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Immunology and Infection

फिजियोलॉजिकल इम्यूनोजेनिक डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं के सृजन के लिए उपन्यास प्रोटोकॉल

Published: May 17, 2019 doi: 10.3791/59370
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1
1Department of Dermatology, Yale University School of Medicine, 2Dermatology Department, University of Rome Tor Vergata, 3Department of Pathology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Transimमीकरण (तिवारी) डिवाइस या प्लेट और संबंधित प्रोटोकॉल extracorporeal photoकीमोथेरपी (ecp) की प्रमुख विशेषताओं को दोहराने के लिए विकसित किया गया है, एक प्रयोगात्मक सेटिंग में, के उत्पादन के लिए अनुमति देता है फिजिकली सक्रिय, समस्वरणीय द्रुमाकृतिक कैंसर इम्यूनोथेरेपी के लिए सेल (DCs) ।

Abstract

Extracorporeal photoकीमोथेरपी (ecp) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कैंसर इम्यूनोथेरेपी त्वचीय टी कोशिका लिंफोमा (ctcl), ऑपरेटिव से अधिक ३५० विश्वविद्यालय के केंद्रों में दुनिया भर में । जबकि ईसीपी की नैदानिक प्रभावकारिता और अनुकरणीय सुरक्षा प्रोफाइल ने अपने व्यापक उपयोग को संचालित किया है, अंतर्निहित तंत्रों की व्याख्या एक चुनौती बनी हुई है, जो आंशिक रूप से प्रयोगशाला ईसीपी मॉडल की कमी के कारण है । इस बाधा को दूर करने और ECP अनुसंधान के लिए एक सरल, उपयोगकर्ता के अनुकूल मंच बनाने के लिए, हम दोनों माउस मॉडल, और छोटे मानव रक्त के नमूनों के साथ काम के लिए उपयुक्त नैदानिक ECP leukocyte प्रसंस्करण डिवाइस, के एक स्केल्ड-डाउन संस्करण विकसित की है । इस डिवाइस को ट्रांसिम्यूलाइज़ेशन (TI) चैंबर, या प्लेट कहा जाता है । ऐतिहासिक प्रयोगों की एक श्रृंखला में, लघुकृत डिवाइस एक सेलुलर टीका है कि नियमित रूप से कई syngeneic माउस ट्यूमर मॉडल में चिकित्सकीय विरोधी कैंसर प्रतिरक्षा शुरू उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रायोगिक प्रणाली से व्यक्तिगत कारकों को निकाल कर और वीवो ट्यूमर विरोधी प्रतिक्रिया में उनके योगदान को सुनिश्चित करने के द्वारा, हम तो क्षमता से छुटकारा ecp के प्रमुख यंत्रवादी ड्राइवरों को स्पष्ट । सामूहिक रूप से, हमारे परिणामों से पता चला है कि विरोधी ट्यूमर ecp के प्रभाव द्रुमाकृतिक कोशिकाओं (डीसी) द्वारा शुरू कर रहे हैं, फिजिकली टी प्लेट में प्लेटलेट्स के साथ रक्त मोनोसाइट बातचीत के माध्यम से उत्पन्न, और ट्यूमर कोशिकाओं से एंटीजन के साथ भरी हुई जिसका अपोप्तोटिक सेल मौत photoactivatable डीएनए को पार करने एजेंट 8-methoxypsoralen और UVA प्रकाश (8-एमओपीए) के संपर्क में पतले titrated है । जब माउस को लौटा, इस सेलुलर टीका विशिष्ट और हस्तांतरणीय विरोधी ट्यूमर टी सेल प्रतिरक्षा की ओर जाता है । हम सत्यापित करते है कि तिवारी चैंबर मानव रक्त संसाधन के लिए भी उपयुक्त है, मानव Dc पूरी तरह से सक्रियण राज्य और प्रोफ़ाइल में नैदानिक ECP चैंबर से प्राप्त करने के लिए तुलनीय उत्पादन । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माउस और आदमी में ecp अध्ययन के लिए इरादा कर रहे हैं, 8 के साथ अपोप्तोटिक ट्यूमर कोशिकाओं के नियंत्रण पीढ़ीएक, और शारीरिक मानव और माउस monocyte के तेजी से उत्पादन-अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए डीसी व्युत्पंन ।

Introduction

Extracorporeal photoकीमोथेरपी (ecp) एक स्थापित इम्यूनोथेरेपी है कि व्यापक रूप से विश्वविद्यालय के केंद्रों में दुनिया भर में ऑपरेटिव है । इसके उपयोग अद्वितीय चयनात्मकता, सुरक्षा से प्रेरित किया गया है, और द्वि-ECP चिकित्सा की दिशात्मक प्रभावकारिता, लक्षण है कि शारीरिक प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ ही ECP शेयर जिसके साथ यह साथी प्रतीत होता है । Ecp चयनात्मक रूप से त्वचीय टी सेल लिंफोमा (ctcl)1,2में घातक कोशिकाओं के खिलाफ प्रतिरोधकता है, और चयनात्मक प्रत्यारोपण, autoimmunity, और भ्रष्टाचार-बनाम-मेजबान रोग (gvhd) सेटिंग्स में लक्षित एंटीजन के लिए बर्दाश्त 3 । , 4. ecp के immunogenicity एक बरकरार सीडी 8 T सेल कंपार्टमेंट में ctcl5पर अपनी निर्भरता से प्रकाश डाला है, जबकि विशिष्टता ecp बहुत अनुकूल प्रतिकूल प्रतिक्रिया प्रोफ़ाइल द्वारा परिलक्षित होता है, कोई बंद लक्ष्य प्रत्यारोपण में प्रतिरक्षा दमन या GvHD सेटिंग्स, और कोई वृद्धि अवसरवादी संक्रमण संवेदनशीलता CTCL में, जहां गैर रोगजनक टी सेल क्लोन संभवतः घातक टी कोशिकाओं के साथ खो सकता है ।

ECP के नैदानिक महत्व को देखते हुए, आशा है कि अपने तंत्र की बेहतर समझ कैंसर और immunologic विकारों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए है ECP चिकित्सकीय पहुंच का विस्तार हो सकता है अंतरराष्ट्रीय हित उत्तेजित है । दो राष्ट्रीय स्तर पर मंजूरी दे दी कार्यशालाओं, स्वास्थ्य के एक राष्ट्रीय संस्थान (NIH) राज्य के विज्ञान संगोष्ठी6 और एक अमेरिकन सोसायटी Apheresis आम सहमति संमेलन7के लिए, आयोजित की गई और रिपोर्ट, तेजी लाने के उद्देश्य से ECP के कैंसर विरोधी और सहनशीलता के प्रभाव के लिए प्रमुख सेलुलर योगदानकर्ताओं की पहचान.

तारीख करने के लिए, कई प्रकाशित करने के लिए ecp तंत्र पता प्रयास रिपोर्ट के बावजूद, दो प्राथमिक बाधाओं वैज्ञानिक अग्रिमों बाधित है । सबसे पहले, प्रयोगात्मक प्रयोगशाला सेटिंग में ECP तंत्र की जांच लघु ECP डिवाइस है कि पूरी तरह से ECP सेलुलर और vivo में प्रभाव में परिलक्षित होता है की कमी से सीमित किया गया है, और पशु मॉडलों के लिए लागू हो । दूसरे, नैदानिक सेटिंग में ECP नमूनों की गहराई प्रयोगशाला विश्लेषण ECP की सीमित उपलब्धता द्वारा प्रतिबंधित किया गया है-प्रसंस्कृत रोगी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, जो उपचार केंद्रों के लिए उपयोग की आवश्यकता है, और इसके अतिरिक्त के समय के अधीन हैं रोगी के सुई लेनी, और रोगी-पुनर्संचार ल्यूकोसाइट्स के बिना छेड़छाड़ सेट के लिए नैतिक जरूरत है ।

ECP अनुसंधान की प्रगति impeding बाधाओं को हल करने के लिए, हम बाहर सेट के लिए एक लघु ECP उपकरण है कि सबसे बारीकी से चिकित्सा के प्रमुख तत्वों की नकल होगा विकसित । मानक ecp उपचार एक 1 मिमी मोटी, पराबैंगनी एक प्रकाश (UVA)-पारदर्शी, प्लास्टिक की थाली6,8के माध्यम से एक मरीज के leukapheresis-समृद्ध ल्यूकोसाइट्स के पारित होने शामिल है. प्लेट में, ल्यूकोसाइट्स 8-methoxypsoralen (8-एमओपी), एक फोटो-activatable एजेंट जो UVA जोखिम पर transiently एक प्रतिक्रियाशील रूप (8-एमओपीए) में परिवर्तित कर दिया है करने के लिए उजागर कर रहे हैं बहन डीएनए किस्में9,10। संसाधित, 8-एमओपीकाइलाज ल्यूकोसाइट्स एकत्र कर रहे हैं और रोगी के लिए नसों के द्वारा वापस आ गया ।

