Summary
Her presenterer vi en protokoll kultur menneskelige enteroid eller colonoid monolayers som har intakt barriere-funksjonen til å studere vert epithelial bakterieflora samhandlinger på mobilnettet og biokjemiske.
Abstract
Menneskelige 3-dimensjonale (3D) enteroid eller colonoid kulturer avledet fra krypten base stamceller er den mest avanserte ex vivo modellen av intestinal epitel. Deres lukkede strukturer og betydelig støtte ekstracellulær matrix er 3D kulturer ikke ideelt for vert-patogen studier. Enteroids eller colonoids kan dyrkes som epithelial monolayers på permeable vev kultur membraner som tillater manipulering av både luminal og basolateral celle overflater og tilhørende væsker. Denne forbedrede luminal overflaten tilgjengelighet muliggjør modellering bakteriell vert epithelial interaksjoner som Slim-nedverdigende mulighet av enterohemorrhagiske E. coli (EHEC) på colonic epitel. En metode for 3D kultur fragmentering, monolayer frø og transepithelial motstand (TER) mål å overvåke fremdriften mot confluency og differensiering er beskrevet. Colonoid monolayer differensiering gir utskilles Slim som kan studeres ved immunofluorescence eller immunoblotting teknikker. Mer generelt, enteroid eller colonoid monolayers aktiverer en fysiologisk relevante plattform å evaluere bestemt celle populasjoner som kan målrettes av patogene eller commensal bakterieflora.
Introduction
Intestinal organoids, enteroids og colonoids har ført til mange fremskritt i å forstå stamcelleforskningen atferd, intestinal utvikling, barriere/transport funksjon og differensiering. 1 men 3D kultur begrenser studiet av verten epithelial-patogen samhandling fordi lumen er ikke direkte tilgjengelig for bakterier eller virulens faktorer med mindre de lukkede strukturene er utsatt for microinjection. 2 , 3 i tillegg utskilles materialer som små molekyler, proteiner, eller Slim kan ikke være lett samplet fra 3D kultur for nedstrøms. Virkningen av patogene agenter på epithelial barriere funksjonen4 og ion transport5 er evaluert i 3D kultur med fluorescerende fargestoffer og time-lapse mikroskopi, men monolayers dyrket på permeable vev kultur støtter er mottakelig for flere teknikker som TER måling og Ussing kammer/spenning klemme innspilling. 6 , 7
Flere publikasjoner har beskrevet protokoller for 2D- eller monolayer kulturen i enteroids/colonoids. Materialer seg for å fremme tarmepitelet vedlegg inkluderer kollagen hydrogels,8,9 0,1% gelatin,10 tynne lag murine sarkomspesialitet-avledet kjelleren membran matrix (BMM),11,12, 13 og menneskelige kollagen IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 såing tilnærmingsmåtene er mekanisk fragmentering av pipettering6,14,15 og/eller av celle vedheft faktorer bruke trypsin,10,11 dispase,13 eller EDTA. 9 noen protokoller bruker ikke-porøse vev kultur plasticware for såing, men dette begrenser tilgang til basolateral, så de fleste programmer avhenger permeable vev kultur setter inn. Dokumentasjon av stabile confluent monolayer dannelsen og vedlikeholdet varierer blant publikasjonene. Dessuten vekst og differensiering media komposisjoner for menneskelige kulturer varierer for ulike grupper og fortsette å utvikle seg som flere forskere vedta og justere metodikken deres program og tilgjengelige ressurser.
For å løse begrensningene for 3D intestinal epithelial kultur i vert-patogen samhandling studier, presenterer vi en endret protokoll for å konvertere 3D menneskelig enteroids eller colonoids til en monolayer. Etter å oppnå confluency i en krypt-lignende umodne tilstand, fører tilbaketrekking av vekstfaktorer WNT3A, RSPO1 og hemmere A-83-01 og SB 202190 til differensiering representative for små intestinal villus eller overflate colonic epitel. Vi beskriver den ideelle matrise, menneskelige kollagen type IV pels som setter inn og få uniform enteroid eller colonoid fragmenter for plating. Vi viser at denne protokollen gir en confluent monolayer med et høyt TER. Colonoid monolayers skiller ut et tykt apikale Slim lag, slik at ex vivo studier av patogen Slim kommunikasjon via immunoblotting eller immunostai. En modifisert fiksering prosedyre å bevare colonic Slim laget for immunostai-er også beskrevet. Denne metoden tar sikte på å gi en tett modell for å studere de tidligste intestinal vert-patogen interaksjonene ved infeksjon.
Protocol
Denne protokollen er basert på studier tidligere publisert av forfatterne. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 følgende trinn skal utføres i et sterilt biosikkerhet skap med riktig aseptiske teknikker. Alle metoder som involverer menneske prøver er godkjent av den institusjonelle gjennomgang styret av Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329).
