Dette manuskriptet beskriver en FACS-basert protokoll for isolering av papillær og retikulære fibroblaster fra menneskelig hud. Det omgår in vitro kulturen som var uunngåelig med den brukte isolasjons protokollen via explant kulturer. De som kommer Fibroblast delsett er funksjonelt distinkte og viser differensial genuttrykk og lokalisering i dermis.
Fibroblaster er en svært heterogen celle befolkning innblandet i patogenesen av mange menneskelige sykdommer. I humant hud dermis, fibroblaster har tradisjonelt vært tilskrevet overfladisk papillær eller lavere retikulære dermis i henhold til deres histologiske lokalisering. I mus dermis, papillær og retikulære fibroblaster stammer fra to forskjellige linjene med avvikende funksjoner vedrørende fysiologiske og patologiske prosesser og en distinkt celle overflate markør uttrykk profil der de kan skilles.
Viktigere, bevis fra explant kulturer fra overfladiske og lavere dermal lag tyder på at minst to funksjonelt distinkt dermal fibroblaster linjene finnes i menneskets hud dermis også. Men i motsetning til musen huden, celleoverflaten markører slik at diskriminering av ulike Fibroblast delsett ennå ikke er etablert for menneskelig hud. Vi utviklet en ny protokoll for isolering av menneskelig papillær og retikulære Fibroblast populasjoner via fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) ved hjelp av to celleoverflaten markører Fibroblast aktivisering protein (FAP) og Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. Denne metoden gjør det mulig å isolering av ren Fibroblast delsett uten in vitro manipulasjon, som ble vist å påvirke genuttrykk, og dermed tillater nøyaktig funksjonell analyse av menneskelig dermal Fibroblast delsett i forhold til vev homeostase eller sykdom Patologi.
Som den viktigste cellulære komponenten av bindevev, fibroblaster er primært ansvarlig for deponering av kollagen og elastiske fibre som til slutt danner ekstracellulære matrise1, og dermed sin rolle i vev homeostase, regenerering og sykdommen har vært undervurdert i lang tid. Men fibroblaster har nylig kommet under søkelyset av forskere, ikke bare fordi de representerer en fremtredende mobil kilde for indusert Pluripotent stamceller2 , men også på grunn av deres høye plastisitet og konsekvensen i patogenesen av et bredt antall sykdommer som organ fibrose3,4,5 eller Cancer6,7.
Human hud er sammensatt av en flerlags epitel, epidermis, og dens underliggende bindevev, dermis, som kan histologisk inndelt i øvre papillær og nedre retikulære dermis og er i hovedsak sammensatt av fibroblaster og ekstracellulære matrise8 og hypodermis. Ifølge deres plassering i vevet, dermal fibroblaster har grovt blitt klassifisert i papillær og retikulære fibroblaster1.
Viktigere, nyere data tyder på at disse dermal Fibroblast subpopulasjoner er ikke bare histologisk gjenkjennelig, men også at deres funksjon er betydelig mangfoldig. I mus hud, papillær og retikulære fibroblaster oppstår fra to distinkte linjene under embryogenesis9. Flere linjer av bevis tyder på at de to linjene utøve ulike roller ikke bare i vev homeostase, hårsekken morphogenesis, såret reparasjon og fibrose7,9,10, men de også svare på ulike signaler fra neoplastic epidermal stamceller11, antyder avvikende roller i kreft patogenesen. Beleilig, både linjene uttrykke et distinkt sett av gjensidig utelukkende cellulære markører i voksen mus hud, og dermed muliggjøre isolering av ren dermal Fibroblast bestander og påfølgende omfattende analyse av deres spesifikke funksjoner i vitro9 , 11i.
Tilsvarende, minst to distinkte Fibroblast delsett med distinkte morfologi og funksjoner, inkludert avvikende spredning priser, vev remodeling kapasiteter12,13, samt evne til å støtte veksten av epidermal stamceller in vitro, har blitt beskrevet for Human Skin dermis14,15. Men de fleste av de publiserte studier på menneskelig dermal fibroblaster har blitt gjennomført ved hjelp av blandede Fibroblast populasjoner isolert fra explant kulturer fra dermatomed hud, siden bestemte celleoverflaten markør sett muliggjør isolering av ren menneskelig papillær eller retikulære Fibroblast subpopulasjoner i analogi til mus dermis var ennå ikke etablert.
Vi har nylig demonstrert, at menneskets hud papillær og retikulære fibroblaster er preget av spesifikke celleoverflaten markører som muliggjør isolering av de respektive subpopulasjoner via fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)16: FAP + CD90– fibroblaster representerer papillær fibroblaster primært plassert i øvre dermis, presenterer høyere spredning priser, en distinkt gen signatur, men ingen adipogenic potensial. FAP+CD90+ og FAP–CD90+ fibroblaster tilhører den retikulære Lineage av lavere dermal rom, som er mindre proliferativ men lett gjennomgår adipogenesis-et kjennetegn for retikulære fibroblaster. Denne metoden gjør det mulig å omfattende studere disse distinkte Fibroblast subpopulasjoner ikke bare i forhold til deres spesifikke funksjoner under fysiologiske forhold, men også i sammenheng med patogenesen av hudsykdommer, inkludert hudkreft.
Men siden fibroblaster endre deres celle overflate markør uttrykk i to-dimensjonale in vitro kultur16,17,19, anvendelse av vår protokoll er begrenset til isolering av primær fibroblaster fra Human dermis og tillater ikke identifisering av papillær eller retikulære fibroblaster i blandet cellekultur populasjoner. Viktigere, selv om uttrykket av celleoverflaten markører endringer in vitro, har vi vist at Fibroblast delsett isolert i henhold til protokollen beskrevet nedenfor beholde sin spesifikke funksjonalitet når dyrket16, og dermed muliggjør in vitro studier av delsett-spesifikke egenskaper under fysiologiske eller patologiske tilstander.
Avslutningsvis har vi utviklet en protokoll for isolering av distinkte Fibroblast delsett via FACS som for første gang tillater isolering av rene Fibroblast populasjoner fra menneskelig hud dermis i en naiv tilstand.
I denne artikkelen beskriver vi en metode for isolering av papillær og retikulære fibroblaster fra menneskelig hud. CD90 har blitt mye brukt for identifisering eller isolering av dermal fibroblaster18,20,21. Men vi har vist at i tillegg CD90 + fibroblaster, menneskelige dermis også havner en CD90– Fibroblast BEFOLKNING uttrykker FAP16, som har blitt etablert som en markør for aktivert fibroblaster og kreft-assosiert fibroblaster ( CAFs)22,23,24,25. Viktigere var vi i stand til å identifisere tre Fibroblast subpopulasjoner FAP+CD90–,FAP +CD90+ og FAP–CD90+ i huden biopsier fra alle friske menneskelige donorer. Vi konkluderer derfor med at FAP er ikke bare en markør for aktivert fibroblaster eller CAFs men også normalt vev fibroblaster.
Av notatet, den FAP–CD90– celle befolkning gjenværende etter påføring av den ovenfor beskrevne eksklusjon-og gating strategi ikke inneholder fibroblaster, siden disse cellene ikke sprer i Fibroblast dyrking medium in vitro, men de fleste sannsynlig en blandet celle befolkning inkludert lymfatisk celler og pericytes blant annet16.
Cellen yield oppnås ved bruk av ovennevnte protokollen kan variere avhengig av kroppsdelen at huden stykke brukt for isolasjonen stammer fra. Dermis fra ulike kroppsdeler varierer med hensyn til struktur, tykkelse samt kollagen sammensetning. For eksempel er huden fra ansiktet eller overarmen mye tynnere enn huden fra magen eller låret, som også ofte viser et tykkere underhudsfett lag. I tillegg, alder og kjønn på hud donorer kan videre ikke bare påvirke vevet dissosiasjon effektivitet, men kan også påvirke fordelingen av de tre Fibroblast subpopulasjoner (Figur 3) når isolert fra full tykkelse hud. Dette skyldes det faktum at papillær dermis krymper og at total Fibroblast tall reduseres med alderen11,26,27,28. Videre vil cellen pellet fra papillær dermis trolig være større enn fra retikulære dermis, siden den øvre dermis er mer tett befolket av fibroblaster enn retikulære dermis. For resten, det lavere dermis er likeledes tøffere og flere tett pakket med kollagen, gjør den hardere å distansere vevet og å løslate det fibroblaster. Av notatet, kan cellen pellet vises veldig rødt, det er derfor røde blodlegemer lyse anbefales.
I tillegg til identifisering av tre subpopulasjoner i intakt menneskelig hud, viser vi også at i dermatomed hud, hver Fibroblast delsett er beriket enten i papillær eller retikulære dermis16. Presis kutting av huden med dermatome er avgjørende for å oppnå en riktig berikelse av hver pasientpopulasjonen fra ulike dermal lag. Siden papillær dermis er svært tynn, dermatomed skive representerer det bør ikke overstige en tykkelse på 300 μm. øvre retikulære og lavere retikulære fibroblaster begge representerer retikulære avstamning og vise lignende funksjoner og gen signaturer, Derfor kan man også vurdere å ikke skille dem.
Viktigere, alle tre fibroblaster populasjoner finnes i hele dermis og er ikke utelukkende til stede i ett lag, og det er derfor explant kulturer fra papillær eller retikulære dermis resultere i blandede Fibroblast kulturer. Men FAP+CD90– papillær Fibroblast er mest rikelig i papillær dermis og følge en gradient fra overfladisk til lavere dermal lag mens FAP+CD90+ og FAP–CD90+ fibroblaster følge en inverse gradient fra nedre til overfladiske lag16. Videre flertallet av CD90+ fibroblaster av papillær dermis er nesten utelukkende funnet rundt blodkar og uttrykke inflammasjon FIBROBLAST markør CD14629, og dermed trolig utstillingen ulike funksjoner enn resterende CD146– retikulære fibroblaster16. CD146 kan brukes som en ekstra markør i gating strategi for å utelukke denne populasjonen.
Etter dissosiasjon av dermal lag, er de isolerte cellene beiset med en spesialdesignet antistoff cocktail som inneholder ulike antistoffer for utelukkelse av immunceller, endothelial og lymfatisk celler, epidermal celler, erytrocytter og MSCs til få rene Fibroblast populasjoner. Av notatet, velge en markør for identifisering og utelukkelse av MSCs kan være vanskelig på grunn av det høye antallet publiserte MSC markører30,31. Siden MSCs uttrykke CD90 som fibroblaster, ytterligere MSC markører som CD105 eller CD271 kan være nyttig for deres identifikasjon. Men MSCs bare representerer en svært lav prosentandel av alle dermal celler og siden CD90+ fibroblaster display typisk morfologiske funksjoner av fibroblaster upon sortering, kan man argumentere for at utelukkelse av MSCs ved bruk av distinkte celleoverflaten markører kan være unødvendig.
Viktigere, analyserte vi FAP og CD90 genuttrykk etter å ha holdt cellene i kultur for 7-14 dager etter sortering (data ikke vist) og funnet ut at uttrykk for begge markører er upregulated i de respektive sortert enkelt positive (FAP+CD90– eller FAP–CD90+) celler16. Vi understreker derfor at de ovenfor beskrevne markør sett og protokoll tillater isolering av primære Fibroblast delsett direkte fra vevet, men ikke fra tidligere kultivert blandet Fibroblast populasjoner.
Likevel viser vi at funksjonaliteten til alle tre subpopulasjoner er beholdt i cellekultur uavhengig av endring av celle overflate markør uttrykk, siden fibroblaster sortert som FAP+CD90– papillær fibroblaster ikke tilegne seg muligheten til å gjennomgå adipogenesis etter en lengre periode med kultur, mens fibroblaster sorteres som FAP+CD90+ eller FAP–CD90+ retikulære fibroblaster opprettholde sin evne til å differensiere til adipocytter 16 . Viktigere, vi fant også at papillær og retikulære-spesifikke gener er fortsatt uttrykt i høyere grad i FAP+CD90– og CD90+ hhv.
Avslutningsvis har vi etablert en protokoll for isolering av funksjonelt distinkte Fibroblast delsett via FACS som for første gang tillater isolering og analyse av ren og naiv Fibroblast subpopulasjoner fra menneskelig hud dermis. Denne metoden etablerer en stor avansement til vanlig brukte Fibroblast explant kultur isolasjon protokollen fra øvre og nedre dermis som (i) en opposisjon gradient av papillær og retikulære fibroblaster eksisterer fra huden overflaten til hypodermis og (II) fibroblaster endre sin gen signatur in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker takknemlig assistanse i FACS-sortering av Bärbel Reininger og Wolfgang Bauer. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til B. M. L. fra det østerrikske vitenskaps fondet (FWF: V 525-B28), og Føderasjonen av europeiske biokjemiske foreninger (FEBS, oppfølgings Forskningsfond). S. F. er mottaker av en DOC Fellowship of the Austrian Academy of Sciences (OeAW). Vi takknemlig erkjenner utmerket støtte fra kjernen anlegg ved Medical University of Vienna. Vi takker Bernhard Gesslbauer, Christine Radziszewska og Martin Vierhapper for å gi menneskelig hud materiale.
Material: | |||
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | ! CAUTION |
C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | ! CAUTION |
Collagenase II | Gibco | 17101015 | ! CAUTION |
Collagenase IV | Sigma | C5138 | ! CAUTION |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | ! CAUTION |
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | ! CAUTION |
Insulin | Sigma | I5500 | |
Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
OilRed O | Sigma | O-0625 | |
Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | ! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++ | Lonza | BE17-512F | |
Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | ! CAUTION Skin and eye irritant. |
Troglitazone | Sigma | T2573 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry Antibodies: | |||
anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
Tea strainer | x | x | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fibroblast growth medium: | |||
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S |