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Genetics

पूरे रक्त से mRNA के अनुक्रमण नैनोकोर अनुक्रमण का उपयोग

Published: June 3, 2019 doi: 10.3791/59377
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, 2Institute of Novel and Emerging Infectious Diseases, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Department of Animal Science, Njala University

Summary

Nanopore अनुक्रमण एक उपंयास प्रौद्योगिकी है कि दूरदराज के स्थानों और संसाधन गरीब सेटिंग्स में लागत प्रभावी अनुक्रमण की अनुमति देता है । यहाँ, हम पूरी रक्त कि ऐसी स्थितियों के साथ संगत है से mRNAs के अनुक्रमण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

दूरस्थ स्थानों और संसाधन-गरीब सेटिंग्स में Sequencing अद्वितीय चुनौतियां प्रस्तुत करता है । ऐसी परिस्थितियों में नैनोकोर अनुक्रमण का सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है, और हाल ही में इबोला वायरस महामारी के दौरान पश्चिम अफ्रीका में तैनात किया गया था, इस संभावना को रेखांकित करते हुए । अपने व्यावहारिक लाभ के अलावा (कम लागत, उपकरण परिवहन और उपयोग की आसानी), इस तकनीक को भी दूसरी पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण पर मौलिक लाभ प्रदान करता है, विशेष रूप से बहुत लंबे समय तक पढ़ने की लंबाई, सीधे अनुक्रम करने की क्षमता आरएनए, और डेटा की वास्तविक समय उपलब्धता । रॉ पढ़ें सटीकता अंय अनुक्रमण प्लेटफार्मों, जो इस तकनीक की मुख्य सीमा का प्रतिनिधित्व करता है के साथ तुलना में कम है; हालांकि, यह आंशिक रूप से उत्पन्न उच्च पठन गहराई से शमन कर सकते हैं । यहाँ, हम Niemann-पिक C1, जो ebolaviruses के लिए सेलुलर रिसेप्टर है के लिए एन्कोडिंग mRNAs के अनुक्रमण के लिए एक क्षेत्र संगत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल में पशु रक्त नमूनों से शाही सेना का निष्कर्षण शामिल है, लक्ष्य संवर्धन, बारकोडिंग, पुस्तकालय तैयार करने के लिए आरटी-पीसीआर द्वारा पीछा किया, और अनुक्रमण ही चलाने के लिए, और आसानी से अन्य डीएनए या आरएनए लक्ष्यों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित कर सकते हैं ।

Introduction

अनुक्रमण जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक शक्तिशाली और महत्वपूर्ण उपकरण है । यह जीनोम, आनुवंशिक विविधताओं, और आरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल के विश्लेषण की अनुमति देता है, और इस तरह1,2एक जैसे मानव और पशु रोगों की जांच में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । , डीएनए अनुक्रमण के लिए उपलब्ध सबसे पुराने तरीकों में से एक sanger अनुक्रमण, अभी भी नियमित रूप से इस दिन के लिए प्रयोग किया जाता है और आणविक जीव विज्ञान के एक कोने पत्थर किया गया है । पिछले ५० वर्षों में, इस तकनीक को पढ़ने की लंबाई को प्राप्त करने के लिए सुधार किया गया है १,००० से अधिक nt और एक सटीकता ९९.९९९%1के रूप में उच्च के रूप में । हालांकि, सेंगर सीक्वेसिंग की भी सीमाएं हैं । नमूनों का एक बड़ा सेट या इस विधि के साथ पूरे जीनोम के विश्लेषण के अनुक्रमण समय लेने वाली और महंगी1,3है । दूसरी पीढ़ी (अगली पीढ़ी) डीएनए अनुक्रमण विधियों जैसे ४५४ pyrosequencing और Illumina प्रौद्योगिकी के रूप में हमें काफी लागत और पिछले एक दशक में अनुक्रमण के लिए आवश्यक कार्यभार को कम करने की अनुमति दी है, और में एक जबरदस्त वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया है जैविक अनुक्रम जानकारी उपलब्ध की राशि4। फिर भी, व्यक्तिगत अनुक्रमण इन दूसरी पीढ़ी के प्रौद्योगिकियों का उपयोग कर चलाता है महंगे हैं, और क्षेत्र की स्थितियों के तहत अनुक्रमण चुनौतीपूर्ण है, के रूप में आवश्यक उपकरण भारी और नाजुक है (Sanger अनुक्रमण उपकरणों के समान), और अक्सर कैलिब्रेट किया और विशेष रूप से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा सेवित । इसके अलावा, दूसरी पीढ़ी के कई प्रौद्योगिकियों के लिए पढ़ें-लंबाई बल्कि सीमित है, जो अक्सर इन डेटा चुनौतीपूर्ण के बहाव bioसूचनाविज्ञान विश्लेषण करता है ।

पॉकेट-आकार नैनोकोर अनुक्रमण उपकरणों का उपयोग कर तीसरी पीढ़ी के अनुक्रमण ( सामग्री तालिकादेखें) इन स्थापित sequencing प्लेटफार्मों के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते हैं । इन युक्तियों में एक एकल-असहाय डीएनए या आरएनए अणु नैनोपोर से एक साथ एक आयनिक धारा के साथ गुजरता है जिसे फिर एक संवेदक द्वारा मापा जाता है (चित्र 1) । जैसे-किनारा नैनोपोर को traverses करता है, किसी भी दिए गए समय में ताकना में मौजूद न्यूकोटाइड द्वारा वर्तमान के मॉडुलन का पता लगाया जाता है, और कंप्यूटेट्युट को न्यूकोटाइडअनुक्रम में वापस-अनुवादित किया जाता है । इस परिचालनात्मक सिद्धांत के कारण, नैनोकोर अनुक्रमण बहुत लंबी reads की दोनों पीढ़ी (1 x 106 न्यूनाभिकोटाइड6के करीब) और वास्तविक समय में अनुक्रमण डेटा के विश्लेषण की अनुमति देता है । बारकोडिंग एक नमूना है, जो एक एकल अनुक्रमण चलाने में कई नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देता है, इस प्रकार नमूना throughput बढ़ रही है और प्रति नमूना लागत को कम करने में न्यूमिक एसिड के लिए परिभाषित न्यूकोटाइड दृश्यों संलग्न द्वारा संभव है. उनकी उच्च पोर्टेबिलिटी और उपयोग में आसानी के कारण, पश्चिम अफ्रीका में हाल ही में इबोला वायरस रोग महामारी के दौरान नैनोकोर सीक्वेंसिंग उपकरणों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, जिससे सुदूर क्षेत्रों में त्वरित तैनाती के लिए उनकी उपयुक्तता पर प्रकाश डाला गया है7 , ८।

यहाँ, हम एक विस्तृत क्षेत्र-संगत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए mRNA एंकोडिंग के अनुक्रमण Niemann-लेने C1 (NPC1) प्रोटीन है, जो अबाध्यकारी प्रवेश रिसेप्टर ऐसे ebolaviruses के रूप में filoवायरसों के लिए है, और प्रजातियों के लिए संवेदनशीलता को सीमित करने के लिए दिखाया गया है ये वायरस9,10। प्रोटोकॉल रक्त नमूनों से पूरे शाही सेना के निष्कर्षण शामिल है, आरटी द्वारा NPC1 mRNA के विशिष्ट प्रवर्धन-पीसीआर, नमूनों की बारकोडिंग, पुस्तकालय तैयारी और एक नैनोकोर अनुक्रमण डिवाइस के साथ अनुक्रमण । डेटा विश्लेषण अंतरिक्ष सीमाओं के कारण चर्चा नहीं की जा सकती, हालांकि कुछ बुनियादी दिशाओं प्रतिनिधि परिणामों में प्रदान की जाती हैं; हालांकि, रुचि पाठक एक पिछले प्रकाशन11 के लिए एक और अधिक विस्तृत विवरण के लिए कार्यप्रवाह हम इस्तेमाल किया, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दूसरों के प्रकाशन के लिए भेजा है12,13,14 विस्तृत जानकारी के लिए इस वर्कफ़्लो में उपयोग किए गए विश्लेषण उपकरणों के बारे में ।

Protocol

नजला विश्वविद्यालय सांस्थानिक समीक्षा बोर्ड (एनयूआईआरबी) के नयाचार सं IRB00008861/FWA00018924.

1. रक्त के नमूनों से आरएनए निष्कर्षण

  1. एक रक्त संग्रह में विश्लेषण किया जा करने के लिए प्रजातियों से पूरे रक्त के 3 मिलीलीटर एकत्र डीएनए के 6 मिलीलीटर के साथ प्रेफिल्लेड सरिंज/ 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए रक्त का नमूना स्टोर ।
  2. एक ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रक्त संग्रह ट्यूब की सामग्री स्थानांतरण, proteinase कश्मीर के १२० μL जोड़ें, और 5 एस के लिए vortexing द्वारा मिश्रण कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूने सेते ।
  3. 5 एस के लिए मिश्रण और भंवर के लिए isopropanol के 9 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. एक जलाशय को आरएनए शुद्धीकरण स्पिन कॉलम पर रखें ( सामग्रियों की तालिकादेखें) और असेंबली को एक वैक्यूम कई गुना पर रखें ( सामग्री की तालिकादेखें) । जलाशय में नमूना मिश्रण जोड़ें । एक वैक्यूम लागू करें जब तक सभी तरल स्तंभ के माध्यम से पारित कर दिया गया है ।
  5. वैकल्पिक रूप से, यदि कोई वैक्यूम कई गुना उपलब्ध है, रक्त ७०० μL भागों में कॉलम के माध्यम से १२,००० एक्स जी में 30 एस के लिए दोहराया केंद्रायन के बीच प्रवाह के माध्यम से छोड़ दिया द्वारा पारित किया जा सकता है । हालांकि, यह लगभग 26 अपकेंद्रण चरणों की आवश्यकता होगी ।
  6. एक संग्रह ट्यूब में आरएनए शुद्धि स्पिन कॉलम प्लेस और जोड़ने के४०० ΜL डीएनए/ 30 एस के लिए १२,००० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  7. डीएनए/आरएनए वॉश बफर के ४०० μL जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) कॉलम, 30 एस के लिए १२,००० एक्स जी पर केंद्राचयक और प्रवाह के माध्यम से त्यागने ।
  8. मिश्रण के 5 μL DNase मैं (1 U/μL) ( सामग्री तालिकादेखें) के साथ डीएनए पाचन बफर के ७५ Μl ( सामग्री तालिकादेखें) और स्तंभ पर मिश्रण जोड़ें । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  9. डीएनए की ४०० μL जोड़ें/इस प्रवाह के माध्यम से त्यागें के लिए कॉलम और १२,००० एक्स जी पर केंद्राचयक के लिए स्तंभ के लिए आरएनए तैयारी बफर ।
  10. डीएनए/आरएनए वॉश बफर के ७०० μL के साथ कॉलम और 30 एस के लिए १२,००० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र धो प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  11. डीएनए के ४०० μL के साथ कदम १.९/आरएनए धोने बफर और 2 मिनट के लिए १२,००० x g पर अपकेंद्रित्र सभी अवशिष्ट धोने बफर हटाने के लिए और स्तंभ सूखी । संग्रह ट्यूब से स्तंभ निकालते समय, सुनिश्चित करें कि संग्रह ट्यूब में बफ़र के साथ स्तंभ के नीचे गीला करने के लिए नहीं है ।
  12. कॉलम को एक नए १.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें और इसमें ७० μL के न्यूक्लेस-फ्री पानी जोड़ें । कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेक्यूबेट और 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र १२,००० x gपर आगे का उपयोग करें जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्टोर (या तुरंत उपयोग) ।
    1. वैकल्पिक: आरएनए की गणना करने के लिए, एक aliquot लेने के लिए और एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एकाग्रता निर्धारित ( सामग्री की मेजदेखें).