1. frakk celle kultur setter inn med ekstracellulær matrix
- Forberede 5 mL av lager kollagen IV løsning (1 mg/mL) i 100 mM eddiksyre. La stå på 4 ° C i ca 4 timer å fullt hydrat/oppløse.
- Aliquot kollagen IV lagerløsning og lagre på 4 ° C (≤ 1 måned) eller 20 ° C (> 1 måned).
- Umiddelbart før belegg, fortynne kollagen IV lager løsningen i sterilt vev kultur klasse vann til en siste konsentrasjon av 34 μg/mL. For 24-vel tallerken setter cellekultur, pels hvert sett med 100 μL løsning, som tilsvarer 10 μg/cm2.
- Inkuber platen i en standard CO2 vev kultur inkubator på 37 ° C for ≥ 2 h, eller for bekvemmelighet forsegle plate kantene med parafin film og ruge på 4 ° C over natten eller opptil 1 uke.
2. isolere enteroids/colonoids fra 3D kultur
Merk: Enteroids eller colonoids er opprettet fra donor biopsier og vedlikeholdes i 3D kultur etter standardprotokoller som beskrevet tidligere. 14 , 18 kort, Krypter høstes fra intestinal biopsier eller resections via chelation og mekanisk agitasjon. Krypten er vasket, høstet og belagt i BMM. Utvidelse medier (beskrevet i trinn 4.2) legges til kultur og erstattet hver 2 dager. 3D kultur formasjon er synlig innen timer etter plating.
- Sug opp kultur medium fra 24-vel platen og erstatte med 1 mL iskald høsting løsning (se Tabell for materiale) per brønn.
- Bruk en mini celle skraper å dislodge og oppløsningen kjelleren membran matrix pellets, særlig vekt materiale nær godt.
- Agitere plate på en orbital shaker på ca 200 rpm, 4 ° C i 30-45 minutter.
3. dissociate 3D enteroids/colonoids
- Bruk en P200 enkeltkanals pipette eller en flerkanals pipette utstyrt med sterilt filter tips til triturate celle suspensjon.
- Basseng i celle suspension(s) i en 15 mL konisk hetteglass. Bruk flere ampuller hvis totale suspensjon er > 6 mL.
- Legge til en lik mengde avanserte DMEM/F12 mediet inneholder 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamin dipeptide (1 x) og penicillin-streptomycin (1 x) (vask medium). Invertere røret 3 - 4 ganger å blande. Sentrifuger på 300 x g, 10 min, 4 ° C.
- Eventuelt Sug opp vask mediet og erstatte med 0,5 mL/vel trypsin (se Tabell for materiale). Resuspend colonoids med en P200 pipette, cap røret og sted i en 37 ° C vannbad for ca 2 min. umiddelbart fjerne røret, legge vask medium til et endelig antall 10 mL og gjenta sentrifugering som trinn 3.3.
Merk: Dette trinnet kan være å foretrekke hvis føden ikke medfører jevnt størrelse fragmenter.
- Eventuelt Sug opp vask mediet og erstatte med 0,5 mL/vel trypsin (se Tabell for materiale). Resuspend colonoids med en P200 pipette, cap røret og sted i en 37 ° C vannbad for ca 2 min. umiddelbart fjerne røret, legge vask medium til et endelig antall 10 mL og gjenta sentrifugering som trinn 3.3.
4. plating enteroid/colonoid suspensjon
- Hvis belagt setter ble lagret på 4 ° C, equilibrate i en 37 °C/5% CO2 vev kultur inkubator for minst 30 min før cellen plating.
- Hver innsetting å være belagt, forberede 1 mL varme (mellom 25-37 ° C) ekspansjon medium (EM) og legge til 10 μM Y-27632 og 10 μM CHIR 99021.
Merk: EM består av avansert DMEM/F12 som inneholder B27 (1 x), 50% WNT3A betinget medium, 15% RSPO1 betinget medium, 10% Noggin betinget medium, 50 ng/mL menneskelige EGF, 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, antibiotika/antimycotic cocktail (1 x), 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamin dipeptide (1 x) og penicillin-streptomycin (1 x) (se Tabell for materiale). - Sug opp vask mediet røret som inneholder cellen pellets og resuspend i et volum på EM tilstrekkelig å gi minst 100 μL/insert.
- Sug opp kollagen IV løsningen fra hvert sett inn og vask to ganger med 150 μL av vask mediet per sett inn.
- Pipetter 600 μL EM i feltet under hvert sett inn.
- Pipetter 100 μL celle suspensjon i hvert sett inn.
- Returnere platen til vev kultur inkubator og la uforstyrret minst 12 h.
