Summary
O dispositivo de transimmunização (TI) ou a placa e os protocolos relacionados foram desenvolvidos para replicar as principais características da fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), em um ambiente experimental, permitindo a produção de células dendríticas ativadas fisiologicamente, células (DCs) para a imunoterapia do cancro.
Abstract
A fotoquimioterapia extracorpórea (ECP) é uma imunoterapia de câncer amplamente utilizada para o linfoma cutâneo de células T (CTCL), operativa em mais de 350 centros universitários em todo o mundo. Embora a eficácia clínica do ECP e o perfil de segurança exemplar tenham impulsionado seu uso generalizado, a elucidação dos mecanismos subjacentes permaneceu um desafio, em parte devido à falta de um modelo de laboratório ECP. Para superar esse obstáculo e criar uma plataforma simples e fácil de usar para a pesquisa do ECP, desenvolvemos uma versão reduzida do dispositivo clínico de processamento de leucócitos ECP, adequado para trabalho com modelos de mouse e pequenas amostras de sangue humano. Este dispositivo é denominado a câmara de Transimmunization (TI), ou a placa. Em uma série de experimentos de referência, o dispositivo miniaturizado foi usado para produzir uma vacina celular que iniciou regularmente a imunidade terapêutica anticancerígenos em vários modelos de tumores de camundongo syngeneic. Removendo fatores individuais do sistema experimental e verificando sua contribuição à resposta in vivo do anti-tumor, nós elucidados então excitadores mecanísticos chaves do potencial IMUNIZANTE do ECP. Coletivamente, nossos resultados revelaram que os efeitos antitumorais da ECP são iniciados por células dendríticas (DC), geradas fisiologicamente através da interação monócito do sangue com plaquetas na placa de TI, e carregadas com antígenos de células tumorais cuja célula apoptótica a morte é finamente titulada pela exposição ao agente de ligação cruzada do ADN photoactivatable 8-methoxypsoralen e luz UVA (8-MOPa). Quando retornado ao rato, esta vacina celular conduz à imunidade antitumoral específica e transferível da pilha de T. Verificou-se que a câmara de TI também é adequada para o processamento de sangue humano, produzindo DCs humanos totalmente comparáveis no estado de ativação e perfil para aqueles derivados da câmara de ECP clínica. Os protocolos aqui apresentados destinam-se a estudos de ECP em camundongo e homem, geração controlada de células tumorais apoptóticas com 8-MOPAe produção rápida de DCS de monócitos humanos e de rato fisiológicos para uma variedade de aplicações.
Introduction
A fotoquimioterapia extracorpórea (ECP) é uma imunoterapia estabelecida que é amplamente operatória em centros universitários em todo o mundo. Seu uso foi conduzido pela seletividade original, pela segurança, e pela eficácia bidirecional da terapia do ECP, traços que o ECP compartilha com o sistema imunitário fisiológico próprio com que parece sócio. ECP é seletivamente imunizando contra as células malignas no linfoma cutâneo de células T (CTCL)1,2, e tolerando seletivamente para antígenos direcionados no transplante, autoimunidade, e doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) configurações 3. º , 4. a imunogenicidade da ECP é destacada por sua dependência em um compartimento de células T CD8 intacto na CTCL5, enquanto a especificidade é refletida pelo perfil de reação adversa muito favorável da ECP, sem supressão imune fora do alvo em transplante ou Ajustes de GvHD, e nenhuma susceptibilidade oportunista aumentada da infecção em CTCL, onde os clones não-patogénicos da pilha de T poderiam potencial ser perdidos junto com as pilhas de T malignos.
Dada a importância clínica da ECP, a esperança de que uma melhor compreensão de seus mecanismos possa expandir o alcance terapêutico do ECP para um espectro mais amplo de cânceres e distúrbios imunológicos tem estimulado o interesse internacional. Dois workshops nacionalmente sancionados, um Simpósio Nacional de saúde (NIH) estado-da-ciência6 e uma sociedade americana para a conferência de consenso de Apheresis7, foram conduzidos e relatados, com o objetivo de acelerar o identificação dos principais contribuidores celulares para os efeitos anticancerígenos e tolerogênicos da ECP.
Até à data, apesar de numerosos relatórios publicados que tentam abordar o mecanismo da ECP, dois obstáculos primários impediam os avanços científicos. Em primeiro lugar, a investigação dos mecanismos de ECP no ambiente experimental do laboratório tem sido limitada pela falta de dispositivo ECP em miniatura que refletisse plenamente os efeitos celulares e in vivo da ECP, e ser aplicável a modelos animais. Em segundo lugar, a análise laboratorial aprofundada das amostras de ECP no ambiente clínico foi restringida pela disponibilidade limitada de células imunes do doente processadas pelo ECP, que necessitam de acesso a centros de tratamento, e estão adicionalmente sujeitas à temporização do as infusões do paciente, e a necessidade ética para jogos uncompromised de leucócito paciente-reinfundido.
Para resolver os obstáculos que impedem o progresso da pesquisa ECP, nós definimos para desenvolver um aparelho ECP miniatura que mais estreitamente imitaria os elementos-chave da terapia. O tratamento padrão do ECP envolve a passagem de um paciente leukapheresis-enriquecido leucócito através de um 1 mm-grosso, uma luz ultravioleta (uva)-transparente, placa plástica6,8. Na placa, os leucócitos são expostos a 8-methoxypsoralen (8-MOP), um agente Photo-activatable que após a exposição UVA é transientemente convertido em uma forma reativa (8-MOPa), capaz de cross-linking DNA através de sua ligação bivalente para bases pirimidina em costas do ADN da irmã9,10. Os leucócitos processados, 8-MOPa-tratados são recolhidos e retornados intravenosamente ao paciente.
Como o ECP em si é uma terapia bidirecional, imunizando-se em câncer e tolerando em transplante, autoimunidade e configurações de GvHD, para esclarecimento, denominamos o modo de imunização do modelo ECP "transimmunização", e o modo tolerogênico "transtolerização". Primeiramente, nos concentramos na modalidade de transimmunização. Nosso recentemente relatado miniaturizado escalável mouse-to-Man ECP dispositivo, a transimmunization (TI) câmara ou placa, e o protocolo correspondente, reproduzir tanto o celular e in vivo efeitos do dispositivo ECP humano em um câncer de configuração11.
A fim fazer o modelo in vivo do transimmunization como clinicamente relevante como possível, nós iniciamos a imunoterapia depois que os tumores syngeneic injetados por via subcutânea do rato se tornaram palpáveis, assim testando a eficácia do protocolo no cancro estabelecido. Similarmente ao ECP no CTCL, o protocolo do transimmunization da prova--princípio no modelo de YUMM 1.7 da melanoma usa pilhas mononucleares do sangue periférico (PBMC) dos animais tumor-tendo. As células são passadas através da placa de TI fluxo. Enquanto 8-MOPum tratamento de células na câmara em miniatura é possível, é preferível para conduzi-lo separadamente, para garantir que apenas o tipo de célula desejada é exposto a 8-MOPa. Estudos anteriores indicam que o efeito tolerogênico da ECP é mediado por células de apresentação de antígeno de 8 ESFREGONAa-lesionadas12, enquanto o efeito IMUNIZANTE requer 8-MOPum ferimento de células-alvo do tumor11. No protocolo do transimmunization as pilhas do tumor, ou as pilhas imunes, podem seletivamente ser expor a 8 MOPa como necessário. Uma vez que maximizar o tempo de contato entre células tumorais de 8-MOPa-feridos e células dendríticas induzidas por ECP (DC) demonstrou aumentar significativamente a capacidade imuno-terapêutica do ECP clínico13, nós incorporamos uma noite etapa de coincubação em nosso protocolo. Após a incubação durante a noite, as células tratadas são devolvidas ao animal tumor-Bearing.
Este sistema reduziu confiantemente o crescimento do tumor e a imunidade antitumoral específica iniciada nos ratos com os tumores syngeneic estabelecidos11, e permitiu-nos de dissecar o mecanismo da eficácia antitumoral clínica do ECP. Em vários estudos,demonstramos que a imunidade ECP é iniciada por meio da ativação plaquetária ex vivo na placa de ti14,15. As plaquetas ativadas subsequentemente sinalizam a maturação das células monócitos-a-dendríticas14, levando à produção de DCS fisiológicas. Os DCs recém-formados de monócitos são capazes de cruzar-apresentar antígenos internalizados de células tumorais de8-MOP a-danificado para ativar respostas de células T antígeno-específicas16. Como sugerido anteriormente12,17, no entanto, 8-MOPa-induzida danos dos próprios DCS nascente pode Counter-Act ou até mesmo reverter o efeito antitumoral11, proporcionando uma ligação mecanicista à tolerância ECP.
A placa de TI também foi usada para produzir DCs ativados fisiologicamente de PBMC humano. Similarmente aos estudos do rato, os DCs humanos TI-derivados são dependentes da placa-passagem na presença de plaqueta para sua geração, aparecem fenotipicamente idênticos a estes produzidos na placa clínica do ECP, e são capazes de processar eficientemente e antígenos humanos do tumor da Cruz-apresentação para a ativação de pilhas de T humanas11,16.
Ao descobrir o mecanismo da imunoterapia do ECP, temos, portanto, descoberto um método para a rápida geração de camundongo fisiológico e células dendríticas humanas de especificidade desejada do antígeno, que pode ser modulada funcionalmente. O dispositivo e o protocolo inovativos do ti têm a importância potencial substancial nos campos da pesquisa do ECP e da terapia e da imunoterapia do cancro mais extensamente, e em todo o outro campo com interesse em pilhas dendríticas fisiológicas, funcionais no imunizante ou a modalidade tolerizante. Esperamos que esta publicação forneça as ferramentas necessárias para aqueles com interesse nessas áreas de pesquisa.
Protocol
Todos os métodos de mouse descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Yale, de acordo com os institutos nacionais de diretrizes de saúde animal. Todos os estudos humanos foram realizados com sangue doado por voluntários saudáveis, com consentimento informado e escrito. Os estudos de sangue humano foram conduzidos de acordo com as directrizes éticas reconhecidas (por exemplo, declaração de Helsínquia, CIOMS, relatório de Belmont, régua comum dos E.U.), e foram aprovados pela placa investigational da revisão de Yale humana o protocolo número 0301023636.
Nota: O seguinte é o protocolo que descreve o transimmunization para a terapia antitumoral de tumores syngeneic do rato.
1. implante syngeneic do tumor de YUMM 1.7
- Siga protocolos estabelecidos para implantar tumores syngeneic nos flancos dos ratos como apropriado à linha de pilha do tumor de interesse.
Nota: O protocolo abaixo descreve o modelo do tumor do melanoma do rato de YUMM 1.7 C57BL/6. As pilhas do melanoma de YUMM 1.7 foram fornecidas amavelmente pelo Dr. Bosenberg, Yale18. -
Descongelar uma alíquota congelada de células e usar células após uma passagem de célula. Cultura recém-descongelados YUMM 1.7 células em Dulbecco ' s modificado Eagle ' s mistura nutritiva F-12 médio (DMEM/F12), suplementado com 10% de calor-inactivated soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina/estreptomicina, e 1% não-aminoácidos essenciais, padrão condições da cultura do tecido (37 ° c, 5% CO2).
- Colete YUMM 1.7 células em 60 \ u201270% confluência, adicionando suficiente Trypsin-EDTA para cobrir a parte inferior da placa de cultura celular ou balão (por exemplo, 4 mL para um balão T75).
- Descanse as embarcações da cultura da pilha na temperatura ambiente para 3 \ u20124 min, batendo delicadamente na parte inferior ou nos lados da embarcação ocasionalmente para ajudar a separar as pilhas.
- Adicionar 1 mL de soro fetal bovino (FBS) por 4 mL de ácido tripsina-etilenodiamético (EDTA) para parar a reacção uma vez que a maioria das células são destacadas. Recolher as células pipetando para um tubo cônico de 15 mL. Enxague o frasco com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e adicione o enxaguamento ao mesmo tubo de recolha. Encha o tubo para 15 mL com PBS.
- Pegue uma pequena alíquota e conte as células.
- Gire para baixo por 10 minutos em 250 x g em um centrifugador padrão da cultura do tecido para recolher as pilhas do tumor.
- Resuspend YUMM 1.7 células em PBS na densidade de 1 x 106 células/ml.
- Injete 1 x 105 Yumm 1.7 células tumorais por via subcutânea em 100 ΜL de PBS nos flancos direito do receptor 4 a 6-Week-Old tipo selvagem machos C57Bl/6J, anestesiados de acordo com as diretrizes institucionais (por exemplo, 3 \ u20125% de gás inalante isoflurano, anestesia confirmado pela falta do reflexo da pitada da pata do Hind).
- Monitore o volume tumoral através de medições bi-semanais de diâmetros e altura do tumor perpendicular usando um paquímetro. Calcule YUMM 1.7 (volume do tumor como o comprimento x largura x altura do tumor)/2.
- Iniciar a terapia transimmunization quando os tumores se tornam apenas palpáveis; para os tumores de YUMM 1.7, este é geralmente implante do tumor do borne do dia 7 \ u201210.
2. coleta de células mononucleares do sangue periférico para Transimmunização
- Colete 100 \ u2012150 μL de sangue de cada rato do tumor-rolamento através do sangramento da bochecha.
- Como o sangue está sendo coletado, o sangue da piscina de cada grupo de tratamento do rato (cada 5 ratos experimentais + 5 ratos de controle) em um único tubo de 15 mL contendo 5.000 U/mL de heparina. Use 10 μL de heparina a 10% por 100 μL de sangue coletado.
Nota: Misture o tubo freqüentemente durante a coleta para evitar a coagulação do sangue. Enquanto o controle de camundongos portadores de tumor pode ser sangrado ao mesmo tempo que os camundongos experimentais, para garantir condições iguais com o grupo de tratamento, o sangue "controle" pode ser descartado ou combinado com o sangue do grupo de tratamento para fornecer adicional PBMC experimental para o grupo de tratamento, a critério dos investigadores. - Configurar 1 15 mL de tubo com 4 mL de meio de isolamento de linfócitos (ver a tabela de materiais) por 5 \ u201210 ratos sangrados. Lentamente o sangue da camada (coletado dos ratos tumor-tendo) na parte superior do meio. Gire as células por 20 min em 1000 \ u20121, 500 x g para separar o PBMC de glóbulos vermelhos.
- No final da centrifugação, recolher a camada de plasma superior, deixando ~ 0,5 mL restantes acima do casaco Buffy, e armazenar a 4 °C para uso posterior (passo 7,1).
- Colete a camada de revestimento Buffy em um tubo limpo de 15 mL, encha com PBS a 15 mL, e gire por 10 minutos em 250 x g em um centrifugador padrão da cultura do tecido para coletar o PBMC.
- Cuidadosamente Pipet fora do sobrenadante, e ressuscitava o pellet por flicking o tubo. Não decantar, como a pelota é macia e pode ser perdida. Adicione 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos de ACK (veja a tabela de materiais) ao tubo para remover quaisquer glóbulos vermelhos remanescentes do PBMC. Incubar no gelo por 10 min.
- Encha o tubo com PBS a 15 mL, e gire para baixo por 10 minutos em 250 x g em um centrifugador padrão da cultura do tecido para recolher o PBMC.
- Cuidadosamente Pipet fora do sobrenadante, e ressuscitava o pellet por flicking. Não decantar, como a pelota é macia e pode ser perdida.
Nota: Nesta etapa, o PBMC purificado pode ser modificado conforme melhor se adapte ao experimento. Os vários componentes PBMC (plaquetas, monócitos, outros tipos de células imunes) podem ser esgotados ou isolados do PBMC, conforme necessário. Também, PBMC eles mesmos podem ser expor a 8 MOPa, antes ou depois da seção 4 (antes ou depois da passagem da placa-após a seção 2 ou antes da seção 5), seguindo as etapas do protocolo 3.3 \ u 20123.8 e substituindo PBMC para pilhas de Yumm 1.7. Isso irá truncar a capacidade imunogênica do tratamento e, em vez disso, promover a tolerância imune. - Para cada grupo de tratamento (cada 5 camundongos experimentais + 5 camundongos controle), ressuscitem o pellet PBMC em 300 μL de FBS.
3.8-MOP/UVA tratamento de células tumorais
- Cultura e coletar pilhas do tumor de YUMM 1.7 como descrito nas etapas 1.2 – 1.3 para preparar uma fonte do antígeno da pilha do tumor de 8 MOPa-Exposed.
- Prepare 2,5 x 106 Yumm 1.7 células tumorais por grupo de tratamento de 5 camundongos. Para cada grupo de tratamento, Ressuspender a pelota da pilha do tumor em FBS em 2,5 x 106 Cells/300 μl (~ 8,33 x 106 pilhas/ml).
- Com as luzes da capa da cultura do tecido fora, adicione 8 MOP (veja a tabela dos materiais) à suspensão da pilha do tumor de Yumm 1.7 para uma concentração final de 8 espanador de 100 ng/ml.
Cuidado: 8-MOP é um agente de DNA-prejudicial photoactivatable e carcinogen. Tenha cuidado ao manusear e dispensar, evite o contacto com a pele exposta e descarte-o apropriadamente. - Misture bem as células, enrole o recipiente de células em folha de estanho, e incubar por 20 min a 37 °C.
- Pre-Coat uma placa da cultura do tecido 12-well enchendo um poço para cada grupo do tratamento de 5 ratos (2,5 x 106 pilhas do tumor de Yumm 1.7) com 1 ml de FBS, e leve à geladeira a placa enchida por 20 minutos em 4 °C.
- Ligue a fonte de luz UVA para pré-aquecê-lo.
Atenção: A luz UVA é um carcinógeno. Ao trabalhar com fontes de luz UVA, trabalhe com rapidez e cuidado, proteja a pele da exposição e use protetores faciais ou óculos de proteção para proteger o rosto e os olhos. - Após 20 minutos, mova a placa refrigerada 12-well (etapa 3,5) à capa da cultura do tecido, remova FBS dos poços, e adicione 300 μL (2,5 x 106 pilhas/poço) pilhas do tumor MOP-expor (da etapa 3,4) por bem.
- Expor a placa contendo células à fonte de luz UVA pré-aquecida para irradiação total de 4 J/cm2.
Nota: A concentração de 8 MOP e a dose de UVA descrita aqui são calibradas para a linha celular do tumor de YUMM 1.7. Uma titulação de 8-MOP/UVA dose, suficiente para causar 100% morte celular tumoral dentro de 1 semana de exposição, deve ser realizada para cada tumor experimental linha celular, a fim de determinar a dose efetiva de matar. Isso é extremamente importante para o mouse in vivo experimentos de TI, porque as células são reinjetadas retro-orbitalmente (passo 6,1) e, portanto, quaisquer células tumorais não danificadas podem formar tumores oculares no animal tratado. Como uma diretriz, 4 \ u20128 J/cm2 de uva, 100 \ u2012200 ng/ml 8-MOP, é a escala eficaz típica para a maioria de linhas de pilha do tumor. - Colete 8-MOPcélulas tumorais tratadas de cada poço, rodando a placa e pipetagem com cuidado para garantir a recuperação completa da célula.
4. placa de TI passagem de células
- Para cada grupo de tratamento de 5 camundongos, combine em um tubo cônico de 1,5 mL 300 μL do PBMC apropriado (do passo 2,11) e 300 μL de célulastumorais tratadas com 8 esfregona (da etapa 3,9). Misture as células.
- Use uma seringa de 10 mL para encher os conjuntos de "entrada" e "saída" de tubos de TI (ver
Tabela de materiais) com FBS. Abra as braçadeiras da tubulação para encher os tubos, e feche as braçadeiras uma vez que os tubos estão preenchidos antes de desconectar a seringa, para reter FBS dentro da tubulação. - Use uma pipeta P1000 para adicionar o PBMC e a mistura da pilha do tumor (da etapa 4,1) à placa do TI (veja a tabela dos materiais). Segure a placa em um ângulo de 45° , coloc a ponta da pipeta firmemente na entrada da placa do ti, e encha a placa lentamente, evitando bolhas.
- Retire a ponta da pipeta da entrada antes de liberar o êmbolo da pipeta. A placa prende 450 μL; retornar as células restantes para o tubo cônico 1,5 mL.
- Incubar a tubulação cheia de FBS, a placa Cell-filled do TI, e o tubo cónico de 1,5 mL que contem as pilhas restantes na incubadora da cultura do tecido em 37 °C para 1 h. Após a incubação, esvazie a tubagem de TI por gravidade, liberando as braçadeiras.
- Use uma pipeta P1000 para remover as células da placa de TI inserindo a ponta da pipeta com o êmbolo pressionado na porta da placa. Segure a placa com um ângulo de 45° e encha a ponta da pipeta P1000. Coloque as células de volta em seu original 1,5 mL tubo cônico.
- Para executar a placa de TI, conecte o tubo de saída à placa e fixe a placa de TI no sistema de funcionamento da placa.
- Usando uma seringa de 1 mL, elabore o μL 600 de PBMC e a mistura da pilha do tumor do tubo cônico de 1,5 mL, começ livrado de todas as bolhas na seringa, prenda a seringa ao tubo de entrada com a braçadeira aberta e encha-o lentamente até que o líquido alcangue a extremidade da tubulação.
- Fixe a extremidade livre do tubo de entrada à placa de TI e continue a carregar suavemente o volume restante. Feche a braçadeira de entrada.
- Retire a seringa de 1 mL e ligue o tubo de entrada à bomba da seringa. Fixe a tubulação da saída a um tubo cônico 1,5 mL limpo para a coleção da pilha.
- Ajuste a vazão da bomba da seringa para 0, 9 mL/min, mas não inicie a bomba ainda. Incline a placa TI ~ 30° em direção ao lado da bomba da seringa, usando uma plataforma de ti rodando ou qualquer outro meio (por exemplo, um pequeno objeto plano uma extremidade da placa).
- Solte cuidadosamente a braçadeira na tubagem de entrada. Inicie a bomba da seringa, observando cuidadosamente como a placa de TI preenche, e deslize o tubo ou a chapa conforme necessário, caso as bolhas de ar impeçam o fluxo.
- Uma vez que a placa do TI é enchida completamente, incline-a ~ 30° no sentido oposto enquanto esvazia. Quando todas as células e líquidos estiverem no tubo de recolha cônico de 1,5 mL, pare a bomba.
- Para lavar a placa de TI, desconecte o tubo de entrada da bomba da seringa, conecte-se a uma seringa de 1 mL preenchida com 600 μL de FBS e siga o procedimento para as etapas 4.8 \ u 20124.9.
- Ajuste a vazão da bomba da seringa para 0,49 mL/min, solte a braçadeira de entrada e execute a placa de TI conforme descrito nas etapas 4.12 \ u 20124.13, coletando a lavagem no mesmo tubo cônico 1,5 mL. Mexa ou bata a placa de TI suavemente o tempo todo, para auxiliar na desanexação e eluição de todas as células aderentes.
- Gire a coleção 1,5 ml de tubo cônico no microcentrífuga do de bancada em 250 x g por 8 min. descarte o sobrenadante.
5. preparação de soro de camundongo autólogo para meio de cultura overnight
- Colete sangue de 10 u201212 semanas de idade C57BL/6J camundongos por qualquer método institucionalmente aprovado (por exemplo, sangramento ocular, sangramento da veia cauda, sangramento da bochecha, ou sangramento terminal por punção cardíaca), sem anticoagulantes. Estimativa de coleta de 1 mL de sangue para cada 300 μL de soro necessário.
Nota: Um precisaria de 300 μL de soro para cada grupo de tratamento de 5 camundongos no experimento. - Permitir que o sangue coagule durante a noite a 4 ° c.
- Gire para baixo o sangue coagulado em 3.000 x g por 15 min. cuidadosamente coletar a camada de soro contendo Top
Nota: O soro pode ser usado imediatamente para fazer o meio de incubação da célula durante a noite (etapa 6,1), ou preservado para experimentos futuros. Para preservar o soro, congele em alíquotas a-20 ° c.
6. overnight co-incubação de PBMC com antígeno
- Resuspend o PBMC e a pelota da pilha do tumor (etapa 4,5) em 2 mL do RPMI desobstruído com o soro autólogo do rato de 15% (preparado em etapa 5). Placa em um prato estéril Tratado não-tecido-cultura de 35 milímetros, e incubar durante a noite circunstâncias padrão da cultura do tecido (° c 37, 5% CO2).
Nota: Se o PBMC estiver sendo usado com um antígeno não celular (peptídeo, nanopartícula, proteína, etc.), omita a seção 3 do protocolo e prossiga da seção 2 diretamente para a seção 4, adicionando o antígeno desejado à placa de TI-passou PBMC para a coincubação durante a noite aqui em Passo 6,1. - No dia seguinte, Retire cuidadosamente todas as células aderentes da parte inferior do prato com um raspador de cultura de tecido, girando o prato durante a raspagem para garantir até mesmo a coleta de células. Colete as células em um tubo de 15 mL.
- Adicione 2 mL de PBS ao prato e repita a etapa de raspagem, recolhendo as células no mesmo tubo. Enxague o prato de 35 mm com 1 mL de PBS e adicione o enxaguamento ao mesmo tubo.
- Gire por 10 minutos em 250 x g em um centrifugador padrão da cultura do tecido para recolher as pilhas. Cuidadosamente Pipet fora do sobrenadante e ressuscitava o pellet por flicking o tubo. Não decantar, como a pelota é macia e pode ser perdida.
7. Re-injeção de células tratadas com TI em camundongos portadores de tumor
- Gire para baixo o plasma autólogo (preparado na etapa 2,4) em 750 x g por 15 minutos para sedimentar todas as partículas. Ressuscitem o pellet celular (da etapa 6,4) em 600 μL de plasma autólogo ou PBS.
- Injete células a 100 μL por rato no plexo orbital de forma adequada anestesiada (por exemplo, 3 \ u20125% de gás inalante isoflurano, anestesia confirmada por falta de reflexo da pinça pata traseira) ratos experimentais com tumor. Se assim o desejar, reinjete ratos do rolamento do tumor do controle com 100 μL do plasma autólogo sozinho, ou PBS.
- Para camundongos YUMM 1.7 com tumor, repita o tratamento (etapas 2 – 7,2) duas vezes por semana durante 3 semanas, para um total de 6 tratamentos. Colete e processe o PBMC de camundongos portadores de tumor semanalmente (seções de protocolo 2 \ u20124) às segundas e quintas-feiras, e reinfusão após a incubação durante a noite (seções de protocolo 5 \ u20127) às terças e sextas-feiras.
Nota: Este regime de tratamento foi desenvolvido para a cinética de crescimento específico de tumores YUMM 1.7 em camundongos. Pode ser necessário titulado para outros sistemas tumorais com taxas de crescimento tumoral mais lentas ou mais rápidas — respectivamente, aumentando ou reduzindo o número de tratamentos. - Monitore o volume tumoral por meio da medição bi-semanal — preferencialmente no momento da administração da terapia (terça e sexta-feira) — de diâmetros e altura do tumor perpendicular usando um paquímetro. Encerre o experimento quando o controle dos volumes tumorais atinge o tamanho máximo permitido pelas diretrizes e protocolos institucionais.
8. protocolo de adaptação para o tratamento de Ssmall volumes de sangue humano
- Adapte o protocolo para o uso com pilhas humanas primeiramente isolando PBMC do sangue humano. Use heparina como um anticoagulante, com qualquer protocolo de isolamento de PBMC preferencial.
- Assegure-se de que a fração isolada de PBMC contenha um número fisiológico de plaquetas, para melhores resultados do protocolo. Monitore contagens da plaqueta pre-e isolação do borne-PBMC usando todo o contador padrão da hematologia.
- Se estiver usando uma fonte de antígeno celular humano, trate as células antigênicas humanas seguindo os passos descritos na seção 3 para as células YUMM 1.7. Titrate 8-MOP e UVA doses em conformidade.
- Realize as etapas da placa-passagem descritas na seção 4, usando até 3 x 107 PBMC por placa ti.
- Cultura PBMC durante a noite com o antígeno celular/outro da escolha, como descrito na seção 6, mas substitua o soro humano do AB de 15% para o plasma autólogo do rato para o meio de cultura overnight na etapa 6,1.
- Use as células resultantes em qualquer ensaio desejado. Por exemplo, cocultura com células T antígeno-reativas para observar as respostas de célula T antígeno-específicas iniciadas pelas células tratadas com TI.
Representative Results
Recentemente, desenvolvemos um dispositivo ECP miniatura escalável do mouse para homem, a placa de TI (Figura 1a) e protocolos de tratamento correspondentes projetados. O dispositivo e o protocolo reproduzem as principais características celulares e in vivo do ECP imunizante, denominado "transimmunization".
O protocolo de transimmunização Murina da prova-de-princípio11 (Figura 1b) consiste na passagem extracorpórea da placa do ti de pilhas mononucleares do sangue periférico (PBMC) dos ratos do tumor-rolamento junto com o 8-MOP apoptóticoa-expor células tumorais. Notavelmente, a câmara de TI é transparente e dimensionada para corresponder ao formato de slide de microscopia padrão, permitindo fácil visualização das interações celulares dentro da placa de TI em qualquer ponto do protocolo (vídeo 1). As células imunes ativadas por TI são incubadas durante a noite com as células tumoraisapoptóticas de 8 MOP a-Exposed, facilitando a captação de células tumorais, o processamento e a transferência de antígenos tumorais para os DCS. No dia seguinte, a mistura de células coincubadas é devolvida para a corrente sanguínea do animal que carrega o tumor. Animais de controle passam por procedimentos de coleta de sangue idênticos, para normalizar para quaisquer efeitos de linfodepleção no crescimento tumoral, mas em vez disso, recebem re-infusões de PBS. O crescimento tumoral em todos os animais é monitorado durante todo o experimento.
Em estudos que utilizam o modelo de melanoma murino syngeneic YUMM 1.718, o protocolo de transimmunização foi repetido duas vezes por semana durante três semanas, para um total de seis tratamentos em cada animal (Figura 1b). A terapia pareceu bem tolerada em todos os animais tratados (> 100), e mostrou consistentemente a redução do crescimento do tumor de YUMM 1.7 em animais tratados versus do controle, como observado em 9 experimentos independentes conduzidos sobre 2 anos (Figura 2a, B). Os resultados mostram dados cumulativos de crescimento tumoral em animais tratados com transimmunização e controle sobre todos os experimentos realizados (Figura 2a), bem como curvas representativas de crescimento tumoral para animais individuais dentro de um experimento, para proporcionar um sentido de variabilidade no sistema (Figura 2b).
Verificou-se que o sucesso do protocolo depende criticamente da presença de monócitos no PBMC Tratado, da presença de plaquetas na fração PBMC e da etapa de passagem da placa de TI. Quando a passagem da placa é omitida, ou quando as plaquetas ou os monócitos são esgotados da fração PBMC, o efeito terapêutico não é mais observado (Figura 3a). O tratamento também requer a presença de células tumorais apoptóticas. É ineficaz na ausência de pilhas imunes ou de uma fonte do antígeno, ou na presença de antígeno incompatível, por exemplo quando os ratos que carregam os tumores de YUMM 1.7 são tratados usando pilhas da carcinoma do cólon MC38 (Figura 3B). Para um resultado imunizante também é crítico para evitar a exposição de PBMC a 8-MOPa. 8-MOPa-Exposed PBMC não só abrogate, ou possivelmente até mesmo reverter, anti-tumor imunidade (Figura 3C), mas também inibir o potencial imunizante de células não expostas, como no experimento onde um número igual de 8-MOPA-expostos e 8-MOP O PBMC protegido por umfoi utilizado sem efeito antitumoral observável (Figura 3C).
Com o PBMC humano, a câmara de TI e o protocolo de transimmunização levam à ativação bem-sucedida do monócitos em DC, indistinguível pela superfície celular e marcadores de ativação intracelular daquele obtido pela placa de ECP clínica (tabela 1). Como nos estudos do rato, a ativação de DC (figura 4a) e a capacidade de DCS gerados por transimmunization para processar e apresentar antígeno (Figura 4B,C) dependem criticamente da presença de plaquetas no PBMC e na passagem da placa de ti. Os DCs humanos ativados por Transimmunization podem efetivamente processar e cruzar-apresentar antígenos peptídicos (Figura 4B), ou antígenos de células tumorais humanasexpostas a 8 MOP inteiras, para ativar linhas de células T específicas de antígeno humano em in vitro (Figura 4C), de ti e de forma dependente de plaquetas (Figura 4B, C).
Figura 1: câmara de Transimmunization (TI) e esquemas de protocolo. A) diagrama e especificações da câmara de tratamento da transimmunização (placa de ti). (B) descrição esquemática do fluxo de trabalho experimental de tratamento de transimmunização. Momentaneamente, os animais são inoculados por via subcutânea (s.c.) com pilhas syngeneic do tumor; os animais com tumores palpáveis são tratados duas vezes por semana pela tração do sangue, isolação de PBMC do sangue, passagem do fluxo de PBMC através da placa plaqueta-revestida autóloga do TI na presença de pilhas tratadas 8-MOP/UVA do tumor, PBMC e co-incubação da pilha do tumor durante a noite, e a re-injeção das pilhas intravenosamente nos mesmos animais do tumor-rolamento. O volume tumoral é medido ao longo do experimento. Este número foi modificado de11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Transimmunization controla o crescimento de tumores syngeneic do melanoma de YUMM 1.7. (A) volume tumoral de Yumm 1.7 ao longo do tempo plotado para camundongos C57Bl/6 inoculados com células tumorais 1 x 105 Yumm 1.7 e recebendo seis tratamentos de transimmunização (linha preta) ou seis tratamentos de controle (linha cinza). Os dados são cumulativos em nove experimentos independentes conduzidos ao longo de dois anos. (B) dados de um experimento único representante Yumm 1.7 transimmunizaton, com cada linha mostrando crescimento tumoral para um mouse individual. (A e B) Camundongos "controle PBS" em todos os experimentos foram sangrados no mesmo horário que os animais experimentais, mas receberam seis reinfusões de PBS estéreis. As barras de erro representam SEM, valores de p calculados para cada ponto de tempo usando o teste de comparações múltiplas de Sidak; * *, p = 0, 13; , p < 0, 1. Este número foi modificado de11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: a transimmunização requer monócitos e plaquetas em fração de PBMC de placa de ti, bem como 8-MOPum tratamento de células tumorais pareadas com antígeno e 8-MOPa poupando de PBMC. (A) volume tumoral de Yumm 1.7 ao longo do tempo plotado para camundongos C57Bl/6 inoculados com células tumorais 1 * 105 Yumm 1.7 e recebendo seis tratamentos de transimmunização (linhas pretas sólidas), seis tratamentos de controle (linhas cinzentas sólidas) ou seis tratamentos de ti onde monócitos ou plaquetas foram esgotados de PBMC antes da etapa de passagem da placa (usando os kits de depleção a-CD11b e a-CD41, respectivamente), ou a passagem da placa foi omitida (linhas pontilhadas). (B) volume tumoral ao longo do tempo plotado para camundongos C57Bl/6 inoculados com células tumorais 1 x 105 Yumm 1.7 e recebendo seis tratamentos de transimmunização (linhas pretas sólidas), seis tratamentos de controle (linhas cinzentas sólidas), PBMC isoladamente (linha tracejada), 8- MOPa-tratados Yumm 1.7 células sozinho, ou ti usando 8-MOPa-tratados MC38 células tumorais (linhas pontilhadas). (C) volume tumoral ao longo do tempo plotado para camundongos C57Bl/6 inoculados com células tumorais 1 x 105 Yumm 1.7 e recebendo seis tratamentos de transimmunização (linhas pretas sólidas), seis tratamentos de controle (linhas cinzentas sólidas), seis tratamentos de ti onde PBMC foram expostos uniformemente a 8-MOPa imediatamente antes da passagem da placa, seis tratamentos de ti onde PBMC foram uniformemente expostos a 8-MOPa imediatamente após a passagem da placa, ou seis tratamentos onde as células de ti após a passagem da placa foram misturados 1:1 com um número igual de PBMC que foram expostos uniformemente a 8-MOPa irradiação (linhas pontilhadas). (A, B e C) Camundongos "controle PBS" em todos os experimentos foram sangrados no mesmo horário que os animais experimentais, mas receberam seis reinfusões de PBS estéreis. Os dados são fornecidos para experimentos representativos. As barras representam os valores de SEM, P calculados para cada ponto de tempo usando o teste de comparações múltiplas de Sidak; *, p < 0, 5; * *, p < 0, 1; , p < 0, 1; , p < 0, 1; NS = diferenças não significativas. Este número foi modificado de11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: o protocolo de TI com câmara de TI rapidamente induz maturação da DC, perfil de ativação único e capacidade ativadora de células T em PBMC humano, dependente da passagem da placa e das plaquetas.
A. FACS análise dos marcadores indicados em células CD11c+ entre o PBMC humano recém-isolado ("controle"), PBMC tratado com o protocolo de ti ("ti"), ou PBMC tratado com ti, onde a passagem da placa foi omitida, as plaquetas foram esgotadas usando o a-CD41 talão kit antes da passagem da placa, ou ambos os acima foram realizados. Os dados resumem seis experimentos independentes com três doadores de sangue. As barras representam valores médios, enquanto as barras de erro representam SEM. valores de P para cada comparação calculada usando o teste t pareado; *, p < 0, 5; * *, p < 0, 1. Os painéis foram modificados a partir de11. B. os PBMC humanos tratados com plaquetas ou com depleção plaquetária foram coincubados durante a noite com um peptídeo irrelevantes (SIINFEKL), ou com peptídeo longo para proteína de HPV E7 associada à Carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. O PBMC foi usado então para estimular uma linha de célula T CD8 humana especificamente reactiva ao peptide E7. A estimulação da pilha de T foi medida pela produção de IFNg após 5 dias da cultura. C) os PBMC humanos tratados com plaquetas ou com depleção de plaquetas foram coincubados durante A noite com uma linha celular de carcinoma de células escamosas com 8 esfregona A, comAcabeça e o pescoço, SCC61, expressando (SCC61 HPV E6/7) ou não expressando (SCC61 sem HPV ) as proteínas antigênicas HPV E6 e E719. O PBMC foi usado então para estimular uma linha de célula T CD8 humana especificamente reactiva ao peptide E7. A estimulação da pilha de T foi medida pela produção de IFNg após 5 dias da cultura. (B e C) Os dados mostram experimentos representativos com três repetições em cada um. As barras representam valores médios, enquanto as barras de erro representam SEM. valores de P para cada comparação calculada usando o teste de comparações múltiplas de Sidak; , p < 0, 1; , p < 0, 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Marcador | Parâmetro | Tratada | Placa ECP com protocolo TI | Placa TI com protocolo TI | p-valor ECP vs TI |
| HLA-DR | Δ MFI | 100,1 ± 42,4 | 439,8 ± 152,5 | 417,7 ± 152,2 | Ns |
| CD80 | Δ | 3,9 ± 1,1 | 22,3 ± 7,2 | 24,5 ± 7,2 | Ns |
