Summary
Nanopmalm sekvensering er en ny teknologi, der giver mulighed for omkostningseffektiv sekventering i fjerntliggende steder og ressourcefattige indstillinger. Her præsenterer vi en protokol til sekvensering af mRNAs fra fuldblod, der er kompatibel med sådanne betingelser.
Abstract
Sekvensering i fjerntliggende steder og ressourcefattige indstillinger præsenterer unikke udfordringer. Nanopmalm sekvensering kan med held anvendes under sådanne forhold, og blev indsat i Vestafrika under den seneste Ebola virus epidemi, der fremhæver denne mulighed. Ud over de praktiske fordele (lave omkostninger, nem transport og brug af udstyr), giver denne teknologi også grundlæggende fordele i forhold til andengenerations sekvensering tilgange, især den meget lange læse længde, evne til direkte sekvens RNA og realtids tilgængelighed af data. Rå læse nøjagtighed er lavere end med andre sekvensering platforme, som repræsenterer den vigtigste begrænsning af denne teknologi; Dette kan dog delvist afbødes af den høje læse dybde, der genereres. Her præsenterer vi en felt kompatibel protokol til sekventering af mRNAs-kodning for Niemann-pick C1, som er den cellulære receptor for eboldaviruses. Denne protokol omfatter ekstraktion af RNA fra animalske blodprøver, efterfulgt af RT-PCR til målberigelse, barkodning, biblioteks forberedelse og sekvensering af selve køre, og kan let tilpasses til brug med andre DNA-eller RNA-mål.
Introduction
Sekvensering er et kraftfuldt og vigtigt værktøj inden for biologisk og biomedicinsk forskning. Det giver mulighed for analyse af genomer, genetiske variationer, og RNA Expression profiler, og dermed spiller en vigtig rolle i undersøgelsen af menneske-og dyresygdomme både1,2. Sanger sekventering, en af de ældste metoder til rådighed for DNA sekventering, er stadig rutinemæssigt anvendes til denne dag og har været en hjørnesten af molekylær biologi. I løbet af de seneste 50 år er denne teknologi blevet forbedret for at opnå læse længder på mere end 1.000 NT og en nøjagtighed så høj som 99,999%1. Men sanger sekventering har også begrænsninger. Sekvensering et større sæt af prøver eller analysen af hele genomer med denne metode er tidskrævende og dyrt1,3. Anden generations (næste generations) DNA-sekvente Rings metoder som 454 pyrosekvensering og Illumina-teknologi har gjort det muligt for os at reducere de omkostninger og den arbejdsbyrde, der er nødvendig for sekventering i det seneste årti, betydeligt og har medført en enorm stigning i mængden af biologisk sekvensinformation til rådighed4. Ikke desto mindre er individuelle sekvensering kører ved hjælp af disse andengenerationsteknologier er dyrt, og sekvensering underfelt betingelser er udfordrende, da det nødvendige udstyr er voluminøse og skrøbelige (svarende til sanger sekventering enheder), og ofte er nødt til at kalibreres og serviceres af specialuddannet personale. Også for mange af de anden generations teknologier læse længder er temmelig begrænset, hvilket ofte gør downstream Bioinformatik analyse af disse data udfordrende.
Tredje generations sekvensering ved hjælp af nanopenheder i lommestørrelse (Se tabel over materialer) kan fungere som et alternativ til disse etablerede sekvensering platforme. I disse enheder passerer et enkeltstrenget DNA eller RNA-molekyle gennem en nanopmalm samtidig med en ionisk strøm, som derefter måles af en sensor (figur 1). Da strengen krydser nanopmalmen, detekteres moduleringen af de nukleotider, der er til stede i poren på et givent tidspunkt, og beregningsmæssigt tilbage-oversat til nucleostidsekvensen5. På grund af dette driftsprincip tillader nanopmalm sekvensering både generering af meget lange læsninger (tæt på 1 x 106 nukleotider6) og analyse af sekvensering data i realtid. Stregkodning er muligt ved at knytte definerede nukleotidsekvenser til nukleinsyrer i en prøve, hvilket gør det muligt at analysere flere prøver i en enkelt sekvensering, hvilket øger prøvehastigheden og sænker pr. stikprøve omkostningerne. På grund af deres høje bærbarhed og brugervenlighed er der blevet anvendt nanopudstyr med succes i marken under den seneste epidemi af Ebola virus i Vestafrika, hvilket understreger deres egnethed til hurtig indsættelse i fjerntliggende regioner7 , 8. den er
Her beskriver vi en detaljeret felt kompatibel protokol til sekventering af mRNA-kodning for Niemann-pick C1 (NPC1)-proteinet, som er den forpligte indgangs receptor til filovira såsom ebolsaviruser, og har vist sig at begrænse arter modtagelighed for disse vira9,10. Protokollen omfatter ekstraktion af hele RNA fra blodprøver, specifik forstærkning af NPC1 mRNA ved RT-PCR, barkodning af prøver, biblioteks forberedelse og sekvensering med en nanop-sekvente Rings anordning. Data analyse kan ikke diskuteres på grund af pladsbegrænsninger, selv om nogle grundlæggende retninger er fastsat i de repræsentative resultater; den interesserede læser henvises dog til en tidligere publikation11 for en mere detaljeret beskrivelse af den arbejdsgang, vi brugte, samt for publikationer fra andre12,13,14 for detaljerede oplysninger med hensyn til de analyseværktøjer, der bruges i denne arbejdsgang.
Protocol
Der blev indsamlet prøver efter Njala Universitetsinstitut (NUIRB) protokol nr. IRB00008861/FWA00018924.
1. RNA ekstraktion fra blodprøver
- Saml 3 mL fuldblod fra den art, der skal analyseres, i en blodindsamlings slange fyldt med 6 mL DNA/RNA-stabiliserings reagens (Se tabel over materialer) og bland ved at invertere 5 gange. Blodprøven opbevares i op til en måned ved 4 °C.
- Indholdet af blod opsamlingsrøret overføres til en 50 mL opsamlings slange, der tilsættes 120 μL proteinase K og blandes ved vortexning i 5 s. der Inkube prøven i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 9 mL isopropanol til blandingen og vortex i 5 s.
- Anbring et reservoir på en RNA-rensnings spin kolonne (Se tabel over materialer), og Anbring samlingen på en vakuum manifold (Se tabel over materialer). Tilsæt prøveblandingen i reservoiret. Påfør et vakuum, indtil al væsken er passeret gennem søjlen.
- Hvis der ikke findes nogen vakuum manifold, kan blodet overføres gennem kolonnen i portioner på 700 μL ved gentagen centrifugering i 30 s ved 12.000 x g med gennemstrømningen bortskaffes mellem Centrifugerings trin. Dette vil dog kræve ca. 26 Centrifugerings trin.
- Sæt RNA-rensnings spin-søjlen i en opsamlings slange og tilsæt 400 μL DNA/RNA prep-buffer (Se tabel over materialer). Der centrifugeres ved 12.000 x g i 30 s, og gennemstrømningen kasseres.
- Der tilsættes 400 μL DNA/RNA-vaskebuffer (Se tabel over materialer) til kolonnen, centrifugeres ved 12.000 x g i 30 s og kasseres gennemstrømningen.
- Bland 5 μL DNase I (1 U/μL) (Se tabel over materialer) med 75 μl DNA-nedbrydnings buffer (Se tabel over materialer) og tilsæt blandingen til kolonnen. Inkubeter i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 400 μL DNA/RNA-prep-buffer til kolonnen, og der centrifugeres ved 12.000 x g i 30 s. Bortskaf gennemstrømningen.
- Kolonnen vaskes med 700 μL DNA/RNA-vaskebuffer og centrifugeres ved 12.000 x g i 30 s. Bortskaf gennemstrømningen.
- Gentag trin 1,9 med 400 μL DNA/RNA-vaskebuffer, og centrifuge ved 12.000 x g i 2 min. for at fjerne al resterende vaskebuffer og for at tørre kolonnen. Når du fjerner kolonnen fra opsamlingsrøret, skal du sørge for ikke at fugte undersiden af søjlen med bufferen i opsamlingsrøret.
-
Kolonnen anbringes i et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas, og der tilsættes 70 μL nukleasefri vand. Der inkupereres i 1 min ved stuetemperatur, og der centrifugeres i 30 s ved 12.000 x g. RNA skal opbevares ved-80 °C til videre brug (eller anvendes med det samme).
- Valgfri: For at kvantificere RNA skal du tage en alikvot og bestemme koncentrationen ved hjælp af et UV-Spektrofotometer (Se tabel over materialer).
2. reverse transkription af NPC1 mRNA til cDNA
- I et 0,2 mL reagensglas tilsættes 8 μL skabelonrna (1 PG til 2,5 μg RNA) og 1 μL hver af 10x DNase-buffer og DNase-enzym (Se tabel over materialer). Der inkubeeres ved 37 °C i 2 min. Derefter centrifugeres reaktionen kortvarigt, og den anbringes på is.
- Der tilsættes 4 μL revers transkriptase Master Mix (Se tabel over materialer) og 6 μl nukleasefri vand til reaktionsrøret og blandes forsigtigt. Reaktionen inkubieres i en termo cycler i 10 minutter ved 25 °C (for primer-glødning) efterfulgt af 10 min ved 50 °C (ved omvendt transkription af RNA). For at inaktivere enzymet, inkuieres i 5 min ved 85 °C.
- Overfør cDNA til et nyt 1,5 mL mikrocentrifugerør og opbevares ved-80 °C indtil videre brug (eller brug straks).
3. forstærkning af NPC1 åben læse ramme
-
Indledende forstærknings trin
- Indstil en touchdown PCR15,16 for at forstærke NPC1 cDNA med primer sæt 1 (Se tabel 1) ved hjælp af en hot start high fidelity DNA Polymerase (Se tabel over materialer) med den relevante reaktionsbuffer i en 50 μl reaktion volumen med 1 μL-skabelon. Indstil om muligt reaktionen på is eller i en 4 °C kølig blok.
- Der inkubieres reaktionen i en termo cycler med et indledende Denaturerings trin på 30 s ved 98 °C, efterfulgt af 10 cyklusser med denaturering ved 98 °C i 10 s, primer glødning i 20 s ved 65 °C, sænkning af temperaturen med 0,5 °C pr. cyklus og forlængelse i 1 min ved 72 °C. Efterfølgende, køre en ekstra 20 cyklusser med 10 s ved 98 °C, 20 s ved 60 °C, og 1 min ved 72 °C, efterfulgt af et afsluttende forlængelse trin på 5 min ved 72 °C.
-
PCR rensning ved hjælp af magnetiske perler
- Overfør 50 μL PCR-produkt til et 1,5 mL DNA-Low-bindende reaktions rør (Se tabel over materialer). Resuspension af magnetiske perler (Se tabel over materialer) grundigt ved vortexning og tilsæt 50 μl perler til PCR-reaktionen. Bland godt. Prøven inkupereres på en roterende mixer (Se tabel over materialer) i 5 minutter ved stuetemperatur (ved 15 rpm).
- Drej prøven kortvarigt, og Anbring 1,5 mL-mikrocentrifugerings røret på et magnetisk stativ (Se tabel over materialer) for at pille de magnetiske perler. Vent, indtil supernatanten er helt afklaret, før du fortsætter med næste trin.
- Aspirér supernatanten uden at forstyrre perle pellet og kassere.
- Der afpipetteres 200 μL af 70% ethanol i reaktionsrøret, og der inkubieres i 30 s. Aspirér ethanol uden at forstyrre pellet og kassere. Gentag for i alt to skyller. Sørg for, at der ikke er ethanol tilbage. Det kan være nødvendigt først at aspirere med en større pipette (f. eks. 1000 μL) og derefter fjerne eventuelle resterende ethanoldråber med en mindre pipette (f. eks. 10 μL).
- Luft-tør pellet i 1 min ved stuetemperatur.
- Reagensglasset fjernes fra magnet stativet, og pellet gensuspenderes i 30 μL nukleasefri vand og inkuleeres i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Placer reaktionsrøret tilbage på magnet stativet og vent, indtil perlerne er helt pelleteret.
- Fjern supernatanten uden at forstyrre pillen og overfør den til et nyt 1,5 mL reagensglas.
-
Tilføjelse af stregkode adaptere ved indlejret PCR
- Konfigurer en 50 μL touchdown-PCR med hot start high-fidelity DNA-Polymerase med 5x reaktionsbuffer og primer set 2 (Se tabel 1). Primers i dette sæt består af en målsekvens specifik region til at tillade binding af PCR produkter genereret i trin 3,2 (inde i primer sæt 1 sekvenser), samt en adapter sekvens, der anvendes som mål i den efterfølgende stregkode PCR reaktion (se punkt 4). Indstil om muligt reaktionen på is eller i en 4 °C kølig blok. Brug 1 μL af det rensede PCR produkt, der er fremstillet i afsnit 3,2 som skabelon.
- Reaktionsblandingen inkubieres i en termo cycler ved hjælp af et indledende Denaturerings trin på 30 s ved 98 °C, efterfulgt af 10 cyklusser med denaturering ved 98 °C i 10 s, primer glødning i 20 s ved 65 °C, hvilket sænker temperaturen med 0,5 °C pr. cyklus og forlængelse i 1 min ved 72 °C. Derefter inkube reaktionen i yderligere 30 cyklusser i 10 s ved 98 °C, 20 s ved 71 °C og 1 min ved 72 °C, efterfulgt af et afsluttende forlængede trin på 5 min ved 72 °C.
- Rengør PCR-produktet med magnetiske perler som beskrevet i afsnit 3,2.
4. barkodning af NPC1 Amplicons
- For hvert PCR-produkt, der genereres i afsnit 3, skal der oprettes en barkodnings-PCR-reaktion i et 0,2 mL reagensglas med 50 μL Taq DNA Polymerase 2x Master Mix (Se tabel over materialer), 2 μl af en af stregkode grunderne fra et PCR-barkodningssæt (Se tabel over materialer og tabel 2) og 1 ΜL renset PCR-produkt fra trin 3.3.2 som skabelon. Der tilsættes 47 μL nuklease frit vand for at opnå et endeligt volumen på 100 μL.
- Reaktionen inkubieres i en termo cycler ved 95 °C i 3 minutter som en Initial denaturering. Kør derefter 15 cyklusser i 15 s ved 95 °C, 15 s ved 62 °C og 1,5 min ved 65 °C. Som en afsluttende forlængelse, inkubere reaktionen ved 65 °C i 5 min.
- Du renser PCR-produktet som beskrevet under 3,2, men brug 100 μl magnetiske perler og elueres i 30 μl nukleasefri vand.
- Hvis det er muligt, kvantificeres prøven ved hjælp af et UV-Spektrofotometer.
5. forberedelse af bibliotek
- Der kombineres en tilsvarende mængde barkodet DNA fra hver prøve til i alt 1 μg DNA i et volumen på 45 μL (om nødvendigt tilsættes nukleasefri vand) i et 0,2 mL reagensglas. Hvis der ikke findes et UV-Spektrofotometer, skal der anvendes lige store mængder af hver prøve. For dA-tailing tilsættes 7 μL end-prep reaktionsbuffer (Se tabel over materialer), 3 μl end-prep enzym mix (Se tabel over materialer), og 5 μl nukleasefri vand. Bland forsigtigt røret.
- Reaktionen inkubieres i 5 min ved 20 °C efterfulgt af 5 min ved 65 °C i en termo cycler.
- Rense reaktionsproduktet som beskrevet i punkt 3,2, men brug 60 μl magnetiske perler og elueres i 25 μl nukleasefri vand.
- Valgfrit: Tag 1 μl for at kvantificere prøvens koncentration ved hjælp af et UV-Spektrofotometer. Det samlede beløb skal være mere end 700 ng.
- Kombiner 22,5 μL renset DNA fra trin 5,3 med 2,5 μL 1D2 adapter (Se tabel over materialer) og 25 μl STUMP/ta ligasemastermix (Se tabel over materialer) i et nyt 1,5 ml DNA-lav bindende reaktions rør, bland forsigtigt ved at svige, og drej kortvarigt Ned. Inkuperer i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Rense reaktionsproduktet som beskrevet i punkt 3,2, men brug 20 μl magnetiske perler, Øg inkubationstid for DNA-binding til 10 min, Udfør to vaske trin med 1 ml ethanol hver, og elueres i 46 μl nukleasefri vand.
- Kombiner 45 μL af reaktionsproduktet fra trin 5,6 med 5 μL stregkode adapter mix (Se tabel over materialer) og 50 μl STUMP/ta ubiquitinligase Master Mix i et DNA-lav bindende reaktions rør. Bland forsigtigt ved at svige og inkube i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Rense reaktionsproduktet som beskrevet i punkt 3,2, men brug 40 μL magnetiske perler, gør to vask trin med 140 μL af ABB buffer (Se tabel over materialer) i stedet for ethanol, resuspender perlerne ved at flimre og pille på en magnetisk rack. Elueret i 15 μL elutions buffer (Se tabel over materialer). Forøg inkubationstiderne for den initiale binding af DNA til perlerne samt for elueringtrinnet til 10 min. Opbevar det resulterende produkt på is eller ved 4 °C indtil brug.
6. kvalitetskontrol af flow Cell
- Foretag en kvalitetskontrol af flowcellen før brug. Til dette formål skal du slutte sekvente Rings enheden til værtscomputeren og åbne softwaren.
- Indsæt en flowcelle (Se tabel over materialer) i sekvente Rings enheden, og vælg flowcelle typen i vælger feltet, og Bekræft ved at klikke på tilgængelig.
- Klik på Kontroller flowcellen nederst på skærmen, og vælg den korrekte flowcelle type.
- Klik på Start test for at starte kvalitets kontrollen. Der kræves mindst 800 aktive nanopmalme i alt, for at flowcellen kan anvendes.
7. indlæsning af flow cellen og start af sekvensering Run
- Åbn dækslet til priming porten ved at skubbe det i urets retning. Indstil en P1000-pipette til 200 μL, og Indsæt spidsen i priming-porten. Juster pipetten til 230 μL, mens du holder spidsen i priming porten, for at trække 20-30 μL buffer og fjerne eventuelle luftbobler.
- I en ny 1,5 mL DNA-Low bindende reaktions slange forberedes priming blandingen ved at kombinere 576 μL RBF buffer (Se tabel over materialer) med 624 μl nukleasefri vand.
- Pipettér forsigtigt 800 μL af det tilberedte priming mix ind i priming porten og vent 5 min. løft prøve portens dæksel, og afpipettér yderligere 200 μL af det tilberedte priming mix i priming porten.
- Der afpipetteres 35 μL RBF-buffer i et nyt, rent 1,5 mL DNA-lavbindende reaktions rør. Bland omhyggeligt LLB-perler (Se tabel over materialer) ved at pipette og tilsæt 25,5 μl af perlerne til RBF-bufferen. Der tilsættes 2,5 μL nuklease frit vand og 12 μL DNA-bibliotek fra trin 5,8 og blandes ved pipettering.
- Der tilsættes 75 μL af prøveblandingen i en langsom drop-mode til strømningscellen via prøve porten.
- Udskift dækslet til prøve porten, Luk priming-porten, og luk låget på sekvente Rings enheden.
- I softwaren skal du bekræfte, at flowcellen stadig er tilgængelig, åbne et nyt eksperiment og konfigurere kørsels parametrene ved at vælge det anvendte kit. Vælg direkte base opkald. Start sekvensering ved at klikke på Start eksperiment. Fortsæt sekvensering, indtil der er indsamlet tilstrækkelige eksperimentelle data.
Representative Results
I et repræsentativt eksperiment for at teste den præsenterede protokol vi ekstraheret RNA fra 10 forskellige blodprøver af fem dyrearter (dvs., 2 individer pr art (ged, får, svin, hund, kvæg)) (tabel 3). RNA-udbyttet og-kvaliteten efter ekstraktion kan variere meget, især på grund af forskelle i håndtering og opbevaring af prøver. I vores repræsentative eksperiment observerede vi RNA-koncentrationer mellem 43 ng og 543 ng pr. μL (tabel 3). Efter forstærkning ved RT-PCR viste gel-analyse af NPC-1 PCR-produkter også forskellige resultater (figur 2) med markant svagere bånd til prøver BC01 og BC02 (begge geder). Disse forskelle skyldtes sandsynligvis forskelle i prøve kvaliteten, selv om forskelle i PCR-effekten på grund af forskelle i primer-binding til NPC1-genet af forskellige arter ikke kan udelukkes. Disse forskelle i udbyttet og/eller forstærknings effektiviteten påvirkede imidlertid ikke det samlede resultat af sekvensering mærkbart. Desuden forekom et ekstra ikke-specifikt PCR-produkt i prøve BC10 (kvæg). I modsætning til sanger sekvensering påvirker sådanne ikke-specifikke produkter ikke negativt resultaterne af nanopmalm sekvensering, da disse læsninger kasseres under kortlægningen af de opnåede læsninger til en referencesekvens som en del af dataanalysen.
Forud for hver sekvens kørsel anbefales det kraftigt, at der foretages en kvalitetskontrol af den strømnings celle, der skal anvendes, med et minimumskrav på 800 samlede porer. I vores repræsentative eksperiment, returnerede denne kvalitetskontrol 1.102 porer til rådighed for sekventering. Da dataene leveres i realtid og kan analyseres med det samme, kan længden af en sekvensering køre justeres for den enkelte ansøgning (dvs. indtil tilstrækkelig sekvensering data er produceret for den ønskede analyse). I vores eksperimenter udføres sekvensering typisk natten over, og i tilfælde af vores repræsentative eksperiment opnåede vi ca. 1.400.000 læsninger under sådan en 14 timer kørsel.
Afhængigt af den type dataanalyse, der skal udføres, kan det være tilrådeligt at behandle kun en delmængde af de opnåede læsninger. I tilfælde af vores repræsentative eksperiment, en under gruppe af 10.000 læsninger blev udvalgt til yderligere analyse. Til dette formål, de fastq filer genereret under sekventering køre blev yderligere behandlet i en Ubuntu 18,04 LTS miljø, og demultiplexed ved hjælp af flexbar v 3.0.3 med parametre optimeret til at demultiplexe af nanopmalm sekvensering data (stregkode-hale-længde 300 , stregkode-fejl-sats 0,2, stregkode-Gap-straf-1)12. Efter demultiplexing, kan læse kortlægning og konsensus generation derefter ske ved hjælp af en række forskellige værktøjer, men en detaljeret diskussion af Bioinformatik aspekt af nanopmalm sekvensering går ud over omfanget af dette manuskript. Men i tilfælde af vores repræsentative resultater, læse kortlægning til en referencesekvens blev udført ved hjælp af Geneious 10.2.3. Af de 10.000 læsninger analyseret, 5.457 viste en længde mellem 1.750 og 2.000 nukleotider, som matcher de forventede størrelser for PCR fragmenter forstærket som en del af vores workflow (1.769 NT, figur 3). Et yderligere højdepunkt i længden fordeling af læsninger blev observeret mellem 250 til 500 nukleotider, som kan tilskrives uspecifikke PCR-produkter. Demultiplexing af læsninger tillod tildeling af 87,6% af læsninger til en af de 10 stregkoder/prøver analyseret (figur 4). Andelen af demultiplexede læsninger for hver stregkode varierede fra 3,4% for stregkode 1 til 16,9% for stregkode 10; men på grund af det samlede store antal læser dette stadig tilladt meningsfuld konsensus opkald med en høj læse dybde selv for disse lavere overflod stregkode datasæt. Kortlægning af de sorterede læsninger til en referencesekvens på NPC1 resulterede i mellem 31,7% (stregkode 2) og 100% (stregkode 7 og 8) for at læse tilknytningen til referencen, hvilket giver en læse dybde på mere end 90 læsninger i enhver position for hver prøve. Dette er så mere end tilstrækkeligt til at tillade sikker konsensus base-Calling med en ubetydelig fejlprocent.
Figur 1: skematisk gengivelse af DNA-sekventering ved hjælp af nanopmalm teknologi. Et enkeltstrenget DNA-molekyle passerer gennem en nanopmalm indlejret i en elektrisk resistent membran, med en helicase regulerer overgangshastigheden. En ionisk strøm passerer samtidig gennem pore og måles kontinuerligt. Modulationer af strømmen forårsaget af nukleotider, der er til stede i pore, detekteres og beregningsmæssigt tilbage-oversat til DNA-streng sekvensen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: amplifikation af PCR-produkter af Niemann-pick C1 fra mRNA. mRNA blev isoleret fra ged (BC01 og 02), får (BC03 og 04), svin (BC05 og 06), hund (BC07 og 08) og kvæg (BC09 og 10). Indlejrede PCR-produkter blev udskilt i en 0,8% agopstået gel i 1x TAE-buffer (fremstillet af 50x TAE-buffer: 242,28 g Tris-base, 57,1 mL iseddike, 100 mL 0,5 M EDTA, dH2O til 1 L, ph justeret til 8,0) for 45 min ved 100 V og farves med Sybr Safe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Læs-længde fordeling af 10.000 læser fra det repræsentative eksperiment. Antallet af læsninger, der er opnået med et givet læse længdeinterval, er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: fordeling af aflæsninger efter demultiplexing. Antallet og procentdelen af demultiplexed (grå) og kortlagte læsninger (sort) for hver stregkode vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: oversigt af de anvendte primer-sæt. Indledende forstærkning af målsekvenser blev udført med primer set 1. Primer set 2 blev derefter brugt til indlejrede amplifikation og adapter addition. Adaptere er angivet med rødt. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel 2: oversigt af stregkode sekvenser. Individuelle stregkoder blev anvendt til at identificere hver serie prøve. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tabel 3: RNA-koncentrationer opnået efter ekstraktion fra blodprøver sekvenseret i det repræsentative eksperiment. RNA-koncentrationerne af to individer fra hver af fem arter er vist, og forholdet mellem den optiske tætheder ved 260/280 Nm og 260/230 nm er angivet. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
I løbet af de sidste to årtier er sekvensering af biologiske prøver blevet et stadigt vigtigere aspekt af undersøgelser inden for en lang række fagområder. Udviklingen af andengenerations sekvente Rings systemer baseret på sekvensering af en tæt vifte af DNA-funktioner ved hjælp af iterativ cyklusser af enzymatisk manipulation og billedbaseret dataindsamling1 har dramatisk øget gennemløb sammenlignet med traditionelle sanger sekventering teknik, og giver mulighed for analyse af flere prøver samt forskellige nukleinsyre arter i en given prøve i parallel4. Men for de fleste af de almindeligt anvendte andengenerations systemer, er kun korte læsninger produceret, og alle platforme er afhængige af følsom, voluminøse, og dyrt udstyr3,4.
I modsætning til andengenerations sekvente Rings platforme er den sekvente Rings anordning, der anvendes i denne protokol, baseret på nanopmalm teknologi. Her passerer et enkeltstrenget nukleinsyre molekyle gennem en nanopmalm, hvilket resulterer i modulation af en ionisk strøm, der også flyder gennem den samme nanopmalm, og som kan måles og tilbage-oversat for at udlede sekvensen af nukleinsyre molekylet. Denne tredje generations sekvente Rings tilgang indebærer en række fordele i forhold til andre tilgange. De vigtigste fordele, der er direkte relateret til det unikke Arbejdsprincip i denne teknologi er den ekstremt lange læse længde produceret (læse længder på op til 8,8 x 105 nukleotider er blevet rapporteret6), evnen til at sekvens ikke kun DNA, men også RNA direkte, som for nylig blev demonstreret for en komplet influenzavirus genom17, og evnen til at analysere data i realtid, som de bliver genereret, som giver mulighed for hurtig metagenomik påvisning af patogener inden for minutter18. Yderligere praktiske fordele er den ekstremt lille størrelse af nanopmalm sekventering enhed, tillader dens anvendelse i ethvert laboratorium eller på marken missioner til fjerntliggende steder19,20, og den lave pris i forhold til andre sekventering Platforme. Med hensyn til løbende omkostninger, der i øjeblikket en ny flowcelle er nødvendig for hver sekvensering køre, hvilket resulterer i omkostninger på omkring $1.100 per løb for flowcelle og bibliotek forberedelse reagenser. Disse omkostninger kan reduceres i nogle tilfælde ved at vaske og genbruge flowcellen, eller ved at barkodning og sekvensering flere prøver i en enkelt kørsel. Desuden er en ny type af flowcelle i øjeblikket bliver beta-testet af et lille antal laboratorier, som vil kræve brug af en flowcelle adapter (kaldet en "flongle"), og bør betydeligt reducere flowcelle pris og dermed driftsomkostninger.
Den største mangel ved nanopmalm sekvensering forbliver dens nøjagtighed, med en enkelt læse nøjagtighed i intervallet 83 til 86%, der rapporteres6,21,22, og de fleste af de unøjagtigheder, der forårsages af indsættelse/sletninger ( indels)5,21. Men, høj læse dybde kan kompensere for disse unøjagtigheder, og en nylig undersøgelse foreslået baseret på teoretiske overvejelser, at en læse dybde på > 10 kan øge den samlede nøjagtighed til > 99,8%21. Ikke desto mindre vil der være behov for yderligere forbedringer af nøjagtigheden, især hvis analysen skal udføres på et enkelt molekyleniveau i stedet for på et konsensus sekvens niveau. Brugen af 1D2 -teknologien som beskrevet i denne protokol, som er baseret på tilføjelsen af 1d2 -og stregkode adaptere (jf. afsnit 5,5), som resulterer i, at begge dele af et enkelt DNA-molekyle sekvenseres af samme nanopmalm, øger læse nøjagtighed, da oplysninger fra begge DNA-tråde kan anvendes til sekvens bestemmelse. Desuden er en løsningsstrategi, der kan forfølges med henblik på at kombinere fordelene ved nanopmalm sekvensering (særlig lang læse længde) med den højere nøjagtighed af andre sekvensering teknologier, at anvende oplysninger om nanopmalm sekvensering som et stillads, hvilket er derefter poleret ved hjælp af sekvensering data fra andre platforme6.
Den mest kritiske faktor for succesen af protokollen præsenteret her er prøve kvalitet, og især mængden og kvaliteten af det ekstraherede RNA. Korrekt opbevaring og hurtig ekstraktion af RNA hjælper med at opnå et passende RNA-udbytte. Brugen af passende blod opsamlings rør tillader opbevaring af blodprøver i op til en måned, men blodpropper kan være et problem, især når prøverne bliver opbevaret ved forhøjede temperaturer, hvilket kan være tilfældet underfelt betingelser. Det andet kritiske trin er amplificeringen af målsekvenser, og især underfelt betingelser fungerer PCR-reaktioner ofte mindre godt end under standard laboratoriebetingelser7. Til dette formål er omhyggelig primer design og optimering altafgørende for at opnå robust forstærkning. Desuden kan indlejrede PCR-tilgange og touchdown-PCR, som anvendes i denne protokol, øge både specificitet og følsomhed af Target-genamplifikation4,7. Faktisk, i vores erfaringer i Liberia og Guinea med denne teknologi indlejrede protokoller var påkrævet underfelt betingelser med feltprøver selv for primer sæt, som tillod forstærkning af mål fra laboratorieprøver og under laboratorieforhold med en enkelt runde af PCR (7 og ikke-udgivne resultater).
I modsætning til disse mere kritiske skridt, bibliotek forberedelse og sekvensering køre i sig selv er temmelig robuste procedurer. Men underfelt forhold kan praktiske spørgsmål såsom tilgængeligheden af visse dele af udstyret være problematiske. For eksempel er et UV-Spektrofotometer nødvendigt for at bestemme DNA-koncentrationerne forud for Biblioteks klargøring af barkodede prøver. Hvis en sådan anordning ikke er tilgængelig underfelt betingelser, kan en tilsvarende mængde af hver prøve ganske enkelt kombineres for at gøre op med den 45 μL, der kræves til Biblioteks tilberedning, idet forskelle i indlagringsmateriale derefter normalt afbødes af den store antal læsninger. På samme måde kan behovet for internetkonnektivitet for sekvensering køre være et problem, selv om grund-kald ikke længere skal udføres online, men kan gøres lokalt; dog, denne nødvendighed kan fjernes under visse omstændigheder af producenten, hvis det kræves.
Sammenfattende giver den præsenterede protokol mulighed for relativt lave omkostninger sekventering på steder uden adgang til traditionelle sekvente Rings udstyr, herunder i fjerntliggende steder. Det kan nemt tilpasses ethvert mål-RNA eller DNA, hvilket gør det muligt for forskerne at besvare talrige biologiske spørgsmål.
Disclosures
TH deltog i Oxford Nanopmalm Technologies (ONT) MinION tidlig adgang program fra 2014 til 2015, og modtog MinION enheder og flow celler til en tidligere undersøgelse 7 udført af National Institutes of Health, USA, gratis eller til reducerede omkostninger . Han blev inviteret af ONT til at præsentere en del af dette arbejde på London Calling 2015 møde i London, UK, og ONT betalt for transport og indkvartering. For det arbejde, der præsenteres i dette manuskript, blev der ikke opnået nogen fordele (f. eks. hardware eller reagenser til reducerede omkostninger, rejsegodtgørelser osv.) fra ONT. AM, KF og RS har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Allison Groseth for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet finansielt af det tyske Forbundsministerium for fødevarer og landbrug (BMEL) på grundlag af en afgørelse truffet af Forbundsrepublikken Tysklands parlament gennem forbundskontoret for landbrug og fødevarer (BLE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK308 | 1D² Sequencing Kit |
| Blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent | Zymo Research | R1150 | DNA/RNA Shield - Blood Collection Tube |
| Blunt/TA ligase master mix | New England Biolabs | M0367S | Blunt/TA Ligase Master Mix |
| DNA-low binding reaction tube | Eppendorf | 30108051 | DNA LoBind Tube |
| DNase buffer and DNase | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
| Flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN105.24 | flow cell R9.4 |
| Hot start high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0493L | Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U) |
| Magnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | Agencourt AMPure XP beads |
| Magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | DynaMag-2 Magnet |
| Nanopore sequencing device | Oxford Nanopore Technologies | - | MinION Mk 1B |
| PCR barcoding kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-PBC001 | PCR Barcoding Kit I (R9) |
| Reverse transcriptase master mix | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
| RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer | Zymo Research | R1151 | Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit |
| Rotating mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | HulaMixer Sample Mixer |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0287S | LongAmp Taq 2x Master Mix |
| Ultra II End-prep kit | New England Biolabs | E7546S | NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul |
| UV spectrophotometer | Implen | - | NanoPhotometer |
| Vacuum manifold | Zymo Research | S7000 | EZ-Vac Vacuum Manifold |
References
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Shendure, J., Lieberman Aiden, E. The expanding scope of DNA sequencing. Nature Biotechnology. 30 (11), 1084-1094 (2012).
- Liu, L., et al. Comparison of next-generation sequencing systems. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 251364 (2012).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in Next-Generation Sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17, 95-115 (2016).
- Lu, H., Giordano, F., Ning, Z. Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (5), 265-279 (2016).
- Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Ebola Outbreak Tool. Emerging Infectious Diseases. 22 (2), 331-334 (2016).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Carette, J. E., et al. Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick C1. Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).
- Ndungo, E., et al. A Single Residue in Ebola Virus Receptor NPC1 Influences Cellular Host Range in Reptiles. mSphere. 1 (2), (2016).
- Martin, S., et al. A genome-wide siRNA screen identifies a druggable host pathway essential for the Ebola virus life cycle. Genome Medicine. 10 (1), 58 (2018).
- Roehr, J. T., Dieterich, C., Reinert, K. Flexbar 3.0 - SIMD and multicore parallelization. Bioinformatics. 33 (18), 2941-2942 (2017).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kielbasa, S. M., Wan, R., Sato, K., Horton, P., Frith, M. C. Adaptive seeds tame genomic sequence comparison. Genome Research. 21 (3), 487-493 (2011).
- Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Research. 19 (14), 4008 (1991).
- Korbie, D. J., Mattick, J. S. Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nature Protocols. 3 (9), 1452-1456 (2008).
- Keller, M. W., et al. Direct RNA Sequencing of the Coding Complete Influenza A Virus Genome. Scientific Reports. 8 (1), 14408 (2018).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Medicine. 7, 99 (2015).
- Castro-Wallace, S. L., et al. Nanopore DNA Sequencing and Genome Assembly on the International Space Station. Scientific Reports. 7 (1), 18022 (2017).
- Goordial, J., et al. In Situ Field Sequencing and Life Detection in Remote (79 degrees 26'N) Canadian High Arctic Permafrost Ice Wedge Microbial Communities. Frontiers in Microbiology. 8, 2594 (2017).
- Runtuwene, L. R., et al. Nanopore sequencing of drug-resistance-associated genes in malaria parasites, Plasmodium falciparum. Scientific Reports. 8 (1), 8286 (2018).
- Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy. Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).