Merk: Unngå rystelser eller vipping kraftig platen for å unngå ujevn fordeling av colonoid fragmenter på Sett inn membranen. - Overvåke celle vedlegget og spre for å danne en confluent monolayer ved å sette platen på kontrast lys mikroskop under en 2.5 x-10 x linsen.
- Etter 1-2 dager, bør de fleste fragmenter følge kollagen matrix. Oppdater kultur medium og avslutte behandling med Y-27632 og CHIR 99021. Fortsette å oppdatere mediet hver 2-3 dager før confluent. Confluency er vanligvis tilgjengelig i 7-10 dager.
5. tiltak transepithelial elektrisk motstand
- Koble elektroden fører og makt på de epithelial voltohmmeter (EVOM). Kontroller at funksjonen måling er satt til ohm.
- Dypp elektrode tips kort i 70% etanol og tørk deretter tørt med et laboratorium vev. Equilibrate elektroden i 5 mL av vask medium for ca 5 min.
- Fordype kortere elektrode spissen i sett inn medium og orientere lengre elektrode spissen inn i lavere godt plate. Opprettholde elektroden full loddrett sideretning til EVOM lesing er relativt stabil eller lenger enn 60 s.
Merk: Hvis samlingen elektrode beveges langt fra loddrett eller tips høyden justeres feil, kortere spissen kan komme i kontakt med og forstyrre celle monolayer. - Sammenlign EVOM mål verdi fra en celle uten setter nedsenket i kultur medium å evaluere fremgang mot confluency eller differensiering.
6. differensiering av confluent enteroid/colonoid monolayers
- Bytte dem for differensiering medium (DM), og fortsette å oppdatere media annenhver dag til dag 5. DM er dem som mangler WNT3A, RSPO1, A-83-01 og SB 202190.
- Fortsette å overvåke TER for å kontrollere at differensiering går som forventet. TER vil fortsette å øke i løpet av 1-5 differensiering. Monolayers kan fortsette å øke TER og beholde levedyktighet utover dagen 5-6 men utstilling største og mest reproduserbar resultater når den brukes på dag 5-6.
7. bakteriell infeksjon med commensal eller patogene E. coli
- Én dag før gjennomføring av infeksjon, vask og mate monolayers med antibiotika uten EM eller DM.
- Bruk en steril mikrobiologi loop å forsiktig skrape overflaten av en frossen bakteriell glyserol lager og vaksinere 2 mL av LB kjøttkraft. Overføre røret til en standard risting inkubator ved 37 ° C i 12-16 h.
- Fortynne 50 μL av startkulturer i 5 mL frisk LB kjøttkraft (1: 100) og fortsette inkubasjon med skjelvende i 90 min. Dette vil gi en logg fase kultur med en tetthet av 105-106 colony-forming enheter (cfu) / mL.
- Eventuelt bekrefte bakteriell konsentrasjonen av optisk densitet måling på 600 nm (OD600) i et spektrofotometer.
- Nedspinning bakteriell kultur på 12.000 x g i 10 min, fjerne nedbryting og resuspend bakterier i antibiotika uten EM eller DM til en siste konsentrasjon av 107 cfu/mL.
- Tilsett 10 μL av bakteriell suspensjon innsatsen (siste konsentrasjon 106 cfu/mL). Pipetter sakte å blande og unngå å forstyrre ekstracellulære Slim laget.
- Tilbake plate til en vev kultur inkubator for ønsket infeksjon perioden.
8. fiksering å bevare og immunostai Slim
- Løft i cellekultur setter inn fra 24-vel platen, invertere nøye på et laboratorium silkepapir fjerne apikale medium, og tørke bort eksterne væske klamrer seg til innsatsen.
- I en ny 24-vel plate, fordype innsatsen i en 1:3 løsning iseddik i absolutt etanol (Clarkes løsning) i 10 min ved romtemperatur.
- Invertere innsatsen for å fjerne bindemiddel og rehydrate cellene i 1 x PBS for 10 min. Fortsett med standard immunostai-protokoller.
- Bruk et barberblad til å kutte rundt omkretsen av sett inn membranen. Overføre membranen til en barometer microscope skyve ved hjelp av pinsett og påføre en coverglass med montering medium.
9. utarbeidelse av celle lysates for immunoblotting
Merk: Utføre følgende trinn på is eller en kald rommet.
- Sug opp medium og vask sette inn én gang med PBS.
- Legge til 150 μL lysis buffer inneholder proteasehemmere (se tabell of Materials) til innsatsen og la stå 5-10 min. lyseringsbuffer inneholder 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS, 1: 100 protease hemmer cocktail.
- Bruk en mini celle skraper for å fjerne celler på Sett inn, og bruk en P200 pipette til kort triturate suspensjon og overføring til et microcentrifuge rør.
- Sonicate suspensjon med 5 x 1 s pulser på 20% amplituden bruker en microtip undersøke (se Tabell for materiale).
- Legg SDS-lasting buffer hvis umiddelbart utfører geleelektroforese eller aliquot og lagre lysates på 20 ° C.
Representative Results
Menneskelig enteroid og colonoid kulturer er vokst som 3D strukturer, og avstand og fragmentert for plating på menneskelig kollagen IV-belagt celle kultur setter. Utviklingen av monolayer formasjon er lett overvåkes daglig via lyse feltet mikroskopi, immunofluorescence flekker (figur 1), og en jevn økning i transepithelial elektrisk motstand (TER) (figur 2), som gjenspeiler permeabilitet av tett veikryss ioner og korrelerer med monolayer confluency. TER av Tom 24-og insert er ca 50-100 Ω·cm2, og på å nå confluency øker til ca 400-500 Ω·cm2. Alle epitelceller i confluent monolayers er forbundet med junctional komplekser oppdaget av F-utgangen ringen på cellen omkretsen (figur 1). Monolayers i full vekstfaktor media representerer proliferativ krypt-lignende epitel består hovedsakelig av aktivt dele celler som inneholder nukleosid analoge EdU (figur 2). Tilbaketrekking av vekstfaktorer WNT3A og RSPO1 fremmer differensiering, fører til villus-lignende kulturer som mangler voksende celler. Differensierte monolayers inneholder enterocytes (enteroids) eller colonocytes (colonoids) og utvikle spesialiserte intestinal epitelceller som har vært vist i 3D kulturer,18 inkludert begeret og enteroendocrine celler. 15 differensierte monolayers viser også en betydelig økning i TER (> 1000 Ω·cm2) (figur 2), som angir modne stramt veikryss.
I normale menneskelige fysiologi skiller intestinal epiteliale lag næringsstoffer og mikrobe-beriket luminal plass i sterilt serosal miljøet. Epitel regulerer tett kryss-snakk mellom disse to avdelinger. Enteroid og colonoid monolayers bevare viktige compartmentalization egenskapen som vist av proteomic analyse i tabell 1. Det er betydelige forskjeller mellom protein sammensetningen i apikale basolateral betinget media fra differensiert enteroid monolayers. Tilgang til både den apikale og basolateral siden tillater for samling av begge supernatants på en gang avhengige måte for måling av differensial sekresjon av andre molekyler som cytokiner og chemokines. 15 , 17
Monolayers er praktisk og svært reproduserbar modeller å oppdage endringer i protein uttrykk med både immunoblotting og immunostai. Dermed endringene i mucin 2 (MUC2) uttrykk av shRNA knockdown (KD) kan oppdages ved hjelp av begge teknikkene (Figur 3). ShRNA signaltransduksjon ble utført på 3D colonoids og vedlikeholdes i antibiotikumet utvalg media. Etter å ha kontrollert KD, colonoids kan være kontinuerlig opprettholdt som 3D kulturer og/eller belagt som monolayers for eksperimentelle formål. MUC2 KD påvirker dessuten ikke effektiviteten av monolayer formasjon sammenlignet med vill type foreldre colonoid linjen. Samling av monolayers for immunoblotting er enkel og ligner på protokollene på menneskelig epithelial adenocarcinoma-avledet cellelinjer. Vanligvis ca 50 µg eller mer totalt protein kan hentes fra en enkelt 0,33 cm2 sett inn dyrket monolayer. Som vist i Figur 3, MUC2 er knapt synlig i udifferensierte (UD) WT colonoid monolayers men er svært uttrykt i differensiert (DF) WT monolayers. MUC2 er under nivået av gjenkjenning i både UD og DF colonoid monolayers transduced med MUC2 shRNA.
Viktigere, er monolayers en passende modell å studere vert-mikrobiell interaksjoner på apikale overflaten av epithelia. Colonoid monolayers danner en tykk vedlagte MUC2-positive Slim lag på differensiering som ikke er lett gjennomsyret av commensal E. coli HS bakterier (Figur 4), ligner det har blitt foreslått i normale menneskelige tykktarmen. 19 men enterohemorrhagiske E. coli (EHEC), en menneskelig colonic patogen, har vist å ha evnen til å ødelegge MUC2-beriket vedlagte Slim laget for å nå apikale overflaten av epitel (Figur 4). 14 , 20 gjenværende MUC2 finnes bare i de goblet cellene.
Figur 1: Av menneskelig enteroid/colonoid-monolayers. (A) eksempel på colonoid fragmenter etter BMM og føden. (B) eksempel på Sett inn umiddelbart etter plating colonoid fragmenter. Skalere bar (AB) = 200 μm. Representant (C) maksimale intensitet projeksjon og (D) AC confocal optisk Z-delen med de tilsvarende orthogonal anslagene viser at colonoid fragmenter seeded menneskelige kollagen IV-belagt filtre skjemaet flere monolayer øyer 2-4 dager etter seeding. Cellen gratis områder (stjerne) er identifiserbare ved fravær av både kjernefysiske (Hoechst 33342, blå) og apikale F-utgangen (phalloidin, grønn) flekker i både C og D. representant (E) maksimale intensitet projeksjon og (F) AC confocal optisk del med tilsvarende orthogonal anslagene viser en confluent colonoid monolayer med sammenhengende apikale overflate oppdaget av F-utgangen immunostai-ca 1 uke etter seeding. (G) forstørring av en representant maksimale intensitet projeksjon og (H) AC confocal optisk delen med tilsvarende orthogonal anslagene viser at celler i confluent colonoid monolayers danne F-utgangen perijunctional ringer (hvitt pilhode) og en umoden apikale brush-grensen (gul pil hoder). Skalere bar (C-H) = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: evaluering av enteroid/colonoid monolayer differensiering. (A) EdU (rød) inkorporering demonstrerer en progressiv tap av spredning under jejunal monolayer differensiering. (B) gjennomsnittlig TER målinger i confluent jejunal monolayers utvidelse eller differensiering medium. Feilfelt representerer SEM. UD, udifferensierte; DF, differensiert. Tallene tilsvarer dager under de angitte betingelsene; UD1 var den første dagen i confluency, ca 1 uke etter seeding. (C) UD jejunal monolayers har bred, kortere celler og en mindre modne apikale utgangen-baserte brush-grensen enn DF dag 5 jejunal monolayers. Skalere bar (A, C) = 50 μm. Alle monolayers ble avbildet minst 1 uke etter såing og var confluent før begynnelsen differensiering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Wild type colonoids og shRNA transduced knockdown (KD) colonoids hvert skjema confluent monolayers. (A) representant bilder av vill-type (WT) menneskelig confluent colonoid monolayer differensiert for 5 dager, og (B) tilsvarende vokst monolayers avledet fra MUC2 KD colonoid kulturer. Skalere bar (AB) = 50 μm (C) representant immunoblot colonoid kulturer transduced med stekte shRNA eller MUC2 shRNA viser at endringene i protein uttrykk på grunn av KD kan være quantitated av immunoblot. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Enteroid/colonoid monolayers er egnet modeller å studere luminal mikrobe vert interaksjoner. (A) representant maksimale intensitet projeksjon og ortogonale optisk delen av en colonoid-monolayer viser tykke apikale MUC2-positive Slim lag som ikke permeable til E. coli HS (svart pilspisser) sitter på apikale Slim overflaten. Monolayer var infisert 6 timer med 106 cfu/mL HS. (B) representant maksimale intensitet projeksjon av menneskelig colonoid monolayer apically infisert av EHEC (106 cfu/mL, 6 timer). Skalere bar (AB) = 50 μm. (C) MUC2 immunofluorescence intensitet målinger viser en betydelig reduksjon i MUC2 i EHEC-infiserte colonoid monolayers sammenlignet med infisert kontroller. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protein | Tiltredelse nummer | Peptid overflod |
| Basolateral Media | ||
| fettsyre-bindende protein, leveren [Homo sapiens] | NP_001434.1 | 1299 |
| profilin-1 [Homo sapiens] | NP_005013.1 | 797 |
| Apolipoprotein A-IV forløper [Homo sapiens] | NP_000473.2 | 744 |
| Ecto-ADP-ribosyltransferase 4 forløper [Homo sapiens] | NP_066549.2 | 633 |
| glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase isoformen 1 [Homo sapiens] | NP_002037.2 (1) | 616 |
| serotransferrin forløper [Homo sapiens] | NP_001054.1 (1) | 572 |
| vitamin D-bindende protein isoformen 3 forløper [Homo sapiens] | NP_001191236.1 (2) | 567 |
| catalase [Homo sapiens] | NP_001743.1 | 427 |
| agrin isoformen 1 forløper [Homo sapiens] | NP_940978.2 (1) | 377 |
| lactotransferrin isoformen 1 forløper [Homo sapiens] | NP_002334.2 (1) | 262 |
| Apikale Media | ||
| Trefoil faktor 3 forløper [Homo sapiens] | NP_003217.3 | 326 |
| Trefoil faktor 1 forløper [Homo sapiens] | NP_003216.1 | 304 |
| kjelleren membran-spesifikke heparan sulfate proteoglycan kjernen protein isoformen en forløper [Homo sapiens] | NP_001278789.1 (3) | 303 |
| filamin-B isoformen 1 [Homo sapiens] | NP_001157789.1 (2) | 240 |
| Trefoil faktor 2 forløper [Homo sapiens] | NP_005414.1 | 182 |
| slettet i ondartet hjernen svulster 1 protein isoformen b forløper [Homo sapiens] | NP_015568.2 (3) | 169 |
| keratin, type II cellen cytoskjelett 1 [Homo sapiens] | NP_006112.3 | 157 |
| myosin-9 [Homo sapiens] | NP_002464.1 | 150 |
| aminopeptidase N forløper [Homo sapiens] | NP_001141.2 (1) | 145 |
| agrin forløper [Homo sapiens] | NP_940978.2 (1) | 112 |
Tabell 1. En delvis liste over peptider identifisert av flytende kromatografi/tandem massespektrometri i apikale og basolateral væsker samplet fra differensiert jejunal monolayers.
