Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

عزل الخلايا الليفية الحليمة والشبكية من جلد الإنسان عن طريق الفرز الخلوي المنشط الفلوري

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59372
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Skin, Endothelium Research Division, Department of Dermatology, Medical University of Vienna
* These authors contributed equally

Summary

تصف هذه المخطوطة البروتوكول المستند إلى FACS لعزل الخلايا الليفية الحليمة والشبكية من جلد الإنسان. وهو يلتف في الثقافة الانبوبيه التي لا مفر منها مع بروتوكول العزل الشائع الاستخدام عبر الثقافات المفسرة. الخلايا الليفية المنبثقة الفرعية متميزة وظيفيا وعرض التعبير الجينات التفاضلية والتعريب داخل الادمه.

Abstract

الخلايا الليفية هي السكان خليه غير متجانسة للغاية المتورطين في التسبب في العديد من الامراض البشرية. في الادمه الجلد البشري ، وقد نسبت الخلايا الليفية تقليديا إلى الحليمة السطحية أو شبكي الادمه السفلي وفقا لتوطينهم النسيجي. في الادمه الماوس ، والخلايا الليفية حليمي شبكي تنشا من اثنين من السلالات المختلفة مع وظائف متباينة فيما يتعلق بالعمليات الفسيولوجية والمرضية ومتميزة سطح الخلية علامة التعبير الشخصية التي يمكن تمييزها.

الأهم من ذلك ، تشير الادله من الثقافات المفسرة من طبقات الجلد السطحية والسفلية إلى وجود ما لا يقل عن اثنين من الخلايا الليفية الجلدية المتميزة وظيفيا في الادمه الجلد البشري أيضا. ومع ذلك ، علي عكس الجلد الماوس ، علامات سطح الخلية تمكين التمييز من مختلف الخلايا الليفية الفرعية لم يتم بعد تاسيسها للبشرة البشرية. وضعنا بروتوكولا جديدا لعزل السكان الليفية حليمي والشبكي الخلايا عن طريق الفرز الخلية المنشطة الفلورية (FACS) باستخدام اثنين من علامات سطح الخلية الخلايا الليفية البروتين التنشيط (FAP) والبويضات مستضد 1 (Thy1)/CD90. تمكن هذه الطريقة عزل الخلايا الليفية النقية الفرعية دون التلاعب في المختبر ، والتي تبين ان تؤثر علي التعبير الجيني ، التالي السماح تحليل وظيفي دقيقه من الخلايا الليفية الجلدية البشرية الفرعية فيما يتعلق بالتوازن الانسجه أو المرض علم الامراض.

Introduction

كمكون الخلوية الرئيسية من النسيج الضام ، الخلايا الليفية هي المسؤولة في المقام الأول عن ترسب الكولاجين وألياف المرنة التي تشكل في نهاية المطاف مصفوفة خارج الخلية1، التالي ، دورها في التوازن الانسجه ، وتجديد وقد تم التقليل من المرض لفتره طويلة. ومع ذلك ، فان الخلايا الليفية قد أصبحت مؤخرا تحت أضواء الباحثين ، ليس فقط لأنها تمثل مصدرا خلويا بارزا للخلايا الجذعية مستحث المستحثة2 ولكن أيضا بسبب اللدونة العالية والضمنية في التسبب في عدد كبير من الامراض مثل التليف الجهاز3,4,5 أو السرطان6,7.

يتكون الجلد البشري من ظهاره متعددة الطبقات ، والبشرة ، والنسيج الضام الأساسي ، الادمه ، والتي يمكن تقسيمها تشريحيا إلى حليمة العليا والادمه شبكي السفلي وتتكون أساسا من الخلايا الليفية مصفوفة خارج الخلية8 والطبقة الناقصة الادمه. وفقا لموقعها داخل الانسجه ، وقد تم تصنيف الخلايا الليفية الجلدية تقريبا إلى حليمي والخلايا الليفية شبكي1.

والاهم من ذلك ، تشير البيانات الاخيره إلى ان هذه الخلايا الليفية غير النسيجية الجلدية لا يمكن تمييزها من الناحية التشريحية فحسب ، بل أيضا ان وظيفتها متنوعة إلى حد كبير. في الجلد الماوس ، والخلايا الليفية حليمي شبكي تنشا من اثنين من سلاله متميزة اثناء الاجنه9. عده خطوط من الادله تشير إلى ان اثنين من السلالات ممارسه ادوار مختلفه ليس فقط في التوازن الانسجه, الشعر المسام الجذور, إصلاح الجرح والتليف7,9,10, لكنها تستجيب أيضا لمختلف إشارات من الخلايا الجذعية الجلدية الأورام11، مما يوحي باختلاف الأدوار في الاصابه بمرض السرطان. مريح ، علي حد سواء السلالات التعبير عن مجموعه متميزة من علامات الخلوية الحصرية المتبادلة في جلد الفار الكبار ، التالي تمكين عزل السكان الليفية الجلد النقي والتحليل الموسع اللاحقة من وظائف محدده في المختبر9 , 11-الآن

وفي المقابل ، ما لا يقل عن اثنين من الخلايا الليفية متميزة مجموعات فرعيه مع المورفولوجية والوظائف المتميزة ، بما في ذلك معدلات الانتشار المتباينة ، وأعاده عرض الانسجه القدرات12،13، فضلا عن القدرة علي دعم نمو الخلايا الجذعية البشرة في المختبر ، وقد وصفت للبشرة البشرية الادمه14،15. ومع ذلك ، تم اجراء معظم الدراسات المنشورة علي الخلايا الليفية الجلدية البشرية باستخدام السكان الليفية المختلطة المعزولة من الثقافات المفسرة من الجلد الجلدي ، منذ محدده الخلية علامات سطح تمكين عزل حليمي الإنسان النقي أو شبكي الخلايا الليفية الفرعية في القياس إلى الادمه الماوس لم يتم إنشاؤها بعد.

وقد أظهرنا مؤخرا ، ان جلد الإنسان حليمي والخلايا الليفية شبكي تتميز علامات سطح الخلية المحددة التي تمكن من عزل السكان الفرعيين المعنية عن طريق الفرز الخلية المنشطة مضان (FACS)16: يندرج + CD90-الخلايا الليفية تمثل الخلايا الليفية الحليمة الموجودة في المقام الأول في الادمه العليا ، وتقديم معدلات انتشار اعلي ، وتوقيع الجينات متميزة ولكن لا إمكانات اديبوغينيك. يندرج +CD90 + و fap-CD90 + الخلايا الليفية تنتمي إلى سلاله شبكي من مقصورات الجلد السفلي ، والتي هي اقل التكاثري ولكن الخضوع بسهوله اديبوجينيسيس-السمة المميزة لشبكي الخلايا الليفية. هذا الأسلوب يتيح لدراسة علي نطاق واسع هذه الخلايا الليفية متميزة ليس فقط فيما يتعلق بوظائفها المحددة في ظل الظروف الفسيولوجية ولكن أيضا في سياق التسبب في الامراض الجلدية بما في ذلك سرطان الجلد.

ومع ذلك ، منذ الخلايا الليفية تغيير التعبير الخاصة بهم علامة سطح الخلية في ثنائي الابعاد في المختبر الثقافة16،17،19، ويقتصر تطبيق بروتوكولنا علي عزل الخلايا الليفية الاوليه من الإنسان الادمه ولا يسمح بتحديد الخلايا الليفية حليمي أو شبكي في السكان المختلطة ثقافة الخلية. الأهم من ذلك ، علي الرغم من ان التعبير عن علامات سطح الخلية يتغير في المختبر ، فقد أثبتنا ان الخلايا الفرعية الليفية المعزولة وفقا للبروتوكول الموصوف أدناه تحتفظ بوظائفها المحددة عندما تزرع16، التالي تمكين في دراسات المختبر للخصائص الخاصة بالمجموعات الفرعية في ظروف فسيولوجية أو مرضيه.

في الختام ، وضعنا بروتوكولا لعزل الخلايا الليفية الفرعية متميزة عبر FACS ان للمرة الاولي يسمح عزل السكان الليفية النقية من الادمه الجلد البشري في حاله ساذجه.

Protocol

تم الحصول علي الجلد البشري من الرجال القوقازيين والنساء الذين تتراوح أعمارهم بين 26 إلى 61 سنه (الجلد الشمس المحمية ، والتصحيحات في البطن ، وتخفيض الثدي). وتم الحصول علي موافقه خطيه مستنيرة من المريض قبل جمع الانسجه وفقا لإعلان هلسنكي ، وبموافقه مجلس المراجعة المؤسسية لجامعه فيينا الطبية.

ملاحظه: نحن نقدم بروتوكولا لعزل الخلايا الليفية متميزة وظيفيا اما من الادمه سمك كامل (يرجى الرجوع إلى القسم 1) أو بعد التماس الادمه الجلد البشري في طبقاتها المختلفة (تخطي القسم 1 والرجوع مباشره إلى القسم 2) .

1. اعداد الادمه سمك كامل

  1. ضع قطعه جلد الإنسان 10 سم × 10 سم (علي سبيل المثال ، من التصحيحات البطنية أو تخفيضات الثدي) مع البشرة التي تواجه أسفل علي ورقه فلتر سميكه.
  2. عقد البشرة باحكام علي حوافها مع ملقط وكشط قباله طبقه الدهون تحت الجلد مع مشرط. ثم تقطع الانسجه إلى شرائح عريضة بحجم 5 ملم قبل وضعها في طبق بيتري.
    ملاحظه: وهذا يسهل اختراق الثانية ديداز (المشار اليها باسم انزيم انفصام من الآن فصاعدا ، انظر القسم 3) ويستخدم إذا كانت البشرة تحتاج إلى فصلها عن الادمه بأكملها. لهذا تخطي القسم 2 والرجوع مباشره إلى القسم 3. لتجنب التلوث ، والحفاظ علي الانسجه العقيمة بعد الازاله الجراحية أو تنظيفه جيدا مع الايثانول أو محلول اليود. ان [آت ول], ايثانول يسبب معالجه من الجلد سطح فقط صغيره خليه موت. العمل في ظل ظروف معقمه في نسيج الانسجه المتدفقة.

2. التماس الادمه الجلد البشري إلى الطبقات الحليمة والشبكية مع الجلدية

  1. ضع قطعه جلد 10 سم × 10 سم (علي سبيل المثال ، من التصحيحات البطنية أو تخفيضات الثدي) علي ورق الفلتر السميك ، مع البشرة التي تواجه صعودا. عقد الجلد باحكام علي حوافها مع ملقط.
  2. شريحة الجلد مع الجلدية الكهربائية ، وتعديلها علي سمك القطع/عمق 300 μm ، عن طريق انزلاق رئيس الجلدية بعيدا عن النفس ، مع نصل يجري في زاوية 90 ° بالنسبة لسطح الجلد.
  3. تاخذ الطبقة الاولي التي تتكون من البشرة والادمه حليمي (300 μm سميكه ، "طبقه الجلد 1" ، الشكل 1 والشكل 2) ووضعها في طبق بيتري. المضي قدما فورا إلى القسم 3 أو أضافه 1x تلفزيوني للحفاظ علي الانسجه من الجفاف.
    ملاحظه: لتجنب التلوث ، والحفاظ علي الانسجه العقيمة بعد أزاله الجراحية أو تنظيفه جيدا مع الايثانول أو محلول اليود. العمل في ظل ظروف معقمه في نسيج الانسجه المتدفقة.
    تحذير: التعامل مع الجلدية بعناية منذ شفرات حاده جدا.
  4. كرر الخطوة 2.2 ضبط الجلد إلى قطع سمك 700 μm وشريحة الادمه المتبقية. ضع الشريحة العلوية التي تعرف باسم الادمه شبكي العليا ("طبقه الجلد 2" ، الشكل 2) في طبق بيتري منفصل. المضي قدما فورا إلى القسم 4 أو أضافه 1x تلفزيوني للحفاظ علي الانسجه من الجفاف.
  5. كشط بعيدا طبقه الدهون تحت الجلد مع مشرط من طبقه الجلد السفلي شبكي المتبقية (> 1000 μm) وتجاهله. جمع الادمه شبكي السفلي ("طبقه الجلد 3" ، الشكل 2) في طبق بيتري آخر. المضي قدما فورا إلى القسم 4 أو أضافه 1x تلفزيوني للحفاظ علي الانسجه من الجفاف.
    ملاحظه: بدلا من ذلك ، عوضا عن كشط الدهون قباله مع مشرط ، وأزاله طبقه الدهون مع مقص. قد يساعد علي وضع الادمه شبكي علي الجليد قبل كشط الدهون بعيدا.

3. فصل البشرة والادمه

  1. اعداد 3 U/mL انزيم انفصام (اي ، يوزع الثاني) الحل في 1x العقيمة تلفزيوني. وضع المشارب الجلد 5 مم (من القسم 1) ، أو الادمه البشرة/الحليمة (من الخطوة 2.2) ، مع البشرة التي تواجه التصاعدي في صحن بيتري 10 سم مع 10 مل من 3 U/مل محلول انزيم انفصام. احتضان طبق بيتري في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
    1. قد يكون البروتوكول متوقفا هنا. احتضان البشرة/الادمه الحليمة في البروتياز في الثلاجة في 4 °C ليلا بدلا من ذلك. حسب الحاجة تخزين الطبقات الأخرى (طبقه الجلد 1 ، 2 و 3) بين عشيه وضحيها مغمورة في 1x تلفزيوني في أنابيب 50 مل في 4 درجه مئوية.
      تحذير: العمل بعناية مع الانزيم البروتيني ، فانه قد تهيج الجلد والعينين عند الاتصال.
  2. بعد الحضانة ، نقل الادمه البشرة/الحليمة إلى الغطاء الجاف لطبق بيتري وفصل البشرة من الادمه العليا (طبقه الجلد 1) مع اثنين من ملقط كل عقد علي حافه اما البشرة أو الادمه.

4. الهضم الانزيمي للانسجه الجلدية

  1. المفروم كل طبقه الجلد (الجلد طبقه 1 ، 2 و 3) علي حده مع مقص/مشرط بدقه قدر الإمكان ؛ أصغر القطع ، وأفضل هضم الانسجه.
    ملاحظه: يمكن ان تختلف صلابة الادمه اعتمادا علي جزء من الجسم انه يتكون من (علي سبيل المثال ، الجلد في البطن أو الذراع العلوي).
  2. اعداد مزيج الهضم عن طريق الجمع بين 1.25 ملغ/مل كولاجيناز انا ، 0.5 ملغ/مل كولاجيناز الثاني ، 0.5 ملغ/مل كولاجيناز الرابع و 0.1 ملغ/مل حمض الهيالورونيك في المتوسطة دولبيكو النسر المعدلة (DMEM) مع L-الجلوتامين (انظر جدول المواد) ، 10 ٪ الجنين الساق المصل ( FCS) و 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين (P/S).
    تحذير: العمل بعناية مع كولاجيناسيس لان هذه قد تهيج الجلد والعينين عند الاتصال.
  3. وضع كل من الانسجه المفروم مع 10 مل من مزيج الهضم المعدة في أنبوب 50 mL واحتضان في 37 °C حمام الماء الدافئ ل 1 ح تحت الهياج الدائم. اثناء الهضم عكس الأنابيب عده مرات.
    ملاحظه: يجب علي المرء ان ينظر في ضبط حجم الهضم وفقا لحجم قطعه الجلد المفروم. لا تفرط في الهضم 10 مل مزيج مع الكثير من الانسجه والا فان العائد الخلية يكون الحد الأدنى. يوصي بأقل من ثلث الانسجه داخل الحجم الإجمالي (1:2 واط/الخامس).

5. اعداد تعليق خليه واحده و كريات تحلل

  1. وقف الهضم الانسجه الانزيميه عن طريق أضافه 10 مل الليفية المتوسطة (DMEM مع L-الجلوتامين ، 10 ٪ FCS و 1 ٪ P/S) إلى الانسجه المهضومة. العمل علي الجليد من هنا علي.
  2. صب محتويات كل أنبوب من خلال مصفاه الشاي غير القابل للصدا معقمه العادية وجمع تعليق الخلية في طبق بيتري نظيفه. يغسل المصفاة مع المتوسطة والهريس قطع الانسجه غير مهضوم مع حافه حقنه الغطاس.
  3. بعد ذلك ، الماصة جمعت تعليق الخلية من خلال مصفاه الخلية 70 μm في أنبوب 50 mL. شطف مصفاه الخلية مع المتوسطة وجمع تدفق من خلال في نفس الأنبوب.
  4. أنابيب الطرد المركزي في 500 x g في 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه أزاله وتجاهل ماده طافي وغسل الخلية بيليه مع 5 مل الليفية المتوسطة. كرر الخطوة الطردة.
  5. أزاله وتجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 1 mL الذاتي الصنع ACK كريات تحلل العازلة (0.15 M NH4Cl ، 10 ملم khco3، 0.1 mm Na2أدتا ؛ pH 7.2 \ u 20127.4). اترك الخلايا في المخزن المؤقت تحلل لمده دقيقه واحده تقريبا عند درجه الحرارة المحيطة (20 \ u201222 درجه مئوية).
  6. وقف تحلل عن طريق أضافه 9 مل من 1x تلفزيوني مع 10 ٪ FCS والطرد المركزي الأنابيب مره أخرى في 500 x ز في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق. تجاهل سوبرناتانت.
    تحذير: ويمكن تعديل وقت الحضانة في كريات تحلل إذا كان التحلل يبدو غير مكتمل (بيليه احمر). ومع ذلك ، لا تترك الخلايا في المخزن المؤقت كريات تحلل لفتره طويلة جدا لتجنب تحلل الخلايا الليفية والمناعية.

6. حجب وتلطيخ الخلايا الليفية ل FACS

  1. اعداد 5 μL من الإنسان--مستقبلات الحل حجب في 100 μL من 1x مع 10 ٪ FCS وأعاده التعليق الخلايا في 100 μL من مانع Fc الإنسان. احتضان علي الجليد لمده 10 دقيقه.
  2. تصميم لوحه تلطيخ FACS لوصمه الخلايا الليفية الجلدية البشرية. مزيج المضادة للإنسان FAP APC (1:20) ، ومكافحه الإنسان CD90 AF700 (1:30) ، ومكافحه الإنسان E-الملتصقون PE (1:20) ، ومكافحه الإنسان CD31 FITC (1:30) ، ومكافحه الإنسان CD45 المحيط الهادئ الأزرق (1:20) ، ومكافحه الإنسان ITGA6 PE (1:20) ، ومكافحه الإنسان CD235ab المحيط الأزرق (1:100) في 1x تلفزيوني مع FCS 10 ٪.
  3. بعد منع مستقبلات Fc ، تدور الخلايا في 500 x ز في 4 درجه مئوية لمده 3 دقائق أزاله وتجاهل ماده طافي وأعاده التعليق الخلايا في 100 μl من مزيج الأجسام المضادة. احتضان الخلايا في الظلام عند 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
    1. قبل تلطيخ ، أزاله 20 μL من عينه مع عدد الخلايا العالية لعناصر التحكم FACS وصمه عار غير ملطخه وواحده.
  4. غسل الخلايا الملونة وضوابط FACS مرتين مع 500 μL 1x تلفزيوني مع 10 ٪ FCS وأجهزه الطرد المركزي في 500 x ز في 4 درجه مئوية لمده 3 دقائق. في هذه الاثناء ، أضافه 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) إلى 1x التلفزيونية مع 10 ٪ FCS لجعل التركيز النهائي من 1 ميكروغرام/مل.
  5. أزاله وتجاهل supernatant ، أعاده التعليق الخلايا في الحل DAPI 200 μL وتصفيه كل تعليق الخلية من خلال مصفاه الخلية 70 μm في أنبوب FACS 5 مل.
    ملاحظه: إذا كان سيتم تنفيذ FACS مع التاخير ، أضافه DAPI وتصفيه قبل وقت قصير من التسجيل.

7. استراتيجية النابضة للإنسان البشري الخلايا الليفية العزلة الفرعية و FACS

  1. ضوابط التدفق الخلوي سجل ، تعيين إعدادات الجهد الصحيح وأداء التعويض المناسب. بوابه للخلايا المفردة والعيش (DAPI-) ، المحيط الهادئ الأزرق ، PE و fitc الخلايا السلبية (CD45-، CD31-، CD235ab-، CD106-، ITGA6- و E-cملتصقون-) للحصول علي ثلاثه السكان الليفية:يندرج + CD90-، fap + CD90 + و يندرج-CD90 + الخلايا. انظر الشكل 3.
  2. فرز الخلايا الليفية الفرعية ثلاثه في منفصلة 1.5 mL المسمار غطاء أنابيب الطرد المركزي الصغيرة ملات اما مع 350 μL تحلل العازلة للعزل RNA أو مليئه 350 μL الليفية النمو المتوسطة (انظر جدول المواد) للثقافة الخلية. عكس الأنابيب مباشره بعد هذا النوع ووضع اما أنابيب تحلل العازلة في النيتروجين السائل لتجميد المفاجئة أو وضع أنابيب متوسطه علي الجليد.
    تحذير: اعداد تحلل العازلة مع 0.1 ٪ ب-Mercaptoethanol في غطاء الدخان وتجنب استنشاق.

8. الخياطة من الخلايا الليفية وفحص التكوين

  1. بعد FACS ، تدور الخلايا أسفل في 500 x g لمده 3 دقائق في 4 °c وأرقام الخلايا متساوية اللوحة (5000 \ u201210 ، 000 خليه/بئر) في الخلايا الليفية النمو المتوسطة (انظر جدول المواد) في 48 الخلية ثقافة الاطباق. اترك الخلايا تنمو حتى تصل إلى 70% كونفلوينسي.
  2. أضافه 5 ميكروغرام/مل الانسولين ، 5 μM تروجليزون ، 0.5 mM 3-ايزوبوتيل-1-ميثيلززانيني (IBMX) و 1 μM ديكساتاسوني لنمو الخلايا الليفية المتوسطة لاعداد التمايز الخلايا الشحمية المتوسطة.
  3. استبدل متوسط الخلايا المستزرعة بوسيطه التمايز الشحمي واترك الخلايا تفرق لمده 14 يوما. تبادل المتوسطة بعد اليوم 2 مع انخفاض اديبوجينيسيس المتوسطة التي تحتوي علي 5 ميكروغرام/مل الانسولين و 5 μM تروجليزون. تجديد المتوسطة كل 3 الثالث أو اليوم الرابع.
  4. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ PFA لمده 20 دقيقه في درجه الحرارة المحيطة (20 \ u201222 درجه مئوية) في اليوم التمايز 14. غسل الآبار مع 60 ٪ ايزوبروبانول والسماح لها تتبخر تماما. الخلايا وصمه عار مع 5 مم النفط الأحمر O (فلتر قبل الاستخدام) لمده 20 دقيقه. اغسل الخلايا الملونة أربع مرات بالماء المقطر. المضي قدما لأداء المجهر.
    تحذير: PFA هو السامة والضارة. التعامل بعناية.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين الخلايا الثابتة في 1x تلفزيوني في 4 درجه مئوية حتى يتم تنفيذ تلطيخ النفط الأحمر O. يغطي الطبق بغشاء البارافين قبل التخزين لتجنب التبخر.
  5. خلايا الصورة مغمورة في الماء مع المجهر المقلوب في التكبير 10x مع الضوء المنقول.

Representative Results

يتم عرض نظره عامه علي الخطوات الرئيسية لمعالجه انسجه الجلد للحصول علي تعليق خليه واحده في الشكل 1، وعرض الجلد من البشرة (الشكل 1a) ، طبقات جلديه مختلفه (الشكل1a) ، وأزاله الدهون تحت الجلد طبقه (الشكل 1C) وفصل البشرة والادمه الحليمة (الشكل 1c) ، فضلا عن الخطوات المختلفة لتفكك الانسجه اليدوية والانزيميه (الشكل 1c، F). ويرد في الشكل 2مخطط للطبقات الثلاث الجلدية.

الشكل 3 يعرض استراتيجية النابضة لتدفق لوحه تلطيخ الخلوي لتحليل مختلف الخلايا الليفية الفرعية من جلد الإنسان. علامات سطح الخلية الاضافيه التي لا يتم التعبير عنها في الخلايا الليفية تسمح باستبعاد مختلف الخلايا الأخرى الموجودة في الجلد مثل الخلية المناعية ، خلايا البشرة ، الخلايا الجذعية المسمارية (MSCs) ، خلايا الدم الحمراء أو الخلايا البطانية لتحقيق النقاء القصوى في السكان المعزولين. ليس من المهم لاستخدام لوحه FACS متطابقة المستخدمة في الشكل 2 لتحديد هذه الخلايا الليفية الفرعية ، ولكن هذه هي توصيتنا. يمكن للمرء استخدام الأجسام المضادة الموسومة باصباغ فلورية مختلفه أو تغيير تركيبه علامات الاستبعاد.

ومن الجدير بالذكر ان هذا البروتوكول يمكن من تحديد ثلاثه من السكان الليفيين في الجلد البشري الذي يقدم مع التعريب الداخل الادمه المختلفة ، وملامح التعبير الجيني وكذلك وظائف (الشكل 4). يندرج +CD90- يتم تخصيبها في الادمه حليمي بينما يندرج + CD90 + و يندرج-CD90 + هي أكثر وفره في الادمه شبكي ( الشكل4a). كل ثلاثه [سوببوبولايشن] يبدي النموذجية [فيفرنسف] تشكل علي يصنف في خليه ثقافة (شكل [4 ب]). ومن المثير للاهتمام, انها تختلف فيما يتعلق بقدرتها علي التفريق في الخلايا الشحمية التي هي السمة المميزة لشبكي الليفية. الجمع بين هذه النتائج مع التنميط التعبير الجيني عن طريق الوقت الحقيقي البلمره سلسله تفاعل (RT-PCR)16 (الشكل4c), تبين ان يندرج + CD90- الخلايا التعبير عن مستويات عاليه من علامات عاده ما تعزي إلى الخلايا الليفية الحليمة مثل CD26 ، NTN و PDPN في حين CD90 + الخلية التعبير عن علامات الشبكي المعروفة مثل الCD36 والACTA2 والpparγ في مستويات عاليه ، نستنتج ان يندرج + CD90 الخلايا تنتمي إلى حليمي والCD90 + الخلايا تنتمي إلى سلاله شبكي.

Figure 1
الشكل 1: عزل الجلد تعليق خليه واحده من بشره الإنسان سليمه. (A) شرائح الجلد مع الجلدية الكهربائية في الادمه والشبكية. (ب) الادمه الحليمة مع البشرة المجاورة هو 300 μm سميكه (اعلي) في حين الادمه العليا شبكي هو 700 μm سميكه (أسفل). (ج) طبقه الدهون تحت الجلد هو كشط قباله الادمه شبكي السفلي مع مشرط. (د) بعد احتضان الادمه الحليمة في محلول انزيم التفكك عند 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة ، يمكن بسهوله أزاله البشرة بالملقط. (ه) طبقات الجلد المختلفة مفرومه مع مقص ونقلها إلى مزيج انزيم الهضم تتكون من كولاجيناز الأول والثاني والرابع وحمض الهيالورونيك. (و) بعد 1 h من التفكك عند 37 درجه مئوية ، يتم إيقاف هضم الانسجه ويسكب التعليق من خلال مصفاه الشاي لأزاله قطع الجلد غير المهضومة. (ز) يتم تصفيه تعليق الخلية مره أخرى من خلال مصفاه الخلية 70 μm و طرد في 500 x G في 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه. (ح) بعد طرد ، يتم غسلها بيليه الخلية مع 1x التلفزيونية مع 10 ٪ FCS وعلي استعداد ل facs تلطيخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التماس الادمه الجلدية البشرية في طبقات حليميه وشبكي مع الجلد. مخطط يظهر الطبقات الجلدية الثلاثة التي تم الحصول عليها عن طريق تشريح الجلد سمك كامل في الادمه حليمي (بما في ذلك البشرة ؛ 0 \ u2012300 μm ؛ طبقه الجلد 1) ، شبكي العليا (300/u20121 ، 000 ميكرومتر ؛ طبقه الجلد 2) واقل شبكي الادمه (> 1000 μm ؛ طبقه الجلد 3) قطاع جلدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: استراتيجية العصف السطحي للبشر الخلايا الليفية الجلدية البشرية. (A\u2012e) أولا ، يتم بوابات الخلايا علي واحد (B) وخلايا قابلهللحياة (dapi) (ج). الخلايا المناعية (CD45 +) ، والخلايا الجذعية المسمارية (CD106 +) ، وخلايا الدم الحمراء (CD235ab +) مستبعده (C) والمحيط الهادئ الأزرق الخلايا السالبة هي بوابات أخرى علي البريد الكتروني (ECAD) و ITGA6 خلايا سلبيه مزدوجة (قناه PE ، D ). E-الملتصقون و ITGA6 هي علامات التعبير عنها في خلايا البشرة. بعد ذلك ، يتم استبعاد الخلايا الموجبة CD31 (البطانة والخلايا اللمفاوية) (د) مما ادي إلى ثلاثه السكان الليفية التعبير عن اي واحد أو كل من اثنين من الخلايا الليفية سطح الخلية علامات FAP و CD90: fap + CD90-، Fap +CD90 + و fap-CD90 + (E). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:يندرج +CD90-,يندرج + CD90 + ويندرج-CD90 + الخلايا الليفية تختلف في توطين الجلد, التعبير الجيني والأداء الوظيفي. (ا) القطع التمثيلية لل facs من الخلايا الليفية المسورة المعزولة عن الحليمات والشبكي العليا والادمه شبكي السفلي. ويرد شرح استراتيجية الصب في الشكل 3. يندرج +CD90- الخلايا الليفية المخصب في الادمه حليمي (19.2 ٪) بالمقارنة مع الادمه شبكي السفلي (0.83 ٪). يندرج +CD90 + الخلايا يمكن العثور عليها في جميع انحاء الادمه ولكن لديها اعلي وفره في الادمه العليا شبكي (40.7 ٪). CD90 + هي المخصب في الادمه شبكي السفلي (64.4 ٪). (ب) من الملاحظة ، تعرض جميع السكان الفرعيين الثلاثة المفروزة شكل الخلايا الليفية النموذجية علي الثقافة لمده 7 أيام (يسار). ومن المثير للاهتمام ، انها تتصرف بشكل مختلف في فحص التكوين. بعد 14 يوما في الثقافة، fap + CD90- لا تفرق في الخلايا الشحمية في حين يندرج + CD90 + و يندرج-CD90 + بسهوله الخضوع اديبوجينيسيس (الحق ؛ النفط الأحمر O البقع الدهنية التي تحمل الخلايا الحمراء). قضبان المقياس = 1,000 μm. (ج) فرزهامباشره FAP + CD90-الخلايا الليفية التعبير عن علامات الورم الليفي حليمي CD26 ، NTN1 و pdpn ، في حين يندرج-CD90 + الخلية التعبير عن CD36 ، ACTA2 وpparγ ، والمعروف ان يكون يعبر عنها النسب شبكي. * p ≤ 0.05 ؛ p ≤ 0.0005 مقارنه بFAP +/cd90-الخلايا ; # p ≤ 0.05; # # # p ≤ 0.0005 مقارنه ب FAP-/cd90 + الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه المقالة ، ونحن وصف طريقه لعزل الخلايا الليفية حليمي وشبكي من جلد الإنسان. CD90 وقد استخدمت علي نطاق واسع لتحديد أو عزل الخلايا الليفية الجلدية18،20،21. ومع ذلك, لقد أظهرنا انه إلى جانب CD90 + الخلايا الليفية , الادمه البشرية أيضا الموانئ السكان CD90 الخلايا الليفية التعبير عن FAP16, التي تم تاسيسها كعلامة لتنشيط الخلايا الليفية والأورام الليفية المرتبطة بالسرطان ( Cafs)22،23،24،25. الأهم من ذلك ، تمكنا من تحديد ثلاثه الخلاياالليفية الفرعية يندرج + CD90-، يندرج + CD90 + و يندرج-CD90 + في الخزعات الجلدية من جميع المتبرعين البشرية الصحية. ولذلك فاننا نستنتج ان يندرج ليس فقط علامة لتنشيط الخلايا الليفية أو CAFs ولكن أيضا الخلايا الليفية الانسجه العادية.

من الملاحظة ، فان السكان CD90- الخلية المتبقية بعد تطبيق استراتيجية الاستبعاد والعزل الموصوفة أعلاه لا تحتوي علي الخلايا الليفية ، لان هذه الخلية لا تتكاثر في زراعه الليفية المتوسطة في المختبر ، ولكن معظم من المرجح ان مختلطة خليه السكان بما في ذلك الخلايا اللمفاوية و pericytes بين الآخرين16.

يمكن ان تختلف عائدات الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه تبعا للجزء الأساسي الذي تنبع منه قطعه الجلد المستخدمة للعزل. الادمه من أجزاء الجسم المختلفة تختلف فيما يتعلق بنيتها ، سمك وكذلك تكوين الكولاجين. علي سبيل المثال ، الجلد من الوجه أو الذراع العلوي هو ارق بكثير من الجلد من البطن أو الفخذ ، والتي تعرض أيضا في كثير من الأحيان طبقه الدهون تحت الجلد أكثر سمكا. بالاضافه إلى ذلك, العمر والجنس من المتبرعين الجلد قد لا تؤثر فقط علي كفاءه تفكك الانسجه, ولكن قد تؤثر أيضا علي توزيع الخلايا الليفية الثلاثة الفرعية (الشكل 3) عندما معزولة من الجلد سمك كامل. ينتج هذا من الحقيقة ان ال [حليمي] الادمه ينكمش وان إجماليه [فيبرونسف] تناقص أرقام مع عمر11,26,27,28. وعلاوة علي ذلك ، فان الخلية بيليه من الادمه حليمي ربما تكون أكبر من شبكي الادمه ، منذ الادمه العلوي هو أكثر كثافة سكانية من الخلايا الليفية من الادمه شبكي. إلى جانب ذلك ، الادمه السفلي هو أيضا أكثر صرامة وأكثر كثافة معباه مع الكولاجين ، مما يجعل من الصعب فك النسيج والإفراج عن الخلايا الليفية. من الملاحظة ، قد تظهر الخلية بيليه حمراء جدا ، وهذا هو السبب في التحلل خلايا الدم الحمراء الموصي بها.

بالاضافه إلى تحديد ثلاثه من السكان الفرعيين في الجلد البشري سليمه ، ونحن أيضا تبين انه في الجلد الجلدية ، يتم إثراء كل مجموعه فرعيه الخلايا الليفية اما في الادمه الحليمة أو شبكي16. التشريح الدقيق للجلد مع الجلد أمر بالغ الاهميه للحصول علي الإثراء السليم لكل السكان الفرعيين من طبقات جلديه مختلفه. وبما ان الادمه الحليمة رقيقه جدا ، فان شريحة الجلدية التي تمثلها لا ينبغي ان تتجاوز سماكه 300 ميكرومتر. شبكي العلوية والشبكي الليفية السفلي علي حد سواء تمثل سلاله شبكي وعرض وظائف مماثله والتوقيعات الجينات ، لذلك ، يمكن للمرء أيضا ان ينظر في عدم فصلها.

الأهم من ذلك ، يتم العثور علي جميع السكان الخلايا الليفية الثلاثة في جميع انحاء الادمه وليست موجودة حصرا في طبقه واحده ، وهذا هو السبب في الثقافات المفسرة من حليمة أو شبكي الادمه يؤدي في الثقافات الليفية المختلطة. ومع ذلك، فأب + CD90- حليمي الليفية هي الأكثر وفره في الادمه حليمي واتباع التدرج من سطحيه إلى اقل طبقات الجلد في حين يندرج + CD90 + ويندرج-CD90 + الخلايا الليفية تتبع انحدار معكوسه من ال [لوور] إلى الطبقات سطحيه16. وعلاوة علي ذلك ، معظمCD90 + الخلايا الليفية من الادمه حليمي تقريبا وجدت حصرا المحيطة بالاوعيه الدموية والتعبير عن الخلايا الليفية الوعائية علامة CD14629، التالي ربما يحمل وظائف مختلفه من المتبقية CD146-شبكي الخلايا الليفية 16. يمكن استخدام CD146 كعلامة اضافيه في استراتيجية النابضة لاستبعاد هؤلاء السكان.

بعد تفكك طبقات الجلد ، وملطخه الخلايا المعزولة مع كوكتيل الأجسام المضادة المصممة خصيصا التي تحتوي علي الأجسام المضادة المختلفة لاستبعاد الخلايا المناعية ، البطانية والخلايا اللمفاوية ، خلايا البشرة ، الكريات الحمراء و MSCs الحصول علي السكان الليفية نقيه. من ملاحظه ، اختيار علامة لتحديد واستبعاد mscs قد تكون خادعه بسبب العدد الكبير من علامات MSC المنشورة30،31. وبما ان MSCs express CD90 مثل الخلايا الليفية ، يمكن ان تكون علامات MSC الاضافيه مثل CD105 أو CD271 مفيده للتعرف عليها. ومع ذلك ، MSCs تمثل فقط نسبه منخفضه جدا من جميع الخلايا الجلدية ومنذCD90 + الأورام الليفية عرض الميزات المورفولوجية النموذجية من الأورام الليفية علي الفرز ، يمكن للمرء ان يجادل بان استبعاد mscs باستخدام علامات سطح الخلية متميزة قد تكون غير ضرورية.

الأهم من ذلك ، حللنا FAP و CD90 التعبير الجيني بعد الحفاظ علي الخلايا في الثقافة لأيام 7-14 بعد الفرز (البيانات لم تظهر) وجدت ان التعبير عن كل من علامات هو اوبريجولاتيد في كل واحده الايجابيه التي تم فرزها (FAP +CD90- أو CD90 +)الخلايا16. ولذلك فاننا نشدد علي ان مجموعات العلامات الموصوفة أعلاه والبروتوكول تسمح بعزل الخلايا الليفية الاساسيه مباشره من الانسجه ولكن ليس من السكان الذين كانوا مثقفين سابقا مختلطة الخلايا الليفية.

ومع ذلك ، فاننا نثبت ان وظائف جميع السكان الفرعيين الثلاثة يتم الاحتفاظ بها في ثقافة الخلية بغض النظر عنالتغيير في التعبير عن علامة سطح الخلية ، حيث ان الخلايا الليفية التي يتم فرزها علي انها FAP + CD90-حليميالخلايا الليفية لا الحصول علي القدرة علي الخضوع اديبوجينيسيس بعد فتره أطول من الثقافة ، في حين انالخلايا الليفية فرزها كما يندرج + CD90 + أو يندرج-CD90 + شبكي الخلايا الليفية الحفاظ علي قدرتها علي التفريق في الخلايا الشحمية 16 . والاهم من ذلك ، وجدنا أيضا ان الجينات الحليمة والشبكية الخاصة لا تزال تعبر عنها إلى حد اعلي فيFAP +CD90- و CD90 + علي التوالي.

في الختام ، انشانا بروتوكولا لعزل الخلايا الليفية متميزة وظيفيا من خلال FACS التي تسمح للمرة الاولي عزل وتحليل الخلايا الليفية النقية والساذجة من الادمه الجلد البشري. هذا الأسلوب يؤسس تقدما كبيرا لبروتوكول عزل الخلايا الليفية المستخدمة التي يشيع استخدامها من الادمه العلوية والسفلية كما (ط) الانحدار المتعارضة من حليمي وشبكي الخلايا الليفية موجودة من سطح الجلد إلى هيبوالادمه و (2) الخلايا الليفية تغيير توقيع الجينات في المختبر.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ونحن نعترف بامتنان المساعدة في FACS-الفرز بواسطة بريبل رايننجر وفولفغانغ باور. وقد دعم هذا العمل بمنح قدمت إلى السيد ب. م. ل. من صندوق العلوم النمساوي (FWF: V 525-B28) ، واتحاد الجمعيات الاوروبيه البيوكيميائية (FEBS ، صندوق بحوث المتابعة). وهو حاصل علي زمالة الدكتوراه في الاكاديميه النمساوية للعلوم (OeAW). ونحن نعترف بامتنان بالدعم الممتاز من المرافق الاساسيه في جامعه فيينا الطبية. نشكر برنارد جيسباور وكريستين رادتكي ومارتن فيرهاببير لتوفير المواد الجلدية البشرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material:
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Ammonium chloride Sigma 9718 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium Gibco 17001-074 used for fibroblast growth medium
β-Mercaptoethanol Scharlau ME0095 CAUTION
C100 Supplement Thermo Scientific 12556015 used for fibroblast growth medium
Collagenase I Thermo Scientific 17100017 CAUTION
Collagenase II Gibco 17101015 CAUTION
Collagenase IV Sigma C5138 CAUTION
DAPI Thermo Scientific 62248
Dexamethasone Sigma D8893
Dispase II Roche 4942078001 CAUTION
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX Gibco 31966-021
EDTA disodium salt Sigma E1644 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10500-064
Hyaluronidase Sigma H4272 CAUTION
Insulin Sigma I5500
Isopropanol Merck 1,096,341,011
OilRed O Sigma O-0625
Paraformaldehyd Sigma 158127 CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070-063
Phosphate-buffered saline without Ca2+ & Mg2+ Lonza BE17-512F
Potassium bicarbonate Sigma 237205 used for selfmade ACK Lysis Buffer
PureLink RNA MicroKit Invitrogen 12183-016
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR Invitrogen 11752
Taqman 2x Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4324018 CAUTION Skin and eye irritant.
Troglitazone Sigma T2573
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry Antibodies:
anti human CD31-AF488 Biolegend 303109 Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075
anti human CD45-Pacific blue Biolegend 304029 Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123
anit human CD49f/ITGA6-PE Serotec MCA699PE Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833
anti human CD90/Thy-1-AF700 Biolegend 328120 Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302
anti human CD106-AF421 BD 744309 Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x
anti human CD235ab-Pacific blue Biolegend 306611 Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153
anti-human E-cadherin-PE Biolegend 147304 Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040
anti human FAP-APC R&D FAB3715A Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x
Human TruStain FcX Biolegend 422302 Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
1.4 mL micronic tubes Thermo Scientific 4140
1.5 mL screw cap micro tube Sarstedt 72,692,405
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap Falcon 352235
48-well cell culture cluster Costar 3548
50 mL polypropylene canonical tubes Falcon 352070
70 µm cell strainer nylon Falcon 352350
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome VWR AESCGA670
Aesculap Dermatome blades VWR AESCGB228R
MicroAmp Fast Optical 96well Applied Biosystems 4346906
Primary cell culture dish Corning 353803
Scalpel blades F.S.T 10022-00
Tea strainer x x
Name Company Catalog Number Comments
Fibroblast growth medium:
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10% FCS and 1% P/S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of Cell Science. 117 (Pt 5), 667-675 (2004).
  2. Lowry, W. E., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).
  3. Kisseleva, T. The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver. Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).
  4. LeBleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).
  5. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  6. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  7. Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), (2015).
  8. Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets. Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  9. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  10. Mastrogiannaki, M., et al. beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis. Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).
  11. Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages. Nature Communications. 7, 10537 (2016).
  12. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204 (4392), 526-527 (1979).
  13. Hiraoka, C., et al. Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability. Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).
  14. Higgins, C. A., et al. Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins. Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).
  15. Korosec, A., Lichtenberger, B. M. Ch. 12. Skin Tissue Models. Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. , Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00012-7 279-301 (2017).
  16. Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. , (2018).
  17. Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).
  18. Philippeos, C., et al. Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
  19. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  20. Jiang, D., Rinkevich, Y. Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133 (2018).
  21. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).
  22. Huang, Y., et al. Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts. BioMed Research International. 2017, 4825108 (2017).
  23. Jiang, G. M., et al. The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy. Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).
  24. Pure, E., Blomberg, R. Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics. Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).
  25. Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. PROTEOMICS – Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).
  26. Gilchrest, B. A. A review of skin ageing and its medical therapy. Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).
  27. Gilchrest, B. A., Krutmann, J. Skin Aging. , Springer. 198 (2006).
  28. Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. Molecular mechanisms of skin aging: state of the art. Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).
  29. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  30. Kundrotas, G. Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts. Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).
  31. Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).

Tags

علم الوراثة ، الإصدار 147 ، FACS ، علامات سطح الخلية ، تغاير الليفية ، الخلايا الليفية ، الجلد البشري ، حليمي والخلايا الليفية شبكي
عزل الخلايا الليفية الحليمة والشبكية من جلد الإنسان عن طريق الفرز الخلوي المنشط الفلوري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Korosec, A., Frech, S.,… More

Korosec, A., Frech, S., Lichtenberger, B. M. Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (147), e59372, doi:10.3791/59372 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter