Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

بروتوكول جديد لتوليد الخلايا العصبية المناعية الفسيولوجية

Published: May 17, 2019 doi: 10.3791/59370
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1
1Department of Dermatology, Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department, University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

وقد تم تطوير الجهاز أو لوحه والبروتوكولات ذات الصلة (TI) لتكرار السمات الرئيسية للعلاج الكيميائي الضوئي خارج الجسد (ECP) ، في بيئة تجريبية ، مما يسمح لإنتاج المنشطة فسيولوجيا ، الشجيري خلايا (DCs) للعلاج المناعي للسرطان.

Abstract

العلاج الكيميائي الضوئي خارج الجسد (ECP) هو العلاج المناعي السرطان المستخدمة علي نطاق واسع لخلايا الغدد الليمفاوية الجلدية T (CTCL) ، المنطوق في أكثر من 350 المراكز الجامعية في جميع انحاء العالم. وفي حين ان الفعالية السريرية لهذا الصندوق والصورة المثالية للسلامة قد دفعت إلى استخدامه علي نطاق واسع ، فان توضيح أليات الاساسيه ظل يشكل تحديا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود نموذج لمختبر ECP. للتغلب علي هذه العقبة وإنشاء منصة بسيطه سهله الاستخدام للبحوث ECP ، قمنا بتطوير نسخه خفضت إلى أسفل من السريرية ECP الكريات البيضاء تجهيز الجهاز ، ومناسبه للعمل مع كل من نماذج الماوس ، وعينات الدم البشري الصغيرة. ويسمي هذا الجهاز الغرفة (TI) Transimmunization ، أو لوحه. في سلسله من التجارب التاريخية ، تم استخدام الجهاز المصغر لإنتاج لقاح خلوي الذي بدا بانتظام المناعة العلاجية المضادة للسرطان في عده نماذج ورم الفئران المتزامنة. عن طريق أزاله العوامل الفردية من النظام التجريبي والتحقق من مساهمتها في الجسم المضاد للورم الاستجابة ، ثم قمنا بتوضيح المحركات الميكانيكية الرئيسية من القدرة المناعية ECP. بشكل جماعي ، كشفت نتائجنا ان الآثار المضادة للورم من ECP هي التي بداتها الخلايا الجذعية (DC) ، التي تولد من الناحية الفسيولوجية من خلال التفاعل الكريات الدم مع الصفائح الدموية في لوحه TI ، ومحمله مستضدات من الخلايا السرطانية التي خليه ابوتوتيك يتم معايره الموت بدقه عن طريق التعرض للحمض النووي photoactivatable الصليب--ربط وكيل 8-methoxypsoralen والضوء UVA (8-ممسحةA). عندما عاد إلى الماوس ، وهذا اللقاح الخلوي يؤدي إلى مناعة الخلية المضادة للورم محدده وقابله للتحويل. تحققنا من ان غرفه TI هي أيضا مناسبه لمعالجه الدم البشري ، وإنتاج الإنسان DCs قابله للمقارنة تماما في حاله التنشيط والملف الشخصي لتلك المستمدة من غرفه ECP السريرية. وتهدف البروتوكولات المعروضة هنا للدراسات ECP في الماوس والرجل ، والجيل الذي تسيطر عليه من خلايا الورم ابوتوتيك مع 8-ممسحةا، والإنتاج السريع للإنسان الفسيولوجي والماوس وحدات التحكم الذاتي المشتقة من الخلية لمجموعه متنوعة من التطبيقات.

Introduction

العلاج الكيميائي الضوئي خارج الجسد (ECP) هو العلاج المناعي المعمول به علي نطاق واسع في المراكز الجامعية في جميع انحاء العالم. وقد تم استخدامه من قبل الانتقائية فريدة من نوعها ، والسلامة ، وفعالية ثنائيه الاتجاه من العلاج ECP ، والصفات التي تشارك ECP مع الجهاز المناعي الفسيولوجي نفسها التي يبدو ان شريك. يقوم ECP بشكل انتقائي بتحصين الخلايا الخبيثة في الغدد الليمفاوية للخلايا التائية (ctcl)1،2، والتحمل الانتقائي للمستضدات المستهدفة في الزرع ، والمناعة الذاتية ، وإعدادات مرض الكسب غير الصالح للمضيف (gvhd) 3 , يتم تسليط الضوء علي 4.the والاستمناع من ECP من قبل الاعتماد علي مقصوره الخلية CD8 T سليمه في ctcl5، في حين تنعكس خصوصية من قبل ECP الشخصية رد فعل سلبي مواتيه جدا ، مع عدم وجود قمع المناعي خارج الهدف في زرع أو إعدادات GvHD ، وليس زيادة قابليه العدوى الانتهازية في CTCL ، حيث غير المسببة للامراض T الخلايا المستنسخة يمكن ان تضيع جنبا إلى جنب مع الخلايا الخبيثة T.

النظر إلى الاهميه السريرية لECP ، فان الأمل في ان يؤدي فهم أفضل للياته إلى توسيع نطاق العلاج العلاجي لهذا الهدف إلى طيف أوسع من السرطانات والاضطرابات المناعية قد حفز الاهتمام الدولي. وأجريت حلقتا عمل بشان الجزاءات علي الصعيد الوطني ، هما الندوة السادسة للدولة المعنية بالعلوم الصحية التابعة لمعاهد الصحة ، والمؤتمر السابع للجمعية الامريكيه من أجل التوصل إلى توافق في الآراء ، بهدف التعجيل ب تحديد المساهمين الخلويين الرئيسيين في التاثيرات المضادة للسرطان والتحمل في ECP.

وحتى الآن ، وعلي الرغم من كثرة التقارير المنشورة التي تحاول معالجه اليه العملية ، فان عقبتين رئيسيتين أعاقت التقدم العلمي. أولا ، كان التحقيق في أليات ECP في اعداد المختبر التجريبي محدودا بسبب نقص جهاز ECP المصغر الذي يعكس تماما تاثيرات ECP الخلوية والمجرية ، ويكون قابلا للتطبيق علي النماذج الحيوانية. ثانيا ، تم تقييد التحليل المختبري المتعمق لعينات ECP في البيئة السريرية بالتوافر المحدود للخلايا المناعية للمرضي المجهزة بواسطة ECP ، والتي تتطلب الوصول إلى مراكز العلاج ، وتخضع بالاضافه إلى ذلك لتوقيت ضخ المريض ، والحاجة الاخلاقيه لمجموعات غير القابلة للخطر من الكريات البيضاء التي غرسها المريض.

ولحل العقبات التي تعرقل تقدم البحوث المتعلقة بعمليه التعاون الموسع ، وضعنا لتطوير جهاز مصغر لECP من شانه ان يحاكي بشكل وثيق العناصر الرئيسية للعلاج. العلاج القياسي ECP ينطوي علي مرور الكريات البيضاء المخصب المريض من خلال 1 مم-سميكه ، الاشعه فوق البنفسجية ضوء (UVA)-شفافة ، لوحه من البلاستيك6،8. في لوحه ، وتتعرض الكريات البيضاء إلى 8-methoxypsoralen (8-ممسحة) ، وهو عامل الصور المنشطة التي علي التعرض للاشعه فوق البنفسجية تحولت بشكل عابر إلى نموذج رد الفعل (8-ممسحةا) ، قادره علي الصليب الحمض النووي عبر ربط لها ربط التكافؤ إلى قواعد بيريميداين علي الأخت الحمض النووي فروع9،10. يتم جمع الكريات البيضاء المعالجة ، 8-ممسحة وإرجاعها عن الوريد للمريض.

منذ ECP نفسه هو العلاج ثنائي الاتجاه ، وتحصين في السرطان والتسامح في زرع ، المناعة الذاتية وإعدادات GvHD ، للتوضيح قمنا بتسميه نموذج التمنيع ECP في وضع "transimmunization" ، ووضع التحمل "transtاوليزيشن". وركزنا أولا علي طريقه التركيز العابر. لدينا مؤخرا المصغرة تحجيم الماوس إلى الرجل ECP الجهاز ، وغرفه النقل (TI) أو لوحه ، والبروتوكول المقابل ، وأعاده إنتاج كل من الآثار الخلوية والمجرية من الجهاز البشري ECP في اعداد السرطان11.

من أجل جعل transimmunization في نموذج الجسم الصناعي كما ذات الصلة سريريا قدر الإمكان ، بدانا العلاج المناعي بعد جلد حقن الفئران المتزامنة الأورام أصبح واضحا ، التالي اختبار فعاليه البروتوكول في السرطان المعمول بها. المثل إلى ECP في CTCL ، فان البروتوكول الذي يثبت المبدا للتنقيط في نموذج YUMM 1.7 من الميلانوما يستخدم خلايا كريات الدم الاحاديه الطرفية (PBMC) من الماشية الحاملة للورم. يتم تمرير الخلايا من خلال لوحه TI تحت التدفق. في حين ان 8 -mop علاج الخلايا في غرفه مصغره من الممكن ، فمن الأفضل لاجراء ذلك بشكل منفصل ، للتاكد من ان نوع الخلية المطلوب فقط يتعرض لل 8-mopا. وتشير الدراسات السابقة إلى ان التاثير المحتمل لECP هو توسط من قبل 8-MOP المصابة مستضد-تقديم الخلايا12، في حين ان تاثير التحصين يتطلب 8-ممسحة أصابه الخلايا السرطانية المستهدفة11. في ال [ترنسسمبموايشن] بروتوكول اما الورم خلايا, أو ال [ايمون سل], يستطيع كنت بشكل انتقائي كشفت إلى [8-MOP][ا ] بما ان يحتاج. منذ تعظيم الوقت من الاتصال بين 8-ممسحة الخلايا السرطانية المصابة والخلايا الجذعية الناجمة عن ECP (DC) وقد ثبت ان يعزز إلى حد كبير قدره العلاج المناعي لل ecp السريرية13، ونحن أدرجت بين عشيه وضحيها المشاركة في حضانة خطوه في بروتوكول لدينا. بعد الحضانة بين عشيه وضحيها ، يتم إرجاع الخلايا المعالجة إلى الحيوانية الحاملة للورم.

هذا النظام يقلل بشكل موثوق نمو الورم وبدات المناعة المضادة للورم محدده في الفئران مع الأورام التركيبية الراسخة11، وسمح لنا لتشريح اليه السريرية لمكافحه الورم فعاليه المضادة للورم. في العديد من الدراسات وقد أظهرنا ان يتم البدء في الحصانة ECP من خلال تفعيل الصفائح الدموية السابقة في لوحه TI14,15. الصفائح الدموية المنشطة في وقت لاحق اشاره إلى نضوج الخلية الاحاديه إلى الجذعية14، مما يؤدي إلى إنتاج DCs الفسيولوجية. الخلايا النامية المشتقة حديثا هي قادره علي العرضية مستضدات المستوعبة من 8-MOP الأورام التالفة لتنشيط الاستجابات الخلية T الخاصة antigen16. وكما اقترح سابقا12،17، ومع ذلك، فان 8-MOP الاضرار الناجمة عن الناشئة DCs أنفسهم يمكن ان المضادة أو حتى عكس تاثير المضادة للورم11، وتوفير وصله ميكانيكيه للتسامح ECP.

كما تم استخدام لوحه TI لإنتاج DCs المنشطة فسيولوجيا من PBMC البشرية. المثل للدراسات الماوس ، وتعتمد DCs الإنسان المستمدة من لوحه المرور في وجود الصفائح الدموية لجيلهم ، وتظهر متطابقة ظاهريا لهذه المنتجة في لوحه ECP السريرية ، وقادره علي معالجه بكفاءة عبر تقديم مستضدات الورم البشري لتنشيط خلايا T البشرية11,16.

في الكشف عن اليه العلاج المناعي ECP ، ولذلك فقد كشفنا عن طريقه لتوليد بسرعة الفئران الفسيولوجية والخلايا البشرية الجذعية من خصوصية مستضد المطلوب ، التي يمكن التضمين وظيفيا. الجهاز TI مبتكره والبروتوكول لها اهميه كبيره محتمله في مجالات البحث والعلاج ECP والسرطان المناعي أكثر علي نطاق أوسع ، وفي اي مجال آخر مع الاهتمام في الفسيولوجية ، والخلايا الوظيفية الجذعية في اما المناعية أو طريقه التسامح. ونامل ان يوفر هذا المنشور الاداات اللازمة لمن لهم اهتمام بمجالات البحث هذه.

Protocol

تمت الموافقة علي جميع طرق الفاره الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات (IACUC) في جامعه ييل ، بالاتفاق مع المعاهد الوطنية لإرشادات الرعاية الصحية للحيوانات. وأجريت جميع الدراسات البشرية بالدم المتبرع به من قبل متطوعين أصحاء ، مع موافقه خطيه مستنيرة. أجريت دراسات الدم البشري وفقا للمبادئ التوجيهية الاخلاقيه المعترف بها (علي سبيل المثال ، إعلان هلسنكي ، CIOMS ، تقرير بلمونت ، القاعدة الامريكيه المشتركة) ، وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة البشرية في جامعه ييل ببموجب البروتوكول رقم 0301023636.

ملاحظه: وفيما يلي البروتوكول الذي يصف العلاج المضاد للورم من الأورام المتزامنة الماوس.

1. سينجينيك YUMM 1.7 غرس الأورام

  1. اتبع البروتوكولات المعمول بها لزرع الأورام المتزامنة في الاجنحه من الفئران بما يتناسب مع خط الخلايا السرطانية من الفائدة.
    ملاحظه: يصف البروتوكول الوارد أدناه نموذج ورم الميلانوما الفار من YUMM 1.7 C57BL/6. تم التكرم بتوفير الخلايا الميلانوما من YUMM 1.7 من قبل الدكتور Bosenberg ، يال18.
  2. ذوبان الجليد المجمدة من الخلايا واستخدام الخلايا بعد مرور خليه واحده. الثقافة المذابة الطازجة YUMM 1.7 الخلايا في الخليط الغذائية النسر المعدلة في دولبيكو والمتوسطة F-12 (DMEM/F12) ، وتستكمل مع 10 ٪ مصل البقر الجنين الحرارة المعطلة ، 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين ، و 1 ٪ من الأحماض الامينيه غير الاساسيه ، تحت القياسية الانسجه ثقافة الظروف (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2).
    1. جمع YUMM 1.7 الخلايا في 60 \ u201270 ٪ التقاء عن طريق أضافه ما يكفي من التريبسين-أدتا لتغطيه الجزء السفلي من لوحه ثقافة الخلية أو قارورة (علي سبيل المثال ، 4 مل للزجاجة T75).
    2. بقية السفن ثقافة الخلية في درجه حرارة الغرفة ل 3 \ u20124 min ، والتنصت برفق علي الجزء السفلي أو الجانبين من السفينة في بعض الأحيان للمساعدة في فصل الخلايا.
    3. أضافه 1 مل من مصل الأبقار الجنينية (سيتم) لكل 4 مل من حمض التريبسين-ايثيلنديديبيناتيتاسيتيك (أدتا) لوقف رد الفعل بمجرد فصل معظم الخلايا. جمع الخلايا عن طريق الأنابيب في أنبوب مخروطي 15 مل. اشطف القارورة بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات وأضف الشطف إلى نفس أنبوب التجميع. ملء الأنبوب إلى 15 مل مع تلفزيوني.
    4. اخرج قليلا من الأمعاء وعد الخلايا.
    5. تدور لمده 10 دقيقه في 250 x g في الجهاز المركزي للثقافة الانسجه الاساسيه لجمع الخلايا السرطانية.
  3. أعاده التعليق YUMM 1.7 الخلايا في الاذاعه التلفزيونية في كثافة من 1 × 106 خلايا/مل.
  4. حقن 1 × 105 yumm 1.7 الخلايا السرطانية جلد في 100 ΜL من تلفزيوني في الاجنحه اليمني من المتلقي 4 إلى 6 أسابيع من العمر البرية الذكور C57BL/6j الفئران ، تخدير وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية (علي سبيل المثال ، 3 \ u20125 ٪ ايزوفلوان استنشاق الغاز ، والتخدير أكدت بسبب عدم وجود الخلفية مخلب قرصه المنعكس).
  5. رصد حجم الورم عن طريق قياسات ثنائيه الاسبوعيه من أقطار الورم عمودي والارتفاع باستخدام الفرجار. احسب YUMM 1.7 (حجم الورم كطول الورم × العرض × الارتفاع)/2.
  6. البدء في العلاج بالتنقيط عندما تصبح الأورام واضحة فقط. ل YUMM 1.7 الأورام ، وهذا هو عاده يوم 7 \ u201210 آخر زرع الورم.

2-جمع الخلايا الاحاديه النواة للدم الطرفية للترانسيمونايشن

  1. جمع 100 \ u2012150 μL من الدم من كل الماوس التي تحمل الورم عن طريق نزيف الخد.
  2. كما يتم جمع الدم ، تجمع الدم من كل مجموعه العلاج الماوس (كل 5 الفئران التجريبية + 5 الفئران التحكم) في واحده 15 مل أنبوب يحتوي علي 5,000 U/mL الهيبارين. استخدام 10 μL من 10 ٪ الهيبارين لكل 100 μL الدم التي تم جمعها.
    ملاحظه: اخلط الأنبوب بشكل متكرر اثناء الجمع لتجنب تخثر الدم. في حين ان السيطرة علي الفئران الحاملة للورم يمكن ان تنزف في نفس الوقت الفئران التجريبية ، لضمان ظروف متساوية مع مجموعه العلاج ، يمكن ان يكون الدم "السيطرة" اما التخلص منها ، أو الجمع بين الدم من مجموعه العلاج لتوفير اضافيه التجريبية PBMC لمجموعه العلاج ، وفقا لتقدير المحققين.
  3. اعداد أنبوب 1 15 mL مع 4 مل من اللمفاوية العزلة المتوسطة (انظر جدول المواد) لكل 5 \ u201210 الفئران نزفت. ببطء طبقه الدم (التي تم جمعها من الفئران الحاملة للورم) علي راس المتوسطة. تدور الخلايا لمده 20 دقيقه في 1000 \ u20121 ، 500 س ز لفصل pbmc من خلايا الدم الحمراء.
  4. في نهاية طرد ، وجمع اعلي طبقه البلازما ، وترك ~ 0.5 mL المتبقية فوق معطف بافي ، وتخزين في 4 درجهمئوية لاستخدامها في وقت لاحق (الخطوة 7.1).
  5. جمع طبقه بوفي معطف في أنبوب 15 مل نظيفه ، وملء مع برامج تلفزيونيه إلى 15 مل ، وتدور لمده 10 دقيقه في 250 x g في النسيج المركزية ثقافة الانسجه الطاردة لجمع pbmc.
  6. ماصه pipet-x بعناية قباله supernatant ، وأعاده تعليق بيليه عن طريق تحريك الأنبوب. لا decant ، كما بيليه لينه ويمكن ان تضيع. أضافه 2 مل من ACK خليه الدم الحمراء تحلل العازلة (انظر جدول المواد) إلى أنبوب لأزاله اي خلايا الدم الحمراء المتبقية من pbmc. احتضان علي الجليد لمده 10 دقيقه.
  7. ملء أنبوب مع تلفزيوني إلى 15 مل ، وتدور لمده 10 دقيقه في 250 x g في الجهاز المركزي لجمع الطاردات النسيجية النسيج القياسية لتجميع pbmc.
  8. ماصه pipet-x بعناية قباله supernatant ، وأعاده تعليق بيليه عن طريق الوخز. لا decant ، كما بيليه لينه ويمكن ان تضيع.
    ملاحظه: في هذه الخطوة ، يمكن تعديل PBMC المنقي كما يناسب أفضل التجربة. يمكن للمكونات PBMC المختلفة (الصفائح الدموية ، الخلايا الاحاديه ، أنواع الخلايا المناعية الأخرى) ان تستنفد أو تعزل عن PBMC حسب الحاجة. أيضا ، يمكن ان يتعرض PBMC أنفسهم إلى 8-ممسحةA، اما قبل أو بعد القسم 4 (قبل أو بعد مرور لوحه-بعد القسم 2 أو قبل القسم 5) ، من خلال اتباع الخطوات بروتوكول 3.3 \ u 20123.8 واستبدال pbmc ل yumm 1.7 الخلايا. وهذا سيتم اقتطاع القدرة المناعية للعلاج ، وبدلا من ذلك تعزيز التسامح المناعة.
  9. لكل مجموعه العلاج (كل 5 الفئران التجريبية + 5 الفئران التحكم) ، أعاده تعليق بيليه PBMC في 300 μL.

3.8-MOP/UVA العلاج من الخلايا السرطانية

  1. الثقافة وجمع الخلايا السرطانية YUMM 1.7 كما هو موضح في الخطوات من 1.2إلى 1.3 لاعداد مصدر مستضد الخلايا السرطانية المكشوفة 8 ممسحة.
  2. اعداد 2.5 × 106 yumm 1.7 الخلايا السرطانية لكل مجموعه العلاج من 5 الفئران. لكل مجموعه العلاج ، أعاده تعليق بيليه الخلايا السرطانية في الخلية في 2.5 × 106 خلايا/300 μl (~ 8.33 x 106 خلايا/مل).
  3. مع الانسجه الثقافة هود أضواء قباله ، أضافه 8-ممسحة (انظر جدول المواد) إلى التعليق الخلايا السرطانية yumm 1.7 لتركيز النهائي 8-ممسحة من 100 Ng/mL.
    تحذير: 8-ممسحة هو عامل الحمض النووي الضارة فوتواكتيكتابل ومسرطنه. توخي الحذر عند المناولة والاستغناء ، وتجنب ملامسه الجلد المكشوف ، وتجاهله بشكل مناسب.
  4. تخلط الخلايا جيدا ، والتفاف الحاوية الخلية في رقائق القصدير ، واحتضان لمده 20 دقيقه في 37 درجهمئوية.
  5. قبل معطف لوحه ثقافة الانسجه 12 بئر من خلال ملء واحده جيدا لكل مجموعه العلاج من 5 الفئران (2.5 x 106 yumm الخلايا السرطانية 1.7) مع 1 مل من ، والمبردة لوحه مملوءة لمده 20 دقيقه في 4 درجهمئوية.
  6. قم بتشغيل مصدر الضوء UVA لتسخينه مسبقا.
    تحذير: ضوء UVA هو مسرطن. عند العمل مع مصادر الضوء UVA تعمل بسرعة وبعناية ، وحماية الجلد من التعرض ، واستخدام الدروع الوجه أو نظارات واقيه لحماية الوجه والعينين.
  7. بعد 20 دقيقه ، ونقل المبردة 12 بئر لوحه (الخطوة 3.5) إلى غطاء الانسجه الثقافية ، وأزاله الآبار التابعة لل ، وأضافه 300 μL (2.5 x 106 خلايا/بئر) الخلايا السرطانية المكشوفة الممسحة (من الخطوة 3.4) في البئر.
  8. تعرض الصفيحة المحتوية علي الخلية لمصدر الضوء الذي تم تسخينه مسبقا للاشعه الاجماليه من 4 J/cm2.
    ملاحظه: يتم معايره تركيز 8 ممسحة وجرعه UVA الموصوفة هنا لخط الخلايا السرطانية YUMM 1.7. وينبغي اجراء المعايرة بالنسبة لجرعه 8-ممسحة/UVA ، كافيه للتسبب 100 ٪ وفاه الخلايا السرطانية في غضون أسبوع واحد من التعرض ، لكل خط الخلايا السرطانية التجريبية ، من أجل تحديد جرعه قتل فعاله. وهذا أمر مهم للغاية بالنسبة للماوس في المجرية التجارب TI ، لان الخلايا هي يعاد إدخالها الرجعية المدارية (الخطوة 6.1) التالي اي خلايا الورم غير التالفة قد تشكل أورام العين في الحيوانية المعالجة. كمبدا توجيهي ، 4 \ u20128 J/سم2 من UVA ، 100 \ u2012200 Ng/mL 8-MOP ، هو النطاق الفعال النموذجي لمعظم خطوط الخلايا السرطانية.
  9. جمع 8-ممسحةالخلايا السرطانية المعالجة من كل بئر ، ويحوم لوحه والأنابيب بعناية لضمان استعاده الخلايا الكاملة.