चूंकि ECP ही एक द्वि-दिशात्मक चिकित्सा, कैंसर में प्रतिरक्षित और प्रत्यारोपण में सहनशीलता, autoimmunity और GvHD सेटिंग्स, स्पष्टीकरण के लिए हम मॉडल है ECP प्रतिरक्षण मोड "transimmunization" का नाम है, और सहनशीलता मोड "ट्रांस्टोलेनाइजेशन" । हम पहले ट्रांसिम्यूलाइजेशन मोडलिटी पर ध्यान देते थे । हमारे हाल ही में सूचित लघुकृत स्केलेटयुक्त माउस-आदमी ecp डिवाइस, transimzation (तिवारी) चैंबर या थाली, और इसी प्रोटोकॉल, दोनों सेलुलर और एक कैंसर की स्थापना11में मानव ecp डिवाइस के vivo प्रभाव में पुन: पेश ।

आदेश में करने के लिए संभव के रूप में नैदानिक प्रासंगिक के रूप में vivo मॉडल में transimमीकरण बनाने के लिए, हम subcuically syngeneic माउस ट्यूमर इंजेक्शन के बाद इम्यूनोथेरेपी शुरू कर स्पष्ट हो गया, इस प्रकार स्थापित कैंसर में प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता का परीक्षण. इसी प्रकार CTCL में ECP करने के लिए, मेलेनोमा के YUMM 1.7 मॉडल में सबूत के सिद्धांत ट्रांसिम्युनीकरण प्रोटोकॉल परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMC) ट्यूमर असर जानवरों से उपयोग करता है । यह कोशिकाएं प्रवाह के तहत टीआई प्लेट से होकर गुजरती हैं । जबकि 8-एमओपी लघु कक्ष में कोशिकाओं काएक इलाज संभव है, यह अलग से संचालित करने के लिए बेहतर है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि केवल वांछित सेल प्रकार 8-एमओपीके संपर्क में है । इससे पहले के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि ECP के सहनशीलता प्रभाव 8-एमओपीएकघायल प्रतिजन-कोशिकाओं को पेश12, जबकि प्रतिरक्षण प्रभाव 8-एमओपी लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं कीएक चोट की आवश्यकता है11. ट्रांसिम्यूराइजेशन प्रोटोकॉल में या तो ट्यूमर कोशिकाओं, या प्रतिरक्षा कोशिकाओं, चुनिंदा 8 को उजागर किया जा सकता है-एक के रूप में जरूरत एमओपी । 8 के बीच संपर्क के समय अधिकतम के बाद से-एमओपीएक-घायल ट्यूमर कोशिकाओं और ecp प्रेरित द्रुमाकृतिक कोशिकाओं (डीसी) को काफी नैदानिक ecp13की immunचिकित्सीय क्षमता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, हम एक रात को शामिल हमारे प्रोटोकॉल में सह ऊष्मायन कदम । रातोंरात ऊष्मायन के बाद, इलाज कोशिकाओं ट्यूमर असर जानवर को लौट रहे हैं ।

इस प्रणाली मज़बूती से ट्यूमर के विकास को कम करने और स्थापित syngeneic ट्यूमर के साथ चूहों में विशिष्ट विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा शुरू11, और हमें ecp के नैदानिक विरोधी ट्यूमर प्रभावकारिता के तंत्र टुकड़े टुकड़े करने के लिए अनुमति दी. कई अध्ययनों में हमने दिखा दिया है कि ईसीपी प्रतिरक्षा पूर्व vivo प्लेटलेट सक्रियण के माध्यम से टीआई प्लेट14,15में शुरू की है । सक्रियित प्लेटलेट्स बाद में मोनोसाइट-टू-डेन्ड्रिटिक कोशिका परिपक्वनका संकेत करते हैं, जिससे फिजियोलॉजिकल डीसीएस का उत्पादन होता है । नई बनाई गई monocyte-व्युत्पंन dc से पार वर्तमान भली भांति एंटीजन 8-एमओपीएक-क्षतिग्रस्त ट्यूमर कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए कर रहे है antigen-विशिष्ट T सेल प्रतिक्रियाएं16। के रूप में पहले12,17का सुझाव दिया, तथापि, 8-एमओपीएक-नवजात DCs खुद को जवाबी कार्रवाई कर सकते है या यहां तक कि विरोधी ट्यूमर प्रभाव11रिवर्स, ecp सहिष्णुता के लिए एक मैकेस्टिक लिंक प्रदान करने के लिए प्रेरित क्षति ।

टीआई प्लेट भी मानव PBMC से फिजिकली सक्रिय डीसी का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसी प्रकार माउस अध्ययन करने के लिए, मानव TI-व्युत्पन्न Dc अपनी पीढ़ी के लिए प्लेटलेट्स की उपस्थिति में थाली-मार्ग पर निर्भर हैं, इन नैदानिक ECP प्लेट में उत्पादित के लिए phenotypically समान दिखाई देते हैं, और कुशलता से प्रसंस्करण में सक्षम हैं और मानव टी कोशिकाओं11,16के सक्रियण के लिए पार से पेश मानव ट्यूमर एंटीजन.

Ecp इम्यूनोथेरेपी के तंत्र को उजागर करने में, हम इसलिए तेजी से और वांछित प्रतिजन विशिष्टता के शारीरिक माउस और मानव द्रुमाकृतिक कोशिकाओं को पैदा करने के लिए एक विधि का पर्दाफाश किया है कि कार्यात्मक modulated किया जा सकता है । अभिनव तिवारी उपकरण और प्रोटोकॉल ecp अनुसंधान और चिकित्सा और कैंसर इम्यूनोथेरेपी और अधिक मोटे तौर पर के क्षेत्रों में पर्याप्त संभावित महत्व है, और शारीरिक, कार्यात्मक द्रुमाकृतिक कोशिकाओं में या तो छुटकारा या में ब्याज के साथ किसी भी अंय क्षेत्र में बर्दाश्त मोजिलिटी । हमें उम्मीद है कि इस प्रकाशन से ऐसे शोध क्षेत्रों में रुचि रखने वालों को आवश्यक औजार उपलब्ध होंगे ।

Protocol

यहां वर्णित सभी माउस तरीकों को येल विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा राष्ट्रीय पशु स्वास्थ्य देखभाल दिशा-निर्देशों के साथ समझौते में मंजूरी दी गई है । सभी मानव अध्ययन स्वस्थ स्वयंसेवकों द्वारा दान रक्त के साथ प्रदर्शन किया गया, लिखित सूचित सहमति के साथ । मानव रक्त अध्ययन मांयता प्राप्त नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए (उदाहरण के लिए, हेलसिंकी, CIOMS की घोषणा, Belmont रिपोर्ट, अमेरिका के आम नियम), और येल मानव अधिष्ठापन की समीक्षा बोर्ड द्वारा प्रोटोकॉल संख्या ०३०१०२३६३६ के तहत अनुमोदित किया गया ।

नोट: निंनलिखित प्रोटोकॉल के विरोधी के लिए ट्रांसिमराइजेशन का वर्णन है-ट्यूमर syngeneic ट्यूमर के अर्बुद चिकित्सा ।

1. syngeneic YUMM 1.7 ट्यूमर रोपण

  1. के रूप में रुचि के ट्यूमर कोशिका लाइन के लिए उपयुक्त चूहों के flanks में syngeneic ट्यूमर प्रत्यारोपण करने के लिए स्थापित प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    नोट: नीचे दिए गए प्रोटोकॉल YUMM 1.7 C57BL/6 माउस मेलेनोमा ट्यूमर मॉडल का वर्णन करता है । YUMM 1.7 मेलेनोमा कोशिकाओं कृपया डॉ Bosenberg, येल18द्वारा प्रदान किया गया ।
  2. कोशिकाओं की एक जमे हुए aliquot पिघलना और एक सेल बीतने के बाद कोशिकाओं का उपयोग करें । संस्कृति हौसले से थामी 1.7 है Dulbecco संशोधित ईगल पोषक तत्व मिश्रण F-12 मध्यम (DMEM/F12) में कोशिकाओं, 10% गर्मी inसक्रियित भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन/ ऊतक संस्कृति की स्थिति (३७ ° c, 5% CO2) ।
    1. 60 \ u201270% संगम पर yumm 1.7 कोशिकाओं को पर्याप्त trypsin जोड़ने से इकट्ठा-edta सेल संस्कृति थाली या फ्लास्क (जैसे, एक T75 फ्लास्क के लिए 4 मिलीलीटर) के नीचे कवर करने के लिए ।
    2. 3 \ u20124 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेल संस्कृति जहाजों आराम, धीरे से नीचे या बर्तन के किनारों पर दोहन करने में मदद करने के लिए कोशिकाओं को अलग ।
    3. Trypsin के 4 मिलीलीटर में 1 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) जोड़ें-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एक बार कोशिकाओं के सबसे अलग कर रहे हैं । 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नली में पिपीटिंग करके कोशिकाएँ लीजिए । फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) के साथ फ्लास्क कुल्ला और एक ही संग्रह ट्यूब को कुल्ला जोड़ें । पीबीएस के साथ 15 मिलीलीटर तक ट्यूब भरें ।
    4. एक छोटे से aliquot बाहर ले लो और कोशिकाओं की गिनती ।
    5. एक मानक ऊतक संस्कृति अपकेंद्रित्र में २५० एक्स जी में 10 मिनट के लिए नीचे स्पिन ट्यूमर कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ।
  3. 1 x 106 कोशिकाओं के घनत्व में PBS में yumm 1.7 कोशिकाओं को निलंबित/एमएल ।
  4. 1 x 105 yumm 1.7 ट्यूमर कोशिकाओं के १०० ΜL में pbs के सही flanks में 6-सप्ताह पुराने जंगली प्रकार पुरुष C57BL/6j चूहों, संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार संवेदनाहरण (उदाहरण के लिए, 3 \ u20125% isoflurane श्वास गैस, बेहोशी हिंद पंजा चुटकी पलटा की कमी से पुष्टि की) ।
  5. द्वि-साप्ताहिक माप के माध्यम से ट्यूमर मात्रा मॉनिटर सीधा ट्यूमर व्यास और ऊंचाई एक कैलिपर का उपयोग कर । 2 YUMM की गणना (ट्यूमर लंबाई x चौड़ाई x ऊंचाई के रूप में ट्यूमर की मात्रा)/
  6. शुरू ट्रांसिमराइजेशन थेरेपी जब ट्यूमर बस स्पष्ट हो; YUMM 1.7 ट्यूमर के लिए, यह आम तौर पर 7 दिन है \ u201210 पोस्ट ट्यूमर रोपण ।