Discussion
Kritiske parametere for vellykket dannelsen av enteroid/colonoid monolayers inkluderer 1) frisk, voksende 3D kulturer som starter materiale; 2) belegg celle kultur sett inn overflaten med menneskelige kollagen IV før monolayer frø; 3) fragmentering av 3D kulturer enten mekanisk eller enzymatisk, men ikke enkelt cellenivå.
Under isolasjon av 3D enteroids/colonoids, kan optimal risting hastigheten variere avhengig av roterende diameteren på en gitt shaker modell. Hensikten er å ikke bare agitere platen for en effektiv blanding, men også unngå spruting celle suspensjon på plate omslag eller i tilstøtende brønner. Inkubasjon perioder < 30 min kan gi gjenværende BMM klamrer seg til celler som kan hindre vedlegg og dannelse av uniform celle monolayers når belagt på innlegg. Omfattende inkubering (≥ 1t) vil gi betydelig redusert celle levedyktighet.
Omfanget av føden må distansere 3D enteroids/colonoids kan variere stempelet stivhet og bruker fingerferdighet. Periodiske eksamen godt innholdet på kontrast lys mikroskop anbefales å finne fragment ensartethet under føden, med et mål om lag 30 celler per fragment. I stedet for eller i tillegg til føden, kan suspensjon bli fordøyd kort med trypsin å få mindre ensartet fragmenter. Trypsin oversikten kan være ønskelig hvis monolayers inneholder en stor andel av 3D-lignende strukturer blant en ellers enkelt epiteliale lag. Imidlertid er avstandtagen til enkeltceller ikke ønskelig som dette reduserer betydelig celle levedyktighet. En brønn av enteroids/colonoids kultivert i en 35 μL BMM dråpe vil normalt være nok til å fylle ut 2-3 innlegg, men denne faktoren kan variere avhengig av antall og gjennomsnittlig størrelse på enteroids/colonoids.
Colonoid monolayers kan absorbere en betydelig mengde apikale mediet som de skille. Dette kan omgås ved å bruke flere DM til øvre sett inn chamber (150-200 μL), selv om delvis tørking av den øvre kammeret ikke synes å påvirke monolayer levedyktighet eller funksjon i nedstrøms analyser. Etter ca 4-5 dager med differensiering utvikle colonoid monolayers ekstracellulære Slim som kan være synlig som tykk/geléaktige materiale på cellens overflate etter forsiktig aspirasjon av DM.
For EHEC interaksjon med ytre Slim laget bruker vi rutinemessig bakteriell titer og inkubasjon perioden angitt i protokollen. Imidlertid bør unik bakteriell stammer først bli assayed på flere konsentrasjoner og inkubasjon perioder å finne de riktige parametrene for den ønskede effekten.
Under Slim fiksering, vil aspirating apikale mediet trolig fjerne mesteparten av ekstracellulære fristilt Slim laget. Derfor er det viktig å nøye helle ut mediet. Hvis mediet beholdes i sette inn av overflatespenning, bruke hjørnet av en foldet laboratorium vev å bryte overflatespenningen og veken vekk de fleste av mediet. Etter fiksering og flekker, kan Slim laget utilsiktet forskyves eller flat mens montering en coverglass over sett inn filteret. For å bevare Slim høyde, plasser filteret på en dråpe montering media og forsiktig plassere coverglass på filteret. Ikke trykk eller trykke ned på coverglass som dette kan betydelig flat Slim laget.
For å danne en polarisert monolayer fra celler i 3D kultur, er det nødvendig å reprodusere samspillet mellom basolateral membran integrins av intestinal epitelceller og ekstracellulær matrix (EFM) proteiner. Laminin, kollagen IV, fibronectin og en rekke proteoglycans utgjør intestinal epithelial ECM. 21 , 22 vi sammenlignet menneskelige celle-avledet laminin, fibronectin, collagen IV og Trouble-avledet BMM som sett inn belegg. Bare kollagen IV støttes dannelsen av stabil, langsiktig (opptil 4 uker) confluent enteroid/colonoid monolayers (tall 1-2). Små flekker av monolayer-lignende vekst ble oppnådd på hver av de andre testet matriser, men disse områdene ikke videre til confluency. Bruk av menneskelige kollagen IV som ECM surrogat har en rekke fordeler. BMM avledet fra Engelbreth-Holm-sverm (EHS) murine sarkomspesialitet celler ikke er menneskets opprinnelse, mens menneskelige kollagen IV er kommersielt tilgjengelig og generelt mer kostnadseffektive. I tillegg til BMM er en kompleks blanding av proteiner med iboende variasjon, og kan inneholde vekstfaktorer utskilles av sarkomspesialitet som påvirker genuttrykk. 23
Interaksjoner mellom intestinal epitelceller og underliggende ECM i intestinal epithelial hvile er fortsatt ufullstendig forstått. Betydningen av kollagen IV, men ikke laminin, som en vedheft ligand for menneskelig colonocytes24 og enhancer intestinal krypten epithelial celle hvile25 har blitt foreslått bruker antistoffer mot kollagen IV som forhindret vedlegg . Epithelial uttrykt β1-integrin synes å være viktig for ECM interaksjon, som et antistoff som er spesifikke for β1-integrin betydelig blokkert vedheft av colonocytes skrive IV kollagen. 24 mens kollagen IV gir en pålitelig ECM for enteroid/colonoid monolayer formasjon på inserts, epithelial ombygging av ECM over tid ikke ennå blitt evaluert i denne modellen, eller har innflytelse mer komplekse og definerte ECM blandinger av kollagen IV, laminin og fibronectin.
Menneskelige enteroids/colonoids i monolayer-format (tall 1-4) aktiverer manipulasjoner og prøvetaking som ville være tungvint eller umulig å oppnå med 3D matrix-embedded kulturer. 3D enteroids/colonoids varierer i størrelse, strukturelle kompleksitet og luminal volum, og dermed microinjection av mikrober eller små molekyler er vanskelig å nøyaktig quantitate. I tillegg, i motsetning til monolayers (tabell 1) hindre 3D kulturer direkte tilgang til både luminal og basolateral overflater å måle ioner, næringsstoffer, cytokiner eller utskilles faktorer assosiert med fysiologiske eller pathophysiologic . Confluency (tall 1-2) er en av de viktigste egenskapene til enteroid/colonoid monolayer nødvendig for å etablere ikke bare fysiologiske gradienter av næringsstoffer, ioner, og andre makromolekyler,16 men også skape riktig barriere luminal bakterieflora og sterile mesenchymal/immun celle befolkede serosal miljøer. Disse fasetter er viktig å vurdere for fremtidige studier som innlemme enteroid/colonoid monolayers med mesenchymal, immun eller nevrale celletyper å bygge mer komplekse fysiologiske modeller.
Kjente begrensninger i celle kultur sett inn modellen beskrevet her inkluderer mangel på fysiske kreftene som flytende skjæring stress og mekanisk strekk/komprimering (peristalsis), og fraværet av en anaerob apikale miljø vanligvis oppleves av intestinal epithelia i vivo. Disse elementene har potensial til å bli behandlet med mer avanserte microphysiological plattformer,26 , men de krever også ekstra kostnad, utstyr og ekspertise til å implementere. Både 3D og monolayer kulturer er også uten interaksjon med eller bidrag fra intestinal microbiome stromal celle populasjoner og immunsystemet med mindre disse komponentene er målbevisst lagt.