4. لوحه TI مرور الخلايا

  1. لكل مجموعه العلاج من 5 الفئران ، والجمع في واحد 1.5 مل أنبوب مخروطي 300 μL من PBMC المناسبة (من الخطوة 2.11) و 300μl من 8-ممسحة الخلايا السرطانية المعالجة (من الخطوة 3.9). اخلط الخلايا.
  2. استخدام حقنه 10 مل لملء "مدخل" و "خروج" مجموعات من الأنابيب TI (انظر
    جدول المواد) مع المنفذ. فتح المشابك أنابيب لملء الأنابيب ، وإغلاق المشابك مره واحده يتم ملء الأنابيب قبل فصل الحقنه ، للاحتفاظ بالأسطوانات داخل الأنابيب.
  3. استخدام ماصه P1000 لأضافه PBMC ومزيج الخلايا السرطانية (من الخطوة 4.1) إلى لوحه TI (انظر جدول المواد). امسك الصفيحة بزاوية 45درجه ، ضع طرف الماصة بشكل أمن في كميه لوحه TI ، وأملا الطبق ببطء ، وتجنب الفقاعات.
  4. قم بازاله طرف الماصة من الكمية قبل الإفراج عن مكبس الماصة. لوحه يحمل 450 μL; إرجاع الخلايا المتبقية إلى أنبوب مخروطي 1.5 mL.
  5. احتضان الأنابيب المملوءة بالأسطوانات ، ولوحه TI المليءه بالخلايا ، والأنبوب المخروطي 1.5 mL الذي يحتوي علي الخلايا المتبقية في حاضنه ثقافة الانسجه في 37 درجهمئوية لمده 1 ساعة. بعد الحضانة ، إفراغ الأنابيب TI عن طريق الجاذبية ، والإفراج عن المشابك.
  6. استخدم ماصه P1000 لأزاله الخلايا من لوحه TI عن طريق إدخال طرف الماصة مع المكبس المكتئب في منفذ اللوحة. امسك الصفيحة بزاوية 45درجه وأملا طرف الماصة P1000. وضع الخلايا مره أخرى في أنبوب المخروطية 1.5 mL الأصلي.
  7. لتشغيل لوحه TI ، قم بتوصيل أنبوب الخروج إلى لوحه وتامين لوحه TI في لوحه تشغيل النظام.
  8. باستخدام حقنه 1 مل ، ورسم ما يصل 600 μL من PBMC ومزيج الخلايا السرطانية من أنبوب مخروطي 1.5 mL ، والتخلص من اي فقاعات في الحقنه ، ونعلق حقنه إلى أنبوب مدخل مع المشبك مفتوحة وملء ببطء حتى يصل السائل إلى نهاية الأنابيب.
  9. قم بتوصيل الطرف الحر لأنبوب المدخل بلوحه TI واستمر في تحميل الحجم المتبقي برفق. اغلق المشبك المدخل.
  10. افصل حقنه 1 مل وقم بتوصيل أنبوب المدخل بمضخة الحقنه. تامين أنابيب الخروج إلى أنبوب مخروطي نظيفه 1.5 mL لجمع الخلايا.
  11. ضبط معدل تدفق مضخة حقنه إلى 0.09 mL/min ، ولكن لا تبدا المضخة حتى الآن. أماله لوحه TI ~ 30درجه نحو الجانب مضخة حقنه ، وذلك باستخدام لوحه ti تشغيل منصة أو اي وسيله أخرى (علي سبيل المثال ، كائن مسطح صغير تحت واحده من نهاية لوحه).
  12. الإفراج بعناية المشبك علي أنابيب المدخل. بدء ضخ حقنه ، ومراقبه بعناية كيف لوحه TI يملا ، ونفض الغبار الأنابيب أو لوحه حسب الضرورة يجب ان اي فقاعات الهواء تعيق تدفق.
  13. مره واحده يتم تعبئة لوحه TI تماما ، أماله ~ 30درجه في الاتجاه المعاكس لأنه يفرغ. عندما تكون جميع الخلايا والسائل في أنبوب جمع المخروطية 1.5 mL ، وقف المضخة.
  14. لغسل لوحه TI ، قطع الأنابيب مدخل من مضخة حقنه ، والاتصال إلى حقنه 1 مل مليئه 600 μL ، واتبع الاجراء للخطوات 4.8 \ u 20124.9.
  15. ضبط معدل تدفق مضخة حقنه إلى 0.49 mL/min ، والإفراج عن مدخل المشبك ، وتشغيل لوحه TI كما هو موضح في الخطوات 4-12 \ u 20124.13 ، وجمع يغسل في نفس أنبوب 1.5 mL المخروطية. نفض الغبار أو الاستفادة من لوحه TI بلطف طوال الوقت ، للمساعدة في فصل والتملص من اي خلايا ملتصقة.
  16. تدور مجموعه 1.5 mL أنبوب مخروطي الشكل في الأنابيب المجهرية علي السطح في 250 x g ل 8 دقيقه. تجاهل supernatant.

5. اعداد مصل الماوس الذاتي للثقافة الليلية المتوسطة

  1. جمع الدم من 10 \ u201212 الأسبوع القديم C57BL/6J الفئران من قبل اي طريقه المعتمدة مؤسسيا (علي سبيل المثال ، نزيف العين ، نزيف الوريد الذيل ، نزيف الخد ، أو الطرفية نزيف الخروج عن طريق ثقب القلب) ، دون اي مضادات التخثر. تقدير جمع 1 مل من الدم لكل 300 μL من المصل اللازمة.
    ملاحظه: واحد سيحتاج 300 μL من المصل لكل مجموعه العلاج من 5 الفئران في التجربة.
  2. السماح للدم لتجلط بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  3. تدور أسفل الدم المتخثر في 3,000 x g لمده 15 دقيقه. جمع بعناية اعلي طبقه المصل التي تحتوي علي
    ملاحظه: ويمكن استخدام المصل علي الفور لجعل حضانة الخلية بين عشيه وضحيها المتوسطة (الخطوة 6.1) ، أو الحفاظ عليها للتجارب في المستقبل. للحفاظ علي المصل ، وتجميد في الارصفه في-20 درجه مئوية.

6. بين عشيه وضحيها المشتركة حاضنه PBMC مع مستضد

  1. أعاده التعليق PBMC والورم بيليه الخلية (الخطوة 4.5) في 2 مل من RPMI واضحة مع 15 ٪ مصل الماوس الذاتية (أعدت في الخطوة 5). لوحه في 35 mm غير الانسجه ثقافة معالجه طبق معقم ، واحتضان بين عشيه وضحيها تحت ظروف الانسجه القياسية الثقافة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2).
    ملاحظه: إذا تم استخدام PBMC مع مستضد غير الخلوية (الببتيد ، جسيمات متناهي ، البروتين ، الخ) ، وحذف القسم 3 من البروتوكول ، والمضي قدما من القسم 2 مباشره إلى القسم 4 ، مضيفا مستضد المطلوب لل TI لوحه التمرير PBMC لفتره الليل المشاركة في الحضانة هنا في الخطوة 6.1.
  2. في اليوم التالي ، فصل بعناية اي خلايا ملتصقة من الجزء السفلي من الطبق مع مكشطه ثقافة الانسجه ، وتناوب الطبق في حين كشط لضمان جمع الخلايا حتى. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل.
  3. أضافه 2 مل تلفزيوني إلى الطبق وكرر خطوه تجريف ، وجمع الخلايا في نفس الأنبوب. شطف الطبق 35 مم مع 1 مل تلفزيوني وأضافه شطف إلى نفس الأنبوب.
  4. تدور لمده 10 دقيقه في 250 x g في الجهاز الطرد المركزي ثقافة الانسجه القياسية لجمع الخلايا. ماصه pipet-x بعناية قباله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه عن طريق تحريك الأنبوب. لا decant ، كما بيليه لينه ويمكن ان تضيع.

