रोटीन isoform 3 पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 001191236.1 (+ 2) ५६७
कैटलेस [होमो सपियंस] NP_ 001743.1 ४२७
अग्न समरूपी 1 पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 940978.2 (+ 1) ३७७
लैक् टोट्रांस्रीन समरूप 1 पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 002334.2 (+ 1) २६२
पिकल मीडिया
तिपतिया फैक्टर 3 पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 003217.3 ३२६
तिपतिया फैक्टर 1 पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 003216.1 ३०४
तहखाने झिल्ली-विशिष्ट heparan सल्फेट proteoglycan कोर प्रोटीन isoform एक अग्रदूत [होमो sapiens] NP_ 001278789.1 (+ 3) ३०३
filamin-B समरूपी 1 [होमो sapiens] NP_ 001157789.1 (+ 2) २४०
तिपतिया फैक्टर 2 पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 005414.1 १८२
घातक मस्तिष्क ट्यूमर में नष्ट कर दिया 1 प्रोटीन isoform बी पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 015568.2 (+ 3) १६९
केरातिन, प्रकार द्वितीय साइटोस्केलेटल 1 [होमो सपियंस] NP_ 006112.3 १५७
myosin-9 [होमो sapiens] NP_ 002464.1 १५०
aminopeptidase एन पूर्वगामी [होमो sapiens] NP_ 001141.2 (+ 1) १४५
अग्न के प्रणेता [होमो सपियंस] NP_ 940978.2 (+ 1) ११२

तालिका 1. पेप्टाइड्स की एक आंशिक सूची तरल क्रोमेटोग्राफी/टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा चिह्नित और बासोलेटरीय तरल पदार्थ में विभेदित जेजुनल मोनोलयेर्स से जांचा गया ।

Discussion

एंटेरॉइड के सफल गठन के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों/कोलोनॉइड monolayers शामिल 1) स्वस्थ, शुरू सामग्री के रूप में 3 डी संस्कृतियों proliferating; 2) कोटिंग कोशिका संस्कृति मानव कोलेजन IV के साथ सतह डालने monolayer बोने से पहले; 3 3 डी संस्कृतियों के विखंडन या तो यंत्रवत् या enzymatically, लेकिन एक कोशिका स्तर पर नहीं ।

3 डी enteroids के अलगाव के दौरान/colonoids, इष्टतम मिलाते हुए गति एक दिया शेखर मॉडल के घूर्णी व्यास के आधार पर भिंन हो सकते हैं । मंशा केवल एक कुशल मिश्रण के लिए थाली आंदोलन नहीं है, लेकिन यह भी प्लेट कवर पर या आसंन कुओं में सेल निलंबन splashing से बचने के लिए । < 30 मिनट की ऊष्मायन अवधि अवशिष्ट BMM कोशिकाओं है, जो अनुलग्नक और वर्दी सेल monolayers के गठन जब आवेषण पर चढ़ाया बाधा कर सकते है पकड़ उपज सकता है । व्यापक ऊष्मायन (≥ 1 ज) काफी कमी सेल व्यवहार्यता उपज जाएगा ।

3d एन्टरइड्स/कोलोनॉइड को अलग-अलग करने के लिए आवश्यक संपेषण की सीमा पिस्टन कठोरता और उपयोगकर्ता निपुणता के साथ भिन्न हो सकते हैं । एक चरण-विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोप पर अच्छी तरह से सामग्री की आवधिक परीक्षा टुकड़ा प्रति लगभग 30 कोशिकाओं के एक लक्ष्य के साथ, tration के दौरान एक टुकड़ा एकरूपता निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है । के एवज में, या trituration के अलावा, निलंबन के साथ संक्षेप में पचा जा सकता है ट्रिप्सिन छोटे समान टुकड़े प्राप्त करने के लिए । Trypsin डाइजेस्ट वांछनीय हो सकता है अगर monolayers एक अंयथा एकल उपकला परत के बीच 3 डी की तरह संरचनाओं के एक बड़े अनुपात होते हैं । हालांकि, एकल कोशिकाओं के लिए वियोजन वांछनीय नहीं है क्योंकि यह काफी कोशिका व्यवहार्यता कम हो जाती है । एक ३५ μL BMM छोटी बूंद में सुसंस्कृत enteroids/कॉलोनाइड्स के एक अच्छी तरह से आम तौर पर 2-3 आवेषण आबाद करने के लिए पर्याप्त होगा, लेकिन इस कारक संख्या और enteroids के औसत आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं/