2. ट्रांसिम्यूनीकरण के लिए परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का संग्रह

  1. प्रत्येक ट्यूमर-असर माउस से गाल खून के माध्यम से 100 \ u2012150 μL रक्त इकट्ठा ।
  2. रक्त एकत्र किया जा रहा है के रूप में, प्रत्येक माउस उपचार समूह से पूल रक्त (प्रत्येक 5 प्रयोगात्मक चूहों + 5 नियंत्रण चूहों) ५,००० U/एमएल हेपरिन युक्त एक एकल 15 मिलीलीटर ट्यूब में । एकत्र 10% हेपरिन प्रति १०० μL रक्त का दस μL का उपयोग करें ।
    नोट: मिश्रण रक्त जमावट से बचने के लिए संग्रह के दौरान अक्सर ट्यूब । जबकि नियंत्रण ट्यूमर असर चूहों प्रयोगात्मक चूहों के रूप में एक ही समय में ब्लेड किया जा सकता है, उपचार समूह के साथ बराबर की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए, "नियंत्रण" रक्त या तो खारिज कर दिया जा सकता है, या अतिरिक्त प्रदान करने के लिए उपचार समूह के रक्त के साथ संयुक्त प्रयोगात्मक उपचार समूह के लिए PBMC, जांचकर्ताओं के विवेक पर.
  3. लिम्फोसाइट आइसोलेशन माध्यम के 4 मिलीलीटर के साथ १ १५ मिलीलीटर ट्यूब सेट करें ( सामग्री की तालिकादेखें) प्रति 5 \ u201210 चूहों bled । धीरे परत रक्त (ट्यूमर असर चूहों से एकत्र) माध्यम के शीर्ष पर । पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन 1000 \ u20121, 500 x g लाल रक्त कोशिकाओं से pbmc अलग करने के लिए ।
  4. अपकेंद्रण के अंत में, शीर्ष प्लाज्मा परत इकट्ठा, छोड़ने ~ ०.५ एमएल buffy कोट के ऊपर शेष है, और बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियसपर दुकान (चरण ७.१) ।
  5. एक स्वच्छ 15 मिलीलीटर ट्यूब में buffy कोट परत इकट्ठा, PBS के साथ 15 मिलीलीटर को भरने, और 10 मिनट के लिए २५० एक्स जी में एक मानक ऊतक संस्कृति अपकेंद्रित्र में pbs इकट्ठा करने के लिए स्पिन ।
  6. ध्यान से supernatant बंद पिपेट, और ट्यूब flicking द्वारा गोली resuspend । Decant नहीं है, के रूप में गोली नरम है और खो सकता है । ACK लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) को pbmc से किसी भी शेष लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए ट्यूब. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेबेट ।
  7. PBS के साथ 15 मिलीलीटर के लिए ट्यूब भरें, और 10 मिनट के लिए २५० एक्स जी में एक मानक ऊतक संस्कृति अपकेंद्रित्र में pbs इकट्ठा करने के लिए नीचे स्पिन ।
  8. ध्यान से supernatant बंद पिपेट, और flicking द्वारा गोली resuspend । Decant नहीं है, के रूप में गोली नरम है और खो सकता है ।
    नोट: इस कदम पर, शुद्ध PBMC सबसे अच्छा सूट प्रयोग के रूप में संशोधित किया जा सकता है. विभिंन PBMC घटकों (प्लेटलेट्स, monocytes, अन्य प्रतिरक्षा सेल प्रकार) समाप्त या जरूरत के रूप में PBMC से अलग किया जा सकता है. इसके अलावा, खुद PBMC 8 करने के लिए उजागर किया जा सकता है-एमओपीएक, या तो पहले या खंड 4 के बाद (पहले या थाली पारित होने के बाद-खंड 2 के बाद या खंड 5 से पहले), प्रोटोकॉल चरणों का पालन करके 3.3 \ u 20123.8 और yumm 1.7 कोशिकाओं के लिए pbmc प्रतिस्थापन. यह उपचार की immunogenic क्षमता काटें होगा, और इसके बजाय प्रतिरक्षा सहिष्णुता को बढ़ावा देने ।
  9. प्रत्येक उपचार समूह के लिए (प्रत्येक 5 प्रयोगात्मक चूहों + 5 नियंत्रण चूहों), PBMC गोली ३०० μL FBS में फिर से निलंबित.

3.8-एमओपी/

  1. संस्कृति और कदम 1.2 में वर्णित के रूप में YUMM 1.7 ट्यूमर कोशिकाओं को इकट्ठा-1.3एक-एमओपी उजागर ट्यूमर सेल प्रतिजन स्रोत तैयार करने के लिए ।
  2. 5 चूहों के उपचार के समूह के प्रति २.५ x 106 yumm 1.7 ट्यूमर कोशिकाओं तैयार करते हैं । प्रत्येक उपचार समूह के लिए, २.५ x 106 कोशिकाओं/300 μl (~ ८.३३ x 106 कोशिकाओं/एमएल) पर fbs में ट्यूमर सेल गोली निलंबित ।
  3. के साथ ऊतक संस्कृति हूड लाइट्स बंद, जोड़ें 8-एमओपी ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए yumm 1.7 ट्यूमर सेल निलंबन के लिए एक अंतिम 8-एमओपी १०० एनजी/एमएल की एकाग्रता ।
    चेतावनी: 8-एमओपी एक photoactivatable डीएनए हानिकारक एजेंट और कैंसरस है । हैंडलिंग और डिस्पेंसिंग करते समय सावधानी बरतें, उजागर त्वचा के साथ संपर्क से बचें, और उचित रूप से छोड़ें ।
  4. कोशिकाओं को अच्छी तरह मिक्स, टिन पंनी में सेल कंटेनर लपेटो, और ३७ °C पर 20 मिनट के लिए सेते ।
  5. पूर्व कोट 5 चूहों के हर उपचार समूह के लिए एक अच्छी तरह से भरने के द्वारा एक 12-कूप ऊतक संस्कृति प्लेट (२.५ x 106 yumm 1.7 ट्यूमर कोशिकाओं) fbs के 1 मिलीलीटर के साथ, और 4 डिग्री सेल्सियसपर 20 मिनट के लिए ठंडा भरा थाली ।
  6. यह पूर्व गर्म करने के लिए UVA प्रकाश स्रोत चालू करें ।
    चेतावनी: यूवीए लाइट कैंसरस है । जब UVA प्रकाश स्रोतों के साथ काम कर जल्दी और ध्यान से काम, जोखिम से त्वचा की रक्षा, और चेहरा ढाल या काले चश्मे का उपयोग चेहरे और आंखों की रक्षा के लिए ।
  7. 20 मिनट के बाद, फ्रिज में ले जाने के 12-कूप प्लेट (कदम ३.५) ऊतक संस्कृति हुड के लिए, कुओं से FBS हटाने, और जोड़ें ३०० μL (२.५ x 106 कोशिकाओं ३.४/
  8. 4 J/सेमी2के कुल विकिरण के लिए पूर्व गरम UVA प्रकाश स्रोत के लिए सेल युक्त प्लेट का पर्दाफाश ।
    नोट: 8-एमओपी एकाग्रता और UVA खुराक यहां वर्णित YUMM 1.7 ट्यूमर कोशिका रेखा के लिए calibrated हैं । 8 का एक अनुमापन-एमओपी/यूवीए खुराक, प्रदर्शन के 1 सप्ताह के भीतर १००% ट्यूमर सेल मौत का कारण पर्याप्त, प्रत्येक प्रयोगात्मक ट्यूमर कोशिका लाइन के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए, ताकि प्रभावी हत्या खुराक निर्धारित करने के लिए. यह विवो में माउस के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि कोशिकाओं रेट्रो-ऑर्कपल्ली (कदम ६.१) reअंतःक्षिप्त कर रहे हैं और इस प्रकार किसी भी अक्षतिग्रस्त ट्यूमर कोशिकाओं अन्यथा इलाज जानवर में नेत्र ट्यूमर के रूप में हो सकता है । एक दिशानिर्देश के रूप में, 4uva के 4 \ u20128 J/सेमी2 , 100 \ u2012200 Ng/एमएल 8-एमओपी, सबसे ट्यूमर कोशिका लाइनों के लिए ठेठ प्रभावी रेंज है ।
  9. इकट्ठा 8-एकअच्छी तरह से इलाज ट्यूमर कोशिकाओं, थाली घूमता है और ध्यान से pipetting पूरा सेल वसूली सुनिश्चित करने के लिए ।