2. NPC1 mRNA के cDNA में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

  1. एक ०.२ मिलीलीटर की अभिक्रिया नली में 8-उस् टेम्पलेट आरएनए (1 पीजी से २.५-ग्राम आरएनए) तथा 10x डीनेज बफर तथा डीनेज एंजाइम ( सामग्री तालिकादेखें) में से प्रत्येक का 1-l-एल जोड़ें । 2 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । बाद में, प्रतिक्रिया अपकेंद्रित्र संक्षेप और बर्फ पर जगह है ।
  2. प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए 4 μL रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस मास्टर मिक्स ( सामग्री की तालिकादेखें) और 6 μl के nuclease मुक्त पानी के जोड़ें और धीरे मिश्रण । एक थर्मोसाइक्लर में 25 डिग्री सेल्सियस (प्राइमर एनीलिंग के लिए) पर 10 मिनट के लिए, इसके बाद ५० डिग्री सेल्सियस (आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए) में प्रतिक्रिया को सेते हैं । एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए, ८५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  3. एक नए १.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब और स्टोर करने के लिए cDNA स्थानांतरण-८० ° c आगे का उपयोग करें (या तुरंत उपयोग) तक ।

3. NPC1 खुला पढ़ने के फ्रेम के प्रवर्धन

  1. आरंभिक प्रवर्धन सोपान
    1. एक टचडाउन पीसीआर15,16 सेट प्राइमर सेट 1 के साथ NPC1 cdna बढ़ाना करने के लिए ( तालिका 1देखें), एक गर्म शुरू उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें) एक ५० μl प्रतिक्रिया में उपयुक्त प्रतिक्रिया बफर के साथ 1 μL टेम्पलेट के साथ वॉल्यूम । यदि संभव हो तो, बर्फ पर या एक 4 डिग्री सेल्सियस शांत ब्लॉक में प्रतिक्रिया की स्थापना की ।
    2. इस अभिक्रिया को थर्मोसाइक्लर में ९८ ° ब् पर 30 े के प्रारंभिक विकर्तीकरण चरण के साथ, इसके बाद 10 चक्रों के लिए ९८ ° c पर विकृतीकरण के साथ दस चक्र, ६५ ° c पर 20 एस के लिए प्राइमर एनीलिंग, तापमान को ०.५ ° c प्रति चक्र द्वारा कम करना, और ७२ ° c पर 1 मिनट के लिए बढ़ाव । बाद में, 10 एस के साथ एक अतिरिक्त 20 चक्र ९८ ° c, 20 एस पर ६० ° c, और 1 मिनट में ७२ ° c, और उसके बाद एक अंतिम बढ़ाव 5 मिनट में ७२ डिग्री सेल्सियस ।
  2. पीसीआर चुंबकीय मोतियों का उपयोग शुद्धि
    1. पीसीआर उत्पाद के ५० μL एक १.५ मिलीलीटर डीएनए में स्थानांतरण-कम बाध्यकारी रिएक्शन ट्यूब ( सामग्री तालिकादेखें) । Resuspend चुंबकीय मोती ( सामग्री की तालिकादेखें) अच्छी तरह से vortexing द्वारा और पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए ५० μl मोती जोड़ें । अच्छी तरह मिलाएं । कमरे के तापमान पर (15 rpm) पर 5 मिनट के लिए एक घूर्णन मिक्सर ( सामग्री की तालिकादेखें) पर नमूना सेते ।
    2. संक्षेप में नमूना नीचे स्पिन और एक चुंबकीय रैक पर १.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब जगह ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए गोली चुंबकीय मोती । Supernatant पूरी तरह से अगले कदम के साथ जारी रखने से पहले स्पष्ट किया गया है जब तक रुको ।
    3. मनका गोली परेशान और त्यागने के बिना supernatant महाप्राण ।
    4. Pipette २०० μL की प्रतिक्रिया ट्यूब में ७०% इथेनॉल और 30 के लिए इनक्यूबेट गोली और त्यागने परेशान बिना इथेनॉल Aspirate । दो washes की कुल के लिए दोहराएं । सुनिश्चित करें कि कोई एथेनॉल नहीं बचा है । यह एक बड़ा पिपेट (जैसे, १००० μl) के साथ पहले महाप्राण करने के लिए आवश्यक हो सकता है, और फिर एक छोटे पिपेट (जैसे, 10 μl) के साथ किसी भी शेष इथेनॉल बूंदों को दूर करने के लिए ।
    5. हवा-कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए गोली सूखी ।
    6. चुंबकीय रैक से रिएक्शन ट्यूब निकालें, गोली के 30 μL के nuclease मुक्त पानी में और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट resuspend ।
    7. प्रतिक्रिया ट्यूब चुंबकीय रैक पर वापस प्लेस और मोती पूरी तरह से pelleted कर रहे है जब तक रुको ।
    8. गोली से परेशान बिना supernatant निकालें और यह एक नई १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  3. नेस्टेड पीसीआर द्वारा बारकोड एडाप्टर के अलावा
    1. 5 एक्स रिएक्शन बफर और प्राइमर सेट 2 के साथ गर्म शुरू उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ के साथ एक ५० μl टचडाउन पीसीआर सेट करें ( तालिका 1देखें) । इस सेट में primers एक लक्ष्य अनुक्रम-विशिष्ट क्षेत्र से मिलकर (प्राइमर सेट 1 दृश्यों के अंदर) चरण ३.२ में उत्पंन पीसीआर उत्पादों के बंधन की अनुमति के लिए, साथ ही साथ एक एडाप्टर अनुक्रम है कि बाद में बारकोडिंग पीसीआर प्रतिक्रिया (cf. धारा 4) में लक्ष्य के रूप में प्रयोग किया जाता है । यदि संभव हो तो, बर्फ पर या एक 4 डिग्री सेल्सियस शांत ब्लॉक में प्रतिक्रिया की स्थापना की । टेंपलेट के रूप में अनुभाग ३.२ में तैयार की गई शुद्ध पीसीआर उत्पाद की 1 μL का उपयोग करें ।
    2. ९८ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के प्रारंभिक विकृतीकरण कदम का उपयोग करते हुए एक थर्मोसाइक्लर में रिएक्शन मिक्स, 10 के लिए ९८ डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के साथ 10 चक्रों के बाद, ६५ डिग्री सेल्सियस पर 20 एस के लिए प्राइमर अनीलन, प्रति चक्र ०.५ डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम करने , और ७२ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए बढ़ाव । तदनंतर, 10 े के लिए एक और 30 चक्रों के लिए अभिक्रिया को ९८ ° ब्, 20 े पर ७१ ° ब् तथा 1 मि पर ७२ ° ब् पर, तथा उसके बाद ७२ ° ब् पर 5 मि का अंतिम दीर्घीकरण चरण ।
    3. धारा ३.२ में वर्णित के रूप में चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर पीसीआर उत्पाद को साफ करें ।

