यह पांडुलिपि मानव त्वचा से पैपिलरी और रीटिकुलर फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव के लिए एक FACS-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करती है । यह विट्रो संस्कृति में circumvents जो explant संस्कृतियों के माध्यम से आमतौर पर इस्तेमाल किया अलगाव प्रोटोकॉल के साथ अपरिहार्य था । निकलने वाले फाइकोब्लास्ट सबसेट कार्यात्मक रूप से अलग और dermis के भीतर प्रदर्शन विभेदक जीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण कर रहे हैं ।
फाइब्रोब्लास्ट एक अत्यधिक विषम कोशिका आबादी है जो कई मानव रोगों के रोगजनन में फंसाती है । मानव त्वचा dermis में, फाइब्रोब्लास्ट पारंपरिक रूप से उनके ऊतकीय स्थानीयकरण के अनुसार सतही अंकुरक या कम जालीदार dermis के लिए जिंमेदार ठहराया गया है । माउस डर्मिस में पैपिलरी और तंतुमय फाइब्रोब्लास्ट दो विभिन्न प्रजातियों से उत्पन्न होते हैं जो शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं और एक विशिष्ट कोशिका सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के संबंध में अपसारी कार्यों के साथ होते हैं जिसके द्वारा उन्हें प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
महत्वपूर्ण बात, सतही और निचले चमड़े के परतों से explant संस्कृतियों से सबूत सुझाव है कि कम से दो कार्यात्मक अलग चमड़े का फाइब्रोब्लास्ट प्रजातियों मानव त्वचा dermis में के रूप में अच्छी तरह से मौजूद हैं । हालांकि, माउस त्वचा के लिए विपरीत, सेल सतह मार्कर विभिंन फाइकोब्लास्ट सबसेट के भेदभाव को सक्षम करने के लिए मानव त्वचा के लिए अभी तक स्थापित नहीं किया गया है । हम प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई (facs) दो सेल सतह मार्कर रेशकोरक सक्रियकरण प्रोटीन (FAP) और thymocyte antigen 1 (Thy1)/ इस विधि में इन विट्रो हेरफेर, जो जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था बिना शुद्ध फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव को सक्षम बनाता है, इस प्रकार ऊतक homeostasis या रोग के संबंध में मानव त्वचीय फाइकोब्लास्ट सबसेट के सटीक कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति पैथोलॉजी.
संयोजी ऊतक के मुख्य सेलुलर घटक के रूप में, fibroblasts कोलेजन और लोचदार फाइबर के जमाव के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार हैं कि अंततः extracellular मैट्रिक्स के रूप में1, और इस प्रकार, ऊतक homeostasis में उनकी भूमिका, उत्थान और बीमारी को लंबे समय से कम करके आंका गया है । हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट हाल ही में शोधकर्ताओं की सुर्खियों में आ गए हैं, न केवल क्योंकि वे प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के लिए एक प्रमुख सेलुलर स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं2 लेकिन यह भी कारण के रोगजनन में उनके उच्च सुघट्यता और निहितार्थ अंग फाइब्रोसिस3,4,5 या कैंसर6,7जैसे रोगों की एक विस्तृत संख्या ।
मानव त्वचा एक बहु स्तरित उपकला से बना है, epidermis, और उसके अंतर्निहित संयोजी ऊतक, dermis, जो histologically ऊपरी अंकुरक में subdivided किया जा सकता है और कम जालीदार dermis और मुख्य रूप से फाइब्रोब्लास्ट से बना है और कोशिकीय मैट्रिक्स8 और हाइपोडर्मिस । ऊतक के भीतर अपने स्थान के अनुसार, त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट मोटे तौर पर पाषाणमय और तंतुमय फाइब्रोब्लास्ट1में वर्गीकृत किया गया है ।
महत्वपूर्ण बात, हाल के आंकड़ों से संकेत मिलता है कि इन चमड़े का फाइब्रीब्लास्ट subpopulations केवल histologically भेद नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी है कि उनके समारोह में काफी विविध है । माउस त्वचा में, papeni और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट भ्रूणजनन9के दौरान दो अलग प्रजातियों से उत्पन्न होता है । सबूत के कई लाइनों का सुझाव है कि दोनों प्रजातियों न केवल ऊतक homeostasis में विभिंन भूमिकाओं डालती है, बाल कूप morphogenesis, घाव की मरंमत और फाइब्रोसिस7,9,10, लेकिन वे भी विभिंन जवाब नियोप्लास्टिक एपिडर्मी स्टेम कोशिकाओं से संकेत11, कैंसर रोगजनन में हट भूमिकाओं का सुझाव । आसानी से, दोनों प्रजातियों वयस्क माउस त्वचा में पारस्परिक रूप से अनंय सेलुलर मार्करों का एक अलग सेट एक्सप्रेस, इस प्रकार शुद्ध त्वचीय फाइकोब्लास्ट आबादी और उनके विशिष्ट कार्यों की बाद में व्यापक विश्लेषण के अलगाव को सक्षम करने में विट्रो9 , ११।
तदनुसार, अलग आकारिकी और कार्यों, प्रसार दर हट, ऊतक remodeling क्षमता12,13, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षमता के विकास इन विट्रो में एपिडर्मल स्टेम सेल, मानव त्वचा dermis14,15के लिए वर्णित किया गया है । हालांकि, मानव चमड़े का फाइब्रोब्लास्ट पर प्रकाशित अध्ययन के अधिकांश मिश्रित फाइब्रोब्लास्ट की त्वचीय त्वचा से explant संस्कृतियों से अलग आबादी का उपयोग कर आयोजित किया गया है, के बाद से विशिष्ट कोशिका की सतह मार्कर शुद्ध मानव पाशिकीय के अलगाव को सक्षम करने के सेट या जालीदार फाइबब्लास्ट सादृश्य में माउस dermis को subpopulations अभी तक स्थापित किया जाना था ।
हम हाल ही में प्रदर्शन किया है, कि मानव त्वचा अंकुरक और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों कि प्रतिदीप्ति के माध्यम से संबंधित subpopulations के अलगाव को सक्षम द्वारा विशेषता-सक्रिय सेल छंटाई (facs)16: FAP + CD90– fibroblasts मुख्य रूप से ऊपरी dermis में स्थित अंकुरक फाइब्रोब्लास्ट का प्रतिनिधित्व करते हैं, उच्च प्रसार दर, एक विशिष्ट जीन हस्ताक्षर लेकिन कोई adipogenic क्षमता पेश । Fap+CD90+ और fap–CD90+ फाइब्रोब्लास्ट कम चमड़े के डिब्बों की एक प्रकार की वंशावली से संबंधित हैं, जो कम प्रफलन लेकिन आसानी से गुजरना adipogenesis-जालीदार फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक बानगी । इस विधि का बड़े पैमाने पर अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है, न केवल शारीरिक स्थितियों के तहत उनके विशिष्ट कार्यों के संबंध में बल्कि त्वचा कैंसर सहित त्वचीय रोगों के रोगजनन के संदर्भ में भी इन अलग फाइटोब्लास्ट subpopulations ।
हालांकि, के बाद से fibroblasts दो में अपनी कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन इन विट्रो संस्कृति16,17,19, हमारे प्रोटोकॉल के आवेदन मानव से प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव तक ही सीमित है dermis और मिश्रित कोशिका संस्कृति आबादी में अंकुरक या जालीदार फाइब्रोब्लास्ट की पहचान की अनुमति नहीं है । महत्वपूर्ण बात है, हालांकि विट्रो में कोशिका की सतह मार्कर परिवर्तन की अभिव्यक्ति, हम दिखा दिया है कि फाइटोब्लास्ट सबसेट प्रोटोकॉल के अनुसार अलग अपने विशिष्ट कार्यशीलता बनाए रखने के नीचे वर्णित है जब16की खेती, इस प्रकार सक्षम शारीरिक या रोग स्थितियों के तहत सबसेट विशिष्ट गुणों के इन विट्रो अध्ययन ।
अंत में, हम FACS के माध्यम से अलग फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है कि पहली बार के लिए एक भोले राज्य में मानव त्वचा dermis से शुद्ध फाइकोब्लास्ट आबादी के अलगाव परमिट ।
इस लेख में, हम मानव त्वचा से अंकुरक और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन । CD90 व्यापक रूप से किया गया है पहचान या चर्मपत्र फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव18,20,21। तथापि, हमने यह प्रदशत किया है कि CD90 + फाइब्रोब्लास्ट के अलावा, मानव डर्मिस भी एक CD90– फाइब्रोब्लास्ट जनसंख्या के अग्रदूत हैं, जिसमें16FAP, जो सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट और कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के लिए मार्कर के रूप में स्थापित किया गया है ( Cafs)22,23,24,25। महत्वपूर्ण बात, हम तीन फाइकोब्लास्ट subpopulations FAP+CD90 की पहचानकरने में सक्षम थे, fap+CD90 + और fap–CD90+ सभी स्वस्थ मानव दाताओं से त्वचा बायोप्सी में । इसलिए हम निष्कर्ष है कि FAP केवल सक्रिय fibroblasts या CAFs लेकिन यह भी सामांय ऊतक फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक मार्कर नहीं है ।
ध्यान दें, FAP–CD90– कोशिका आबादी के ऊपर-वर्णित बहिष्करण-और gating रणनीति के आवेदन के बाद शेष fibroblasts शामिल नहीं है, क्योंकि इन कोशिकाओं fibroblasts खेती मध्यम में विट्रो में पैदा करना नहीं है, लेकिन सबसे संभावित एक मिश्रित कोशिका आबादी सहित लसीका कोशिकाओं और pericytes16दूसरों के बीच ।
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के उपयोग द्वारा प्राप्त सेल उपज शरीर-भाग के आधार पर अलग कर सकते है कि त्वचा टुकड़ा अलगाव के लिए इस्तेमाल से निकलती है । शरीर के विभिन्न अंगों से डर्मिस अपनी संरचना, मोटाई के साथ ही कोलेजन संरचना के बारे में अलग है । उदाहरण के लिए, चेहरे या ऊपरी बांह से त्वचा बहुत पतली है पेट या जांघ, जो भी अक्सर एक मोटा चमड़े के नीचे वसा परत प्रदर्शित से त्वचा की तुलना में । इसके अतिरिक्त, उंर और त्वचा दाताओं के सेक्स और न केवल ऊतक वियोजन दक्षता प्रभाव हो सकता है, लेकिन यह भी तीन फाइकोब्लास्ट subpopulations के वितरण को प्रभावित कर सकता है (चित्रा 3) जब पूर्ण मोटाई त्वचा से अलग । इस तथ्य यह है कि पैशिलरी dermis सिकुड़ती है और कि कुल फाइकोब्लास्ट संख्या11,26,27,28उम्र के साथ कम से परिणाम । इसके अलावा, पैपिलरी डर्मिस से गुटिका गोली संभवत: मिटिकुलर डर्मिस से भी बड़ी होगी, क्योंकि ऊपरी डर्मिस, रीटिकुलर डर्मिस की तुलना में फाइब्रोब्लास्ट से अधिक घनी आबादी वाला है । इसके अलावा, कम dermis भी मुश्किल और अधिक घनी कोलेजन के साथ पैक किया जाता है, यह कठिन ऊतक अलग करना और फाइब्रोब्लास्ट जारी करने के लिए बना । नोट की, सेल गोली बहुत लाल दिखाई दे सकता है, यही वजह है कि लाल रक्त कोशिका lysis की सिफारिश की है ।
बरकरार मानव त्वचा में तीन subpopulations की पहचान के अलावा, हम यह भी बताते है कि त्वचा की सूजन में, प्रत्येक फाइकोब्लास्ट उपसमुच्चय या तो अंकुरक या जालीदार dermis16में समृद्ध है । त्वचीय परतों से प्रत्येक उपजनसंख्या का एक उचित संवर्धन प्राप्त करने के लिए डर्मा के साथ त्वचा की सटीक टुकड़ा करने की क्रिया महत्वपूर्ण है । के बाद से पिल्लों से भरा हुआ dermis बहुत पतली है, त्वचीय स्लाइस का प्रतिनिधित्व यह ३०० μm की मोटाई से अधिक नहीं होना चाहिए. ऊपरी जालीदार और कम जालीदार फाइब्रोब्लास्ट दोनों जालीदार वंश का प्रतिनिधित्व करते है और इसी तरह के कार्यों और जीन हस्ताक्षर प्रदर्शन, इसलिए कोई भी उन्हें अलग नहीं करने पर विचार कर सकता है ।
महत्वपूर्ण बात, सभी तीन फाइब्रोब्लास्ट आबादी dermis भर में पाए जाते है और विशेष रूप से एक परत में मौजूद नहीं हैं, यही वजह है कि पाशकीय या मिश्रित फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों में जालीदार dermis परिणाम से explant संस्कृतियों । हालांकि, fap+CD90– अंकुरक फाइब्रोब्लास्ट पैपिलरी dermis में सबसे प्रचुर मात्रा में हैं और सतही से कम त्वचीय परतों के लिए एक ढाल का पालन करें, जबकि fap+CD90+ और fap–CD90+ फाइब्रोब्लास्ट एक का पालन करें लोअर से सतही परतों16के लिए व्युत्क्रम ढाल । इसके अलावा, CD90 के बहुमत अंकुरक से भरा हुआ dermis के फाइब्रोब्लास्ट लगभग विशेष रूप से रक्त वाहिकाओं के आसपास पाए जाते हैं और29CD146 परिसंवहनी फाइब्रोब्लास्ट मार्कर व्यक्त करते हैं, और इस तरह शायद से अलग कार्यों प्रदर्शन शेष CD146– जालीदार फाइब्रोब्लास्ट16. CD146 gating रणनीति में एक अतिरिक्त मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इस आबादी को बाहर ।
त्वचीय परतों की वियोजन के बाद, अलग कोशिकाओं को विशेष रूप से डिजाइन एंटीबॉडी एक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बहिष्करण के लिए विभिन्न एंटीबॉडी युक्त कॉकटेल के साथ दाग रहे हैं, endothelial और लसीका कोशिकाओं, एपिडर्मल कोशिकाओं, एरिथ्रोसाइट्स और mscs करने के लिए शुद्ध फाइकोब्लास्ट आबादी प्राप्त करें । नोट की, पहचान और mscs के बहिष्कार के लिए एक मार्कर का चयन क्योंकि प्रकाशित MSC मार्कर की उच्च संख्या30,31मुश्किल हो सकता है । चूंकि एमएससीएस एक्सप्रेस CD90 फाइब्रोब्लास्ट की तरह, अतिरिक्त एमएससी मार्कर जैसे CD105 या CD271 उनकी पहचान के लिए उपयोगी साबित हो सकता है । हालांकि, MSCs केवल सभी त्वचीय कोशिकाओं का एक बहुत कम प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते है और के बाद से CD90+ fibroblasts प्रदर्शन छँटाई पर fibroblasts की ठेठ रूपात्मक सुविधाओं, एक तर्क दे सकता है कि अलग सेल सतह मार्कर के उपयोग द्वारा mscs के बहिष्कार हो सकता है अनावश्यक हो ।
महत्वपूर्ण बात, हम 7-14 दिनों के लिए संस्कृति में कोशिकाओं को रखने के बाद छंटाई (डेटा नहीं दिखाया गया है) के बाद FAP और CD90 जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण और पाया कि दोनों मार्करों की अभिव्यक्ति संबंधित हल एकल सकारात्मक में upregulated है (FAP+CD90– या FAP–CD90+) कोशिकाओं16। इसलिए हम जोर देते है कि इसके बाद के संस्करण का वर्णन मार्कर सेट और प्रोटोकॉल सीधे ऊतक से प्राथमिक फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव की अनुमति नहीं है, लेकिन पहले से संस्कारित मिश्रित फाइकोब्लास्ट आबादी से ।
फिर भी, हम प्रदर्शित करते है कि सभी तीन subpopulations की कार्यशीलता कोशिका संस्कृति में कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति के परिवर्तन की परवाह किए बिना बनाए रखा है, क्योंकि के रूप में fibroblasts के हल FAP+CD90– अंकुरक फाइब्रोब्लास्ट नहीं संस्कृति की एक लंबी अवधि के बाद adipogenesis से गुजरना करने की क्षमता हासिल है, जबकि fibroblasts के रूप में छांटे गए fap+CD90+ या fap–CD90+ जालीदार फाइब्रोब्लास्ट अपने adipocytes में अंतर करने की क्षमता को बनाए रखने 16 . महत्वपूर्ण बात, हमने यह भी पाया है कि पैपिलरी और लिटिकुलर-विशिष्ट जीन अभी भी FAP में अधिक हद तक व्यक्त कर रहे हैं+CD90– और CD90+ क्रमशः.
अंत में, हम facs के माध्यम कार्यात्मक रूप से अलग फाइकोब्लास्ट सबसेट के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की है कि पहली बार मानव त्वचा dermis से अलगाव और शुद्ध और भोली फाइकोब्लास्ट सबसेट के विश्लेषण परमिट के लिए । इस विधि के लिए एक बड़ी उंनति स्थापित करता है आमतौर पर इस्तेमाल किया फाइब्रोब्लास्ट explant ऊपरी और निचले dermis से संस्कृति अलगाव प्रोटोकॉल के रूप में (i) एक विरोधी के ढाल और जालीदार फाइब्रोब्लास्ट त्वचा की सतह से hypodermis करने के लिए मौजूद है और (ii) fibroblasts में उनके जीन हस्ताक्षर विट्रो में बदल जाते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
हम कृतज्ञता FACS में सहायता स्वीकार करते हैं-Bärbel रेनेंगर और Wolfgang Bauer द्वारा छंटाई । यह काम ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (FWF: V ५२५-B28) से बी एम एल के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और यूरोपीय जैव रासायनिक समाजों के फेडरेशन (FEBS, अनुवर्ती अनुसंधान कोष) । एस एफ ऑस्ट्रिया के विज्ञान अकादमी (OeAW) के एक डॉक्टर फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है । हम वियना के चिकित्सा विश्वविद्यालय में प्रमुख सुविधाओं से उत्कृष्ट समर्थन स्वीकार करते हैं । हम मानव त्वचा सामग्री प्रदान करने के लिए बर्नहार्ड Gesslbauer, Christine Radtke और मार्टिन Vierhapper धंयवाद ।
Material: | |||
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | ! CAUTION |
C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | ! CAUTION |
Collagenase II | Gibco | 17101015 | ! CAUTION |
Collagenase IV | Sigma | C5138 | ! CAUTION |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | ! CAUTION |
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | ! CAUTION |
Insulin | Sigma | I5500 | |
Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
OilRed O | Sigma | O-0625 | |
Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | ! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++ | Lonza | BE17-512F | |
Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | ! CAUTION Skin and eye irritant. |
Troglitazone | Sigma | T2573 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry Antibodies: | |||
anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
Tea strainer | x | x | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fibroblast growth medium: | |||
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S |