7-أعاده حقن الخلايا المعالجة بالأورام في الفئران الحاملة للورم

  1. تدور البلازما الذاتية (أعدت في الخطوة 2.4) في 750 x g لمده 15 دقيقه إلى الرواسب اي الجسيمات. أعاده تعليق الخلية بيليه (من الخطوة 6.4) في 600 μL من البلازما الذاتية أو تلفزيوني.
  2. حقن الخلايا في 100 μL لكل ماوس في الضفيرة المدارية الرجعية من تخدير مناسب (علي سبيل المثال ، 3 \ u20125 ٪ ايزوفلواني غاز الاستنشاق ، وأكد التخدير من نقص الخلفية مخلب قرصه المنعكس) الفئران التجريبية التي تحمل الورم. إذا رغبت في ذلك, أعاده حقن السيطرة علي الفئران التي تحمل الورم مع 100 μL من البلازما الذاتية وحدها, أو تلفزيوني.
  3. بالنسبة للفئران الحاملة للورم من YUMM 1.7 ، كرر العلاج (الخطوات 2 – 7.2) مرتين في الأسبوع لمده 3 أسابيع ، لما مجموعه 6 علاجات. جمع ومعالجه PBMC من الفئران الحاملة للورم أسبوعيا (أقسام البروتوكول 2 \ u20124) يومي الاثنين والخميس ، وأعاده بث بعد الحضانة بين عشيه وضحيها (بروتوكول الأقسام 5 \ u20127) في أيام الثلاثاء والجمعة.
    ملاحظه: تم تطوير هذا النظام العلاج لحركيه النمو محدده من الأورام YUMM 1.7 في الفئران. قد تحتاج إلى معايره لأنظمه الأورام الأخرى مع معدلات نمو الورم إبطا أو أسرع — علي التوالي زيادة أو تقليل عدد العلاجات.
  4. رصد حجم الورم عن طريق قياس ثنائي الاسبوعيه — ويفضل في وقت أداره العلاج (الثلاثاء والجمعة) — من أقطار الورم عمودي والارتفاع باستخدام الفرجار. إنهاء التجربة عند التحكم في احجام الأورام التي تصل إلى الحجم الأقصى المسموح به من قبل الإرشادات والبروتوكولات المؤسسية.

8. بروتوكول التكيف لعلاج كميات صغيره من الدم البشري

  1. تكييف البروتوكول للاستخدام مع الخلايا البشرية عن طريق عزل PBMC أولا من الدم البشري. استخدام الهيبارين كمضاد للتخثر ، مع اي بروتوكول العزلة PBMC المفضل.
  2. تاكد من ان كسر PBMC المعزول يحتوي علي عدد من الصفائح الدموية ، للحصول علي أفضل نتائج البروتوكول. مراقبه الصفائح الدموية التهم قبل وبعد PBMC العزلة باستخدام اي عداد الدم القياسية.
  3. إذا كنت تستخدم مصدر مستضد الخلوية البشرية ، وعلاج الخلايا البشرية انتيغينيك اتباع الخطوات الموضحة في القسم 3 ل YUMM 1.7 الخلايا. معايره 8-ممسحة وجرعات UVA وفقا لذلك.
  4. تنفيذ الخطوات لوحه المرور الموصوفة في القسم 4 ، وذلك باستخدام ما يصل إلى 3 × 107 pbmc لكل لوحه TI.
  5. الثقافة PBMC بين عشيه وضحيها مع الخلوية/غيرها من مستضد الاختيار ، كما هو موضح في القسم 6 ، ولكن بديل 15 ٪ الإنسان AB المصل لبلازما الماوس الذاتي لوسط الثقافة بين عشيه وضحيها في الخطوة 6.1.
  6. استخدام الخلايا الناتجة في اي فحص المطلوب. علي سبيل المثال ، الثقافة المشتركة مع خلايا T التفاعلية المتفاعلة لمراقبه استجابات خلايا T الخاصة antigen التي بداتها الخلايا المعالجة TI.

Representative Results

قمنا مؤخرا بتطوير جهاز الماوس إلى الرجل للتحجيم مصغره ECP ، لوحه TI (الشكل 1A) ، وتصميم بروتوكولات العلاج المقابلة. ويعيد الجهاز والبروتوكول إنتاج السمات الخلوية والمجرية الحيوية لتحصين ECP ، الذي يطلق عليه اسم "transimmunization".

ويتكون البروتوكول11 لإثبات المبدا (الشكل 1b) من المرور المادي للخلايا الاحاديه النواة للدم الطرفي (pbmc) من الفئران الحاملة للورم مع الخلايا الدموية 8-ممسحةA– المكشوفة الخلايا السرطانية. علي وجه الخصوص ، غرفه TI شفافة والحجم لتتناسب مع تنسيق الشريحة المجهر القياسية ، مما يسمح لسهوله التصور من التفاعلات الخلية داخل لوحه TI في اي نقطه من البروتوكول (فيديو 1). يتم احتضان الخلايا المناعية المنشطة بلوحه TI بين عشيه وضحيها مع الخلايا السرطانية المكشوفة التيتبلغ8 باتاكا والتي تسهل امتصاص الخلايا السرطانية ومعالجتها ونقل مولدات الأورام إلى الوحدات النامية. في اليوم التالي ، يتم إرجاع خليط الخلايا المشتركة في الحضن في مجري الدم من الحيوانية الحاملة للورم. السيطرة علي الماشية الخضوع لإجراءات جمع الدم متطابقة ، لتطبيع لأي اثار لاستنفاد الليمفاوية علي نمو الورم ، ولكن بدلا من ذلك تلقي العمليات التلفزيونية أعاده ضخ. يتم رصد نمو الورم في جميع الكائنات طوال التجربة.

وفي الدراسات التي استخدمت نموذج الورم الميلانينيالمتزامن من طراز yumm 1.7 ، تم تكرار البروتوكول عبر الأسبوع مرتين أسبوعيا علي مدي ثلاثه أسابيع ، وذلك لما مجموعه سته علاجات في كل حيواني (الشكل 1 ب). ظهر العلاج جيد التحمل في جميع الكائنات المعالجة (> 100) ، وأظهرت باستمرار الحد من نمو الورم YUMM 1.7 في التعامل مع الكائنات المعالجة مقابل السيطرة ، كما لوحظ في 9 تجارب مستقله أجريت علي مدي 2 سنوات (الشكل 2A ، B). تظهر النتائج التراكمية بيانات نمو الورم في الحيوانية المعالجة والسيطرة علي جميع التجارب التي أجريت (الشكل 2A) ، فضلا عن منحنيات نمو الورم التمثيلي للحيوانات الفردية في تجربه واحده ، لتوفير شعور التباين في النظام (الشكل 2 ب).

وجدنا ان نجاح البروتوكول يعتمد بشكل حاسم علي وجود الخلايا الاحاديه في PBMC المعالجة ، وجود الصفائح الدموية في الجزء PBMC ، وخطوه لوحه TI المرور. عندما يتم حذف لوحه المرور ، أو عندما يتم استنفاد الصفائح الدموية أو الخلايا الاحاديه من الكسر PBMC ، لم يعد التاثير العلاجي لاحظ (الشكل 3A). العلاج يتطلب أيضا وجود خلايا الورم ابوتوتيك. فانه غير فعال في غياب اما الخلايا المناعية أو مصدر مستضد ، أو في وجود مستضد غير متطابقة ، علي سبيل المثال عندما يتم التعامل مع الفئران التي تحمل الأورام YUMM 1.7 باستخدام خلايا سرطان القولون MC38 (الشكل 3B). للحصول علي نتيجة مناعية من المهم أيضا تجنب التعرض PBMC ل 8-MOPا. 8-MOPالمكشوفة pbmc لا تلغي فقط ، أو ربما عكس ذلك ، المناعة المضادة للورم (الشكل 3c) ، ولكن أيضا تمنع القدرة المناعية للخلايا غير المكشوفة ، كما هو الحال في التجربة حيث عدد متساو من 8-ممسحةا-مكشوف و 8-ممسحة وقداستخدمت المحمية pbmc مع عدم وجود تاثير المضادة للورم ملحوظ (الشكل 3c).

مع PBMC البشرية ، وغرفه TI وبروتوكول transimmunization تؤدي إلى تنشيط الخلايا الاحاديه ناجحه في العاصمة ، وتمييزها من قبل سطح الخلية وعلامات التنشيط داخل الخلايا من التي حققتها لوحه ECP السريرية (الجدول 1). كما هو الشان في الدراسات الماوس ، العاصمة التنشيط (الشكل 4a) وقدره النامية التي تم إنشاؤها لمعالجه والحاضر مستضد (الشكل 4a،C) تعتمد اعتمادا حاسما علي وجود الصفائح الدموية في pbmc ، وعلي لوحه TI المرور. ال [ترنسسمبموايشن]-ينشط [لند] انسانيه يستطيع بشكل فعال و[كروس-برسنت] اما [ببتيد مستضدات] (شكل [4 ب]), أو مستضدات من كامله [8-MOP][ا-فورم] انسانيه خلايا سرطانيه, ان ينشط انسانيه [ت] [ر] خليه خطوط داخل في مختبره المقايسات (الشكل 4 ج) ، في TI وبطريقه تعتمد علي الصفائح الدموية (الشكل4C ، C).

Figure 1
الشكل 1: التخطيط التخطيطي للغرفة والبروتوكول (ا) مخطط ومواصفات غرفه المعالجة العابرة (لوحه TI). (ب) وصف تخطيطي لسير العمل التجريبي للمعالجة العابرة. لفتره وجيزة ، يتم تطعيم الحيوانية جلد (s.c.) مع الخلايا السرطانية المتزامنة. يتم التعامل مع الماشية مع الأورام واضح مرتين أسبوعيا عن طريق سحب الدم ، وعزل PBMC من الدم ، PBMC تدفق المرور من خلال لوحه TI الصفائح الدموية المغلفة ذاتيا في وجود 8-ممسحة/UVA الخلايا السرطانية المعالجة ، PBMC والخلايا السرطانية المشتركة بين عشيه وضحيها ، و أعاده حقن الخلايا الوريدية في نفس الماشية الحاملة للورم. يتم قياس حجم الورم خلال التجربة. وقد تم تعديل هذا الرقم من11. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تتحكم الزيادة في النمو في الأورام السرطانية المتزامنة التي تصيب الورم الخبيث من YUMM 1.7. (ا) yumm 1.7 حجم الورم مع مرور الوقت تامر ل C57BL/6 الفئران تطعيم مع 1 × 105 yumm 1.7 الخلايا السرطانية ، وتلقي اما سته العلاجات transimmunization (الخط الأسود) ، أو سته علاجات التحكم (الخط الرمادي). والبيانات تراكمية علي مدي تسع تجارب مستقله أجريت علي مدي سنتين. (ب) البيانات المستمدة من تجربه الممثل الواحد yumm 1.7 transimmunizaton ، مع كل خط يظهر نمو الورم للماوس الفردية. (الف وباء) "مراقبه برنامج تلفزيوني" الفئران في جميع التجارب ونزفت علي نفس الجدول الزمني للحيوانات التجريبية ، ولكنها تلقت سته العقيمة تلفزيوني أعاده ضخ. تمثل أشرطه الخطا SEM ، p-قيم محسوبة لكل نقطه زمنيه باستخدام اختبار مقارنات Sidak المتعددة; * * ، ص = 0.0013 ؛ ، ص < 0.0001. وقد تم تعديل هذا الرقم من11. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يتطلب نقل الخلايا الاحاديه والصفائح الدموية في جزء PBMC الذي اجتاز لوحه TI ، فضلا عن معالجه 8-ممسحة للخلايا السرطانية المتطابقة مع مستضد و 8 ممسحة لتجنيب pbmc. (ا) yumm 1.7 حجم الورم مع مرور الوقت تامر ل C57BL/6 الفئران تطعيم مع 1 * 105 yumm 1.7 الخلايا السرطانية ، وتلقي اما سته العلاجات transimmunization (خطوط سوداء صلبه) ، وسته علاجات التحكم (خطوط رمادية صلبه) ، أو سته العلاجات TI حيث تم استنفاد الخلايا الاحاديه أو الصفائح الدموية من PBMC قبل خطوه تمرير لوحه (باستخدام CD11b ومجموعات استنفاد CD41 ، علي التوالي) ، أو تم حذف الممر لوحه (خطوط منقطه). (ب) حجم الورم مع مرور الوقت المرسومة ل C57BL/6 الفئران تطعيم مع 1 × 105 yumm 1.7 الخلايا السرطانية ، وتلقي اما سته العلاجات transimmunization (خطوط سوداء صلبه) ، وسته علاجات التحكم (خطوط رمادية صلبه) ، pbmc وحدها (خط متقطع) ، 8- ممسحةa-معالجه yumm 1.7 الخلايا وحدها ، أو TI باستخدام8-ممسحة الخلايا السرطانية MC38 المعالجة (الخطوط المنقطة). (ج) حجم الورم مع مرور الوقت المرسومة ل C57BL/6 الفئران تطعيم مع 1 × 105 yumm 1.7 الخلايا السرطانية ، وتلقي اما سته علاجات transimmunization (خطوط سوداء صلبه) ، وسته علاجات التحكم (خطوط رمادية صلبه) ، وسته العلاجات TI حيث وتعرضت PBMC بشكل موحد إلى 8-ممسحةa علي الفور قبل مرور لوحه ، وسته العلاجات TI حيث pbmc تعرضت بشكل موحد إلى 8-ممسحةعلي الفور بعد مرور لوحه ، أو سته العلاجات حيث الخلايا TI بعد لوحه المرور كانت مختلطة 1:1 مع عدد متساو من PBMC التي تعرضت بشكل موحد إلى 8- ممسحة التشعيع (خطوط منقطه). (الف وباء وجيم ) "مراقبه برنامج تلفزيوني" الفئران في جميع التجارب ونزفت علي نفس الجدول الزمني للحيوانات التجريبية ، ولكنها تلقت سته العقيمة تلفزيوني أعاده ضخ. وتقدم البيانات للتجارب التمثيلية. تمثل الاشرطه SEM ، P-قيم محسوبة لكل نقطه زمنيه باستخدام اختبار مقارنات Sidak المتعددة; * ، ص < 0.05 ؛ * * ، ص < 0.01 ؛ ، ص < 0.001 ؛ ، ص < 0.0001 ؛ NS = الاختلافات غير هامه. وقد تم تعديل هذا الرقم من11. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: بروتوكول TI مع غرفه TI يحفز بسرعة العاصمة النضج ، والملف الشخصي التنشيط الفريدة ، والقدرة علي تنشيط الخلية T في PBMC الإنسان ، وتعتمد علي مرور لوحه والصفائح الدموية.
تحليل ا. facs للعلامات المشار اليها في CD11c + الخلايا بين اما الطازجة pbmc الإنسان ("السيطرة") ، pbmc التعامل مع بروتوكول ti ("ti") ، أو المعالجة ti pbmc حيث تم حذف لوحه المرور ، واستنفدت الصفائح الدموية باستخدام CD41 حبه طقم قبل المرور لوحه ، أو كل من أعلاه تم تنفيذها. تلخص البيانات ست تجارب مستقله مع ثلاثه متبرعين بالدم. تمثل الاشرطه القيم المتوسطة ، بينما تمثل أشرطه الخطا SEM. P-قيم لكل مقارنه محسوبة باستخدام اقتران t-اختبار; * ، ص < 0.05 ؛ * * ، ص < 0.01. تم تعديل اللوحات من11. B.الصفائح الدموية التي تحتوي علي الصفائح الدموية أو المنضب الصفيحات البشرية pbmc وشارك في احتضان بين عشيه وضحيها مع غير ذي صله (SIINFEKL) الببتيد ، أو مع الببتيد طويلة للراس والرقبة الخلايا الحرشفية سرطان المرتبطة به فيروس الورم الحليمي الإنساني E7. ثم تم استخدام PBMC لتحفيز خط الخلية CD8 T الإنسان علي وجه التحديد رد الفعل إلى E7 الببتيد. تم قياس تحفيز الخلايا التائية بواسطة إنتاج IFNg بعد 5 أيام من الثقافة. ) والبروتينات المضادة لفيروس الورم الحليمي الحيوي E6 و E719. ثم تم استخدام PBMC لتحفيز خط الخلية CD8 T الإنسان علي وجه التحديد رد الفعل إلى E7 الببتيد. تم قياس تحفيز الخلايا التائية بواسطة إنتاج IFNg بعد 5 أيام من الثقافة. (ب ) و ( ج) تظهر البيانات التجارب التمثيلية مع ثلاثه نسخ متماثلة في كل منها. تمثل الاشرطه القيم المتوسطة ، بينما تمثل أشرطه الخطا SEM. P-قيم لكل مقارنه محسوبة باستخدام اختبار مقارنات Sidak المتعددة; ، ص < 0.001 ؛ ، ص < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

