Summary
Эта рукопись описывает протокол на основе FACS для изоляции папиарной и ретикулярной фибробласты из человеческой кожи. Он обходит в пробирке культуры, которая была неизбежна с широко используемым протоколом изоляции через эксфолианта культур. Исходящие фибродоменные подмножества функционально различны и отображают дифференциальное выражение генов и локализацию внутри дермы.
Abstract
Фибробласты будут высоки гетерогенными населенностью вовлечено в патогенезе много людских заболеваний. В коже человека дерме, фибробласты традиционно приписывается к поверхностной папиарной или нижней ретикулярной дерме в соответствии с их гистологическим локализацией. В мыши дермы, папиарные и ретикулярные фибробласты происходят из двух различных линий с расходящимися функциями в отношении физиологических и патологических процессов и отдельный профиль маркера поверхности ячейки, с помощью которого они могут быть различена.
Важно отметить, что данные из эксфолиант культур из поверхностных и нижних кожных слоев предположить, что по крайней мере два функционально различных дермальных фибробласты линий существуют в коже человека дермы, а также. Однако, в отличие от кожи мыши, маркеры клеточной поверхности, позволяющие дискриминацию различных фиброподных подмножеств еще не были созданы для кожи человека. Мы разработали новый протокол для изоляции человека папиарной и ретикулярной популяции фиброза с помощью флуоресцентной активации ячейки сортировки (FACS) с использованием двух клеток поверхности маркеры фиброза активации белка (фак) и Thymocyte антиген 1 (Thy1)/CD90. Этот метод позволяет изоляцию чистого фиброзирующие подмножества без экстракорпорального манипулирования, который, как было показано, влияет на экспрессию генов, таким образом, позволяя точный функциональный анализ подмножества фибровзрыва кожных заболеваний человека в отношении ткани гомеостаза или болезни Патологии.
Introduction
В качестве основной клеточной составляющей соединительной ткани, фибробласты несут главную ответственность за осаждение коллагена и эластичных волокон, которые в конечном итоге образуют внеклеточной матрицы1, и, таким образом, их роль в ткани гомеостаза, регенерации и болезнь была недооценена в течение длительного времени. Тем не менее, фибробласты в последнее время в центре внимания исследователей, не только потому, что они представляют собой видный клеточный источник индуцированных плюрипотентных стволовых клеток2 , но и из-за их высокой пластичности и прикосновенность в патогенезе большое количество заболеваний, таких как фиброз органов3,4,5 или рак6,7.
Человеческая кожа состоит из многослойного эпителия, эпидермис, и его основной соединительной ткани, дермы, которые могут быть гистологически подразделяются на верхнюю папениари и нижней ретикулярной дермы и в основном состоит из фибробласты и внеклеточной матрицы8 и гидермы. Согласно их положению внутри ткань, кожные фибробласты грубо были расклассифицированы в папиарные и ретикулярные фибробласты1.
Важно отметить, что последние данные свидетельствуют о том, что эти субпопуляции фиброза кожного не только гистологически различимы, но и их функции значительно разнообразны. В коже мыши, папиарные и ретикулярные фибробласты возникают из двух различных линий во время эмбриогенеза9. Несколько строк доказательств свидетельствуют о том, что две линии преемственности выполняют различные роли не только в ткани гомеостаза, морфогенез волосяного фолликула, рана ремонта и фиброза7,9,10, но они также реагируют на различные сигналы от неопластических эпидермального стволовых клеток11, предлагая расходящиеся роли в патогенезе рака. Удобно, обе линии выражают отдельный набор взаимоисключающих клеточных маркеров в коже взрослого мыши, что позволяет изоляция чистого популяции фиброза кожи и последующего обширного анализа их специфических функций в пробирке9 , 11-ое.
Соответственно, по крайней мере две различные фибродоменной подмножества с отчетливыми морфологии и функций, в том числе расходящиеся темпы распространения, ткань ремоделирования мощностей12,13, а также способность поддерживать рост эпидермального стволовых клеток в пробирке, были описаны для кожи человека дермы14,15. Однако, большая часть из опубликованных изучений на людских дермальных фибробласты была дирижирована использующ смешанные популяции фиброза изолированное от эксентант культур от дерматомед кожи, в виду того что специфические комплекты маркера поверхности клетки позволяющ изоляцию чисто людской папиарной или ретикулярных субпопуляций фиброза по аналогии с мышью дермы еще предстоит установить.
Недавно мы продемонстрировали, что кожа человека папиарной и Ретикулярная фибробласты характеризуются специфическими поверхностными маркерами, которые позволяют изоляцию соответствующих субпопуляций с помощью сортировки флуоресцентной ячейки (FACS)16: фак + CD90- фибробласты представляют собой папиарные фибробласты, расположенные главным образом в верхнем дерме, представляя более высокие уровни распространения, отдельную сигнатуру генов, но не имеющий адипогенного потенциала. Фак+CD90+ и фак-CD90+ фибробласты принадлежат к ретикулярной линии нижних кожных отсеков, которые менее пролиферативные, но легко претерпевают адипогенез — признак ретикулярной фибробласты. Этот метод позволяет экстенсивно изучать эти отчетливые субпопуляции фиброза не только в отношении их специфических функций в физиологических условиях, но и в контексте патогенеза кожных заболеваний, включая рак кожи.
Однако, так как фибробласты изменить их выражение поверхности маркера ячейки в двумерной в пробирке культуры16,17,19, применение нашего протокола ограничивается изоляцией первичных фибробласты от человека дерме и не допускает идентификации папиарной или ретикулярной фибробласты в популяциях смешанной клеточной культуры. Важно отметить, что, хотя выражение клеточной поверхности маркеров изменений в пробирке, мы показали, что фибромы подмножеств изолированы в соответствии с протоколом, описанным ниже сохранить их конкретной функциональности при культивируется16, таким образом, позволяя в пробирке исследования свойств подмножества конкретных в физиологических или патологических состояний.
В заключение, мы разработали протокол для изоляции отдельных фиброподных подмножеств через FACS, что в первый раз позволяет изоляции чистого популяции фиброза от человеческой кожи дермы в наивное состояние.
Protocol
Человеческая кожа была получена от кавказских мужчин и женщин в возрасте от 26 до 61 лет (солнцезащитная кожа; брюшной коррекции, сокращение груди). Письменное информированное согласие пациента было получено до сбора тканей в соответствии с Хельсинкской декларацией, и с одобрения Совета институциональных обзорный Совет медицинского университета.
Примечание: Мы предоставляем протокол для изоляции функционально различных субпопуляций фиброза либо из полной толщины дермы (пожалуйста, обратитесь к разделу 1) или после секционирования кожи человека дермы в различных слоях (пропустить раздел 1 и непосредственно относятся к разделу 2) .
1. подготовка полной толщины дермы
- Поместите 10 см х 10 см человеческой кожи кусок (например, из брюшной корректировки или сокращения груди) с эпидермис, обращениями вниз на толстой фильтровальной бумаги.
- Держите эпидермис плотно на его краях с щипцами и соскрести подкожно-жировой слой с скальпелем. Затем нарежьте ткань на полоски шириной 5 мм, прежде чем поместить их в чашку Петри.
Примечание: Это облегчает проникновение Дисase II (именуемый энзим с отныне, см. раздел 3) и используется, если эпидермис должен быть отделен от всего дермы. Для этого пропустить раздел 2 и непосредственно относятся к разделу 3. Чтобы избежать заражения, сохранить ткань стерильной после хирургического удаления или очистить его тщательно с этанола или йода решения. Если на всех, обработка этанола поверхности кожи причиняет только малую смерть клетки. Работа в стерильных условиях в тканевой культуре потока капот.
2. секционирование человеческой кожи дермы на Папиары и ретикулярные слои с Дерматомом
- Поместите кусок кожи 10 см х 10 см (например, из брюшной коррекции или сокращения груди) на толстой фильтровальной бумаге, с эпидермисом, обращениями вверх. Держите кожу плотно на краях с помощью щипцов.
- Нарежьте кожу электрическим дерматомом, скорректированный на толщину/глубину 300 мкм, сдвинув головку дерматома от себя, с лезвием, находящимся под углом 90 ° по отношению к поверхности кожи.
- Возьмите первый слой, состоящий из эпидермиса и папиарной дермы (300 мкм толщиной, "дермальный слой 1", Рисунок 1 и Рисунок 2) и положите его в чашку Петри. Немедленно перейти к разделу 3 или добавить 1x PBS, чтобы сохранить ткань от высыхания.
Примечание: Чтобы избежать заражения, сохранить ткань стерильной после хирургического удаления или очистить его тщательно с этанола или йода решения. Работа в стерильных условиях в тканевой культуре потока капот.
Осторожно: Ручка дерматома тщательно, так как лезвия очень острые. - Повторите шаг 2,2 Регулировка дерматома к режущей толщиной 700 мкм и ломтик оставшихся дермы. Поместите верхний срез, который определяется как верхняя Ретикулярная дерма ("дермальный слой 2", Рисунок 2) в отдельную чашку Петри. Немедленно перейти к разделу 4 или добавить 1x PBS, чтобы сохранить ткань от высыхания.
- Очистите слой подкожно-жировой клетчатки скальпелем из остаточного ретикулярного кожного слоя (> 1000 мкм) и выбросьте его. Соберите нижнюю ретикулярные дермы ("дермальный слой 3", Рисунок 2) в другой чашке Петри. Немедленно перейти к разделу 4 или добавить 1x PBS, чтобы сохранить ткань от высыхания.
Примечание: Альтернативно, вместо скрепера сало с скальпелем, извлекайте тучную слой с ножницами. Это может помочь поставить ретикулярной дермы на льду до выскабливание жира прочь.
3. разделение эпидермис и дермы
-
Подготовьте 3 U/mL диссоазирующий фермент (то есть, Дисase II) раствор в стерильном 1x PBS. Поместите 5-миллиметровые полоски кожи (из раздела 1), или эпидермис/папиарную дерму (от шага 2,2), с эпидермисом вверх в 10-сантиметровой чашке Петри с 10 мл 3 U/mL диссодирующий раствор фермента. Инкубировать чашку Петри при температуре 37 ° c в течение 1 ч.
- Протокол может быть приостановлен здесь. Инкубировать эпидермис/папиарной дермы в протеазы в холодильнике при температуре 4 °C ночью вместо. По мере необходимости хранить другие слои (дермальный слой 1, 2 и 3) на ночь погружают в 1x PBS в 50 мл труб при температуре 4 °C.
Осторожно: Тщательно работать с протеазы, это может раздражать кожу и глаза при контакте.
- Протокол может быть приостановлен здесь. Инкубировать эпидермис/папиарной дермы в протеазы в холодильнике при температуре 4 °C ночью вместо. По мере необходимости хранить другие слои (дермальный слой 1, 2 и 3) на ночь погружают в 1x PBS в 50 мл труб при температуре 4 °C.
- После инкубации, передачи эпидермис/папиарной дермы в сухую крышку чашки Петри и отделить эпидермис от верхнего дермы (дермальный слой 1) с двумя щипцами каждый, держащий край либо эпидермис или дермы.
4. ферментативное переваривание кожных тканей
- Фарш каждый дермальный слой (дермальный слой 1, 2 и 3) отдельно с ножницами/скальпелем как можно тщательнее; чем меньше кусочки, тем лучше переваривание тканей.
Примечание: Прочность дермы может варьироваться в зависимости от части тела она исходит от (например, брюшной или верхней части руки кожи). - Приготовьте смесь для пищеварения, объединив 1,25 мг/мл коллагеназы I, 0,5 мг/мл коллагеназы II, 0,5 мг/мл коллагеназы IV и 0,1 мг/мл гиалуронидазы в модифицированной Орлиной среде Дульбекко (ДМЭМ) с L-глютамином (см. таблицу материалов), 10% сыворотки фетальной икры ( ) И 1% пенициллин/стрептомицин (P/S).
Осторожно: Тщательно работайте с коллагеназы, поскольку они могут раздражать кожу и глаза при контакте. - Положите каждый из измельченных тканей с 10 мл подготовленного пищеварения смесь в 50 mL трубки и инкубировать в 37 °C теплой водяной бане в течение 1 ч под постоянным волнением. Во время пищеварения несколько раз переворачиваем трубы.
Примечание: Следует рассмотреть вопрос о корректировке объема пищеварения в соответствии с размером фарш кусок кожи. Не перегружайте 10 мл пищеварения смешать с слишком много ткани в противном случае выход ячейки будет минимальным. Рекомендуется использовать менее одной трети ткани в пределах общего объема (1:2 w/v).
5. Подготовка одноклеточной суспензии и лизиса эритроцита
- Прекратите переваривание ферментативной ткани путем добавления 10 мл фиброзного носителя (ДМ с L-глютамином, 10% СУО и 1% P/S) в перевариваемые ткани. Работайте над льдом отсюда.
- Налейте содержимое каждой трубки через регулярные стерильный фильтр из нержавеющей чай и собирать клеточную суспензию в чистой чашке Петри. Вымойте фильтр со средним и пюре непереваренной части ткани с краем шприца-плунжера.
- После этого, пипетки собраны ячейки подвеска через 70 мкм сетчатый фильтр в 50 mL трубки. Промыть сетчатый фильтр со средним и собирать поток через в ту же трубку.
- Центрифужные трубки при температуре 500 x g при температуре 4 °c в течение 10 мин. Снимите и выбросите гранулы из супернатант и мойки с помощью среды фиброзной 5 мл. Повторите центрифугирования шаг.
- Удалите и выбросьте супернатант и ресуспензируем гранулы в 1 мл самодельного буферизации ACK эритроцитов (0,15 м в. н.4CL, 10 мм khco3, 0,1 mm Na2ЭДТА; pH 7,2 \ u 20127.4). Оставьте ячейки в буфере лизиса примерно на 1 мин при температуре окружающей среды (20 \ u201222 ° c).
- Остановить лизиса, добавив 9 мл 1x PBS с 10% СУО и центрифуга трубы снова на 500 x g при температуре 4 ° c в течение 5 мин. выбросите супернатант.
Осторожно: Время инкубации при лизите эритроцитов может быть скорректировано, если лизиса кажется неполным (красная Пелле). Однако, не оставляйте клетки в буфере лизиса эритроцита слишком долго, чтобы избежать лизиса фибробласты и иммунных клеток.
6. Блокирование и окрашивание фибробласты для FACS
- Подготовка 5 мкл человека FC-рецепторов блокирующего раствора в 100 мкл 1x PBS с 10% СУО и ресуспензируем клеток в 100 мкл человека блокатор FC. Инкубировать на льду в течение 10 мин.
- Дизайн FACS окрашивание панель, чтобы пятно человеческой дермальных фибробласты. Смешайте анти-человеческий фак (1:20), анти-человеческий CD90 AF700 (1:30), анти-человеческий E-кадхерин PE (1:20), анти-человеческий CD31 FITC (1:30), анти-человеческий CD45 Тихоокеанский синий (1:20), анти-человеческий ITGA6 PE (1:20), анти-человеческий CD235ab Тихоокеанский синий (1:1000) и анти-человеческий CD106 Тихий океан синий (1:100) в 1x PBS с 10% СУО.
-
После блокировки рецептора FC, Спиновые клетки вниз на 500 x g при температуре 4 ° с в течение 3 мин. Удалите и выбросите супернатант и ресуспензируем клетки в 100 мкл смеси антител. Инкубировать клетки в темноте при температуре 4 °C в течение 20 мин.
- До окрашивания удалите 20 мкл образца с высоким числом клеток для незапятнанные и одиночные элементы управления FACS.
- Промыть окрашенных клеток и FACS контроля дважды с 500 МКН 1x PBS с 10% СУО и центрифуги на 500 x g при 4 °c в течение 3 мин. В то же время, добавить 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндоле (DAPI) до 1x PBS с 10% СУО, чтобы сделать окончательную концентрацию 1 мкг/мл.
- Удалите и выбросите supernatant, ресуспензируем клетки в 200 мкл DAPI решение и фильтровать каждую клеточную подвеску через фильтр ячейки 70 мкм в 5 мл трубы FACS.
Примечание: Если FACS будет выполняться с задержкой, добавить DAPI и фильтр незадолго до записи.
7. Стратегия стробирования человеческой дермальной Фибродоменной изоляции и FACS
- Контроль потока цитометрии, установите правильные настройки напряжения и выполните соответствующую компенсацию. Ворота для одиночных ячеек и живых (DAPI-), тихоокеанские синие, PE и FITC отрицательные клетки (CD45-, CD31-,CD235ab-, CD106-, ITGA6- и E-кадхерин-), чтобы получить три фиброза популяции: фак+ CD90-, фак+CD90+ и фак-CD90+ клетки. Смотрите Рисунок 3.
- Сортировать три фибродоменных субпопуляций в отдельные 1,5 мл винт микроцентрифуга труб заполнены либо с 350 мкл лизис буфер для изоляции РНК или заполнены 350 мкл рост фиброза среды (см. таблицу материалов) для клеточной культуры. Инвертировать трубы сразу после сортировки и либо положить лизиса буферные трубы в жидкий азот для оснастки замораживания или положить средних труб на льду.
Осторожно: Подготовьте буфер лизиса с 0,1% b-меркаптоэтанола в вытяжной вытяжке и Избегайте вдыхания.
8. культивирование фибробласты и Адипогенеза анализ
- После FACS, Спиновые клетки вниз на 500 x g для 3 мин при 4 ° c и пластины равных номеров ячейки (5000 \ u201210, 000 клеток/хорошо) в фиброзного роста среды (см. таблицу материалов) в 48-хорошо клеток культуры блюд. Оставьте клетки расти, пока они не достигают 70% беглость.
- Добавить 5 мкг/мл инсулина, 5 мкм троглитазон, 0,5 мм 3-изобутиля-1-метилксантин (ibmx) и 1 мкм дексаметазона к фиброза роста среды для подготовки адипоцита дифференциации среды.
- Заменить среды культивируемых клеток с адипоцита дифференциации средних и пусть клетки дифференцировать в течение 14 дней. Обмен средним после 2-х дней с уменьшенним адипогенез средний содержащий 5 мкг/мл инсулина и 5 мкм троглитазон. Пополнить средний каждые 3-й или 4-й день.
- Зафиксируйте ячейки с 4%-ной в течение 20 минут при температуре окружающей среды (20 \ u201222 ° c) в день дифференциации 14. Вымойте скважины с 60% изопропанол и дайте ему испариться полностью. Пятно клетки с 5 мм маслом Red O (фильтр до использования) для 20 мин. промыть окрашенных клеток в четыре раза с дистиллированной водой. Приступаем к выполнению микроскопии.
Осторожно: Фа является токсичной и вредной. Ручка тщательно.
Примечание: Протокол может быть приостановлен здесь. Фиксированные ячейки могут храниться в 1x PBS при температуре 4 °C до тех пор, пока не будет выполнено окрашивание масла Red O. Накройте блюдо парафиновая пленка до хранения, чтобы избежать испарения. - Изображения клетки погружаются в воду с перевернутым микроскопом при 10x увеличении с передаваемым светом.
Representative Results
Обзор основных шагов для обработки ткани кожи для получения одной клеточную суспензию показан на рисунке 1, отображая дерматоминг кожи (рис. 1a), различные кожные слои (рис. 1a), удаление подкожно-жировой клетчатки слой (рис. 1C) и разделение эпидермиса и папиарной дермы (рис. 1c), а также различные этапы ручного диссоциации и ферментативной ткани (рис. 1c, F). Схема трех кожных слоев представлена на рисунке 2.
На рисунке 3 отображается стратегия стробирования потока цитометрии окраски панели для анализа различных фибродоменной подмножеств из кожи человека. Дополнительные маркеры поверхности клеток, которые не выражаются на фибробласты разрешения исключения различных других клеток, присутствующих в коже, таких как иммунные клетки, эпидермальных клеток, мезенхимальных стволовых клеток (МСК), эритроцитов или эндотелиальных клеток для достижения максимальной чистоты в изолированных популяциях. Не критично использовать идентичную панель FACS, которая используется на рисунке 2 для идентификации субпопуляций фибровзрыва, однако это наша рекомендация. Можно использовать антитела, маркированные различными флуоресцентными красителями или изменять комбинацию маркеров исключения.
Следует отметить, что этот протокол позволяет идентифицировать три популяции фиброза в коже человека, которые присутствуют с различной внутрикожные локализацией, профилями экспрессии генов, а также функциями (рис. 4). Фак+CD90- обогащаются в папиарной дерме, тогда как фак+CD90+ и фак-CD90+ более обильны в ретикулярной дерме (рис. 4A). Все три субпопуляции демонстрируют типичную морфологию фиброза при сортировке клеточной культуры (Рисунок 4B). Интересно, что они различаются относительно их способности дифференцироваться в адипоцитов, который является отличительной чертой для ретикулярной фибробласты. Совмещение этих результатов с экспрессией генов в режиме реального времени на полимеразной цепной реакции (RT-СР)16 (Рисунок 4c), показывающая, что фак+CD90- клетки выражают высокий уровень маркеров, обычно приписываемых папиарные фибробласты, такие как CD26, NTN и PDF, в то время как CD90+ клетки выражают известные ретикулярные маркеры, такие как CD36, ACTA2 и ппарγ на высоких уровнях, мы приходим к выводу, что фак+CD90- клетки принадлежат к папиарной и CD90+ клетки принадлежат к ретикулярной линии.
Рисунок 1: изолированность кожных одноклеточных суспензии из нетронутой человеческой кожи. (A) кожа нарезается электрическим дерматомом в папиарные и ретикулярные дермы. (B) папиарная дерма с прилегающим эпидермисом 300 мкм толщиной (вверху), а верхняя Ретикулярная дерма составляет 700 мкм толщиной (снизу). (C) подкожный жир слой является царапины-офф нижней ретикулярной дермы с скальпелем. (D) после инкубации папилломы дермы в растворе диссоциативной фермента при температуре 37 ° c для 1 ч, эпидермис может быть легко удален с помощью щипцов. E) различные кожные слои измельченные ножницами и передаются в смесь фермента пищеварения, состоящую из коллагеназы I, II и IV и гиалуронидазы. (F) после 1 h диссоциации при температуре 37 ° c, ткань пищеварения остановлен и подвеска выливают через чай стрейнер для удаления непереваренной части кожи. (G) клеточную суспензию фильтруют еще раз через 70 мкм сетчатый фильтр и центрифугирования при 500 х G при температуре 4 °c в течение 10 мин. (ч) после центрифугирования, клетка гранулы промывают с 1x PBS с 10% СУО и готов к FACS окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2: секционирование человеческой кожи дермы в папиарной и ретикулярных слоях с дерматомом. Схема, показывающая три кожных слоя, полученные путем нарезки полной толщины кожи на папиарную дерму (в том числе эпидермис; 0 \ u2012300 мкм; дермальный слой 1), верхняя Ретикулярная (300 \ u20121 000 мкм; дермальный слой 2) и Нижняя Ретикулярная дерма (> 1000 мкм; дерматома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3: стратегия FACS в отношении подпопуляций кожных фиброза для человека. (А\u-e) Во-первых, ячейки закрытого типа в одиночных (B) и жизнеспособных (DAPI-) клетках (C). Иммунные клетки (CD45+), мезенхимальные стволовые клетки (CD106+), эритроциты (CD235ab+) исключены (C) и тихоокеанские синие отрицательные клетки защищены дальше E-кадхерин (ECAD) и ITGA6 двойные отрицательные клетки (PE канал, D ). E-кадхерин и ITGA6 – это маркеры, выраженные на клетках эпидермиса. Далее, CD31-FITC положительных клеток (эндотелиальных и лимфатических клеток) исключены (D) в результате чего три фиброза популяции, выражающие один или оба из двух клеток поверхности фиброза маркеров фак и CD90: фак+CD90-, Фак+CD90+ и фак-CD90+ (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4: фак+CD90-, фак+CD90+ и фак-CD90+ фибробласты отличаются комальной локализацией, экспрессией генов и функциональностью. (A) представитель FACS участков закрытого фибробласты изолированы от папиарной, верхней ретикулярной и нижней ретикулярной дермы. Стратегия стробирования объяснена в рисунке 3. Фак+CD90- фибробласты обогащаются в папиарной дерме (19,2%) по сравнению с нижней ретикулярной дермой (0,83%). Фак+CD90+ клетки можно найти на протяжении дермы, но их высокое изобилие в верхней ретикулярной дермы (40,7%). Фак-CD90+ обогащаются нижней ретикулярной дермой (64,4%). (B) к сведению, все три сортированные субпопуляции отображают типичную морфологию фибровзрыва на культуре в течение 7 дней (слева). Интересно, что они ведут себя по-разному в анализ адипогенеза. После 14 дней в культуре, фак+CD90- не дифференцируются в адипоциты в то время как фак+CD90+ и фак-CD90+ легко пройти адипогенез (справа; Нефть красный O пятна липидных клеток красный). Шкала баров = 1 000 мкм. (C) непосредственно сортируется фак+CD90- ФИБРОБЛАСТЫ Экспресс ПАПИЛЛОМЫ фиброза маркеры CD26, NTN1 и PDF, в то время как фак-CD90+ клетки выражают CD36, ACTA2 и ппарγ, как известно, выраженные ретикулярные линии. * p 0,05; p 0,0005 по сравнению с фак+/90- клетками; # p 0,05; # # # p 0,0005 по сравнению с фак-/CD90 90+ ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Discussion
В этой статье мы описываем метод изоляции папиарной и ретикулярной фибробласты из человеческой кожи. CD90 широко используется для идентификации или изоляции кожных фибробласты18,20,21. Однако, мы продемонстрировали, что кроме CD90 + фибробласты, человеческая дерма также таит в себе CD90- фиброза, выражающее фак16, которая была установлена в качестве маркера активированного фибробласты и связанного с раком фибробласты ( Кафс)22,23,24,25. Важно отметить, что мы смогли идентифицировать три субпопуляции фибровзрыва+CD90-, фак+CD90+ и фак-CD90+ в биопсии кожи от всех здоровых человеческих доноров. Поэтому мы приходим к заключению, что фак – это не только маркер для активированных фибробласты, но и нормальных фибробласты тканей.
Следует отметить, что в фак-CD90- Cell популяции, оставшейся после применения вышеописанной стратегии исключения-и стробирования, не содержит фибробласты, так как эти клетки не размножаются в фибродоменной среде культивирования в пробирке, но большинство вероятно, смешанные ячейки населения, включая лимфатические клетки и перициты среди других16.
Урожайность клетки полученная пользой вышеописанного протокола может поменять в зависимости от тела-части которую часть кожи используемая для изоляции возникает от. Дерма из различных частей тела отличается относительно его структуры, толщины, а также коллагена состава. Например, кожа лица или плеча намного тоньше, чем кожа живота или бедра, которые также часто демонстрируют более толстый слой подкожно-жировой клетчатки. Кроме того, возраст и пол кожи доноров может еще больше не влияет на эффективность диссоциации ткани, но также может повлиять на распределение три фибродоменные субпопуляций (рис. 3), когда изолированы от полной толщины кожи. Это приводит к тому, что папиарная дерма сжимается и что общее количество фибровзрыва уменьшается с возрастом11,26,27,28. Кроме того, гранулы ячейки из папиарной дермы, вероятно, будет больше, чем от ретикулярной дермы, так как верхняя дерма более плотно заселена фибробласты, чем Ретикулярная дерма. Кроме того, Нижняя дерма также жестче и плотнее упакован с коллагеном, что затрудняет отделить ткани и освободить фибробласты. Следует отметить, что ячейка гранул может появиться очень красный, поэтому лизиса красных кровяных клеток рекомендуется.
В дополнение к идентификации трех субпопуляций в неповрежденной человеческой коже, мы также показываем, что в дерматомед кожи, каждая фиброза взрыва подмножество обогащается либо в папиарной или ретикулярной дермы16. Точная нарезка кожи с помощью дерматома имеет решающее значение для получения правильного обогащения каждого субпопуляции из различных кожных слоев. Так как папиарная дерма очень тонкая, то срез дерматомед, представляющий его, не должен превышать толщину 300 мкм. Верхняя Ретикулярная и Нижняя Ретикулярная фибробласты как представляют ретикулярную родословную, так и отображают схожие функции и сигнатуры генов, Таким образом, можно было бы также рассмотреть, не разделяя их.
Важно отметить, что все три фибробласты популяции находятся на всей территории дермы и не присутствуют исключительно в одном слое, поэтому эксфолиант культур от папилломы или Ретикулярная дерма приводит к смешанным культурам фибровзрыва. Однако, фак+CD90- папиарный фибровзрыв наиболее обильны в папиарной дерме и следуют градиенту от поверхностных до нижних кожных слоев, в то время как фак+CD90+ и фак-CD90+ фибробласты следуют Обратный градиент от нижнего к поверхностным слоям16. Кроме того, большинство CD90+ фибробласты из папиарной дермы почти исключительно обнаружены окружающие кровеносные сосуды и выражают периваскулярные фибромы маркер CD14629, и, следовательно, вероятно, демонстрируют различные функции, чем оставшиеся CD146- ретикулярные фибробласты16. CD146 может быть использован в качестве дополнительного маркера в стратегии стробирования, чтобы исключить эту популяцию.
После диссоциации кожных слоев, изолированные клетки окрашиваются в специально разработанный антитело-коктейль, содержащий различные антитела для исключения иммунных клеток, эндотелиальных и лимфатических клеток, клеток эпидермального, эритроцитов и МСК, чтобы получения чистого популяции фиброза. Следует отметить, что выбор маркера для идентификации и исключения ММСК может быть сложным из-за высокого количества опубликованных маркеров МСЦ30,31. Поскольку ММСК выражают CD90 как фибробласты, дополнительные маркеры МСЦ, такие как CD105 или CD271, могут оказаться полезными для их идентификации. Однако, МСК только представляют очень низкий процент всех кожных клеток и с CD90+ фибробласты отображения типичных морфологических особенностей фибробласты при сортировке, можно утверждать, что исключение МСК путем использования отдельных маркеров поверхности клеток может быть ненужным.
Важно отметить, что мы проанализировали экспрессии гена фак и CD90 после сохранения клеток в культуре в течение 7-14 дней после сортировки (данные не показаны) и обнаружили, что выражение обоих маркеров upregulated в соответствующих отсортированных одного положительного (фак+CD90- или Фак-CD90+) клетки16. Поэтому мы подчеркиваем, что описанные выше маркер наборы и протокол позволяют изоляции первичных фиброза подмножеств непосредственно из ткани, но не от ранее культивируемых смешанных популяций фиброза.
Тем не менее, мы демонстрируем, что функциональность всех трех субпопуляций сохраняется в клеточной культуре независимо от изменения экспрессии маркеров поверхности клетки, так как фибробласты сортируются как фак+CD90- папиарные фибробласты не приобретают способность проходить адипогенез после длительного периода культуры, в то время как фибробласты сортируются как фак+CD90+ или ФАГ-CD90+ Ретикулярная фибробласты сохраняют свою способность дифференцироваться в адипоциты 16 . Важно, что мы также обнаружили, что папилломы и ретикулярные специфические гены все еще выражены в более высокой степени в ФАГ+CD90- и CD90+ соответственно.
В заключении, мы установили протокол для изоляции функционально выраженных фибродоменных подмножеств через FACS, который впервые позволяет изоляцию и анализ чистого и наивного субпопуляций фиброза от человеческой кожи дермы. Этот метод устанавливает основные улучшения для широко используемого фибровзрыва эксентант культуры изоляции протокол от верхнего и нижнего дермы как (i) противоположные градиент папиарной и ретикулярной фибробласты существует от поверхности кожи к гидермии и (II) фибробласты изменить их ген подпись в пробирке.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы с благодарностью признаем помощь в FACS-Сортировка по Бербель Рейнингер и Вольфганг Бауэр. Эта работа была поддержана грантами б. м. л. из австрийского научного фонда (ФВФ: V 525-B28) и Федерацией европейских биохимических обществ (FEBS, исследовательский фонд последующих мер). S. F. является получателем DOC стипендий Австрийской академии наук (OeAW). Мы с благодарностью признаем отличную поддержку от основных объектов в медицинском университете Вены. Мы благодарим Бернхарда Гесльбауера, Кристин РАДТКЕ и Мартина Вивхафер за предоставление материала для кожи человека.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material: | |||
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
| β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | CAUTION |
| C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
| Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | CAUTION |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | CAUTION |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | CAUTION |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | CAUTION |
| Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | CAUTION |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
| OilRed O | Sigma | O-0625 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline without Ca2+ & Mg2+ | Lonza | BE17-512F | |
| Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
| PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
| Taqman 2x Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | CAUTION Skin and eye irritant. |
| Troglitazone | Sigma | T2573 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry Antibodies: | |||
| anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
| anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
| anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
| anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
| anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
| anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
| anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
| anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
| Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| 1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
| 1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
| 5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| 48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
| 50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
| 70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
| Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
| Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
| MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
| Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
| Tea strainer | x | x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibroblast growth medium: | |||
| AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10% FCS and 1% P/S |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I.
- Lowry, W. E., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).
- Kisseleva, T. The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver. Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).
- LeBleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Kalluri, R., Zeisberg, M.
- Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), (2015).
- Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets. Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Mastrogiannaki, M., et al. beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis. Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).
- Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages. Nature Communications. 7, 10537 (2016).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204 (4392), 526-527 (1979).
- Hiraoka, C., et al. Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability. Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).
- Higgins, C. A., et al. Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins. Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).
- Korosec, A., Lichtenberger, B. M. Ch. 12. Skin Tissue Models. Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. , Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00012-7 279-301 (2017).
- Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. , (2018).
- Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).
- Philippeos, C., et al. Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Jiang, D., Rinkevich, Y. Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133 (2018).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).
- Huang, Y., et al. Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts. BioMed Research International. 2017, 4825108 (2017).
- Jiang, G. M., et al. The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy. Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).
- Pure, E., Blomberg, R. Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics. Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).
- Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. PROTEOMICS – Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).
- Gilchrest, B. A. A review of skin ageing and its medical therapy. Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).
- Gilchrest, B. A., Krutmann, J. Skin Aging. , Springer. 198 (2006).
- Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. Molecular mechanisms of skin aging: state of the art. Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Kundrotas, G. Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts. Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).
- Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).