कोलोनॉइड monolayers के रूप में वे अंतर के रूप में एक व्यापक माध्यम की मात्रा को अवशोषित कर सकते हैं । यह अपर डालने चैंबर (150-200 μL) के लिए अतिरिक्त डीएम को लागू करने से दरकिनार किया जा सकता है, हालांकि ऊपरी चैंबर के आंशिक सुखाने प्रतिकूल monolayer व्यवहार्यता या बहाव assays में समारोह को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है । भेदभाव के लगभग 4-5 दिनों के बाद, कोलोनॉइड monolayers कोशिकाद्रव्य बलगम है कि डीएम की सावधानी आकांक्षा के बाद सेल की सतह पर मोटी/

बाहरी बलगम परत के साथ EHEC बातचीत के लिए, हम नियमित रूप से प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट बैक्टीरियल टाइटर और ऊष्मायन अवधि का उपयोग करें । हालांकि, अद्वितीय जीवाणु उपभेदों शुरू में कई सांद्रता और ऊष्मायन अवधि के लिए वांछित प्रभाव के लिए उपयुक्त मापदंडों का निर्धारण किया जाना चाहिए ।

बलगम निर्धारण के दौरान, ऐपिकल माध्यम aspirating की संभावना extracellular असंलग्न बलगम परत के सबसे दूर होगा । इसलिए, यह ध्यान से माध्यम से बाहर डालना महत्वपूर्ण है । यदि मध्यम सतह तनाव से डालने में बनाए रखा है, एक तह प्रयोगशाला ऊतक के कोने का उपयोग करने के लिए सतह तनाव को तोड़ने और दूर माध्यम के सबसे बाती । निर्धारण और धुंधला हो जाने के बाद, बलगम परत अनजाने या उखाड़ फेंकना हो सकता है, जबकि डालने फिल्टर पर एक coverglass बढ़ते । बलगम ऊंचाई को संरक्षित करने के लिए, बढ़ते मीडिया की एक बूंद पर फिल्टर जगह और ध्यान से फिल्टर पर कवरग्लास जगह है । नल या coverglass पर नीचे प्रेस नहीं के रूप में यह काफी बलगम परत समतल कर सकते हैं ।

3 डी संस्कृति में कोशिकाओं से एक polarized monolayer फार्म के लिए, यह आंतों उपकला कोशिकाओं और extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन की basolateral झिल्ली integrins के बीच बातचीत को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक है । Laminin, कोलेजन चतुर्थ, fibronectin, और proteoglycans की एक सरणी आंत्र उपकला ECM गठन । 21 , 22 हम मानव कोशिका की तुलना में-laminin व्युत्पन्न, fibronectin, कोलेजन चतुर्थ, और murine-डालने कोटिंग्स के रूप में bmm प्राप्त की । केवल कोलेजन चतुर्थ स्थिर के गठन का समर्थन किया, लंबी अवधि (अप करने के लिए 4 सप्ताह) संगामी enteroid/कोलोनॉइड monolayers (आंकड़े 1-2). Monolayer की तरह विकास के छोटे पैच अन्य परीक्षण matrices में से प्रत्येक पर प्राप्त किया गया था, लेकिन इन क्षेत्रों कन्फ्लुएंसी करने के लिए प्रगति करने में विफल रहा. मानव कोलेजन चतुर्थ का उपयोग ECM किराए के रूप में लाभ के एक नंबर है । एंगेलबरेथ-होलिम-झुंड (ईएचएस) से प्राप्त बीएमएम-म्यूरिन सार्कोमा कोशिकाएं मानव मूल की नहीं हैं, जबकि मानव कोलेजन चतुर्थ वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध है और आम तौर पर अधिक लागत प्रभावी है । इसके अतिरिक्त, bmm अंतर्निहित परिवर्तनशीलता के साथ प्रोटीन का एक जटिल मिश्रण है, और वृद्धि कारक है कि जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित सार्कोमा द्वारा स्रावित शामिल हो सकते हैं । 23

आंतों उपकला कोशिकाओं और आंतों उपकला क्षतिपूर्ति में अंतर्निहित ecm के बीच बातचीत अभी भी पूरी तरह से समझ में आता है । कोलेजन चतुर्थ का महत्व है, लेकिन नहीं laminin, मानव colonocytes के लिए एक आसंजन संलग्नी के रूप में24 और आंतों तहखाना उपकला कोशिका क्षतिपूर्ति25 के बढ़ाने कोलेजन चतुर्थ के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने का सुझाव दिया गया है कि रोका लगाव . उपकला-β1-integrin व्यक्त ECM बातचीत के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, β1 के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में-एकीकृत काफी colonocytes के आसंजन अवरुद्ध चतुर्थ कोलेजन टाइप करने के लिए । 24 जबकि कोलेजन चतुर्थ आवेषण पर एन्ड्रॉइड/कोलोनॉइड मोनोलेयर गठन के लिए एक विश्वसनीय ecm प्रदान करता है, समय के साथ ecm के उपकला remodeling अभी तक इस मॉडल में मूल्यांकन नहीं किया गया है, और न ही अधिक जटिल और परिभाषित ecm मिश्रण का प्रभाव है कोलेजन चतुर्थ, laminin, और fibronectin ।

Monolayer प्रारूप (आंकड़े 1-4) में मानव enteroids/जोड़तोड़ और नमूना है कि बोझिल या असंभव के लिए 3 डी मैट्रिक्स-एंबेडेड संस्कृतियों का उपयोग कर प्राप्त होगा सक्षम करें । 3 डी आंत्रशोथ/कॉलोनाइड्स आकार, संरचनात्मक जटिलता और लुमिनल आयतन में भिन्न होते हैं, और इस प्रकार सूक्ष्मजीवों या छोटे अणुओं के माइक्रोइंजेक्शन को सही मात्रा में लगाना कठिन होता है । इसके अतिरिक्त, monolayers (तालिका 1) के विपरीत, 3 डी संस्कृतियों के लिए आयनों, पोषक तत्वों, साइटोकिंस या स्रावित कारकों को मापने के लिए दोनों luminal और basolateral सतहों के लिए सीधी पहुंच को रोकने के शारीरिक या पैथोफाइसिलॉजिक प्रक्रियाओं के साथ जुड़े . कन्फ्लुएंसी (आंकड़े 1-2) एंट्रोइड/कोलोनॉइड मोनोलेयर के मुख्य गुणों में से एक है जो न केवल पोषक तत्वों, आयनों, और अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स,16 की शारीरिक gradients की स्थापना के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी उचित बाधा पैदा के बीच लुमिनल माइक्रोबायोटा और बाँझ mesenchymal/प्रतिरक्षा कोशिका आबाद serosal वातावरण. इन पहलुओं को भविष्य के अध्ययन है कि mesenchymal, प्रतिरक्षा, या न्यूरोनल सेल प्रकार के साथ एंटैरॉइड/कोलोनॉइड monolayers शामिल करने के लिए और अधिक जटिल शारीरिक मॉडल बनाने पर विचार महत्वपूर्ण हैं ।

सेल संस्कृति डालने के मॉडल की उल्लेखनीय सीमाओं यहां वर्णित द्रव कतरनी तनाव और यांत्रिक खिंचाव के रूप में शारीरिक बलों की कमी/संपीड़न (peristalsis), और एक अवायुजीवी शीर्ष वातावरण सामान्य रूप से आंत्र द्वारा अनुभवी की अनुपस्थिति शामिल vivo में एपिथेलिया । इन तत्वों को और अधिक परिष्कृत microशरीरक्रियात्मक प्लेटफार्मों के साथ संबोधित किया जा करने की क्षमता है,26 लेकिन वे भी अतिरिक्त खर्च, उपकरण, और विशेषज्ञता को लागू करने की आवश्यकता है । दोनों 3 डी और monolayer संस्कृतियों के साथ या योगदान के बिना भी कर रहे है आंत्र माइक्रोबायोम, stromal सेल आबादी, और प्रतिरक्षा प्रणाली जब तक इन घटकों को उद्देश्यपूर्ण रूप से जोड़ रहे हैं ।

कोलेजन चतुर्थ लेपित सेल संस्कृति आवेषण पर एंटॉरॉइड/कोलोनॉइड मोनोलेयर के भविष्य के अनुप्रयोगों में रोगजनक या कोमेन्सल माइक्रोबियल इंटरेक्शन, ड्रग या पोषक तत्वों से ऊपर उठाना, विषाक्तता, चयापचय, बैरियर फंक्शन, और कार्यात्मक के अन्य अध्ययन शामिल हो सकते हैं अतिरिक्त आंत्र कोशिका प्रकार के साथ सह संस्कृति द्वारा उत्प्रेरक वृद्धि । मूल्यांकन न केवल स्वस्थ दानदाताओं के एपिथेलिया के भीतर बल्कि आनुवंशिक उत्परिवर्तनों या आंतों विकारों के साथ व्यक्तियों से भी बनाया जा सकता है, प्रदान की vivo phenotypes में संरक्षित किया जा करने के लिए स्थापित कर रहे है पूर्व vivo एंटेरॉइड/

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI), और K01 DK113043 (JGI) द्वारा समर्थित किया गया था । हम जेंस Kaper (मैरीलैंड विश्वविद्यालय, बाल्टीमोर, एमडी, संयुक्त राज्य अमेरिका) ई. कोलाई तनाव एच एस और EHEC प्रदान करने के लिए धंयवाद । हम भी हापकिंस Conte पाचन रोग बुनियादी और Translational अनुसंधान कोर केंद्र (P30 DK089502) और जॉंस हॉपकिंस मास स्पेक्ट्रोमेट्री और Proteomics कोर के एकीकृत फिजियोलॉजी और इमेजिंग कोर स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol Sigma T4661 Tris base, Component of lysis buffer
A-83-01 Tocris 2939 ALK4/5/7 inhibitor
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010 Component of growth medium
Alexa Fluor 488 phalloidin Life Technologies A12379 Fluorescent probe for F-actin
Antibiotic/antimycotic cocktail Invivogen ant-pm-2 Primocin (100x)
B27, 50x Life Technologies 17504-044 Component of growth medium
Cell culture inserts Corning 3470 Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate
CHIR 99021 Tocris 4423 GSK3β inhibitor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life Technologies C10639
Collagen IV, from human placenta Sigma C5533
Cultrex Organoid Harvesting Solution Trevigen 3700-100-01 Depolymerizes basement membrane matrix
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Kaper lab, University of Maryland
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments EVOM2
Epithelial voltohmmeter electrode World Precision Instruments STX3
Escherichia coli strain HS Kaper lab, University of Maryland
Ethanol, absolute Pharmco 111000200
FluorSave mounting medium Millipore 345789 For mounting insert membrane on microscope slide
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc cell line van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research For production of Noggin conditioned medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line Trevigen 3710-001-K For production of Rspondin-1 conditioned medium
HEPES, 1 M Life Technologies 15630-080 Component of growth medium
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004250
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Fluorescent nuclear dye
Human epidermal growth factor (EGF) R&D Systems 236-EG-01M Component of growth medium
IGEPAL CA-630 Sigma I8896 Component of lysis buffer
Inverted cell culture light microscope Olympus CKX51
LB broth EMD Millipore 1.10285.0500
L-WNT3A cell line ATCC CRL-2647 For production of Wnt3a conditioned medium
Matrigel, growth factor reduced Corning 356231 Basement membrane matrix for 3D culture
Mini cell scraper United BioSystems MCS-200
MUC2 antibody, mouse monoclonal Abcam ab11197 Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting
MUC2 shRNA lentiviral particles GE Dharmacon RHS4531 GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Orbital shaker Grant Instruments PSU-10i
Penicillin-streptomycin, 100x Life Technologies 15140-122 Component of growth medium
Phosphate buffered saline Corning 21-031
Probe sonicator with microtip Branson Ultrasonics 450
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells Sigma P8340 Component of lysis buffer
SB 202190 Tocris 1264 p38 MAPK inhibitor
Sodium chloride Sigma S3014 Component of lysis buffer
Sodium dexoycholate Sigma D6750 Component of lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate Sigma L3771 Component of lysis buffer
TrypLE Express, 1x Life Technologies 12605-010 Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments
Vinculin antibody, rabbit monoclonal Abcam ab129002 Use at 1:1000 for immunoblotting
Water, tissue culture grade, sterile filtered Corning 25-055
Y-27632 Tocris 1254 RhoA/ROCK inhibitor

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण १४६ मुद्दा मानव एंटेरॉइड या कोलोनॉइड monolayers मेजबान-रोगज़नक़ संपर्क शीर्ष संक्रमण शीर्ष और basolateral स्राव कालोनी बलगम आंत्र ऑर्गेनोइड monolayer
मानव कोलोनॉइड Monolayers रोगजनकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, Commensals, और मेजबान आंत्र उपकला
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In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium. J. Vis. Exp. (146), e59357, doi:10.3791/59357 (2019).

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