علامه المعلمه علاج لوحه ECP مع بروتوكول TI TI لوحه مع بروتوكول TI ف-القيمة ECP مقابل TI
هلا-دكتور Δ مونتانيار 100.1 ± 42.4 439.8 ± 152.5 417.7 ± 152.2 Ns
CD80 Δ 3.9 ± 1.1 22.3 ± 7.2 24.5 ± 7.2 Ns
CD83 Δ مونتانيار 0.3 ± 0.2 53.3 ± 9.7 51.4 ± 17.4 Ns
CD86 Δ مونتانيار 10.8 ± 1.7 103.9 ± 23.4 87.1 ± 17.6 Ns
PLAUR Δ مونتانيار 54.5 ± 12 721.4 ± 183.6 528.7 ± 135.5 Ns
ICAM1 Δ مونتانيار 12.2 ± 1.6 179.6 ± 28.5 192.5 ± 25.4 Ns
ITGB5 Δ مونتانيار 53.6 ± 25.7 97.1 ± 31.6 103.8 ± 32.8 Ns
CCL2 (العدد 1) Δ 0.6 ± 0.5 70.1 ± 6.7 55.2 ± 8.9 Ns
CXCL5 Δ 0.7 ± 0.4 39.1 ± 7.2 41.5 ± 4.7 Ns
CXCL16 Δ 0.3 ± 0.2 28.0 ± 8.8 35.3 ± 11.7 Ns
CD105 (endoglin) Δ مونتانيار 3.6 ± 0.3 124.3 ± 25.4 141.8 ± 33.2 Ns
CD112 (المنديل 2) Δ مونتانيار 10.9 ± 1.8 47.3 ± 5.2 50.9 ± 9.2 Ns
CD120a ([تنفر-1]) Δ مونتانيار 10.1 ± 2.6 2.2 ± 1.4 1.8 ± 1.1 Ns
CD137L (4-1BBL) Δ مونتانيار 2.9 ± 1.5 1.0 ± 0.4 1.2 ± 0.6 Ns

الجدول 1: بروتوكول ti مع غرفه ti يحفز بسرعة العاصمة نضوج مكافئ لتلك التي يسببها بروتوكول TI مع غرفه ECP السريرية. تحليل FACS للتغير من العلامات المشار اليها من الضوابط مفتش المقابلة في الحية الإنسان CD11c + الخلايا بين اما المعزولة حديثا PBMC ("غير المعالجة") ، ومرت PBMC من خلال لوحه ECP السريرية بعد بروتوكول TI ("لوحه ECP مع بروتوكول TI") و تحليلها بعد الحضانة بين عشيه وضحيها ، أو PBMC التعامل مع بروتوكول TI ("لوحه TI مع بروتوكول") وتحليلها بعد الحضانة بين عشيه وضحيها. بالنسبة للعلامات ، مثل هلا-DR ، حيث تم تغيير عدد سكان الخلية بأكملها ، يتم التعبير عن البيانات كتغيير في كثافة الفلورية المتوسطة (مؤسسه مونتانيار). للعلامات حيث فقط مجموعه فرعيه من الخلايا التعبير عن علامة ، مثل CCL2 ، الفرق في النسبة المئوية للخلايا الايجابيه علامة من العيش CD11c + PBMC بدلا من ذلك يمثل. تلخص البيانات ست تجارب مستقله مع ثلاثه متبرعين بالدم. ويتم التعبير عن البيانات الخاصة بكل علامة علي انها الخطا القياسي الذي يبلغ من العمر الأساسي ± (SEM). P-قيم لكل مقارنه محسوبة باستخدام الاقتران t اختبار; NS = الاختلافات غير هامه. تم تعديل الجدول من11.

Video 1
الفيديو 1: التصوير الخلوي الحي للصفيحات وتفاعلات الخلايا المناعية داخل لوحه TI.
وقد أعدت هذه المادة علي النحو الموصوف في القسم 2 أعلاه من البروتوكول ، وتعرضت لصفيحه الاختزال علي النحو الموصوف في القسم 4 ، باستثناء فتره الحضانة الساكنة في الخطوة 4-2 التي خفضت من 1 ساعة إلى 30 دقيقه. خلال بروتوكول TI ، تم تركيب لوحه TI ، والتي هي متطابقة في الحجم إلى شريحة المجهر القياسية ، في مرحله عقد الشريحة من نظام التصوير مضان والخلايا داخلها كانت في التكبير 40x وعند 37 درجه مئوية خلال ملء لوحه (4.2.2 ) ، والحضانة لوحه (4-2) ، وتدفق لوحه (4.3.5) مراحل. وتم الحصول علي صور مستمرة وإنتاج أفلام باستخدام برنامج "روتين المسح الألى". تشير التسميات التوضيحية الموجودة أسفل الفيديو إلى مرحله البروتوكول التي يتم تصوير الخلايا فيها. تشير الأسهم والدوائر في الفيديو ، مع التسميات التوضيحية المقترنة بها ، إلى الخلايا ومناطق الاهتمام. شريط مقياس 10 μM موجود في الزاوية اليمني السفلية في جميع انحاء الفيديو. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Discussion

ويسمح الجهاز المصغر والبروتوكول الموصوف أعلاه للمرة الاولي باجراء تحقيقات مختبريه فعاله لليات ECP في النظم التجريبية للماوس ، وفي عينات الدم البشرية الصغيرة. هذا هو تقدم كبير; علي سبيل المثال ، فانه يسمح لنا لإثبات للمرة الاولي فعاليه transimmunization ضد الأورام الصلبة في نموذج الماوس 11، وفتح امكانيه المستقبل لتطبيق مماثل في الأورام البشرية.

قبل تطوير الجهاز والطريقة الموصوفة هنا ، كان من المستحيل التحقيق بشكل كامل في جميع جوانب ECP. في نماذج الماوس ، علي الرغم من ان 8-ممسحة ويمكن تكرار جانب من جوانب العلاج إلى حد ما عن طريق علاج الخلايا في صحن بيتري12،20، لم يكن هناك قدره علي الاندماج في طريقه الممر لوحه ، والتي ثبت ان توفير التفاعلات الصفائح الدموية الحيوية التي تكتسي اهميه حاسمه لتنشيط العاصمة الفسيولوجية ECP14. في الدراسات البشرية ، بدلا من ذلك ، كان عنصر التدفق موجودا بالبالكامل ، ولكن القدرة علي الكشف الانتقائي للمكونات الخلوية المحددة إلى 8-ممسحةA، أو لحمايتهم منه ، كانت مفقوده21،22. وقد حال ذلك دون الفهم الكامل لليه ECP ، والتحسين الأمثل للحصانة أو التسامح. الاضافه إلى ذلك ، كميه الدم المطلوبة للعمل مع جهاز ECP السريرية كبيره ، مما يعوق التحقيق العلمي. يسمح جهاز ECP المصغر والبروتوكول الموصوف هنا لأول مره بالنمذجة الفعالة والمرنة بالبالكامل والقابلة للتوقد لمختبر ECP. الاضافه إلى ذلك ، لوحه TI يسمح للرؤية في الوقت الحقيقي ورصد التفاعلات الخلية داخل اللوحة عن طريق المجهر.

لنجاح البروتوكول باستخدام كل من في الجسم الحيوي وأنظمه الجسم السابق ، فمن المهم ان المعالجة PBMC تحتوي علي الخلايا الاحاديه التي يمكن تفعيلها في DCs الوظيفية. لهذا التنشيط للمضي قدما ، فمن الضروري أيضا لضمان الجزء PBMC يحتوي علي عدد فيزيولوجي من صحية ، الصفائح الدموية activatable ، وان يتم اتباع بروتوكول المرور لوحه TI عن كثب. من أجل توجيه DCs المنشطة حديثا نحو التفاعل المحدد ، يجب توفيرها مع مستضد. وقد وجدنا ان الطريقة الأكثر كفاءه للتسليم مستضد لمكافحه السرطان المناعة هو بين عشيه وضحيها المشتركة الحاضنة لل DCs المنشطة حديثا مع الخلايا السرطانية التي تحتويعليمستضد 8-ممسحة المكشوفة. هذا لديه ميزه اضافيه من كونها قادره علي خلق استجابه مناعية لمكافحه السرطان دون التي تستلزم معرفه مسبقه من المستضدات الورم ، من خلال السماح لل DCs لتحديدها. ومع ذلك ، في الحالات التي يكون فيها مستضد معروف ، كان لدينا بعض النجاح في أنظمه الجسم السابق عند استخدام الببتيدات الحرة كمولدات في الحاضنة المشتركة. للتطبيقات المناعية ، يجب حماية DCs نفسها من 8-ممسحةA التعرض. وأخيرا ، في التجارب المجرية ، من المهم العمل مع نموذج الحيوانية التي هي قادره علي المناعة المضادة للورم. تعمل ترانسسيميموشن عن طريق إنشاء DCs النشطة المحددة ، والتي تعمل في الجسم لبدء الاستجابات المناعية الفطرية والمتكيفة. ضعف النشاط أو عدم وجود خلايا ناغورني كاراباخ ، أو CD8 T في الماوس المعالج سيؤثر علي فعاليه البروتوكول5،11.

في حين ان البروتوكول الموصوف هنا هو دليل علي مبدا واحد الذي تم الأمثل لنموذج الفئران الصلبة الورم المتزامن ، فانه يكشف مع ذلك العديد من الفرص. يتم توضيح أليات ECP في علم الأورام فقط ، ولا يزال هناك الكثير من المجال لتحسين الفهم. وعلي نطاق أوسع ، فان القدرة علي توليد الماوس المنشطة فسيولوجيا والإنسان DCs ، وتوجيهها بشكل انتقائي نحو مناعة محدده مستضد لديها العديد من التطبيقات المحتملة وراء السرطان. القدرة علي القيام بنفس الشيء ، ولكن بدلا من ذلك توجيه الوحدات النامية نحو التسامح مستضد محدده ، كما هو مقترح من قبل فعاليه التحمل من ECP نفسها ، ولها أيضا اثار طبية واسعه النطاق. مع هذه الطريقة ، ونحن نامل في توفير الاداات وفتح وسيله منتجه للبحوث لأي شخص لديه مصلحه في العلاجات الفيزيائية العاصمة.

Disclosures

جامعه ييل تمتلك براءات الاختراع المستمدة من بحوث الخلايا الجذعية البروفيسور ريتشارد ادلسون التي تم ترخيصها لشركه ييل البدء ، Transimmune AG. ريتشارد ادلسون ومايكل جيراردي مستشارين علميين ل Transimmune AG, في حين أولغا Sobolev هو موظف Transimmune AG. Transimmune AG ليس لديها اي منتجات تجاريه الحالية ، ولكن علي أساس تعاوني فانه ينتج لوحات Transimmune المستخدمة في هذه المقالة. ومن الممكن ان يستفيد هؤلاء المؤلفون الثلاثة من الاستغلال التجاري لهذه الاكتشافات في المستقبل.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة-انجي بوغ غرانت 1 P50 CA121974 (r. Edelson, m. Girardi); المعاهد القومية للسرطان مركز الدعم منحه 3 P30 CA16359-28S1 (r. Edelson, m. Girardi); زمالة التدريب الخاصة بمعهد هوارد هيوز الطبي (ا. فاسيل) ؛ ومؤسسه القلب NY (r. Edelson, ا. فينتورا, ا. فاسيلي, h. Ezaldein). وقدم الدعم الجزئي من قبل R01 CA196660 إلى m. Bosenberg.

ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم للدكتور روبرت تيغيلار علي الإرشاد والتوجيه والبصيرة التجريبية. ونشكر زملائنا في Fraunhofer IBMT ، ولا سيما الدكتور ثورستن نول ، علي تطوير وتوفير غرفه TI المكافئة لECP. نيكولاس ثيوسوكيس ساعد بلطف مع المراحل الاوليه من تجارب YUMM. نشكر المتبرعين بالدم المتطوعين ، انغر كريستنسن وموظفيها المحترفين في مركز العلاج الخاص بجامعه ييل للمساعدة في شراء الدم التطوعي. الدكتور ويندل يارسبره والدكتورة ناتاليا Issaeva بالتكرم مشتركه معنا SCC61 و SCC61/7 خطوط الخلايا. للحصول علي المساعدة التقنية في المشروع ، نشكر الدكتورة جوليا لويس للمشورة بروتوكول FACS ، و e. Menet ، g. Tokmoulina ، c. كوت في جامعه ييل FACS الاساسيه. تم الحصول علي صور الفيلم من الخلايا داخل لوحه TI بمساعده فيليكس ريفيرا مولينا ، دكتوراه ، قسم بيولوجيا الخلية ومركز التصوير السينمائي ييل ، كليه ييل للطب. وأشرف علي إنتاج الأفلام اندرو اوسبورن ، كبير منتجي الفيديو ، مكتب الاتصالات ، كليه ييل للطب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) Therakos, Inc Rx only, NDC No. 64067-0216-01 Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
AB serum Lonza BioWhittaker 14-498E Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC
ACK red cell lysis buffer Lonza BioWhittaker 10-548E Protocol step 2 - mouse PBMC preparation
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging VetEquip 901820 Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration
Autologous mouse plasma prepare in lab n/a Prepare per protocol step 2.4, use in  7.1 - mouse TI treatment administration
Autologous mouse serum prepare in lab n/a Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC
C57Bl/6J mice Jackson labs 0000664 Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um Medipoint 9891620 Protocol step 2 - mouse PBMC preparation
Clear RPMI Gibco by LifeTech 11835-030 Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC
DMEM/F12 Gibco by LifeTech 11330-032 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
EasyGrip Petri Dishes, 35mm Falcon 351008 Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC
Eppendorf 1.5mL conical tubes DOT scientific 1700-GMT Protocol steps 1-8
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) SAFC Biosciences 12306C-500mL Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate
Hemavet 950FS hematology counter Drew Scientific HV950FS Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers
Heparin 5,000U/mL McKesson Packaging services 949512 Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation
Isoflurane Abbott Laboratories 5260-04-05 Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration
Lympholyte M lymphocyte isolation medium Cedarlane Labs CL5035 Protocol step 2 - mouse PBMC preparation
Non-essential amino acids Gibco by LifeTech 11140-050 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) Gibco by LifeTech 14190-144 Protocol steps 1-7
Pen/strep Gibco by LifeTech 15140-122 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
Polypropylene 15mL conical tubes Falcon 352097 Protocol steps 1-8
Programmable 2-channel syringe pump New Era Pump Systems Inc model NE-4000 Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 BD Biosciences 305109 Protocol step 7 - mouse TI treatment administration
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) BD Biosciences 309604 Protocol steps 4, 8 - running the TI plate
Syringes, 1mL (Slip tip) BD Biosciences 309659 Protocol steps 1, 4, 7, 8
TI plate and tubing set Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
TI plate running platform Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) Falcon 353136 Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture
Tissue culture plates, 12-well Falcon 353043 Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
Tissue culture scrapers Falcon 353085 Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) Gibco by LifeTech 25200-056 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
Tumor injection needles, 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction
UVA irradiator Johnson and Johnson not commercially available  The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System Invitrogen fluorescence imaging instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edelson, R., et al. Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results. The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).
  2. Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens. The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).
  3. Scarisbrick, J. J., et al. A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent. Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).
  4. Barten, M. J., Dieterlen, M. -T. Extracorporeal photopheresis after heart transplantation. Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).
  5. Heald, P., et al. Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy. Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).
  6. Ratcliffe, N., et al. National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis. Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).
  7. Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. American council on ECP (ACE): Why now? Journal of Clinical Apheresis. , (2018).
  8. Edelson, R. L. Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).
  9. Gasparro, F. P., Dall’Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy. The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579 (1989).
  10. Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).
  11. Ventura, A., et al. Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity. Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).
  12. Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable? Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).
  13. Girardi, M., et al. Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study. Leukemia & Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).
  14. Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling. Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).
  15. Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin. Clinical & Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).
  16. Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells. Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).
  17. Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms. Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).
  18. Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell & Melanoma Research. , (2016).
  19. Gubanova, E., et al. Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival. Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).
  20. Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes. Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).
  21. Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease. Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).
  22. Berger, C., et al. Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy. Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).

Tags

المناعة والعدوى ، العدد 147 ، المناعة ، السرطان ، العلاج المناعي ، العلاج الكيميائي الضوئي خارج الجسد ، ECP ، الخلايا الجذعية ، DC
بروتوكول جديد لتوليد الخلايا العصبية المناعية الفسيولوجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ventura, A., Vassall, A., Yurter,… More

Ventura, A., Vassall, A., Yurter, A., Robinson, E., Filler, R., Hanlon, D., Meeth, K., Ezaldein, H., Girardi, M., Sobolev, O., Bosenberg, M. W., Edelson, R. L. Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (147), e59370, doi:10.3791/59370 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter