Summary
Nanopore sekvensering är en ny teknik som möjliggör kostnads effektiv sekvensering i avlägsna platser och resurs fattiga inställningar. Här presenterar vi ett protokoll för sekvensering av mRNAs från helblod som är förenligt med sådana förhållanden.
Abstract
Sekvensering i avlägsna platser och resurs fattiga inställningar innebär unika utmaningar. Nanopore sekvensering kan framgångs rikt användas under sådana förhållanden, och distribuerades till Västafrika under den senaste Ebola virusepidemin, belyser denna möjlighet. Förutom dess praktiska fördelar (låg kostnad, enkel utrustning transport och användning), ger denna teknik också grundläggande fördelar jämfört med andra generationens sekvenserings metoder, särskilt den mycket långa läslängd, förmåga att direkt sekvens Och i real tid till gång till data. RAW Läs noggrannhet är lägre än med andra sekvenseringsplattformar, som representerar den huvudsakliga begränsningen av denna teknik; Detta kan dock delvis mildras av den höga lästa djupet som genereras. Här presenterar vi ett fältkompatibelt protokoll för sekvensering av mRNAs-kodning för Niemann-Pick C1, som är den cellulära receptorn för Ebolavirus. Detta protokoll omfattar utvinning av RNA från djurblod prover, följt av RT-PCR för mål berikning, streckkoder, bibliotek beredning, och sekvensering köra själv, och kan enkelt anpassas för användning med andra DNA eller RNA mål.
Introduction
Sekvensering är ett kraftfullt och viktigt verktyg i biologisk och biomedicinsk forskning. Det möjliggör analys av genom, genetiska variationer, och RNA uttrycks profiler, och därmed spelar en viktig roll i utredningen av människor och djur sjukdomar både1,2. Sanger sekvensering, en av de äldsta metoderna som finns för DNA-sekvensering, används fortfarande rutinmässigt i dag och har varit en hörnsten i molekylärbiologi. Under de senaste 50 åren har denna teknik förbättrats för att uppnå Läs längder på mer än 1 000 NT och en noggrannhet så hög som 99,999%1. Men Sanger sekvensering har också begränsningar. Sekvensering av en större uppsättning prover eller analys av hela genom med denna metod är tids krävande och dyra1,3. Andra generationens (nästa generations) DNA-sekvenseringsmetoder som 454 pyrosekvensering och Illumina-teknik har gjort det möjligt för oss att avsevärt minska den kostnad och arbets börda som krävs för sekvensering under det senaste årtiondet, och har lett till en enorm ökning av mängd biologisk sekvensinformation tillgänglig4. Ändå, individuell sekvensering körs med hjälp av dessa andra generationens teknik är dyra, och sekvensering under fält förhållanden är utmanande, eftersom den nödvändiga utrustningen är skrymmande och bräcklig (liknande Sanger sekvensering enheter), och ofta måste kalibreras och servas av specialutbildad personal. Också, för många av andra generationens teknik Läs längder är ganska begränsad, vilket ofta gör nedströms bioinformatik analys av dessa data utmanande.
Tredje generationens sekvensering med hjälp av fickformat nanopore sekvenserings enheter (se material tabell) kan fungera som ett alternativ till dessa etablerade sekvenseringsplattformar. I dessa enheter passerar en enkelsträngad DNA-eller RNA-molekyl genom en nanopore samtidigt med en jonisk ström som sedan mäts med en sensor (figur 1). Som stranda korsar nanopore, detekteras moduleringen av strömmen vid nukleotider gåvan i pore på en given tid, och beräknings mässigt tillbaka-översatt in i nukleotid ordnar5. På grund av denna operativa princip, nanopore sekvensering tillåter både generering av mycket långa läsningar (nära 1 x 106 nukleotider6) och analys av sekvensering data i real tid. Barcoding är möjligt genom att fästa definierade nukleotidsekvenser till nukleinsyror i ett prov, vilket möjliggör analys av flera prover i en enda sekvenserings körning, vilket ökar prov genom strömningen och sänker per prov kostnader. På grund av deras höga bärbarhet och användar vänlighet, har nanopore sekvenserings anordningar använts framgångs rikt på fältet under den senaste tidens Ebola virus sjukdom epidemi i Västafrika, lyfta fram deras lämplighet för snabb utbyggnad i avlägsna regioner7 , och 8.
Här beskriver vi ett detaljerat fältkompatibelt protokoll för sekvensering av mRNA-kodning för Niemann-Pick C1 (NPC1)-proteinet, som är den obligat inträdes receptorn för filovirus såsom Ebolavirus, och har visats begränsa artens känslighet för dessa virus9,10. Protokollet omfattar extraktion av hela RNA från blodprover, specifik förstärkning av NPC1 mRNA av RT-PCR, streckkoder av prover, förberedelse av biblioteket och sekvensering med en nanopore sekvenseringsenhet. Data analys kan inte diskuteras på grund av utrymmes begränsningar, även om vissa grundläggande riktningar finns i representativa resultat; den intresserade läsaren hänvisas dock till en tidigare publikation11 för en mer detaljerad beskrivning av det arbets flöde vi använt, samt till publikationer av andra12,13,14 för detaljerad information analys verktygen som används i detta arbets flöde.
Protocol
Prover samlades in efter Njala universitets institutionella gransknings nämnd (NUIRB) protokoll nr. IRB00008861/FWA00018924.
1. RNA-extraktion från blod prov
- Samla in 3 mL helblod från de arter som ska analyseras i ett blod uppsamlings rör som är förifyllt med 6 mL av DNA/RNA-stabiliserande reagens (se tabell över material) och blanda genom att Invertera 5 gånger. Förvara blod provet i upp till en månad vid 4 ° c.
- Överför innehållet i blod provs röret till ett 50 mL samlings rör, Tillsätt 120 μL proteinas K och blanda genom att vortexera i 5 s. Inkubera provet i 30 min vid rums temperatur.
- Tillsätt 9 mL isopropanol i blandningen och skaka i 5 s.
- Placera en reservoar på en RNA-reningsanläggning (se material tabell) och placera enheten på ett vakuum rör (se material tabell). Tillsätt prov blandningen i reservoaren. Applicera ett vakuum tills all vätska har passerat genom kolonnen.
- Alternativt, om inget vakuum rör finns tillgängligt, kan blodet passera genom kolonnen i 700 μL portioner genom upprepad centrifugering i 30 s vid 12 000 x g med genomflöde som kasseras mellan centrifugeringsstegen. Detta kommer dock att kräva cirka 26 centrifugeringssteg.
- Placera RNA-reningsanläggningskolonnen i ett samlings rör och tillsätt 400 μL DNA/RNA-prep-buffert (se material tabell). Centrifugera vid 12 000 x g i 30 s och kassera genomflödet.
- Tillsätt 400 μL DNA/RNA-tvättbuffert (se material tabell) till kolonnen, centrifugera vid 12 000 x g i 30 s och kassera genomflödet.
- Blanda 5 μL av DNase I (1 U/μL) (se material tabell) med 75 μl DNA-uppslutnings buffert (se material tabell) och tillsätt blandningen på kolonnen. Inkubera i 15 minuter i rums temperatur.
- Tillsätt 400 μL DNA/RNA-prep-buffert i kolonnen och centrifugera vid 12 000 x g i 30 s. genom att kassera genomflödet.
- Tvätta kolonnen med 700 μL DNA/RNA-tvättbuffert och centrifugera vid 12 000 x g i 30 s. genom att kassera genomflödet.
- Upprepa steg 1,9 med 400 μL av DNA/RNA-tvättbuffert och centrifugera vid 12 000 x g i 2 min för att avlägsna all kvarvarande tvättbuffert och för att torka kolonnen. När du tar bort kolonnen från samlings röret, se till att inte blöta under sidan av kolonnen med bufferten i samlings röret.
-
Placera kolonnen i ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugerör och tillsätt 70 μL nukleasfritt vatten. Inkubera i 1 min vid rums temperatur och Centrifugera i 30 s vid 12 000 x g. Förvara RNA vid-80 ° c tills vidare användning (eller Använd omedelbart).
- Valfritt: För att kvantifiera RNA, ta en alikvot och bestäm koncentrationen med en UV-spektrofotometer (se material tabell).
2. omvänd transkription av NPC1 mRNA till cDNA
- I ett 0,2 mL reaktions rör, tillsätt 8 μL av mallrna (1 PG till 2,5 μg RNA) och 1 μL vardera av 10x DNase buffert och DNase enzym (se tabell över material). Inkubera vid 37 ° c i 2 min. Därefter Centrifugera reaktionen kort och placera den på is.
- Tillsätt 4 μL omvänt transkriptas mastermix (se material tabell) och 6 μl nukleasfritt vatten till reaktions röret och blanda försiktigt. Inkubera reaktionen i en termocykler i 10 min vid 25 ° c (för primer glödgning), följt av 10 min vid 50 ° c (för omvänd transkription av RNA). För att avaktivera enzymet, Inkubera i 5 min vid 85 ° c.
- Överför cDNA till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugerör och förvara vid-80 ° c tills vidare användning (eller Använd omedelbart).
3. amplifiering av NPC1 öppna Läsram
-
Inledande förstärknings steg
- Ställ in en touchdown PCR15,16 för att förstärka NPC1 cDNA med primer set 1 (se tabell 1), med hjälp av en Hot Start High Fidelity DNA-polymeras (se tabell över material) med lämplig reaktionsbuffert i en 50 μL reaktion volym med 1 μL mall. Om möjligt, Ställ in reaktionen på isen eller i en sval 4 ° c block.
- Inkubera reaktionen i en termocykler med ett initialt denatureringssteg på 30 s vid 98 ° c, följt av 10 cykler med denaturering vid 98 ° c i 10 s, primerglödgning i 20 s vid 65 ° c, sänkning av temperaturen med 0,5 ° c per cykel och töjning under 1 min vid 72 ° c. Kör därefter ytterligare 20 cykler med 10 s vid 98 ° c, 20 s vid 60 ° c och 1 min vid 72 ° c, följt av ett slutligt Förlängnings steg på 5 min vid 72 ° c.
-
PCR-rening med magnet pärlor
- Överför 50 μL PCR-produkt till ett 1,5 mL DNA-lågbindande reaktions rör (se material tabell). Omsuspendera magnetiska pärlor (se tabell över material) grundligt genom att vortexa och tillsätt 50 μL pärlor till PCR-reaktionen. Blanda väl. Inkubera provet på en roterande mixer (se material tabell) i 5 min vid rums temperatur (vid 15 rpm).
- Snurra kort provet och placera 1,5 mL mikrocentrifugeringsröret på ett magnet stativ (se tabell över material) för att pelletera magnet pärlorna. Vänta tills supernatanten har blivit helt klarlagt innan du fortsätter med nästa steg.
- Aspirera supernatanten utan att störa pärlpelleten och kassera.
- Pipettera 200 μL av 70% etanol i reaktions röret och inkubera i 30 s. aspirera etanol utan att störa pelleten och kassera. Upprepa för totalt två tvättar. Se till att ingen etanol finns kvar. Det kan vara nödvändigt att först aspirera med en större pipett (t. ex. 1000 μL) och sedan ta bort kvarvarande etanol droppar med en mindre pipett (t. ex. 10 μL).
- Lufttorka pelleten i 1 minut vid rums temperatur.
- Ta bort reaktions röret från magnet hållaren, omsuspendera pelleten i 30 μL nukleasfritt vatten och inkubera i 2 min vid rums temperatur.
- Placera reaktions röret tillbaka på magnet stället och vänta tills pärlorna är helt pelleted.
- Avlägsna supernatanten utan att störa pelleten och överför den till ett nytt 1,5 mL reaktions rör.
-
Tillsats av streckkod adaptrar av kapslade PCR
- Ställ in en 50 μL touchdown PCR med varm start High-Fidelity DNA-polymeras med 5x reaktionsbuffert och primer set 2 (se tabell 1). Primers i denna uppsättning består av en målsekvens-specifik region för att tillåta bindning av PCR-produkter som genereras i steg 3,2 (insidan av primern set 1 sekvenser), samt en adaptersekvens som används som mål i efterföljande Media PCR reaktion (jfr avsnitt 4). Om möjligt, Ställ in reaktionen på isen eller i en sval 4 ° c block. Använd 1 μL av den renade PCR-produkten beredd i avsnitt 3,2 som mall.
- Inkubera reaktions blandningen i en termocykler med ett initialt denatureringssteg på 30 s vid 98 ° c, följt av 10 cykler med denaturering vid 98 ° c i 10 s, primerglödgning i 20 s vid 65 ° c, sänkning av temperaturen med 0,5 ° c per cykel och töjning under 1 min vid 72 ° c. Inkubera därefter reaktionen i ytterligare 30 cykler i 10 s vid 98 ° c, 20 s vid 71 ° c och 1 min vid 72 ° c, följt av ett slutligt Förlängnings steg på 5 min vid 72 ° c.
- Rengör PCR-produkten med magnetiska pärlor enligt beskrivningen i avsnitt 3,2.
4. Barcoding av NPC1 Amplicons
- För varje PCR-produkt som genererats i avsnitt 3, Ställ in en Media PCR-reaktion i ett 0,2 ml reaktions rör med 50 μl av Taq DNA-polymeras 2x mastermix (se tabell över material), 2 μl av en av streckkods primerna från en PCR-streckkod (se tabell över material och tabell 2) och 1 μl renad PCR-produkt från steg 3.3.2 som mall. Tillsätt 47 μL nukleasfritt vatten för att få en slutlig volym på 100 μL.
- Inkubera reaktionen i en termocykler vid 95 ° c i 3 min som en initial denaturering. Kör därefter 15 cykler i 15 s vid 95 ° c, 15 s vid 62 ° c och 1,5 min vid 65 ° c. Som en slutlig förlängning, Inkubera reaktionen vid 65 ° c i 5 min.
- Rena PCR-produkten enligt beskrivningen under 3,2, men Använd 100 μL magnetiska pärlor och eluat i 30 μL nukleasfritt vatten.
- Om möjligt, kvantifiera provet med en UV-spektrofotometer.
5. förberedelse av bibliotek
- Kombinera en lika stor mängd streckkodat DNA från varje prov för totalt 1 μg DNA i en volym på 45 μL (om nödvändigt, tillsätt kärn-fritt vatten) i ett 0,2 mL reaktions rör. Om ingen UV-spektrofotometer finns tillgänglig, Använd lika stora mängder av varje prov. För dA-tailing, tillsätt 7 μL av slutet prep-reaktionsbuffert (se material tabell), 3 μl av enzym blandningen end-prep (se material tabell) och 5 μl nukleasfritt vatten. Blanda försiktigt genom att snärta röret.
- Inkubera reaktionen i 5 min vid 20 ° c, följt av 5 min vid 65 ° c i en termocykler.
- Rena reaktions produkten enligt beskrivningen i avsnitt 3,2, men Använd 60 μL magnetiska pärlor och eluat i 25 μL nukleasfritt vatten.
- Tillval: ta 1 μl för att kvantifiera koncentrationen av provet med en UV-spektrofotometer. Det totala beloppet bör vara mer än 700 ng.
- Kombinera 22,5 μL renat DNA från steg 5,3 med 2,5 μL 1D2-adapter (se material tabell) och 25 μl BLUNT/ta Ligase Master Mix (se tabell över material) i ett nytt 1,5 ml DNA-low bindande reaktions rör, blanda försiktigt genom att snärta och kort snurra Ner. Inkubera i 10 min i rums temperatur.
- Rena reaktions produkten enligt beskrivningen i avsnitt 3,2, men Använd 20 μL magnetiska pärlor, öka inkubations tiden för DNA-bindning till 10 min, utför två tvättsteg med 1 mL etanol vardera och eluera i 46 μL nukleasfritt vatten.
- Kombinera 45 μL av reaktions produkten från steg 5,6 med 5 μL streckkods adapterblandning (se material tabell) och 50 μl av BLUNT/ta Ligase Master mix i ett DNA-lågt bindande reaktions rör. Blanda försiktigt genom att snärta och inkubera i 10 min i rums temperatur.
- Rena reaktions produkten enligt beskrivningen i avsnitt 3,2, men Använd 40 μL magnetiska pärlor, gör två tvättsteg med 140 μL av ABB buffert (se tabell över material) i stället för etanol, omsuspendera pärlorna genom att snärta och pellet på en magnetisk rack. Elute i 15 μL elutionsbuffert (se material tabell). Öka inkubations tiden för den initiala bindningen av DNA till pärlorna samt för elutionssteget till 10 min. förvara den resulterande produkten på is eller vid 4 ° c fram till användning.
6. kvalitets kontroll av Flow cell
- Utför en kvalitets kontroll av flödes cellen före användning. För detta ändamål, Anslut sekvenserings enheten till värddatorn och öppna program varan.
- Infoga en flödes cell (se material tabell) i sekvenseringsenheten och välj flödes cell typ från väljar rutan och bekräfta genom att klicka på tillgänglig.
- Klicka på kontrol lera flöde cell längst ned på skärmen och välj rätt flöde cell typ.
- Klicka på Start test för att starta kvalitets kontrollen. Minst 800 aktiva nanoporer totalt krävs för att flödet cellen ska kunna användas.
7. läsa in flödes cellen och starta Sekvenserings körningen
- Öppna luckan till grundnings porten genom att skjuta den medurs. Ställ en P1000-pipett på 200 μL och för in spetsen i grundnings porten. Justera pipetten till 230 μL samtidigt som spetsen hålls i priming-porten, för att upprätta 20-30 μL buffert och avlägsna eventuella luft bubblor.
- I ett nytt 1,5 mL DNA-low bindande reaktions rör förbereda priming blandningen genom att kombinera 576 μL av RBF buffert (se tabell över material) med 624 μl av nukleasfritt vatten.
- Pipettera försiktigt 800 μL av den beredda grundnings blandningen i grundnings porten och vänta 5 min. lyft prov hamnens kåpa och Pipettera ytterligare 200 μL av den beredda grundnings blandningen i primär porten.
- Pipettera 35 μL RBF-buffert i ett nytt, rent 1,5 mL-lågbindande reaktions rör för DNA. Blanda LLB-pärlor noggrant (se tabell över material) genom att Pipettera och tillsätt 25,5 μl av pärlorna till RBF-bufferten. Tillsätt 2,5 μL nukleasfritt vatten och 12 μL DNA-bibliotek från steg 5,8 och blanda genom pipettering.
- Tillsätt 75 μl av prov blandningen på ett långsamt droppvis sätt till flödes cellen via prov porten.
- Sätt tillbaka luckan till prov porten, Stäng grundnings porten och stäng locket på sekvenseringsenheten.
- I program varan bekräftar du att flödes cellen fortfarande är tillgänglig, öppnar ett nytt experiment och ställer in körnings parametrarna genom att välja det paket som används. Välj Live-bassamtal. Starta sekvenserings körningen genom att klicka på BEGIN experiment. Fortsätt sekvenserings körningen tills tillräckligt många experimentella data samlas in.
Representative Results
I ett representativt experiment för att testa det presenterade protokollet extraherade vi RNA från 10 olika blod prov av fem djur arter (dvs 2 individer per art (get, får, svin, hund, nötkreatur)) (tabell 3). RNA-avkastning och kvalitet efter extraktion kan variera kraftigt, särskilt på grund av skillnader i prov hantering och lagring. I vårt representativa experiment observerade vi RNA-koncentrationer mellan 43 ng och 543 ng per μL (tabell 3). Efter amplifiering av RT-PCR visade också gel analysen av NPC-1 PCR-produkter olika utfall (figur 2), med markant svagare band för proverna BC01 och BC02 (båda get). Dessa skillnader berodde sannolikt på skillnader i prov kvalitet, även om skillnader i PCR-effekt på grund av skillnader i primer bindning till NPC1 genen av olika arter inte kan uteslutas. Dessa skillnader i avkastning och/eller förstärknings effektivitet påverkade dock inte den övergripande sekvenserings resultatet markant. Ytterligare en icke-specifik PCR-produkt förekom i provet BC10 (nötkreatur). I motsats till Sanger sekvensering, påverkar sådana icke-specifika produkter inte negativt resultaten av nanopore sekvensering, eftersom dessa läsningar ignoreras vid mappning av de erhållna läsningar till en referenssekvens som en del av data analysen.
Före varje sekvenserings körning rekommenderas en kvalitets kontroll av den flödes cell som ska användas, med ett minimi krav på 800 totalt antal porer. I vår representativa experiment, denna kvalitets kontroll returnerade 1 102 porer tillgängliga för sekvensering. Eftersom data tillhandahålls i real tid och kan analyseras omedelbart, kan längden på en sekvenserings körning justeras för den enskilda applikationen (dvs. tills tillräcklig sekvenserings data produceras för den önskade analysen). I våra experiment, sekvensering körningar utförs vanligt vis över en natt, och i fallet med vår representativa experiment vi fick cirka 1 400 000 läsningar under en sådan 14 h springa.
Beroende på vilken typ av data analys som ska utföras, kan det vara tillrådligt att bearbeta endast en delmängd av de erhållna läsningar. När det gäller vårt representativa experiment valdes en delmängd av 10 000 läsningar ut för vidare analys. För detta ändamål fastq filer som genereras under sekvensering köra vidarebearbetas i en Ubuntu 18,04 LTS miljö, och demultiplexed med FlexBar v 3.0.3 med parametrar optimerade för demultiplexning av nanopore sekvensering data (streckkod-svans-längd 300 , streckkod-error-rate 0,2, streckkod-gap-påföljd-1)12. Efter demultiplexing, läsa kart läggning och konsensus generation kan sedan göras med hjälp av ett antal olika verktyg, men en detaljerad diskussion om bioinformatik aspekten av nanopore sekvensering går utöver omfattningen av detta manuskript. Men i fråga om våra representativa resultat, Läs mappning till en referenssekvens utfördes med hjälp av Genious 10.2.3. Av de 10 000 läsningar analyseras, 5 457 visade en längd mellan 1 750 och 2 000 nukleotider, som matchar de förväntade storlekarna för PCR-fragment förstärks som en del av vårt arbets flöde (1 769 NT, figur 3). En extra topp i längden fördelningen av läsningar observerades mellan 250 till 500 nukleotider, som kan hänföras till ospecifika PCR-produkter. Demultiplexing av läser tillåtet tilldelningen av 87,6% av läser till en av de 10 streckkoderna/samplar analyserat (figur 4). Andelen demultiplexed läsningar för varje streckkod varierade från 3,4% för streckkod 1 till 16,9% för streckkod 10; men på grund av det totala stora antalet läsningar detta fortfarande tillåtet meningsfullt samförstånd ringer med en hög Läs djup även för dessa lägre överflöd streckkod DataSet. Faktum är att kart läggning av de sorterade läsningar till en referenssekvens av NPC1 resulterade i mellan 31,7% (streckkod 2) och 100% (streckkod 7 och 8) av läser mappning till referens, vilket ger ett Läs djup på mer än 90 läser vid varje position för varje prov. Detta är då mer än tillräckligt för att möjliggöra en säker konsensus bas-samtal med en försumbar fel frekvens.
Figur 1: Schematisk representation av DNA-sekvensering med nanopore-teknik. En enkelsträngad DNA-molekyl passerar genom en nanopore inbäddad i ett elektriskt resistent membran, med en helicase som reglerar över gångs hastigheten. En jonisk ström passerar samtidigt genom porerna och mäts kontinuerligt. Modulationer av strömmen som orsakas av nucleotidesen som är närvarande i pore, upptäcks, och beräknings mässigt baksida-översatt in i nucleotiden ordnar av DNAEN strandar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: amplifiering av PCR-produkter av Niemann-Pick C1 från mRNA. mRNA isolerades från get (BC01 och 02), får (BC03 och 04), svin (BC05 och 06), hund (BC07 och 08) och nötkreatur (BC09 och 10). Kapslade PCR-produkter separerades i en 0,8% AGA ros gel i 1x Tae buffert (beredd från 50x Tae buffert: 242,28 g av tris bas, 57,1 ml koncentrerad ättiksyra, 100 ml 0,5 M EDTA, DH2O till 1 L, pH justerad till 8,0) för 45 min vid 100 V och färgas med SYBR Safe. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Läs längd fördelning av 10 000 läsningar från representativa experiment. Antalet läsningar som erhålls med ett givet Läs längds intervall indikeras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: fördelning av läsningar efter demultiplexering. Antalet och procent andelen demultiplexed (grå) och mappade läsningar (svart) för varje streckkod visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: översikt över de primersatser som används. Initial amplifiering av målsekvenser utfördes med primer set 1. Primer set 2 användes sedan för kapslad förstärkning och adaptertillsats. Adaptrar indikeras med rött. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Tabell 2: översikt över streckkodsekvenser. Enskilda streckkoder användes för att identifiera varje sekvenserade provet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Tabell 3: RNA-koncentrationer erhållna efter extraktion från blod prov sekvenserade i det representativa experimentet. RNA-koncentrationerna av två individer från var och en av fem arter visas, och förhållandet mellan den optiska densiteter vid 260/280 nm och 260/230 nm indikeras. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Under de senaste två decennierna har sekvensering av biologiska prover blivit en allt viktigare aspekt av studier inom ett brett spektrum av ämnes områden. Utvecklingen av andra generationens sekvenserings system baserade på sekvensering av ett tätt spektrum av DNA-funktioner med hjälp av iterativa cykler av enzymatisk manipulation och bildbaserad data insamling1 har dramatiskt ökat genomflöde jämfört med traditionella Sanger sekvenserings teknik, och möjliggör analys av flera prover samt olika nukleinsyraarter i ett givet prov i parallell4. Men för de flesta av de vanligaste andra generationens system, endast korta läsningar produceras, och alla plattformar förlitar sig på känslig, skrymmande och dyr utrustning3,4.
I motsats till andra generationens sekvenseringsplattformar baseras sekvenseringsenheten som används i detta protokoll på nanopore-teknik. Här passerar en enkelsträngad nukleinsyra molekyl genom en nanopore, vilket resulterar i modulering av en jonisk ström som också flyter genom samma nanopore, och som kan mätas och tillbaka-översatt att härleda sekvensen av nukleinsyra molekylen. Denna tredje generationens sekvenserings metod förmedlar ett antal fördelar jämfört med andra metoder. De främsta fördelarna som är direkt relaterade till den unika arbets principen för denna teknik är den extremt långa läslängd som produceras (Läs längder upp till 8,8 x 105 nukleotider har rapporter ATS6), förmågan att SEKVENERA inte bara DNA utan också RNA direkt, som nyligen visades för ett komplett influensa virus genom17, och förmågan att analysera data i real tid som de genereras, vilket möjliggör snabb metagenomik detektion av patogener inom minuter18. Ytterligare praktiska fördelar är den extremt lilla storleken på nanopore sekvenserings anordningen, vilket gör att den kan användas i alla laboratorier eller på fält uppdrag till avlägsna platser19,20, och det låga priset i jämförelse med andra sekvensering Plattformar. När det gäller drifts kostnader, för närvarande en ny flöde cell krävs för varje sekvenserings körning, vilket resulterar i kostnader på cirka $1 100 per körning för flödet cell och bibliotek förberedelse reagenser. Dessa kostnader kan i vissa fall reduceras genom tvättning och åter användning av flödes cellen, eller genom att streckkoder och sekvensering av flera prover i en enda körning. Dessutom är en ny typ av flöde cell för närvarande beta-testad av ett litet antal laboratorier, som kommer att kräva användning av ett flöde cell adapter (kallas en "flongle"), och bör avsevärt minska flödet cell pris och därmed löpande kostnader.
Den stora bristen av nanopore sekvensering förblir dess noggrannhet, med enda Läs noggrannhet i intervallet 83 till 86% rapporteras6,21,22, och de flesta av de felaktigheter som orsakas av införande/borttagningar ( indels)5,21. Högt läsdjup kan dock kompensera för dessa felaktigheter, och en nyligen genomförda studie föreslog utifrån teoretiska överväganden att ett Läs djup på > 10 kan öka den totala noggrannheten till > 99,8%21. Det kommer dock att behövas ytterligare förbättringar av noggrannheten, särskilt om analysen ska utföras på en enda molekyl nivå snarare än på en konsensus-sekvensnivå. Användningen av 1D2 -teknik som beskrivs i detta protokoll, som bygger på tillsats av 1d2 och streckkod adaptrar (jfr avsnitt 5,5) som resulterar i båda delarna av en enda DNA-molekyl som sekvenseras av samma nanopore, ökar läsa noggrannhet eftersom information från båda DNA-strängarna kan användas för sekvensbestämning. Ytterligare, en lösning strategi som kan eftersträvas för att kombinera fördelarna med nanopore sekvensering (särskilt lång Läs längd) med högre noggrannhet av andra sekvenserings teknik är att använda nanopore sekvensering information som en byggnads ställning, vilket är sedan poleras med sekvenserings data från andra plattformar6.
Den mest kritiska faktorn för framgången med det protokoll som presenteras här är prov kvalitet, och särskilt mängden och kvaliteten på det extraherade RNA. Korrekt förvaring och snabb utvinning av RNA hjälp att uppnå en adekvat RNA avkastning. Användning av lämpliga blod uppsamlings rör tillåter lagring av blodprover för upp till en månad, men blodkoagulering kan vara ett problem, särskilt när proverna lagras vid förhöjda temperaturer, vilket kan vara fallet under fält förhållanden. Det andra kritiska steget är amplifiering av målsekvenser, och särskilt under fält förhållanden PCR reaktioner ofta utföra mindre bra än under normala laboratorie förhållanden7. För detta ändamål är noggrann primer design och optimering avgörande för att uppnå robust förstärkning. Dessutom kan kapslade PCR-metoder och touchdown PCR, som används i detta protokoll, öka både specificitet och känslighet för målgenamplifiering4,7. I vår erfarenhet i Liberia och Guinea med denna teknik, var det nödvändigt med kapslade protokoll under fält förhållanden med fältprover även för primersatser som tillät förstärkning av mål från laboratorieprover och under laboratorie förhållanden med en enda omgång PCR (7 och opublicerade resultat).
I kontrast till dessa mer kritiska kliver, är Arkiv förberedelsen och sekvenserings körningen sig själv ganska robusta tillvägagångs sätt. Men under fält förhållanden kan praktiska frågor som till gång till vissa delar av utrustningen vara problematiska. Till exempel behövs en UV-spektrofotometer för att bestämma DNA-koncentrationer före bibliotekets beredning av streckkodade prover. Om en sådan anordning inte är tillgänglig under fält förhållanden, kan dock en lika stor volym av varje prov enkelt kombineras för att kompensera för de 45 μL som krävs för att förbereda biblioteket, med skillnader i prov ingångs material som vanligt vis mildras av den stora antal läsningar. På samma sätt kan behovet av Internet anslutning för sekvenserings körningen vara ett problem, även om bas anropande inte längre måste utföras online men kan göras lokalt. emellertid, denna nödvändighet kan avlägsnas under vissa omständigheter av tillverkaren om det behövs.
Sammanfattnings vis tillåter det presenterade protokollet relativt låg kostnads sekvensering på platser utan till gång till traditionell sekvenserings utrustning, inklusive i avlägsna platser. Det kan lätt anpassas till alla mål-RNA eller DNA, vilket gör det möjligt för forskare att besvara många biologiska frågor.
Disclosures
TH deltog i Oxford Nanopore Technologies (ONT) MinION tidig till gång program från 2014 till 2015, och fick MinION enheter och flöde celler för en tidigare studie 7 utförs av National Institute of Health, USA, gratis eller till sänkta kostnader . Han blev inbjuden av ONT att presentera en del av detta arbete vid London Calling 2015 möte i London, Storbritannien, och ONT betalas för transport och boende. För det arbete som presenteras i detta manuskript erhölls inga fördelar (t. ex. hård vara eller reagens till reducerat pris, rese ersättningar etc.) från ONT. AM, KF och RS har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Allison Groseth för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes ekonomiskt av det tyska federala ministeriet för livsmedel och jordbruk (BMEL) baserat på ett beslut av parlamentet i Förbundsrepubliken Tyskland genom det federala kontoret för jordbruk och livsmedel (BLE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK308 | 1D² Sequencing Kit |
| Blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent | Zymo Research | R1150 | DNA/RNA Shield - Blood Collection Tube |
| Blunt/TA ligase master mix | New England Biolabs | M0367S | Blunt/TA Ligase Master Mix |
| DNA-low binding reaction tube | Eppendorf | 30108051 | DNA LoBind Tube |
| DNase buffer and DNase | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
| Flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN105.24 | flow cell R9.4 |
| Hot start high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0493L | Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U) |
| Magnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | Agencourt AMPure XP beads |
| Magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | DynaMag-2 Magnet |
| Nanopore sequencing device | Oxford Nanopore Technologies | - | MinION Mk 1B |
| PCR barcoding kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-PBC001 | PCR Barcoding Kit I (R9) |
| Reverse transcriptase master mix | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
| RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer | Zymo Research | R1151 | Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit |
| Rotating mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | HulaMixer Sample Mixer |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0287S | LongAmp Taq 2x Master Mix |
| Ultra II End-prep kit | New England Biolabs | E7546S | NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul |
| UV spectrophotometer | Implen | - | NanoPhotometer |
| Vacuum manifold | Zymo Research | S7000 | EZ-Vac Vacuum Manifold |
References
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Shendure, J., Lieberman Aiden, E. The expanding scope of DNA sequencing. Nature Biotechnology. 30 (11), 1084-1094 (2012).
- Liu, L., et al. Comparison of next-generation sequencing systems. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 251364 (2012).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in Next-Generation Sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17, 95-115 (2016).
- Lu, H., Giordano, F., Ning, Z. Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (5), 265-279 (2016).
- Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Ebola Outbreak Tool. Emerging Infectious Diseases. 22 (2), 331-334 (2016).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Carette, J. E., et al. Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick C1. Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).
- Ndungo, E., et al. A Single Residue in Ebola Virus Receptor NPC1 Influences Cellular Host Range in Reptiles. mSphere. 1 (2), (2016).
- Martin, S., et al. A genome-wide siRNA screen identifies a druggable host pathway essential for the Ebola virus life cycle. Genome Medicine. 10 (1), 58 (2018).
- Roehr, J. T., Dieterich, C., Reinert, K. Flexbar 3.0 - SIMD and multicore parallelization. Bioinformatics. 33 (18), 2941-2942 (2017).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kielbasa, S. M., Wan, R., Sato, K., Horton, P., Frith, M. C. Adaptive seeds tame genomic sequence comparison. Genome Research. 21 (3), 487-493 (2011).
- Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Research. 19 (14), 4008 (1991).
- Korbie, D. J., Mattick, J. S. Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nature Protocols. 3 (9), 1452-1456 (2008).
- Keller, M. W., et al. Direct RNA Sequencing of the Coding Complete Influenza A Virus Genome. Scientific Reports. 8 (1), 14408 (2018).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Medicine. 7, 99 (2015).
- Castro-Wallace, S. L., et al. Nanopore DNA Sequencing and Genome Assembly on the International Space Station. Scientific Reports. 7 (1), 18022 (2017).
- Goordial, J., et al. In Situ Field Sequencing and Life Detection in Remote (79 degrees 26'N) Canadian High Arctic Permafrost Ice Wedge Microbial Communities. Frontiers in Microbiology. 8, 2594 (2017).
- Runtuwene, L. R., et al. Nanopore sequencing of drug-resistance-associated genes in malaria parasites, Plasmodium falciparum. Scientific Reports. 8 (1), 8286 (2018).
- Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy. Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).