| CD83 | Δ MFI | 0,3 ± 0,2 | 53,3 ± 9,7 | 51,4 ± 17,4 | Ns |
| CD86 | Δ MFI | 10,8 ± 1,7 | 103,9 ± 23,4 | 87,1 ± 17,6 | Ns |
| O PLAUR | Δ MFI | 54,5 ± 12 | 721,4 ± 183,6 | 528,7 ± 135,5 | Ns |
| ICAM1 | Δ MFI | 12,2 ± 1,6 | 179,6 ± 28,5 | 192,5 ± 25,4 | Ns |
| ITGB5 | Δ MFI | 53,6 ± 25,7 | 97,1 ± 31,6 | 103,8 ± 32,8 | Ns |
| CCL2 (MCP-1) | Δ | 0,6 ± 0,5 | 70,1 ± 6,7 | 55,2 ± 8,9 | Ns |
| CXCL5 | Δ | 0,7 ± 0,4 | 39,1 ± 7,2 | 41,5 ± 4,7 | Ns |
| CXCL16 | Δ | 0,3 ± 0,2 | 28,0 ± 8,8 | 35,3 ± 11,7 | Ns |
| CD105 (endoglin) | Δ MFI | 3,6 ± 0,3 | 124,3 ± 25,4 | 141,8 ± 33,2 | Ns |
| CD112 (nectin 2) | Δ MFI | 10,9 ± 1,8 | 47,3 ± 5,2 | 50,9 ± 9,2 | Ns |
| CD120a (TNFR-1) | Δ MFI | 10,1 ± 2,6 | 2,2 ± 1,4 | 1,8 ± 1,1 | Ns |
| CD137L (4-1BBL) | Δ MFI | 2,9 ± 1,5 | 1,0 ± 0,4 | 1,2 ± 0,6 | Ns |
Tabela 1: o protocolo de ti com câmara de ti induz rapidamente a maturação da DC equivalente àquela induzida pelo protocolo de ti com a câmara de ECP clínica. A análise de FACS da mudança dos marcadores indicados dos controles correspondentes de IgG em pilhas humanas CD11c + vivos entre o PBMC recentemente isolado ("não tratado"), PBMC passou através da placa clínica do ECP que segue o protocolo do TI ("placa ECP com protocolo do TI") e analisados após a incubação durante a noite, ou PBMC tratados com o protocolo de TI ("placa de TI com protocolo") e analisados após a incubação durante a noite. Para os marcadores, como o HLA-DR, onde toda a população celular foi alterada, os dados são expressos como alteração na intensidade média de fluorescência (MFI). Para marcadores em que apenas um subconjunto de células expressa o marcador, como CCL2, a diferença em células positivas de marcador de porcentagem de CD11c ao vivo + PBMC é representada. Os dados resumem seis experimentos independentes com três doadores de sangue. Os dados para cada marcador são expressos como aver-idade ± erro padrão da média (MEV). Valores de P para cada comparação calculada utilizando o teste t pareado; NS = diferenças não significativas. A tabela foi modificada de11.
Vídeo 1: imagens de células ao vivo de plaquetas e interações de células imunes dentro da placa de TI.
Os PBMC foram preparados conforme descrito na seção 2 do protocolo acima e expostos à placa de transimmunização conforme descrito na seção 4, exceto o período de incubação estática no passo 4.2.3 foi reduzido de 1 h para 30 min. Durante o protocolo do TI, a placa do TI, que é idêntica no tamanho a uma corrediça padrão do microscópio, foi cabida no estágio da terra arrendada da corrediça de um sistema da imagem latente da fluorescência e as pilhas dentro dela foram imaged na ampliação 40x e no ° c 37 durante o enchimento da placa (4.2.2 ), incubação de placas (4.2.3) e estágios de fluxo de chapa (de). As imagens contínuas foram adquiridas e os filmes produzidos usando o software da "rotina automatizada da exploração". As legendas abaixo do vídeo indicam o estágio do protocolo em que as células estão sendo filmadas. Setas e círculos no vídeo, com as legendas associadas, apontam as células e áreas de interesse. A barra de escala de 10 μM está presente no canto inferior direito em todo o vídeo. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Discussion
O dispositivo miniaturizado e o protocolo descrito acima pela primeira vez permitem a investigação laboratorial eficiente de mecanismos de ECP em sistemas experimentais de camundongo, e em pequenas amostras de sangue humano. Este é um grande avanço; por exemplo, permitiu-nos demonstrar pela primeira vez a eficácia da transimmunização contra tumores sólidos em um modelo de camundongo 11, abrindo a possibilidade futura de uma aplicação semelhante em Oncologia humana.
Antes do desenvolvimento do dispositivo de transimmunização e método descrito aqui, era impossível investigar plenamente todos os aspectos da ECP. Em modelos de mouse, embora o 8-MOPum aspecto da terapia poderia ser replicado um pouco pelo tratamento de células em uma placa de Petri12,20, não havia capacidade para integrar o método a passagem de chapa, que foi mostrado para fornecem interações dinâmicas de plaquetas que são extremamente importantes para a ativação fisiológica de DC do ECP14. Em estudos humanos, alternativamente, o componente de fluxo estava totalmente presente, mas a capacidade de expor seletivamente componentes celulares específicos para 8-MOP a, ou para protegê-los dele, estava faltando21,22. Isto impediu a compreensão completa do mecanismo do ECP, e sua optimização para a imunidade ou a tolerância. Além disso, a quantidade de sangue necessária para trabalhar com o aparelho de ECP clínico é grande, dificultando o inquérito científico. O dispositivo e o protocolo ECP miniaturizados descritos aqui pela primeira vez permitem a modelagem ECP de laboratório eficiente, totalmente flexível e sintonável. Além disso, a placa de TI permite visualização em tempo real e monitoramento de interações celulares dentro da placa por microscopia.
Para o sucesso do protocolo utilizando sistemas in vivo e ex vivo, é fundamental que o PBMC Tratado contenha monócitos que possam ser ativados em DCs funcionais. Para que esta ativação prossiga, é igualmente necessário assegurar a fração de PBMC contem um número fisiológico de plaquetas saudáveis, ativável, e que o protocolo da passagem da placa do ti é seguido pròxima. A fim de direcionar os DCs recém-ativados para uma reatividade específica, eles devem ser fornecidos com antígeno. Nós descobrimos que o método o mais eficiente da entrega do antígeno para a imunidade anticancerígena é a coincubação durante a noite dos DCs recentemente ativados com pilhas do tumor de 8 MOPa-expor antígeno-contendo. Isto tem a vantagem adicional de poder criar uma resposta imunogênica do anticancerígeno sem necessitar o conhecimento prévio dos antígenos do tumor, permitindo que os DCS os selecionem. No entanto, nos casos em que o antígeno é conhecido, tivemos algum sucesso em sistemas ex vivo ao usar peptídeos livres como antígenos em coincubação. Para aplicações imunogênicas, os próprios DCs devem ser protegidos contra 8-MOPa Exposure. Finalmente, em experimentos in vivo, é importante trabalhar com um modelo animal que é capaz de imunidade antitumoral. A transimmunização funciona através da criação de DCs ativados e específicos do antígeno, que trabalham no corpo para iniciar respostas imunes inatas e adaptativas. A atividade prejudicada ou a ausência das células NK, CD4 ou CD8 no rato Tratado impactará a eficácia do protocolo5,11.
Enquanto o protocolo descrito aqui é uma prova de princípio que foi otimizado para um modelo de tumor sólido syngeneic mouse, ele, no entanto, revela muitas oportunidades. Os mecanismos da ECP em Oncologia estão apenas sendo elucidados, e ainda há muito espaço para uma melhor compreensão. Mais amplamente, a habilidade de gerar o rato fisiologicamente ativado e os DCs humanos, e seletivamente direcioná-los para a imunidade antígeno-específica tem muitas aplicações potenciais além do cancro. A capacidade de fazer o mesmo, mas em vez disso direcionar os DCs para tolerância antígeno-específica, como é sugerido pela eficácia tolerante da ECP em si, também tem implicações médicas de amplo alcance. Com este método, nós esperamos fornecer as ferramentas e abrir uma avenida produtiva da pesquisa para qualquer um com um interesse em terapias fisiológicas da C.C..
Disclosures
A Universidade de Yale possui patentes derivadas da pesquisa de células dendríticas do Prof. Richard Edelson que foram licenciados para uma empresa de start-up de Yale, Transimmune AG. Richard Edelson e Michael Girardi são consultores científicos da Transimmune AG, enquanto Olga Sobolev é uma funcionária da Transimmune AG. Transimmune AG não tem nenhum produto comercial atual, porém em uma base colaborativa produz as placas de Transimmune usadas neste artigo. É possível que esses três autores possam potencialmente se beneficiar da comercialização dessas descobertas no futuro.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por NIH-NCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); NIH Cancer Center support Grant 3 p30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); a bolsa de treinamento Howard Hughes Medical Institute (A. Vassall); e a Fundação cardíaca de NY (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). A sustentação parcial foi fornecida por R01 CA196660-01 a M. Bosenberg.
Os autores são gratos ao Dr. Robert Tigelaar por seu aconselhamento, orientação e visão experimental. Agradecemos aos nossos colegas na Fraunhofer IBMT, especialmente o Dr. Thorsten Knoll, por desenvolver e fornecer a câmara de TI equivalente a ECP. Nicholas Theodosakis gentilmente ajudou com estágios iniciais dos experimentos YUMM. Agradecemos aos nossos doadores de sangue voluntários, Inger Christensen e sua equipe profissional no centro de tratamento de Yale ECP para obter ajuda com suprimento de sangue voluntário. Dr. Wendell Yarbrough e Dr. Natalia Issaeva gentilmente compartilhado com a gente as linhas de celular SCC61 e SCC61-E6/7. Para assistência técnica no projeto, agradecemos ao Dr. Julia Lewis pelo Conselho do protocolo FACS, e e. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote no Yale FACS Core. Imagens de filmes de células dentro da placa de TI foram adquiridas com o auxílio de Felix Rivera-Molina, PhD, Dept de biologia celular e Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. A produção cinematográfica foi supervisionada por Andrew Osborne, Senior Video Producer, escritório de comunicações da Yale School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) | Therakos, Inc | Rx only, NDC No. 64067-0216-01 | Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells |
| AB serum | Lonza BioWhittaker | 14-498E | Protocol step 8.5 - overnight culture of human PBMC |
| ACK red cell lysis buffer | Lonza BioWhittaker | 10-548E | Protocol step 2 - mouse PBMC preparation |
| Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging | VetEquip | 901820 | Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration |
| Autologous mouse plasma | prepare in lab | n/a | Prepare per protocol step 2.4, use in 7.1 - mouse TI treatment administration |
| Autologous mouse serum | prepare in lab | n/a | Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 - overnight culture of mouse PBMC |
| C57Bl/6J mice | Jackson labs | 0000664 | Protocol steps 1, 2, 5 and 7 - mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return |
| Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um | Medipoint | 9891620 | Protocol step 2 - mouse PBMC preparation |
| Clear RPMI | Gibco by LifeTech | 11835-030 | Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC |
| DMEM/F12 | Gibco by LifeTech | 11330-032 | Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture |
| EasyGrip Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351008 | Protocol steps 5 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC |
| Eppendorf 1.5mL conical tubes | DOT scientific | 1700-GMT | Protocol steps 1-8 |
| FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) | SAFC Biosciences | 12306C-500mL | Protocol steps 1-4 - YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate |
| Hemavet 950FS hematology counter | Drew Scientific | HV950FS | Protocol step 8.2 - monitoring human platelet numbers |
| Heparin 5,000U/mL | McKesson Packaging services | 949512 | Protocol steps 2 and 8 - mouse and human PBMC preparation |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 5260-04-05 | Protocol steps 1 and 7 - mouse sc tumor introduction and TI administration |
| Lympholyte M lymphocyte isolation medium | Cedarlane Labs | CL5035 | Protocol step 2 - mouse PBMC preparation |
| Non-essential amino acids | Gibco by LifeTech | 11140-050 | Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture |
| PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) | Gibco by LifeTech | 14190-144 | Protocol steps 1-7 |
| Pen/strep | Gibco by LifeTech | 15140-122 | Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture |
| Polypropylene 15mL conical tubes | Falcon | 352097 | Protocol steps 1-8 |
| Programmable 2-channel syringe pump | New Era Pump Systems Inc | model NE-4000 | Protocol steps 4 and 8 - running the TI plate |
| Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 | BD Biosciences | 305109 | Protocol step 7 - mouse TI treatment administration |
| Syringes, 10mL (LUER-LokTip) | BD Biosciences | 309604 | Protocol steps 4, 8 - running the TI plate |
| Syringes, 1mL (Slip tip) | BD Biosciences | 309659 | Protocol steps 1, 4, 7, 8 |
| TI plate and tubing set | Transimmune AG | not commercially available | Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis. |
| TI plate running platform | Transimmune AG | not commercially available | Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis. |
| Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) | Falcon | 353136 | Protocol steps 1, 2, 6 and 8 - mouse and human cell culture |
| Tissue culture plates, 12-well | Falcon | 353043 | Protocol steps 3 and 8 - mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells |
| Tissue culture scrapers | Falcon | 353085 | Protocol steps 6 and 8 - overnight culture of mouse/human PBMC |
| Trypsin-EDTA 0.25% (1x) | Gibco by LifeTech | 25200-056 | Protocol steps 1 and 2 - YUMM1.7 cell culture |
| Tumor injection needles, 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Protocol step 1 - mouse subcutaneous tumor introduction |
| UVA irradiator | Johnson and Johnson | not commercially available | The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us. |
| Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System | Invitrogen | fluorescence imaging instrument |
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