Fremtidige anvendelser av enteroid/colonoid-monolayer på kollagen IV-belagt celle kultur setter kan inneholde andre studier av patogene eller commensal mikrobiell samhandling, narkotika eller nærings-opptak, toksisitet, metabolisme, barriere-funksjonen, og funksjonelle ekstrautstyr katalysert av co kultur med ekstra intestinal celletyper. Evalueringer kan gjøres ikke bare innen epithelia sunn givere, men også fra personer med genetiske mutasjoner eller tarm lidelser, forutsatt av i vivo fenotyper opprettes bevart i ex vivo enteroid/colonoid kultur.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd P01 AI125181 K01 DK106323 (JGI) og K01 DK113043 (JFA). Vi takker James Kaper (University of Maryland, Baltimore, MD, USA) for å gi E. coli belastning HS og EHEC. Vi erkjenner også integrert fysiologi og Imaging kjerner Hopkins Conte fordøyelsessystemet sykdom grunnleggende Translational Core-forskningssenter (P30 DK089502) og Johns Hopkins massespektrometri og Proteomikk kjernen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Sigma | T4661 | Tris base, Component of lysis buffer |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | ALK4/5/7 inhibitor |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of growth medium |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Fluorescent probe for F-actin |
| Antibiotic/antimycotic cocktail | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
| B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Component of growth medium |
| Cell culture inserts | Corning | 3470 | Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | GSK3β inhibitor |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | |
| Collagen IV, from human placenta | Sigma | C5533 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | Trevigen | 3700-100-01 | Depolymerizes basement membrane matrix |
| Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Epithelial voltohmmeter electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
| Escherichia coli strain HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Ethanol, absolute | Pharmco | 111000200 | |
| FluorSave mounting medium | Millipore | 345789 | For mounting insert membrane on microscope slide |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM |
| HEK293T/Noggin-Fc cell line | van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research | For production of Noggin conditioned medium | |
| HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line | Trevigen | 3710-001-K | For production of Rspondin-1 conditioned medium |
| HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Component of growth medium |
| Heraeus Multifuge X1R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescent nuclear dye |
| Human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-01M | Component of growth medium |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Component of lysis buffer |
| Inverted cell culture light microscope | Olympus | CKX51 | |
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| L-WNT3A cell line | ATCC | CRL-2647 | For production of Wnt3a conditioned medium |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356231 | Basement membrane matrix for 3D culture |
| Mini cell scraper | United BioSystems | MCS-200 | |
| MUC2 antibody, mouse monoclonal | Abcam | ab11197 | Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting |
| MUC2 shRNA lentiviral particles | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583 |
| Orbital shaker | Grant Instruments | PSU-10i | |
| Penicillin-streptomycin, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Component of growth medium |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-031 | |
| Probe sonicator with microtip | Branson Ultrasonics | 450 | |
| Protease inhibitor cocktail for mammalian cells | Sigma | P8340 | Component of lysis buffer |
| SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 MAPK inhibitor |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | Component of lysis buffer |
| Sodium dexoycholate | Sigma | D6750 | Component of lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L3771 | Component of lysis buffer |
| TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments |
| Vinculin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab129002 | Use at 1:1000 for immunoblotting |
| Water, tissue culture grade, sterile filtered | Corning | 25-055 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | RhoA/ROCK inhibitor |
References
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 633-642 (2016).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, e29132 (2017).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6, 301-319 (2018).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and Toxin Production by Clostridium difficile within Human Intestinal Organoids Result in Disruption of Epithelial Paracellular Barrier Function. Infection and Immunity. 83, 138 (2015).
- Foulke-Abel, J., et al. Human Enteroids as a Model of Upper Small Intestinal Ion Transport Physiology and Pathophysiology. Gastroenterology. 150, 638-649.e638 (2016).
- Yin, J., et al. Molecular Basis and Differentiation-Associated Alterations of Anion Secretion in Human Duodenal Enteroid Monolayers. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 591-609 (2018).
- Tse, C., et al. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)—Secreted Serine Protease EspP Stimulates Electrogenic Ion Transport in Human Colonoid Monolayers. Toxins. 10, 351 (2018).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue engineering. Part C, Methods. 19, 961-969 (2013).
- Wang, Y., et al. Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4, 165-182 (2017).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7, 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64, 911 (2015).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell–derived human enteroids. Science. 353, 1387 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- In, J., et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2, 48-62 (2016).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Vernetti, L., et al. Functional Coupling of Human Microphysiology Systems: Intestine, Liver, Kidney Proximal Tubule, Blood-Brain Barrier and Skeletal Muscle. Scientific Reports. 7, 42296 (2017).
- Noel, G., et al. Enterotoxigenic Escherichia coli is phagocytosed by macrophages underlying villus-like intestinal epithelial cells: modeling ex vivo innate immune defenses of the human gut. Gut Microbes. 9, 382-389 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Johansson, M. E. V., Sjövall, H., Hansson, G. C. The gastrointestinal mucus system in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, 352-361 (2013).
- Hews, C. L., et al. The StcE metalloprotease of enterohaemorrhagic Escherichia coli reduces the inner mucus layer and promotes adherence to human colonic epithelium ex vivo. Cellular Microbiology. 19, e12717 (2017).
- Laurie, G. W., Leblond, C. P., Martin, G. R. Localization of type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and fibronectin to the basal lamina of basement membranes. The Journal of Cell Biology. 95, 340 (1982).
- Timpl, R. Macromolecular organization of basement membranes. Current Opinion in Cell Biology. 8, 618-624 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, 1886-1890 (2010).
- Ishii, S., et al. Normal colonic epithelium adheres to carcinoembryonic antigen and type IV collagen. Gastroenterology. 106, 1242-1250 (1994).
- Moore, R., Madri, J., Carlson, S., Madara, J. L. Collagens facilitate epithelial migration in restitution of native guinea pig intestinal epithelium. Gastroenterology. 102, 119-130 (1992).
- Bein, A., et al. Microfluidic Organ-on-a-Chip Models of Human Intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 659-668 (2018).
