Este manuscrito descreve um protocolo FACS-baseado para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. Contorna a cultura in vitro que era inevitável com o protocolo comumente usado da isolação através das culturas do explante. Os subconjuntos emanando do fibroblasto são funcionalmente distintos e indicam a expressão e a localização diferenciais do gene dentro da derma.
Os fibroblastos são uma população de células altamente heterogênea implicada na patogênese de muitas doenças humanas. Na derme da pele humana, os fibroblastos têm sido tradicionalmente atribuídos à derme reticular superficial papilar ou inferior de acordo com a sua localização histológica. Na derme do rato, os fibroblasto Papillary e reticular originam de duas linhagens diferentes com funções divergentes a respeito dos processos fisiológicos e patológicos e de um perfil distinto da expressão do marcador da superfície da pilha por que podem ser distinguidos.
Importante, a evidência das culturas do explante das camadas cutâneas superficiais e mais baixas sugere que pelo menos duas linhagens dérmicas funcional distintas dos fibroblasto existam na derma da pele humana também. No entanto, ao contrário da pele do rato, marcadores de superfície celular que permitem a discriminação de diferentes subconjuntos de fibroblastos ainda não foram estabelecidos para a pele humana. Nós desenvolvemos um protocolo novo para a isolação de populações Papillary e reticular humanas do fibroblasto através da separação fluorescência-ativada da pilha (FACS) usando os dois marcadores de superfície da pilha proteína da ativação do fibroblasto (FAP) e antígeno 1 do Thymocyte (Thy1)/CD90. Este método permite o isolamento de subconjuntos de fibroblastos puros sem manipulação in vitro, o que demonstrou afetar a expressão gênica, permitindo assim uma análise funcional precisa de subconjuntos de fibroblastos dérmicos humanos em relação à homeostase ou doença tecidual Patologia.
Como principal componente celular do tecido conjuntivo, os fibroblastos são os principais responsáveis pela deposição de colágeno e fibras elásticas que, em última instância, formam a matriz extracelular1, e assim, seu papel na homeostase tecidual, regeneração e doença foi subestimada por um longo período de tempo. Entretanto, os fibroblasto vêm recentemente o projector dos investigadores, não somente porque representam uma fonte celular proeminente para pilhas de haste pluripotentes induzidas2 mas igualmente por causa de sua plasticidade e implicação elevadas na patogénese de um grande número de doenças como a fibrose dos órgãos3,4,5 ou câncer6,7.
A pele humana é compor de um epitélio multi-camadas, da epiderme, e de seu tecido conexivo subjacente, a derma, que pode ser histològica subdividido no Papillary superior e na derma reticular mais baixa e é compor principalmente dos fibroblasto e matriz extracelular8 e a hipodermis. De acordo com sua posição dentro do tecido, os fibroblasto cutâneos foram classific aproximadamente em fibroblasto Papillary e reticular1.
Importante, os dados recentes indicam que estas subpopulações dérmicas do fibroblasto são não somente histològica distinguíveis, mas igualmente que sua função é consideravelmente diversa. Na pele do rato, os fibroblasto Papillary e reticular levantam-se de duas linhagens distintas durante a embriogênese9. Várias linhas de evidência sugerem que as duas linhagens exercem papéis diferentes não apenas na homeostase tecidual, morfogênese do folículo piloso, reparo de feridase fibrose7,9,10, mas também respondem a diferentes sinais de células-tronco epidérmicas neoplásicas11, sugerindo papéis divergentes na patogênese do câncer. Convenientemente, ambas as linhagens expressam um conjunto distinto de marcadores celulares mutuamente exclusivos na pele de ratos adultos, permitindo assim o isolamento de populações de fibroblastos puros e a subsequente análise extensiva de suas funções específicas in vitro9 , onzeanos.
Correspondentemente, pelo menos dois subconjuntos distintos de fibroblastos com morfologia e funções distintas, incluindo taxas de proliferação divergentes, capacidades de remodelação tecidual12,13, bem como a capacidade de apoiar o crescimento de células estaminais epidérmicas in vitro, têm sido descritas para a pele humana DermIS14,15. No entanto, a maioria dos estudos publicados sobre fibroblastos dérmicos humanos foram conduzidos usando populações mistas de fibroblastos isoladas de culturas explantes de pele dermatomed, uma vez que conjuntos específicos de marcadores de superfície celular permitem o isolamento de puro humano papilar ou subpopulações reticular do fibroblasto na analogia à derma do rato estavam ainda para ser estabelecidas.
Nós demonstramos recentemente, que os fibroblasto Papillary e reticular da pele humana são caracterizados por marcadores específicos da superfície da pilha que permitem a isolação das subpopulações respectivas através da triagem celular fluorescência-ativada (FACS)16: FAP + CD90– fibroblasto representam os fibroblasto Papillary situados primeiramente na derma superior, apresentando umas taxas mais elevadas da proliferação, uma assinatura distinta do gene mas nenhum potencial adipogênica. FAP+CD90+ e FAP–CD90+ fibroblastos pertencem à linhagem reticular dos compartimentos dérmicos inferiores, que são menos proliferativos, mas prontamente submetidos à adipogênese — uma marca registrada para fibroblastos reticular. Este método permite estudar extensivamente estas subpopulações distintas do fibroblasto não somente em relação a suas funções específicas circunstâncias physiological mas também no contexto da patogénese de doenças cutaneous que incluem o cancro de pele.
Entretanto, como os fibroblastos alteram a expressão do marcador de superfície celular na cultura bidimensional in vitro16,17,19, a aplicação do nosso protocolo limita-se ao isolamento de fibroblastos primários de humanos derme e não permite a identificação de fibroblasto Papillary ou reticular em populações misturadas da cultura de pilha. É importante ressaltar que, embora a expressão de marcadores de superfície celular mude in vitro, demonstramos que os subconjuntos de fibroblastos isolados de acordo com o protocolo descrito a seguir mantêm sua funcionalidade específica quando cultivadas16, possibilitando assim estudos in vitro de propriedades específicas de subconjunto em condições fisiológicas ou patológicas.
Em conclusão, nós desenvolvemos um protocolo para a isolação de subconjuntos distintos do fibroblasto através de FACS que permite pela primeira vez a isolação de populações puras do fibroblasto da derma humana da pele em um estado ingénuo.
Neste artigo, nós descrevemos um método para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. CD90 tem sido amplamente utilizado para a identificação ou isolamento de fibroblastos dérmicos18,20,21. Entretanto, Nós demonstramos que além dos fibroblasto de CD90 +, a derma humana igualmente abriga uma população do CD90– fibroblasto que expressa FAP16, que foi estabelecido como um marcador para fibroblasto ativados e fibroblasto cancro-associados ( CAFS)22,23,24,25. Importante, nós pudemos identificar três subpopulações de fibroblastos FAP+CD90–, FAP+CD90+ e FAP–CD90+ em biópsias de pele de todos os doadores humanos saudáveis. Nós concluímos conseqüentemente que FAP não é somente um marcador para fibroblasto ou CAFs ativados mas igualmente fibroblasto normais do tecido.
Da nota, a população de FAP–CD90– Cell restante após a aplicação da estratégia acima-descrita da exclusão-e da gating não contem fibroblasto, desde que estas pilhas não proliferam no meio do cultivo do fibroblasto in vitro, mas a maioria Provavelmente uma população de células mistas, incluindo células linfáticas e pericitos, entre outros16.
O rendimento celular obtido pelo uso do protocolo descrito acima pode variar dependendo do corpo-parte que a parte da pele usada para o isolamento se origina. Derme de diferentes partes do corpo difere em relação a sua estrutura, espessura, bem como a composição do colágeno. Por exemplo, a pele da face ou o braço superior é muito mais fina do que a pele da barriga ou da coxa, que também freqüentemente exibem uma camada de gordura subcutânea mais espessa. Adicionalmente, a idade e o sexo dos doadores de pele podem ainda não só impactar a eficiência da dissociação tecidual, mas também podem afetar a distribuição das três subpopulações de fibroblastos (Figura 3) quando isoladas da pele de espessura total. Isso resulta do fato de que a derme papilar encolhe e que os números de fibroblastos totais diminuem com a idade11,26,27,28. Além disso, a pelota da pilha da derma Papillary será provavelmente maior do que da derma reticular, desde que a derma superior é povoada mais densa por fibroblasto do que a derma reticular. Além disso, a derme inferior também é mais resistente e mais densamente embalado com colágeno, tornando mais difícil para dissociar o tecido e para liberar os fibroblastos. Da nota, a pelota da pilha pode aparecer muito vermelha, que é porque o lysis do glóbulo vermelho é recomendado.
Além da identificação de três subpopulações na pele humana intacta, nós igualmente mostramos que na pele dermatomed, cada subconjunto do fibroblasto está enriquecido na derma Papillary ou reticular16. O corte preciso da pele com o dermátomo é crítico para obter um enriquecimento adequado de cada subpopulação de diferentes camadas dérmicas. Uma vez que a derme papilar é muito fina, a fatia dermatomed que a representa não deve exceder uma espessura de 300 μm. os fibroblastos reticular e mais baixos reticular superiores representam a linhagem reticular e indicam funções similares e assinaturas do gene, Portanto, pode-se também considerar não separá-los.
Importante, todas as três populações dos fibroblasto são encontradas durante todo a derma e não estão exclusivamente atuais em uma camada, que é porque as culturas do explante da derma Papillary ou reticular resultam em culturas misturadas do fibroblasto. Entretanto, o fibroblasto de FAP+CD90 é o mais abundante na derma Papillary e segue um inclinação de superficial para abaixar camadas dérmicas quando FAP+CD90+ e FAP–CD90+ fibroblasto seguem um gradiente inverso das camadas inferiores para as superficiais16. Além disso, a maioria de CD90+ fibroblasto da derma Papillary é encontrada quase exclusivamente vasos sanguíneos circunvizinhos e expressa o marcador perivascular do FIBROBLASTO CD14629, e assim provavelmente exibe funções diferentes do que o fibroblastos CD146– reticular remanescentes16. CD146 poderia ser usado como um marcador adicional na estratégia de gating para excluir esta população.
Após a dissociação das camadas dérmicas, as células isoladas são manchadas com um coquetel de anticorpos especialmente concebidos contendo vários anticorpos para a exclusão de células imunes, células endoteliais e linfáticas, células epidérmicas, eritrócitos e MSCs para obter populações puras de fibroblastos. De notar, a escolha de um marcador para a identificação e exclusão de MSCS pode ser complicada por causa do elevado número de marcadores MSC publicados30,31. Desde que MSCs expressam CD90 como fibroblasto, os marcadores adicionais do MSC tais como CD105 ou CD271 poderiam revelar-se úteis para sua identificação. Entretanto, os MSCs representam somente uma porcentagem muito baixa de todas as pilhas dérmicas e desde que os fibroblasto de CD90+ indicam características morfológicas típicas dos fibroblasto em cima da classificação, se poderia argumentar que a exclusão de MSCS pelo uso de marcadores distintos da superfície da pilha pôde ser desnecessário.
Importante, nós analisamos a expressão de gene de FAP e de CD90 após ter mantido as pilhas na cultura por 7-14 dias após a classificação (dados não mostrados) e encontramos que a expressão de ambos os marcadores está upregulated no positivo único classificado respectivo (FAP+CD90– ou FAP–CD90+) células16. Nós conseqüentemente emfatizamos que os jogos e o protocolo acima descritos do marcador permitem a isolação de subconjuntos preliminares do fibroblasto diretamente do tecido mas não das populações misturadas previamente cultivadas do fibroblasto.
Não obstante, Nós demonstramos que a funcionalidade de todas as três subpopulações está mantida na cultura de pilha não obstante a alteração da expressão de marcador da superfície da pilha, desde que os fibroblasto classificados como FAP+CD90– Papillary fibroblasto não Adquira a capacidade de sofrer adipogênese após um período mais longo de cultura, enquanto os fibroblastos classificados como FAP+CD90+ ou FAP–CD90+ fibroblastos reticular mantêm sua capacidade de diferenciar em adipócitos 16 . Importante, nós igualmente encontramos que os genes Papillary e reticular-específicos são expressos ainda a uma extensão mais elevada em FAP+CD90– e CD90+ respectivamente.
Em conclusão, nós estabelecemos um protocolo para a isolação de subconjuntos funcionalmente distintos do fibroblasto através de FACS que permite pela primeira vez a isolação e a análise de subpopulações puras e ingénuas do fibroblasto da derma humana da pele. Este método estabelece um avanço principal ao protocolo comumente usado do isolamento da cultura do explante do fibroblasto da derma superior e mais baixa como (i) um inclinação de oposição de fibroblasto Papillary e reticular existe da superfície da pele ao hipoderme e (II) os fibroblasto mudam sua assinatura do gene in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos com gratidão a assistência na FACS-Sorting por Bärbel Reininger e Wolfgang Bauer. Este trabalho foi apoiado por concessões a B. M. L. do fundo Austrian da ciência (FWF: V 525-B28), e o Federation de sociedades bioquímicas européias (FEBS, fundo da pesquisa da continuação). S. F. é destinatário de uma bolsa de DOC da Academia Austríaca de Ciências (OeAW). Reconhecemos com gratidão o excelente apoio das instalações centrais da universidade médica de Viena. Agradecemos Bernhard Gesslbauer, Christine Radtke e Martin Vierhapper por fornecer material de pele humana.
Material: | |||
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | ! CAUTION |
C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | ! CAUTION |
Collagenase II | Gibco | 17101015 | ! CAUTION |
Collagenase IV | Sigma | C5138 | ! CAUTION |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | ! CAUTION |
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | ! CAUTION |
Insulin | Sigma | I5500 | |
Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
OilRed O | Sigma | O-0625 | |
Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | ! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++ | Lonza | BE17-512F | |
Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | ! CAUTION Skin and eye irritant. |
Troglitazone | Sigma | T2573 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry Antibodies: | |||
anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
Tea strainer | x | x | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fibroblast growth medium: | |||
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S |