4. TI प्लेट बीतने के कक्षों

  1. 5 चूहों के प्रत्येक उपचार समूह के लिए, एक १.५ मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ३०० μL उपयुक्त PBMC में संयोजित करें (चरण २.११ से) और ३०० μL of 8-एमओपीएकइलाज ट्यूमर कोशिकाओं (से कदम ३.९) । इसमें कोशिकाओं को मिलाएं ।
  2. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने के लिए "प्रवेश" और "बाहर निकलें" तिवारी टयूबिंग के सेट भरें (देखें
    सामग्री तालिका) FBS के साथ । टयूबिंग clamps खोलने के लिए ट्यूबों को भरने, और बंद clamps एक बार ट्यूब सिरिंज डिस्कनेक्ट करने से पहले भर रहे हैं, टयूबिंग के अंदर fbs बनाए रखने के लिए ।
  3. एक P1000 पिपेट का प्रयोग करें (चरण ४.१ से) टी प्लेट के लिए pbmc और ट्यूमर सेल मिक्स जोड़ने के लिए ( सामग्री की मेजदेखें) । प्लेट को ४५° कोण पर रखें, पिपेट टिप को सुरक्षित रूप से TI प्लेट के सेवन में रखें, और बुलबुले से बचते हुए प्लेट को धीरे से भरें ।
  4. पिपेट प्लंजर को छोड़ने से पहले पिपेट टिप को सेवन से निकालें । थाली ४५० μL रखती है; शेष कोशिकाओं को १.५ मिलीलीटर शंक्वाकार नली में लौटाएं ।
  5. एफबीएस से भरे ट्यूबिंग, कोशिका पूरित टी प्लेट, और १.५ एमएल शंक्वाकार ट्यूब जो टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में शेष कोशिकाओं को 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियसपर समाहित करता है । ऊष्मायन के बाद, गुरुत्वाकर्षण द्वारा तिवारी टयूबिंग खाली, clamps जारी ।
  6. प्लेट पोर्ट में प्लंजर उदास के साथ पिपेट टिप डालकर TI प्लेट से कक्षों को निकालने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग करें । एक ४५° कोण पर थाली पकड़ो और P1000 पिपेट टिप भरें । कोशिकाओं को वापस उनके मूल १.५ मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखें ।
  7. टीआई प्लेट को चलाने के लिए एग्ज़िट ट्यूब को प्लेट से कनेक्ट करें और प्लेट रनिंग सिस्टम में टीआई प्लेट को सुरक्षित करें ।
  8. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, १.५ एमएल शंक्वाकार ट्यूब से PBMC और ट्यूमर सेल मिक्स के ६०० μL आकर्षित, सिरिंज में किसी भी बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए, दबाना खुला साथ प्रवेश ट्यूब के लिए सिरिंज देते हैं और धीरे से तरल पदार्थ टयूबिंग के अंत तक पहुंचता तक भरने ।
  9. टी प्लेट के लिए प्रवेश ट्यूब के मुक्त अंत देते हैं और धीरे शेष मात्रा लोड हो रहा है जारी. प्रवेश क्लैंप बंद करें ।
  10. 1 मिलीलीटर सिरिंज अलग और सिरिंज पंप करने के लिए प्रवेश टयूबिंग कनेक्ट । सेल संग्रह के लिए एक स्वच्छ १.५ एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए निकास टयूबिंग सुरक्षित ।
  11. ०.०९ मिलीलीटर/मिनट के लिए सिरिंज पंप प्रवाह की दर को समायोजित, लेकिन पंप अभी तक शुरू नहीं करते । टीआई प्लेट ~ 30डिग्री सिरिंज पंप की ओर झुकाव, एक तिवारी प्लेट चल रहे मंच या किसी अंय साधन (जैसे, थाली के एक छोर के नीचे एक छोटे से फ्लैट वस्तु) का उपयोग कर ।
  12. ध्यान से प्रवेश करें ट्यूबिंग पर दबाना जारी । सिरिंज पंप शुरू, ध्यान से कैसे टीआई प्लेट भरता है, और झटका ट्यूबिंग या किसी भी हवा बुलबुले प्रवाह बाधा चाहिए के रूप में प्लेट आवश्यक ।
  13. एक बार तिवारी थाली पूरी तरह से भरा है, यह ~ 30° विपरीत दिशा में झुकाव के रूप में यह खाली । जब सभी कोशिकाएं और द्रव १.५ मिलीलीटर शंक्वाकार संग्रह नली में होते हैं, तो पंप बंद कर दीजिये ।
  14. तिवारी प्लेट धोने के लिए, सिरिंज पंप से प्रवेश टयूबिंग डिस्कनेक्ट, एक 1 मिलीलीटर ६०० μL FBS के साथ भरा सिरिंज से कनेक्ट, और कदम के लिए प्रक्रिया का पालन करें 4.8 \ u 20124.9.
  15. ०.४९ मिलीलीटर/मिनट के लिए सिरिंज पंप प्रवाह दर को समायोजित करें, प्रवेश दबाना जारी है, और चरणों में वर्णित के रूप में तिवारी प्लेट चलाने 4.12 \ u 20124.13, एक ही १.५ मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में धोने का संग्रह । झाड़ या टी प्लेट धीरे पूरे समय नल, detaching में सहायता और किसी भी आसंन कोशिकाओं eluting ।
  16. इस संग्रह को स्पिन १.५ मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बेंचटॉप माइक्रोफ्यूज में 8 मिनट के लिए २५० x g . छोड़ें supernatant ।

5. रातोंरात संस्कृति माध्यम के लिए Autologous माउस सीरम की तैयारी

  1. किसी भी institutionally अनुमोदित विधि द्वारा 10 \ u201212 सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों से रक्त ले लीजिए (जैसे, आंख भरो, पूंछ नस खून, गाल खून, या टर्मिनल भरो-हृदय पंचर से बाहर), बिना किसी एंटीकोकुलेंट्स । आवश्यक सीरम के प्रत्येक ३०० μL के लिए 1 मिलीलीटर रक्त एकत्रित अनुमान ।
    नोट: प्रयोग में 5 चूहों के हर उपचार समूह के लिए एक सीरम की ३०० μL की आवश्यकता होगी ।
  2. 4 ° ब् पर रात भर खून जमने दें ।
  3. 15 मिनट के लिए ३,००० x g पर स्कंधित रक्त नीचे स्पिन । ध्यान से शीर्ष सीरम युक्त परत इकट्ठा
    नोट: सीरम तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है रातोंरात सेल ऊष्मायन मध्यम (कदम ६.१), या भविष्य के प्रयोगों के लिए संरक्षित करने के लिए । सीरम को संरक्षित करने के लिए-20 ° c पर aliquots में फ्रीज.

6. रातोंरात Co-ऊष्मायन के साथ प्रतिजन PBMC

  1. Pbmc और ट्यूमर सेल गोली (कदम ४.५) स्पष्ट rpmi के 2 मिलीलीटर में 15% ऑटोलॉगस माउस सीरम (चरण 5 में तैयार) के साथ निलंबित । एक ३५ मिमी गैर में प्लेट-ऊतक-संस्कृति बाँझ पकवान का इलाज, और मानक ऊतक संस्कृति की स्थिति के तहत रात भर सेते (३७ ° c, 5% CO2).
    नोट: यदि PBMC एक गैर सेलुलर प्रतिजन के साथ इस्तेमाल किया जा रहा है (पेप्टाइड, नैनोकणों, प्रोटीन, आदि), प्रोटोकॉल की धारा 3 छोड़, और धारा 2 से सीधे अनुभाग 4 के लिए आगे बढ़ना, तिवारी प्लेट के लिए वांछित प्रतिजन जोड़ने कदम ६.१ ।
  2. अगले दिन, ध्यान से एक ऊतक संस्कृति खुरचने के साथ पकवान के नीचे से किसी भी अनुयायी कोशिकाओं को अलग, डिश घूर्णन करते हुए भी सेल संग्रह सुनिश्चित करने के लिए scraping । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  3. डिश में 2 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और scraping कदम दोहराने, एक ही ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा । 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ ३५ मिमी पकवान कुल्ला और एक ही ट्यूब को कुल्ला जोड़ें ।
  4. एक मानक ऊतक संस्कृति अपकेंद्रित्र में २५० एक्स जी में 10 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए । ध्यान से supernatant बंद पिपेट और ट्यूब flicking द्वारा गोली resuspend । Decant नहीं है, के रूप में गोली नरम है और खो सकता है ।

7. पुनः इंजेक्शन-ट्यूमर असर चूहों में कोशिकाओं का इलाज

  1. ऑटोलॉगस प्लाज्मा नीचे स्पिन (२.४ कदम में तैयार) ७५० एक्स जी पर 15 मिनट के लिए तलछट किसी भी particulates के लिए । (चरण ६.४) ऑटोलॉगस प्लाज्मा या PBS के ६०० μL में सेल गोली से निलंबित ।
  2. (जैसे, 3 \ u20125% Isoflurane श्वास गैस, संज्ञाहरण हिंद पंजा चुटकी पलटा की कमी से पुष्टि) के रेट्रो-कक्षीय जाल में माउस प्रति १०० μL पर कोशिकाओं सुई ट्यूमर असर प्रयोगात्मक चूहों । यदि ऐसा है तो वांछित, पुन: ऑटोलॉगस प्लाज्मा अकेले, या pbs के १०० μl के साथ चूहों असर ट्यूमर सुई ।
  3. YUMM 1.7 ट्यूमर असर चूहों के लिए, उपचार दोहराने (2-7.2 कदम) 3 सप्ताह के लिए एक सप्ताह में दो बार, 6 उपचार की कुल के लिए. इकट्ठा करने और ट्यूमर असर चूहों साप्ताहिक (प्रोटोकॉल वर्गों 2 \ u20124) से सोमवार और गुरुवार को PBMC प्रक्रिया, और फिर से मंगलवार और शुक्रवार को रातोंरात ऊष्मायन (प्रोटोकॉल धारा 5 \ u20127) के बाद डालना ।
    नोट: इस उपचार आहार चूहों में yumm 1.7 ट्यूमर के विशिष्ट विकास कैनेटीक्स के लिए विकसित किया गया था । यह धीमी या तेजी से ट्यूमर विकास दर के साथ अंय ट्यूमर प्रणालियों के लिए titrated की आवश्यकता हो सकती है-क्रमशः बढ़ाने या उपचार की संख्या को कम करने ।
  4. द्वि-साप्ताहिक मापन के माध्यम से ट्यूमर मात्रा की निगरानी-अधिमानतः चिकित्सा प्रशासन के समय (मंगलवार और शुक्रवार)-सीधा ट्यूमर व्यास और ऊंचाई एक कैलिपर का उपयोग कर की । प्रयोग समाप्त जब नियंत्रण ट्यूमर मात्रा संस्थागत दिशा निर्देशों और प्रोटोकॉल द्वारा अनुमत अधिकतम आकार तक पहुँचने ।

8. मानव रक्त के Ssmall मात्रा के इलाज के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलन

  1. पहले मानव रक्त से PBMC आइसोलेट द्वारा मानव कोशिकाओं के साथ प्रयोग के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलन. किसी भी पसंदीदा PBMC आइसोलेशन प्रोटोकॉल के साथ, एक विरोधी स्कंदक के रूप में हेपरिन का उपयोग करें.
  2. सुनिश्चित करें कि अलग pbmc अंश प्लेटलेट्स की एक शारीरिक संख्या में शामिल हैं, सबसे अच्छा प्रोटोकॉल परिणाम के लिए. प्लेटलेट गिनती मॉनिटर पूर्व और पोस्ट-किसी भी मानक रुधिर काउंटर का उपयोग कर पीबीएमसी अलगाव ।
  3. एक मानव सेलुलर प्रतिजन स्रोत का उपयोग करते हैं, तो YUMM 1.7 कोशिकाओं के लिए खंड 3 में वर्णित चरणों का पालन मानव एंटीजेनिक कोशिकाओं का इलाज. तितरते 8-एमओपी और UVA खुराक तदनुसार ।
  4. 3 x 107 pbmc प्रति TI प्लेट का उपयोग कर, खंड 4 में वर्णित प्लेट-पैसेज चरणों का पालन करें.
  5. संस्कृति pbmc रात के सेलुलर/विकल्प के अन्य प्रतिजन के साथ, के रूप में धारा 6 में वर्णित है, लेकिन कदम ६.१ में रातोंरात संस्कृति माध्यम के लिए ऑटोलॉगस माउस प्लाज्मा के लिए 15% मानव एबी सीरम स्थानापन्न.
  6. किसी भी वांछित परख में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं का उपयोग करें । उदाहरण के लिए, antigen-विशिष्ट T कक्ष प्रतिसाद TI-शोधित कक्षों द्वारा प्रारंभ किया गया पर गौर करने के लिए प्रतिजन-प्रतिक्रियाशील T कक्षों के साथ सह-संस्कृति ।

Representative Results

हम हाल ही में एक माउस को विकसित आदमी स्केनीय लघु ECP डिवाइस, तिवारी प्लेट (चित्रा 1a), और डिजाइन इसी उपचार प्रोटोकॉल । डिवाइस और प्रोटोकॉल कुंजी सेलुलर और प्रतिरोधकता ECP के vivo में विशेषताएं पुनरुत्पादित, "ट्रांसिमीकरण" करार दिया ।

सबूत के सिद्धांत murine ट्रांसिम्यूराइजेशन प्रोटोकॉल11 (चित्र 1b) परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (pbmc) ट्यूमर असर चूहों से अपोप्तोटिक 8 के साथ एक साथ के extracorporeal टीआई प्लेट बीतने के होते हैं-एमओपीएक-उजागर ट्यूमर कोशिकाओं । विशेष रूप से, टी चैंबर पारदर्शी और मानक माइक्रोस्कोपी स्लाइड प्रारूप से मेल करने के लिए आकार है, प्रोटोकॉल के किसी भी बिंदु पर तिवारी प्लेट के भीतर सेल बातचीत के आसान दृश्य के लिए अनुमति देता है (वीडियो 1). TI-प्लेट-सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं 8-एमओपीएक-उजागर अपोप्तोटिक ट्यूमर कोशिकाओं के साथ रात भर कर रहे हैं, ट्यूमर कोशिका तेज, प्रसंस्करण, और डीसी को ट्यूमर एंटीजन के हस्तांतरण की सुविधा । अगले दिन, सह-इन्क्यूबिटिड कोशिका मिश्रण ट्यूमर वाले जानवर के रक्त प्रवाह में वापस आ जाता है । नियंत्रण जानवरों के समान रक्त संग्रह प्रक्रियाओं से गुजरना, ट्यूमर के विकास पर लसीकरण के किसी भी प्रभाव के लिए सामान्य करने के लिए, लेकिन इसके बजाय PBS फिर से सुई लेनी प्राप्त. सभी जानवरों में ट्यूमर के विकास के प्रयोग के दौरान निगरानी की जाती है ।

अध्ययन में YUMM 1.7 syngeneic murine मेलेनोमा मॉडल18का उपयोग कर, transimzation प्रोटोकॉल दो बार तीन सप्ताह से अधिक साप्ताहिक दोहराया था, प्रत्येक जानवर में छह उपचार की कुल के लिए (चित्र 1b) । चिकित्सा अच्छी तरह से सभी जानवरों का इलाज (> 100) में सहन दिखाई दिया, और लगातार YUMM 1.7 ट्यूमर के विकास के नियंत्रण जानवरों बनाम इलाज में कमी दिखाया, के रूप में 9 स्वतंत्र 2 साल से अधिक आयोजित प्रयोगों में मनाया (चित्रा 2a, B). परिणाम transimzation में संचई ट्यूमर विकास डेटा दिखाने का इलाज किया और सभी प्रयोगों (चित्रा 2a), साथ ही साथ एक प्रयोग के भीतर व्यक्तिगत पशुओं के लिए प्रतिनिधि ट्यूमर विकास घटता पर नियंत्रण जानवरों, एक भावना प्रदान करने के लिए सिस्टम में परिवर्तनीयता (चित्र 2b) ।

हमने पाया है कि प्रोटोकॉल की सफलता गंभीर इलाज PBMC में monocytes की उपस्थिति पर निर्भर करता है, पीबीएमसी अंश में प्लेटलेट्स की उपस्थिति, और तिवारी प्लेट बीतने कदम. जब प्लेट मार्ग छोड़ दिया जाता है, या जब प्लेटलेट्स या monocytes PBMC अंश से समाप्त हो रहे हैं, उपचारात्मक प्रभाव अब नहीं मनाया जाता है (चित्र 3a). उपचार भी अपोप्तोटिक ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति की आवश्यकता है । यह या तो प्रतिरक्षा कोशिकाओं या एक प्रतिजन स्रोत के अभाव में अप्रभावी है, या बेमेल प्रतिजन की उपस्थिति में, उदाहरण के लिए जब YUMM 1.7 ट्यूमर असर चूहों MC38 बृहदांत्र कार्सिनोमा कोशिकाओं का उपयोग कर इलाज कर रहे है (चित्रा 3b) । एक प्रतिरक्षण परिणाम के लिए यह भी 8 से PBMC जोखिम से बचने के लिए महत्वपूर्ण है-एकएमओपी. 8-एमओपीए-उजागर pbmc न केवल abrogate, या संभवतः भी रिवर्स, विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा (चित्रा 3 सी), लेकिन यह भी असंवृत कोशिकाओं के प्रतिरक्षण क्षमता को बाधित, के रूप में प्रयोग में जहां 8 की एक समान संख्या-एमओपीएकउजागर और 8-एमओपी A-संरक्षित pbmc कोई नमूनीय विरोधी ट्यूमर प्रभाव के साथ इस्तेमाल किया गया (चित्रा 3 सी).

मानव pbmc के साथ, तिवारी चैंबर और ट्रांससिम्यूनीकरण प्रोटोकॉल डीसी में सफल मोनोसाइट सक्रियण के लिए नेतृत्व, सेल की सतह और intracellular सक्रियण मार्करों द्वारा अविवेच्य कि नैदानिक ecp प्लेट द्वारा हासिल की (तालिका 1). जैसा कि माउस अध्ययनों में, DC सक्रियण (चित्र 4a) और ट्रांसिम्यूराइजेशन-जेनरेटेड dc की प्रक्रिया और वर्तमान प्रतिजन की क्षमता (चित्र 4b,C) गंभीर रूप से पीबीएमसी में प्लेटलेट्स की उपस्थिति पर निर्भर करती है, और TI प्लेट मार्ग पर । ट्रांससिम्यूनीकरण-मानव DCs सक्रिय कर सकते हैं प्रभावी ढंग से प्रक्रिया और पार वर्तमान या तो पेप्टाइड एंटीजन (चित्रा 4B), या एंटीजन से पूरे 8-एमओपीए-उजागर मानव ट्यूमर कोशिकाओं, में मानव प्रतिजन विशिष्ट टी सेल लाइनों को सक्रिय करने के लिए इन विट्रो एक टी औरप्लेटलेट पर निर्भर तरीके से (चित्रा 4C, c) assays हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: Transimमीकरण (तिवारी) चैंबर और प्रोटोकॉल schematics. (क) ट्रांसिम्यूराइजेशन ट्रीटमेंट चैम्बर (टीआई प्लेट) के आरेख और विनिर्देश । (ब) स् योजनाबद्ध विवरण ट्रांसिमराइजेशन ट्रीटमेंट प्रायोगिक कार्यप्रवाह । संक्षेप में, प्राणियों को उपक्षकतापूर्वक (सीएससी) syngeneic ट्यूमर कोशिकाओं के साथ inoculated हैं; स्पष्ट ट्यूमर के साथ पशु दो बार साप्ताहिक रक्त ड्रा द्वारा इलाज कर रहे हैं, रक्त से PBMC के अलगाव, ऑटोलॉगस प्लेटलेट के माध्यम से PBMC प्रवाह मार्ग-लेपित TI प्लेट 8 की उपस्थिति में-एमओपी/ एक ही ट्यूमर वाले जानवरों में नसों के द्वारा कोशिकाओं के पुनः इंजेक्शन । ट्यूमर की मात्रा प्रयोग भर में मापा जाता है । यह आंकड़ा11से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: YUMM 1.7 मेलेनोमा syngeneic ट्यूमर के ट्रांसिमराइजेशन नियंत्रण विकास. (क) समय के साथ yumm 1.7 ट्यूमर की मात्रा C57BL/6 चूहों के लिए साजिश रची 1 x 105 yumm 1.7 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ inoculated, और प्राप्त करने के लिए या तो छह transimzation उपचार (ब्लैक लाइन), या छह नियंत्रण उपचार (ग्रे लाइन). डेटा दो वर्षों में किए गए नौ स्वतंत्र प्रयोगों से अधिक संचयी है । (ख) एक एकल प्रतिनिधि yumm 1.7 transimmunizaton प्रयोग से डेटा, प्रत्येक एक व्यक्ति माउस के लिए ट्यूमर वृद्धि दिखा लाइन के साथ । (क और ख) "PBS नियंत्रण" सभी प्रयोगों में चूहों प्रयोगात्मक जानवरों के रूप में एक ही समय पर bled थे, लेकिन छह बाँझ PBS फिर से सुई लेनी प्राप्त. सिदक की एकाधिक तुलनाओं के परीक्षण का उपयोग करते हुए प्रत्येक समय बिंदु के लिए परिकलित SEM, p-मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं; * *, p = ०.००१३; , पी < ०.०००१ । यह आंकड़ा11से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: Transimmunization की आवश्यकता है monocytes और प्लेटलेट्स टीआई प्लेट-PBMC अंश पारित कर दिया, के रूप में अच्छी तरह के रूप में 8-एमओपी काएक उपचार प्रतिजन मिलान ट्यूमर कोशिकाओं और 8-एमओपीएक pbmc के बख्शते. (क) समय के साथ yumm 1.7 ट्यूमर की मात्रा C57BL/6 चूहों के लिए साजिश रची 1 * 105 yumm 1.7 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ, और प्राप्त करने के लिए या तो छह ट्रांसिमराइजेशन उपचार (ठोस काले लाइनों), छह नियंत्रण उपचार (ठोस ग्रे लाइनों), या छह टी उपचार जहां monocytes या प्लेटलेट्स PBMC से पहले थाली बीतने कदम (एक-CD11b और एक-CD41 रिक्तीकरण किट, क्रमशः) का उपयोग कर समाप्त हो गए थे, या थाली पारित (बिंदीदार रेखाएँ) छोड़ा गया था. (ख) C57BL के लिए प्लॉट किए गए समय के साथ ट्यूमर की मात्रा/6 1 x 105 yumm 1.7 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ inoculated चूहों, और या तो छह transimzation उपचार प्राप्त (ठोस काले लाइनों), छह नियंत्रण उपचार (ठोस ग्रे लाइनों), अकेले pbmc (डैश्ड लाइन), 8- एमओपीएक-अकेले yumm 1.7 कोशिकाओं, या टीआई का उपयोग 8-एमओपीएकइलाज MC38 ट्यूमर कोशिकाओं (बिंदीदार रेखाएं) । (ग) समय के साथ C57BL के लिए प्लॉट किए गए ट्यूमर की मात्रा 1 x 105 yumm 1.7 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ inoculated, और या तो छह transimzation उपचार प्राप्त (ठोस काले लाइनों), छह नियंत्रण उपचार (ठोस ग्रे लाइनों), छह टी उपचार जहां PBMC समान रूप से 8 करने के लिए उजागर कर रहे थे-एक तुरंत प्लेट पारित होने से पहले एमओपी, छह टी उपचार जहां pbmc समान रूप से 8 करने के लिए उजागर किया गया-एक तुरंत प्लेट पारित करने के बाद एमओपी, या छह उपचार प्लेट बीतने के बाद जहां तिवारी कोशिकाओं 1:1 मिश्रित थे के साथ PBMC की एक समान संख्या जो समान रूप से 8-एमओपीएक विकिरण (डॉटेड लाइनें) को उजागर किया गया है । (ए, बी और सी) "PBS नियंत्रण" सभी प्रयोगों में चूहों प्रयोगात्मक जानवरों के रूप में एक ही समय पर bled थे, लेकिन छह बाँझ PBS फिर से सुई लेनी प्राप्त. डेटा प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए प्रदान की जाती हैं. सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं, P-हर बार है Sidak एकाधिक तुलना परीक्षण का उपयोग कर बिंदु के लिए गणना मूल्यों; *, पी < ०.०५; * *, पी < ०.०१; , पी < ०.००१; , पी < ०.०००१; एन एस = मतभेद महत्वपूर्ण नहीं है । यह आंकड़ा11से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ti चैंबर के साथ तिवारी प्रोटोकॉल तेजी से डीसी परिपक्वता, अद्वितीय सक्रियण प्रोफ़ाइल लाती है, और मानव PBMC में टी सक्रिय क्षमता सेल, थाली बीतने और प्लेटलेट्स पर निर्भर.
A. facs विश्लेषण में संकेत मार्कर की CD11c+ कोशिकाओं के बीच या तो हौसले से अलग मानव pbmc ("नियंत्रण"), pbmc तिवारी प्रोटोकॉल के साथ इलाज किया ("ti"), या तिवारी का इलाज pbmc जहां प्लेट पारित लोप कर दिया गया था, प्लेटलेट्स का उपयोग कर समाप्त हो रहे थे a-CD41 मनका किट से पहले थाली पारित करने के लिए, या दोनों के ऊपर प्रदर्शन किया गया । आंकड़ों में तीन रक्तदाताओं के साथ छह स्वतंत्र प्रयोगों का सारांश है । पट्टियां माध्य मानों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जबकि त्रुटि पट्टियां युग्मित t-परीक्षण का उपयोग करके परिकलित प्रत्येक तुलना के लिए SEM. P-मान का प्रतिनिधित्व करती हैं; *, पी < ०.०५; * *, पी < ०.०१ । 11से पैनलों को संशोधित किया गया है । B. प्लेटलेट-युक्त या प्लेटलेट-समाप्त टीआई-इलाज मानव pbmc एक अप्रासंगिक (siE7) पेप्टाइड, या सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के लिए लंबे समय पेप्टाइड के साथ-संबद्ध एचपीवी प्रोटीन के साथ रातोंरात सह-इन्क्यूबिटेड थे । PBMC तो एक मानव सीडी 8 T सेल लाइन विशेष रूप से प्रतिक्रियाशील E7 पेप्टाइड को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. टी सेल उत्तेजना की संस्कृति के 5 दिनों के बाद IFNg उत्पादन द्वारा मापा गया था । (ग) प्लेटलेट युक्त या प्लेटलेट-समाप्त टीआई-उपचारित मानव पीबीएमसी ने रातोंरात 8-एमओपीए-उपचारित सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा सेल लाइन SCC61 के साथ सह-इन्क्यूबिटिड किया गया था (SCC61 एचपीवी E6/7) या व्यक्त नहीं (SCC61 कोई एचपीवी ) एंटीजेनिक एचपीवी E6 और E7 प्रोटीन19। PBMC तो एक मानव सीडी 8 T सेल लाइन विशेष रूप से प्रतिक्रियाशील E7 पेप्टाइड को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. टी सेल उत्तेजना की संस्कृति के 5 दिनों के बाद IFNg उत्पादन द्वारा मापा गया था । (ख और ग) डेटा शो प्रतिनिधि प्रयोग प्रत्येक में तीन प्रतिकृति । सलाखों के माध्य मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि त्रुटि सलाखों के एक तुलना के लिए SEM. P मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते है Sidak एकाधिक तुलना परीक्षण का उपयोग कर की गणना; , पी < ०.००१; , पी < ०.०००१ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

मार्कर पैरामीटर इलाज टीआई प्रोटोकॉल के साथ ECP प्लेट टीआई प्रोटोकॉल के साथ TI प्लेट पी मूल्य ECP बनाम तिवारी
हला-डॉ Δ MFI १००.१ ± ४२.४ ४३९.८ ± १५२.५ ४१७.७ ± १५२.२ एन एस
CD80 Δ ३.९ ± १.१ २२.३ ± ७.२ २४.५ ± ७.२ एन एस
CD83 Δ MFI ०.३ ± ०.२ ५३.३ ± ९.७ ५१.४ ± १७.४ एन एस
CD86 Δ MFI १०.८ ± १.७ १०३.९ ± २३.४ ८७.१ ± १७.६ एन एस
PLAUR Δ MFI ५४.५ ± 12 ७२१.४ ± १८३.६ ५२८.७ ± १३५.५ एन एस
ICAM1 Δ MFI १२.२ ± १.६ १७९.६ ± २८.५ १९२.५ ± २५.४ एन एस
ITGB5 Δ MFI ५३.६ ± २५.७ ९७.१ ± ३१.६ १०३.८ ± ३२.८ एन एस
CCL2 (MCP-1) Δ ०.६ ± ०.५ ७०.१ ± ६.७ ५५.२ ± ८.९ एन एस
CXCL5 Δ ०.७ ± ०.४ ३९.१ ± ७.२ ४१.५ ± ४.७ एन एस
CXCL16 Δ ०.३ ± ०.२ २८.० ± ८.८ ३५.३ ± ११.७ एन एस
CD105 (endoglin) Δ MFI ३.६ ± ०.३ १२४.३ ± २५.४ १४१.८ ± ३३.२ एन एस
CD112 (nectin 2) Δ MFI १०.९ ± १.८ ४७.३ ± ५.२ ५०.९ ± ९.२ एन एस
CD120a (टीएनएफआर-1) Δ MFI १०.१ ± २.६ २.२ ± १.४ १.८ ± १.१ एन एस
CD137L (4-1BBL) Δ MFI २.९ ± १.५ १.० ± ०.४ १.२ ± ०.६ एन एस

सारणी 1: टीआई चैंबर के साथ टी प्रोटोकॉल तेजी से नैदानिक ECP चैंबर के साथ टी प्रोटोकॉल द्वारा प्रेरित है कि डीसी परिपक्वता के बराबर लाती है । संबंधित IgG नियंत्रण से संकेत मार्करों के परिवर्तन का FACS विश्लेषण या तो हौसले से अलग PBMC ("अनुपचारित") के बीच लाइव मानव CD11c + कोशिकाओं में, PBMC के माध्यम से पारित नैदानिक ECP प्लेट तिवारी प्रोटोकॉल ("तिवारी प्रोटोकॉल के साथ ECP प्लेट") और निंनलिखित रातोंरात उद्भवन, या तिवारी प्रोटोकॉल के साथ इलाज PBMC ("प्रोटोकॉल के साथ तिवारी प्लेट") का विश्लेषण किया और रात के बाद ऊष्मायन का विश्लेषण किया । मार्कर्स, जैसे कि एचएलए-डीआर के लिए, जहां पूरे सेल जनसंख्या को बदल दिया गया था, डेटा को माध्य फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) में परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया जाता है । मार्कर के लिए जहां केवल कक्षों का एक सबसेट मार्कर, जैसे CCL2 के रूप में व्यक्त, प्रतिशत मार्कर में अंतर-लाइव CD11c की सकारात्मक कोशिकाओं + PBMC बजाय प्रतिनिधित्व किया है. आंकड़ों में तीन रक्तदाताओं के साथ छह स्वतंत्र प्रयोगों का सारांश है । प्रत्येक मार्कर के लिए डेटा का मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं-उम्र ± मानक माध्य (SEM) त्रुटि । P-प्रत्येक तुलना के लिए मान युग्मित t परीक्षण का उपयोग कर परिकलित; एन एस = मतभेद महत्वपूर्ण नहीं है । तालिका को11से संशोधित किया गया है ।

Video 1
वीडियो 1: प्लेटलेट और प्रतिरक्षा सेल बातचीत के टी प्लेट के भीतर लाइव सेल इमेजिंग ।
PBMC इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल अनुभाग 2 में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था और धारा 4 में वर्णित के रूप में transimzation थाली को उजागर, 4.2.3 कदम में स्थिर ऊष्मायन अवधि के अलावा 1 घंटे से 30 मिनट तक कम हो गया था. टीआई प्रोटोकॉल के दौरान, टी प्लेट, जो आकार में एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड के समान है, एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली की स्लाइड होल्डिंग चरण में फिट किया गया था और इसके भीतर कोशिकाओं 40x आवर्धन पर imaged और ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली भरने के दौरान (4.2.2 ), प्लेट ऊष्मायन (4.2.3), और प्लेट फ्लो (4.3.5) चरणों । निरंतर छवियों का अधिग्रहण किया गया और फिल्मों "स्वचालित स्कैनिंग दिनचर्या" सॉफ्टवेयर का उपयोग कर का उत्पादन किया । वीडियो के नीचे कैप्शन में प्रोटोकॉल की उस स्टेज का संकेत मिलता है, जिस पर सेल्स को फिल्माया जा रहा है । वीडियो में तीर और वृत्त, संबद्ध कैप्शंस के साथ, कक्षों और रुचि के क्षेत्रों को इंगित करते हैं । 10 μM स्केल बार पूरे वीडियो में निचले दाएं कोने में मौजूद है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Discussion

लघुकृत युक्ति और प्रोटोकॉल पहली बार के लिए माउस प्रयोगात्मक प्रणाली में ecp के तंत्र के कुशल प्रयोगशाला जांच के लिए अनुमति देते हैं, और छोटे मानव रक्त के नमूनों में ऊपर वर्णित है । यह एक महान अग्रिम है; उदाहरण के लिए, यह हमें पहली बार एक माउस मॉडल 11में ठोस ट्यूमर के खिलाफ ट्रांसिमराइजेशन की प्रभावकारिता के लिए प्रदर्शन करने की अनुमति दी, मानव कैंसर विज्ञान में एक समान आवेदन के भविष्य की संभावना खोलने ।

ट्रांसिमराइजेशन डिवाइस और विधि यहां वर्णित के विकास से पहले, यह पूरी तरह से ECP के सभी पहलुओं की जांच करने के लिए असंभव था । माउस मॉडल में, हालांकि 8-एमओपी चिकित्सा केएक पहलू कुछ एक पेट्री डिश में कोशिकाओं के इलाज के द्वारा दोहराया जा सकता है12,20, वहां कोई विधि में एकीकृत करने की क्षमता थी थाली मार्ग, जो दिखाया गया है डायनामिक प्लेटलेट इंटरैक्शन प्रदान करें जो कि ECP के शारीरिक DC सक्रियण14के लिए महत्वपूर्ण हैं. मानव अध्ययन में, वैकल्पिक रूप से, प्रवाह घटक पूरी तरह से मौजूद था, लेकिन 8 करने के लिए चुनिंदा सेलुलर घटकोंकापर्दाफाश करने की क्षमता-एमओपी, या उन्हें इससे बचाने के लिए,21,22याद आ रही थी । यह ECP तंत्र की पूरी समझ को रोका, और प्रतिरक्षा या सहिष्णुता के लिए अपने अनुकूलन । इसके अलावा, नैदानिक ECP उपकरण के साथ काम करने के लिए आवश्यक रक्त की मात्रा बड़ी है, वैज्ञानिक जांच में बाधा. लघुकृत ecp डिवाइस और प्रोटोकॉल के लिए यहां वर्णित पहली बार कुशल, पूरी तरह से लचीला और स्वरित्र प्रयोगशाला ecp मॉडलिंग के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, तिवारी प्लेट वास्तविक समय दृश्य और microscopy द्वारा थाली के भीतर सेल बातचीत की निगरानी के लिए अनुमति देता है ।

प्रोटोकॉल की सफलता के लिए दोनों vivo में और पूर्व vivo में सिस्टम का उपयोग कर, यह महत्वपूर्ण है कि उपचारित PBMC कार्यात्मक Dc में सक्रिय किया जा सकता है कि monocytes होते हैं. इस सक्रियण के लिए आगे बढ़ने के लिए, यह भी सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है PBMC अंश स्वस्थ, activatable प्लेटलेट्स की एक भौतिक संख्या शामिल हैं, और कि तिवारी प्लेट पारित प्रोटोकॉल बारीकी से पीछा किया है. आदेश में नए सक्रिय Dc एक विशिष्ट जेट की ओर निर्देशित करने के लिए, वे प्रतिजन के साथ उपलब्ध कराया जाना चाहिए । हमने पाया है कि एंटी कैंसर प्रतिरक्षा के लिए प्रतिजन वितरण का सबसे कुशल विधि रात भर सह-ऊष्मायन के साथ नव सक्रिय Dc के साथ-एमओपी-एक-उजागर ट्यूमर कोशिकाओं । यह ट्यूमर एंटीजन के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता के बिना एक immunogenic विरोधी कैंसर प्रतिक्रिया बनाने के लिए सक्षम होने का जोड़ा लाभ है, डीसी उन्हें चुनने के लिए अनुमति देकर. हालांकि, मामलों में जहां प्रतिजन ज्ञात है, हम पूर्व vivo में कुछ सफलता थी जब सह में एंटीजन के रूप में मुक्त पेप्टाइड्स का उपयोग कर प्रणालियों-ऊष्मायन । Immunogenic अनुप्रयोगों के लिए, डीसी स्वयं से संरक्षित किया जाना चाहिए 8-एमओपीएक जोखिम । अंत में, में vivo में प्रयोगों, यह एक पशु मॉडल है कि विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा के लिए सक्षम है के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है । ट्रांसिम्यूनीकरण सक्रिय, प्रतिजन-विशिष्ट Dc, जो जंमजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को आरंभ करने के लिए शरीर में काम करते हैं, बनाने के द्वारा काम करता है । बिगड़ा गतिविधि या एनके, सीडी 4, या इलाज माउस में सीडी 8 T कोशिकाओं की कमी प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता5,11प्रभाव होगा ।

जबकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक सबूत के सिद्धांत एक है कि एक माउस ठोस syngeneic ट्यूमर मॉडल के लिए अनुकूलित किया गया है, यह फिर भी कई अवसरों से पता चलता है । कैंसर विज्ञान में ECP के तंत्र केवल केवल elucidated जा रहा है, और वहां अभी भी बेहतर समझ के लिए बहुत गुंजाइश है । अधिक मोटे तौर पर, फिजिकली सक्रिय माउस और मानव Dc उत्पन्न करने की क्षमता, और उन्हें प्रतिजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा के लिए चुनिंदा रूप से निर्देशित करने के लिए कैंसर से परे कई संभावित अनुप्रयोग हैं । एक ही करने की क्षमता है, लेकिन इसके बजाय प्रतिजन विशिष्ट सहिष्णुता की ओर डीसी प्रत्यक्ष, के रूप में ECP के बर्दाश्त प्रभावकारिता द्वारा ही सुझाव दिया है, भी व्यापक चिकित्सा निहितार्थ है । इस विधि के साथ, हम उपकरण प्रदान करने और फिजियोलॉजिकल डीसी चिकित्सा में रुचि के साथ किसी के लिए अनुसंधान के एक उत्पादक एवेंयू खोलने की उंमीद है ।

Disclosures

येल विश्वविद्यालय के प्रोफेसर रिचर्ड edelson है कि एक येल शुरू कंपनी को लाइसेंस प्राप्त किया गया है के द्रुमाकृतिक कोशिका अनुसंधान से पाने पेटेंट का मालिक है, transimmune एजी । रिचर्ड Edelson और माइकल Girardi वैज्ञानिक सलाहकार Transimmune एजी के लिए कर रहे हैं, जबकि ओल्गा Sobolev एक Transimmune एजी कर्मचारी है । Transimmune एजी किसी भी मौजूदा वाणिज्यिक उत्पादों नहीं है, लेकिन एक सहयोगात्मक आधार पर यह Transimmune इस लेख में इस्तेमाल प्लेटों का उत्पादन । यह संभव है कि इन तीन लेखकों को संभवतः भविष्य में इन खोजों के वाणिज्यीकरण से लाभ हो सकता है ।

Acknowledgments

इस कार्य को एनआईएच-एनसीआई स्पोर ग्रांट 1 P50 CA121974 (आर एडेलसन, एम. गिरराडी) द्वारा समर्थित किया गया था; NIH कैंसर केंद्र सहायता अनुदान 3 P30 CA16359-28S1 (आर Edelson, एम Girardi); हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल संस्थान प्रशिक्षण फैलोशिप (ए Vassall); और हिंदी अनुवाद कार्डिएक फाउंडेशन (आर Edelson, ए Ventura, ए Vassall, एच Ezaldein) । R01 CA196660-01 द्वारा एम. बोसेनबर्ग को आंशिक सहायता प्रदान की गई.

लेखक डॉ रॉबर्ट Tigelaar के लिए उनकी सलाह, मार्गदर्शन, और प्रयोगात्मक अंतर्दृष्टि के लिए आभारी हैं । हम Fraunhofer IBMT में हमारे सहयोगियों, विशेष रूप से डॉ Thorsten टीला, विकासशील और ECP-समकक्ष तिवारी चैंबर प्रदान करने के लिए धंयवाद । निकोलस Theodosakis कृपया YUMM प्रयोगों के प्रारंभिक चरणों के साथ मदद की । हम अपने स्वयंसेवक रक्तदाताओं, Inger Christensen और येल ECP उपचार केंद्र में उसे स्वयंसेवक रक्त की खरीद के साथ मदद के लिए पेशेवर स्टाफ धंयवाद । डॉ वेंडेल Yarbrough और डॉ नतालिया Issaeva कृपया हमारे साथ SCC61 और SCC61-E6/ परियोजना पर तकनीकी सहायता के लिए, हम FACS प्रोटोकॉल सलाह के लिए डॉ जूलिया लुईस धन्यवाद, और येल FACS कोर में ई. Menet, जी Tokmoulina, सी Cote. तिवारी प्लेट के भीतर कोशिकाओं की फिल्म छवियों फेलिक्स Rivera की सहायता से अधिग्रहीत किए गए थे-मोलिना, पीएचडी, सेल जीवविज्ञान विभाग और येल सिनेमा इमेजिंग केंद्र, चिकित्सा के येल स्कूल । फिल्म उत्पादन एंड्रयू ओसबोर्न, वरिष्ठ वीडियो निर्माता, संचार, येल स्कूल ऑफ मेडिसिन के कार्यालय द्वारा निगरानी की गई थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) Therakos, Inc Rx only, NDC No. 64067-0216-01 Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
AB serum Lonza BioWhittaker 14-498E Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC
ACK red cell lysis buffer Lonza BioWhittaker 10-548E Protocol step 2 - mouse PBMC preparation
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging VetEquip 901820 Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration
Autologous mouse plasma prepare in lab n/a Prepare per protocol step 2.4, use in  7.1 - mouse TI treatment administration
Autologous mouse serum prepare in lab n/a Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC
C57Bl/6J mice Jackson labs 0000664 Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um Medipoint 9891620 Protocol step 2 - mouse PBMC preparation
Clear RPMI Gibco by LifeTech 11835-030 Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC
DMEM/F12 Gibco by LifeTech 11330-032 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
EasyGrip Petri Dishes, 35mm Falcon 351008 Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC
Eppendorf 1.5mL conical tubes DOT scientific 1700-GMT Protocol steps 1-8
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) SAFC Biosciences 12306C-500mL Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate
Hemavet 950FS hematology counter Drew Scientific HV950FS Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers
Heparin 5,000U/mL McKesson Packaging services 949512 Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation
Isoflurane Abbott Laboratories 5260-04-05 Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration
Lympholyte M lymphocyte isolation medium Cedarlane Labs CL5035 Protocol step 2 - mouse PBMC preparation
Non-essential amino acids Gibco by LifeTech 11140-050 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) Gibco by LifeTech 14190-144 Protocol steps 1-7
Pen/strep Gibco by LifeTech 15140-122 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
Polypropylene 15mL conical tubes Falcon 352097 Protocol steps 1-8
Programmable 2-channel syringe pump New Era Pump Systems Inc model NE-4000 Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 BD Biosciences 305109 Protocol step 7 - mouse TI treatment administration
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) BD Biosciences 309604 Protocol steps 4, 8 - running the TI plate
Syringes, 1mL (Slip tip) BD Biosciences 309659 Protocol steps 1, 4, 7, 8
TI plate and tubing set Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
TI plate running platform Transimmune AG not commercially available  Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis.
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) Falcon 353136 Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture
Tissue culture plates, 12-well Falcon 353043 Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells
Tissue culture scrapers Falcon 353085 Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) Gibco by LifeTech 25200-056 Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture
Tumor injection needles, 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction
UVA irradiator Johnson and Johnson not commercially available  The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us.
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System Invitrogen fluorescence imaging instrument

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण समस्या १४७ इम्यूनोलॉजी कैंसर इम्यूनोथेरेपी Extracorporeal Photoकीमोथेरपी ECP डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं डीसी
फिजियोलॉजिकल इम्यूनोजेनिक डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं के सृजन के लिए उपन्यास प्रोटोकॉल
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Ventura, A., Vassall, A., Yurter, A., Robinson, E., Filler, R., Hanlon, D., Meeth, K., Ezaldein, H., Girardi, M., Sobolev, O., Bosenberg, M. W., Edelson, R. L. Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (147), e59370, doi:10.3791/59370 (2019).

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