4. NPC1 Amplicons की बारकोडिंग

  1. धारा 3 में उत्पन्न प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के लिए, एक ०.२ मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब में एक बारकोडिंग पीसीआर रिएक्शन सेट अप का उपयोग करते हुए ५० μL का प्रयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिकादेखें), एक पीसीआर बारकोडिंग किट से बारकोड प्राइमर्स में से एक के 2 μl ( सामग्री तालिका देखें और तालिका 2), और चरण 3.3.2 से शुद्ध पीसीआर उत्पाद के 1 μl टेम्पलेट के रूप में । १०० μL की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए nuclease मुक्त पानी की ४७ μL जोड़ें ।
  2. एक थर्मोसाइक्लर में अभिक्रिया को ९५ ° ब् पर 3 मिनट के लिए प्रारंभिक विकरण के रूप में सेते हैं । बाद में 15 चक्रों को ९५ ° c पर, 15 s को ६२ ° c पर और १.५ मिनट पर ६५ ° c पर चलाएँ । अंतिम दीर्घीकरण के रूप में, अभिक्रिया को 5 मिनट के लिए ६५ ° ब् पर सेते ।
  3. ३.२ के तहत वर्णित के रूप में पीसीआर उत्पाद शुद्ध, लेकिन १०० के चुंबकीय मोतियों और elute का उपयोग करें nuclease मुक्त पानी के 30 μL ।
  4. यदि संभव हो तो, एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर नमूना बताना.

5. पुस्तकालय तैयारी

  1. प्रत्येक नमूने से ४५ μl की मात्रा में डीएनए के कुल 1 माइक्रोग्राम के लिए एक समान मात्रा में बारकोडेड डीएनए का मिश्रण (यदि आवश्यक हो, तो एक ०.२ मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब में न्यूक्टेस-मुक्त पानी जोड़ें) । कोई यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर उपलब्ध है, तो प्रत्येक नमूने के बराबर मात्रा का उपयोग करें. डीए-टेलिंग के लिए, अंत-prep प्रतिक्रिया बफर के 7 μL जोड़ें ( सामग्रियों की तालिकादेखें), अंतिम-तैयारी एंजाइम मिक्स के 3 Μl ( सामग्री की तालिकादेखें), और न्यूक्लेज-मुक्त पानी के 5 μl । ट्यूब flicking द्वारा धीरे मिक्स ।
  2. एक थर्मोसाइक्लर में ६५ ° c पर 5 मिनट के बाद 20 ° c पर 5 मि के लिए अभिक्रिया को सेते हैं ।
  3. धारा ३.२ में वर्णित अभिक्रिया उत्पाद को शुद्ध करें, लेकिन 25 μL ऑफ न्यूमेरेज-फ्री वॉटर में ६० μL चुंबकीय मोतियों और ऐरुट का उपयोग करें ।
  4. वैकल्पिक: एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर नमूने की एकाग्रता की मात्रा को निर्धारित करने के लिए 1 μl ले. कुल राशि ७०० एनजी से अधिक होनी चाहिए ।
  5. 1 D2 एडाप्टर के २.५ μL के साथ चरण ५.३ से शुद्ध डीएनए के २२.५ μL का मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें) और कुंद के 25 μl/टा ligase मास्टर मिक्स ( सामग्री तालिकादेखें) एक नया १.५ एमएल डीएनए-कम बाध्यकारी प्रतिक्रिया ट्यूब में, flicking द्वारा धीरे मिश्रण, और संक्षेप स्पिन नीचे. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  6. धारा ३.२ में वर्णित अभिक्रिया उत्पाद को शुद्ध करें, लेकिन चुंबकीय मोतियों के 20 μL का उपयोग करते हैं, 10 मिनट के लिए डीएनए बाइंडिंग के लिए ऊष्मायन समय में वृद्धि, एक इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ दो धोने के कदम प्रदर्शन, और elute में न्यूक्लेज मुक्त पानी की ४६ μL ।
  7. एक डीएनए कम बाध्यकारी प्रतिक्रिया ट्यूब में चरण ५.६ से प्रतिक्रिया उत्पाद के ४५ μL बारकोड एडाप्टर मिश्रण के 5 μL के साथ मिश्रण ( सामग्री तालिकादेखें) और कुंद के ५० μl/ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए flicking और सेते द्वारा धीरे मिक्स ।
  8. ३.२ खंड में वर्णित के रूप में प्रतिक्रिया उत्पाद शुद्ध, लेकिन चुंबकीय मोतियों की ४० μL का उपयोग करें, दो धोने के कदम के साथ १४० μL ABB बफर के ( तालिका सामग्रीदेखें) इथेनॉल के बजाय, एक चुंबकीय रैक पर flicking और गोली से मोतियों को फिर से निलंबित । Elute के 15 μL में elute बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) । डीएनए के मोती के लिए प्रारंभिक बंधन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षालन चरण के लिए 10 मिनट के लिए ऊष्मायन समय बढ़ाएं । परिणामी उत्पाद को बर्फ पर या 4 ° c पर उपयोग तक संग्रहीत करें ।

6. फ्लो सेल की गुणवत्ता की जांच

  1. उपयोग करने से पहले प्रवाह कक्ष पर गुणवत्ता जांच करें । यह अंत करने के लिए, sequencing डिवाइस होस्ट कंप्यूटर से कनेक्ट करें और सॉफ़्टवेयर खोलें ।
  2. एक फ्लो सेल ( सामग्री की तालिकादेखें) अनुक्रमण डिवाइस में डालें और चयनकर्ता बॉक्स से प्रवाह सेल प्रकार का चयन करें और उपलब्धक्लिक करके पुष्टि करें ।
  3. स्क्रीन के निचले भाग में प्रवाह कक्ष जांचें क्लिक करें और सही प्रवाह कक्ष प्रकार चुनें ।
  4. गुणवत्ता जांच प्रारंभ करने के लिए परीक्षण प्रारंभ करेंक्लिक करें । कुल में ८०० सक्रिय नैनोपोर्स की एक ंयूनतम प्रवाह सेल प्रयोग करने योग्य होने के लिए आवश्यक है ।

7. फ्लो सेल लोड हो रहा है और अनुक्रमण चलाने शुरू

  1. यह एक घड़ी की दिशा में फिसलने से भड़काना बंदरगाह कवर खोलें । २०० μl करने के लिए एक P1000 पिपेट सेट और भड़काना बंदरगाह में टिप डालने । 20-30 μl बफर आकर्षित और किसी भी हवा के बुलबुले को दूर करने, जबकि भड़काना बंदरगाह में टिप रखते हुए, २३० μl करने के लिए पिपेट समायोजित करें ।
  2. एक नया १.५ मिलीलीटर डीएनए-कम बाध्यकारी प्रतिक्रिया ट्यूब में RBF बफर के ५७६ μL के संयोजन के द्वारा कण्ठ मिश्रण तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ ६२४ μl के nuclease मुक्त पानी ।
  3. ध्यान से पिपेट ८०० μl के तैयार भड़काना मिश्रण में भड़काना बंदरगाह और 5 मिनट प्रतीक्षा करें नमूना बंदरगाह कवर लिफ्ट, और पिपेट तैयार भड़काना के एक अतिरिक्त २०० μl को भड़काना बंदरगाह में मिश्रण ।
  4. Pipette ३५ μL RBF बफर के एक नए, स्वच्छ १.५ मिलीलीटर डीएनए कम बाध्यकारी प्रतिक्रिया ट्यूब में । अच्छी तरह से मिक्स एलएलबी मोती pipetting द्वारा ( सामग्री की तालिकादेखें) और rbf बफर को मोतियों की २५.५ μl जोड़ें । २.५ μL nuclease-मुक्त पानी और डीएनए पुस्तकालय के चरण ५.८ से 12 μL जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण ।
  5. नमूना बंदरगाह के माध्यम से प्रवाह सेल के लिए एक धीमी बिंदुश: फैशन में नमूना मिश्रण के ७५ μl जोड़ें ।
  6. नमूना पोर्ट आवरण को प्रतिस्थापित करें, भड़काना पोर्ट बंद करें, और sequencing डिवाइस का लिड बंद करें ।
  7. सॉफ़्टवेयर के भीतर, प्रवाह कक्ष अभी भी उपलब्ध है की पुष्टि करें, एक नया प्रयोग खोलें, और उपयोग किट का चयन करके रन पैरामीटर सेट करें । लाइव आधार-कॉलिंग का चयन करें. Experimentप्रारंभ करें क्लिक करके sequencing चलाएँ शुरू । पर्याप्त प्रयोगात्मक डेटा एकत्रित किया जाता है जब तक कि sequencing चलाएँ जारी रखें ।

Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए एक प्रतिनिधि प्रयोग में हमने पाँच पशु प्रजातियों के 10 विभिन्न रक्त नमूनों से आरएनए निकाला (यानी, प्रजातियों के प्रति 2 व्यक्ति (बकरी, भेड़, सूअर, कुत्ता, मवेशी)) (तालिका 3). आरएनए पैदावार और गुणवत्ता के बाद निष्कर्षण व्यापक रूप से भिंन हो सकते हैं, विशेष रूप से नमूना हैंडलिंग और भंडारण में मतभेदों के कारण । हमारे प्रतिनिधि प्रयोग में, हम ४३ एनजी और ५४३ ng प्रति μL (तालिका 3) के बीच शाही सेना सांद्रता मनाया । इसके अलावा, आरटी-पीसीआर द्वारा प्रवर्धन के बाद, एनपीसी-1 पीसीआर-उत्पादों के जेल विश्लेषण ने विभिन्न परिणाम दिखाए (चित्रा 2), नमूनों BC01 और BC02 (दोनों बकरी) के लिए स्पष्ट रूप से कमजोर बैंड के साथ । इन मतभेदों को सबसे अधिक संभावना नमूना गुणवत्ता में अंतर के कारण किया गया, यद्यपि पीसीआर की प्रभावकारिता में अंतर के कारण प्राइमर अलग प्रजातियों के NPC1 जीन के लिए बाध्यकारी में मतभेद बाहर नहीं किया जा सकता है । तथापि, उपज और/या प्रवर्धन दक्षता में इन भिन्नताओं ने समग्र अनुक्रमण परिणाम को स्पष्ट रूप से प्रभावित नहीं किया है । इसके अलावा, एक अतिरिक्त गैर विशिष्ट पीसीआर उत्पाद नमूना BC10 (पशु) में हुई । सांगर अनुक्रमण करने के लिए इसके विपरीत, ऐसे गैर-विशिष्ट उत्पादों नकारात्मक नैनोकोर अनुक्रमण के परिणामों को प्रभावित नहीं करते हैं, के रूप में इन पढ़ता डेटा विश्लेषण के भाग के रूप में एक संदर्भ अनुक्रम करने के लिए प्राप्त पढ़ता की मैपिंग के दौरान छोड़ दिए जाते हैं ।

प्रत्येक अनुक्रमण चलाने से पहले, प्रवाह सेल का उपयोग किया जा करने के लिए एक गुणवत्ता की जांच की दृढ़ता से सिफारिश की है, ८०० कुल pores की एक ंयूनतम आवश्यकता के साथ । हमारे प्रतिनिधि प्रयोग में, इस गुणवत्ता की जांच वापस १,१०२ अनुक्रमण के लिए उपलब्ध pores । के बाद से डेटा वास्तविक समय में प्रदान की जाती है और तुरंत विश्लेषण किया जा सकता है, एक अनुक्रमण चलाने की लंबाई व्यक्तिगत आवेदन के लिए समायोजित किया जा सकता है (यानी, जब तक पर्याप्त अनुक्रमण डेटा वांछित विश्लेषण के लिए उत्पादन किया है) । हमारे प्रयोगों में, अनुक्रमण चलाता है आमतौर पर रातोंरात प्रदर्शन किया, और हमारे प्रतिनिधि प्रयोग हम प्राप्त लगभग १,४००,००० के मामले में इस तरह के एक 14 घंटे के दौरान पढ़ता है ।

किया जा करने के लिए डेटा विश्लेषण के प्रकार पर निर्भर करते हुए, यह केवल प्राप्त किए गए reads का एक सबसेट को संसाधित करने के लिए उचित हो सकता है । हमारे प्रतिनिधि प्रयोग के मामले में, १०,००० पढ़ता का एक सबसेट आगे के विश्लेषण के लिए चुना गया था । इस अंत करने के लिए, अनुक्रमण चलाने के दौरान उत्पंन fastq फ़ाइलों को आगे एक Ubuntu १८.०४ LTS वातावरण में संसाधित थे, और नैनोकोर अनुक्रमण डेटा (बारकोड-पूंछ-लंबाई ३०० के demultiplexed के लिए अनुकूलित मापदंडों के साथ flexbar v 3.0.3 का उपयोग , बारकोड-त्रुटि-दर ०.२, बारकोड-गैप-पेनल्टी-1)12। विकुलिंग के बाद, पठन मानचित्रण और आम सहमति पीढ़ी तो विभिंन उपकरणों के एक नंबर का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन नैनोकोर अनुक्रमण के bioसूचनापहलू की एक विस्तृत चर्चा इस पांडुलिपि के दायरे से परे चला जाता है । हालांकि, हमारे प्रतिनिधि परिणामों के मामले में, एक संदर्भ अनुक्रम करने के लिए मैपिंग पढ़ें Geneious 10.2.3 का उपयोग किया गया था । १०,००० का विश्लेषण किया, ५,४५७ के बीच एक लंबाई दिखाया १,७५० और २,००० न्यूकोटाइड, जो हमारे कार्यप्रवाह के भाग के रूप में परिलक्षित पीसीआर टुकड़े के लिए अपेक्षित आकार से मेल खाता है (१,७६९ nt, चित्रा 3). २५० से ५०० न्यूकोटाइडों के बीच, जो कि अविशिष्ट पीसीआर उत्पादों के लिए उत्तरदायी हो सकते हैं, reads के लम्बाई वितरण में एक अतिरिक्त शिखर देखा गया । पढ़ता का demultiplexing 10 बारकोड में से एक को पढ़ता है की ८७.६% के असाइनमेंट की अनुमति/नमूने का विश्लेषण (चित्रा 4). Demultiplexed के अनुपात में प्रत्येक बारकोड के लिए पढ़ता है ३.४% बारकोड के लिए 1 से १६.९% बारकोड के लिए 10; हालांकि, कुल मिलाकर बड़ी संख्या में पढ़ता है यह अभी भी सार्थक आम सहमति के साथ बुला भी इन कम बहुतायत बारकोड datasets के लिए एक उच्च पढ़ा गहराई की अनुमति दी । वास्तव में, NPC1 के एक संदर्भ अनुक्रम के लिए छांटे गए पढ़ता की मैपिंग के परिणामस्वरूप ३१.७% (बारकोड 2) और १००% (बारकोड 7 और 8) के बीच में संदर्भ के लिए मैपिंग पढ़ता है, एक पढ़ने की गहराई देने से अधिक ९० पढ़ता है प्रत्येक नमूने के लिए किसी भी स्थिति में । यह तो पर्याप्त से अधिक के लिए एक नगण्य त्रुटि दर के साथ विश्वास आम सहमति आधार कॉलिंग की अनुमति है ।

Figure 1
चित्र 1: नैनोकोर तकनीक का उपयोग करके डीएनए अनुक्रमण का योजनाबद्ध निरूपण । एक एकल-फंसे डीएनए अणु एक नैनोकोर के माध्यम से गुजरता है जो एक विद्युत्रोधी झिल्ली में एम्बेडेड होता है, जिसमें संक्रमण की गति को विनियमित करने वाला हेलिलेज होता है । एक ईओण वर्तमान एक साथ ताकना के माध्यम से गुजरता है और लगातार मापा जाता है । ताकना में उपस्थित न्यूकोटाइडों द्वारा उत्पन्न वर्तमान के मॉड्यूनों का पता लगाया जाता है और कंप्यूटायत से डीएनए रज्जुक के न्यूकोटाइड अनुक्रम में वापस अनूदित किया जाता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: निमैन-पिकअप सी1 के एमआरएनए से पीसीआर उत्पादों का प्रवर्धन । mRNA बकरी (BC01 और 02), भेड़ (BC03 और 04), सूअर (BC05 और 06), कुत्ता (BC07 और 08), और पशु (BC09 और 10) से अलग था । नेस्टेड पीसीआर उत्पादों 1x TAE बफर में एक ०.८% एगेरोस जेल में अलग किया गया (50x TAE बफर से तैयार: Tris आधार के २४२.२८ जी, हिमनदों एसिटिक एसिड के ५७.१ मिलीलीटर, ०.५ एम EDTA के १०० मिलीलीटर, डीएच2ओ के लिए 1 एल, पीएच ८.० के लिए समायोजित) ४५ वी और के साथ दाग Sybr सुरक्षित । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:१०,००० के पठन लंबाई वितरण प्रतिनिधि प्रयोग से पढ़ता है. दी गई पठन लंबाई अंतराल वाले reads की संख्या दर्शाई गई है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: डिअल्टीप्लेसिंग के बाद पढ़ता का वितरण. प्रत्येक बारकोड के लिए डेमुटिप्लेड (ग्रे) और मैप्ड पढ़ता (ब्लैक) की संख्या और प्रतिशत दिखाया जाता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: उपयोग किए गए प्राइमर सेट का ओवरव्यू । लक्ष्य दृश्यों का प्रारंभिक प्रवर्धन प्राइमर सेट 1 के साथ किया गया था । प्राइमर सेट 2 तब नेस्टेड प्रवर्धन और एडाप्टर के अलावा के लिए इस्तेमाल किया गया था । एडेप्टर लाल रंग में दर्शाई गई हैं । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 2: बारकोड दृश्यों का ओवरव्यू. प्रत्येक अनुक्रम नमूने की पहचान करने के लिए व्यक्तिगत बारकोड का उपयोग किया गया । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 3: आरएनए सांद्रता रक्त नमूनों से निष्कर्षण के बाद प्राप्त प्रतिनिधि प्रयोग में sequenced । पाँच प्रजातियों में से प्रत्येक से दो व्यक्तियों के शाही सेना सांद्रता दिखाया जाता है, और 260/280 एनएम और 260/230 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व का अनुपात संकेत कर रहे हैं । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

पिछले दो दशकों के दौरान, जैविक नमूनों की सीक्वेंसिंग विषय क्षेत्रों की विस्तृत श्रृंखला में अध्ययन का एक उत्तरोत्तर महत्वपूर्ण पहलू बन गया है । डीएनए सुविधाओं के एक घने सरणी के अनुक्रमण पर आधारित दूसरी पीढ़ी के अनुक्रमण प्रणालियों के विकास एंजाइमी हेरफेर और छवि आधारित डेटा अधिग्रहण के पुनराकर्षक चक्र का उपयोग कर नाटकीय रूप से throughput की तुलना में वृद्धि हुई है पारंपरिक sanger अनुक्रमण तकनीक, और समानांतर4में एक दिए गए नमूने में कई नमूनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभिंन न्यूक्लिक एसिड प्रजातियों के विश्लेषण की अनुमति देता है । हालांकि, आमतौर पर इस्तेमाल किया दूसरी पीढ़ी के सिस्टम के अधिकांश के लिए, केवल लघु पढ़ता है उत्पादित कर रहे हैं, और सभी प्लेटफार्मों संवेदनशील, भारी, और महंगे उपकरण3,4पर भरोसा करते हैं ।

दूसरी पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्मों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अनुक्रमण डिवाइस नैनोपोर प्रौद्योगिकी पर आधारित है । यहाँ एक एकल-असहाय न्यूइक अम्ल अणु नैनोकोर के माध्यम से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप आयनिक धारा का मॉडुलन होता है, जो उसी नैनोपोर के माध्यम से प्रवाहित होता है, और जिसे मापा जा सकता है और न्यूकॉलिक अम्ल अणु के अनुक्रम का अनुमान लगाने के लिए वापस अनूदित किया जाता है । यह तीसरी पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण अंय दृष्टिकोण से अधिक लाभ की एक संख्या प्रदान करता है । मुख्य लाभ है कि सीधे इस प्रौद्योगिकी के अद्वितीय काम कर रहे सिद्धांत से संबंधित है बहुत लंबे समय तक पढ़ने की लंबाई का उत्पादन कर रहे है (८.८ इसके अलावा आरएनए सीधे, जो हाल ही में एक पूर्ण इंफ्लूएंजा वायरस जीनोम के लिए प्रदर्शन किया गया था17, और वास्तविक समय में डेटा का विश्लेषण करने की क्षमता के रूप में वे उत्पंन किया जा रहा है, जो18मिनट के भीतर रोगजनकों की तेजी से metagenomics पता लगाने की अनुमति देता है । अतिरिक्त व्यावहारिक लाभ नैनोकोर अनुक्रमण डिवाइस के अत्यंत छोटे आकार के हैं, किसी भी प्रयोगशाला में या दूरदराज के स्थानों के लिए क्षेत्र मिशन पर इसके उपयोग की अनुमति19,20, और अन्य अनुक्रमण की तुलना में कम कीमत प्लेटफार्मों. चल रहे लागत के संदर्भ में, वर्तमान में एक नया प्रवाह सेल प्रत्येक अनुक्रमण चलाने के लिए आवश्यक है, जो प्रवाह सेल और पुस्तकालय तैयारी अभिकर्मकों के लिए प्रति रन के बारे में $१,१०० की लागत में परिणाम है । इन लागत को धोने और प्रवाह सेल reusing द्वारा कुछ मामलों में कम किया जा सकता है, या बारकोडिंग और एक ही रन में एकाधिक नमूनों अनुक्रमण द्वारा । इसके अलावा, प्रवाह सेल के एक उपंयास प्रकार वर्तमान में किया जा रहा है बीटा-प्रयोगशालाओं की एक छोटी संख्या है, जो एक प्रवाह सेल अनुकूलक के उपयोग की आवश्यकता होगी द्वारा परीक्षण (कहा जाता है एक "flongle"), और काफी प्रवाह सेल मूल्य कम करना चाहिए और इस तरह की लागत चल रहा है ।

नैनोकोर अनुक्रमण की प्रमुख कमी अपनी सटीकता बनी हुई है, ८३ से ८६% की श्रेणी में एक पढ़ने की शुद्धता के साथ6,21,22की रिपोर्ट की जा रही है, और inaccuracies के अधिकांश प्रविष्टि/ indels)5,21। हालांकि, उच्च पढ़ा गहराई इन अशुद्धियों के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं, और एक ताजा अध्ययन सैद्धांतिक विचार के आधार पर सुझाव दिया कि > 10 की एक पढ़ने की गहराई समग्र सटीकता > 99.8%21वृद्धि हो सकती है । फिर भी, सटीकता में और सुधार की आवश्यकता होगी, विशेष रूप से यदि विश्लेषण एक अणु स्तर पर नहीं बल्कि एक आम सहमति अनुक्रम स्तर पर किया जाना है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 1D2 प्रौद्योगिकी का उपयोग, जो 1 डी2 और बारकोड एडेप्टर (cf. धारा ५.५) के अलावा एक ही डीएनए अणु के दोनों किस्में में परिणाम एक ही नैनोकोर द्वारा sequenced किया जा रहा है के आधार पर है, बढ़ता पढ़ने सटीकता दोनों डीएनए किस्में से सूचना के बाद से अनुक्रम निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, एक workaround रणनीति है कि क्रम में अंय अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के उच्च सटीकता के साथ नैनोपोर अनुक्रमण (विशेष रूप से लंबे समय से पढ़ने की लंबाई) के लाभ गठबंधन के लिए एक पाड़, जो है के रूप में नैनोकोर अनुक्रमण जानकारी का उपयोग करने के लिए पीछा किया जा सकता है तब अंय प्लेटफॉर्म्स6से sequencing डेटा का उपयोग करके पॉलिश ।

प्रोटोकॉल की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक यहां प्रस्तुत नमूना गुणवत्ता, और विशेष रूप से राशि और निकाले गए शाही सेना की गुणवत्ता है । आरएनए का उचित भंडारण और शीघ्र निष्कर्षण एक पर्याप्त आरएनए उपज प्राप्त करने में मदद करते हैं । उपयुक्त रक्त संग्रह ट्यूबों के उपयोग के लिए एक महीने के लिए रक्त के नमूनों के भंडारण की अनुमति देता है, लेकिन रक्त के थक्के एक मुद्दा हो सकता है, विशेष रूप से जब नमूने ऊंचा तापमान है, जो क्षेत्र की स्थितियों के तहत मामला हो सकता है पर संग्रहीत किया जा रहा है । दूसरा महत्वपूर्ण कदम लक्ष्य अनुक्रम के प्रवर्धन है, और विशेष रूप से क्षेत्र की स्थिति के तहत पीसीआर प्रतिक्रियाओं अक्सर कम अच्छी तरह से मानक प्रयोगशाला की स्थिति7के तहत प्रदर्शन । इस उद्देश्य के लिए, सावधान प्राइमर डिजाइन और अनुकूलन मजबूत प्रवर्धन प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है । इसके अतिरिक्त, नेस्टेड पीसीआर दृष्टिकोण और टचडाउन पीसीआर, के रूप में इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया, दोनों विशिष्टता और लक्ष्य जीन प्रवर्धन4,7की संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं । वास्तव में, इस प्रौद्योगिकी के साथ लाइबेरिया और गिनी में हमारे अनुभव में नेस्टेड प्रोटोकॉल क्षेत्र के नमूनों के साथ क्षेत्र की स्थिति के तहत भी प्राइमर सेट जो प्रयोगशाला के नमूनों से लक्ष्य के प्रवर्धन की अनुमति दी और प्रयोगशाला के साथ शर्तों के तहत आवश्यक थे पीसीआर के एक दौर (7 और अप्रकाशित परिणाम) ।

इन अधिक महत्वपूर्ण कदम के विपरीत, पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण चलाने के बजाय मजबूत प्रक्रियाओं रहे हैं । हालांकि, क्षेत्र परिस्थितियों के तहत व्यावहारिक मुद्दों जैसे उपकरणों के कुछ टुकड़ों की उपलब्धता समस्याग्रस्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए डीएनए सांद्रता निर्धारित करने से पहले की जरूरत है पुस्तकालय barcoded नमूनों की तैयारी । हालांकि, इस तरह के एक उपकरण क्षेत्र की स्थिति के तहत उपलब्ध नहीं होना चाहिए, प्रत्येक नमूने का एक समान मात्रा बस को ४५ μl पुस्तकालय तैयारी के लिए आवश्यक बनाने के लिए संयुक्त किया जा सकता है, नमूना इनपुट सामग्री में मतभेदों के साथ तो आम तौर पर बड़े द्वारा शमन किया जा रहा reads की संख्या । इसी तरह, अनुक्रमण चलाने के लिए इंटरनेट कनेक्टिविटी की आवश्यकता एक मुद्दा हो सकता है, भले ही आधार-कॉलिंग अब ऑनलाइन प्रदर्शन किया है, लेकिन स्थानीय रूप से किया जा सकता है; हालांकि जरूरत पड़ने पर निर्माता द्वारा कुछ परिस्थितियों में इस अनिवार्यता को दूर किया जा सकता है ।

संक्षेप में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल दूरदराज के स्थानों में सहित पारंपरिक अनुक्रमण उपकरण, के लिए कोई उपयोग के साथ स्थानों में अपेक्षाकृत कम लागत अनुक्रमण की अनुमति देता है. यह आसानी से किसी भी लक्ष्य आरएनए या डीएनए के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, इस प्रकार शोधकर्ताओं कई जैविक सवालों का जवाब देने के लिए अनुमति ।

Disclosures

वें ऑक्सफोर्ड नैनोकोर टेक्नोलॉजीज में भाग लिया (ONT) मिनियन जल्दी से २०१४ तक पहुंच कार्यक्रम २०१५, और मिनियन उपकरणों और एक पिछले अध्ययन 7 स्वास्थ्य, संयुक्त राज्य अमेरिका, नि: शुल्क के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रदर्शन के लिए और प्रवाह कोशिकाओं प्राप्त कम लागत पर . वह ONT लंदन, ब्रिटेन में २०१५ की बैठक बुला रही है कि काम का हिस्सा वर्तमान के लिए फोन किया था, और ONT परिवहन और आवास के लिए payed । इस पांडुलिपि में प्रस्तुत काम के लिए, कोई लाभ नहीं (जैसे हार्डवेयर या कम लागत पर अभिकर्मक, यात्रा प्रतिपूर्ति आदि) ONT से प्राप्त किया गया । एएम, केएफ और आरएस का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एलीसन Groseth धंयवाद । इस काम को आर्थिक रूप से जर्मन संघीय मंत्रालय के खाद्य और कृषि (BMEL) संघीय कृषि और खाद्य (BLE) के लिए कार्यालय के माध्यम से संघीय गणराज्य की संसद के एक निर्णय के आधार पर द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads Oxford Nanopore Technologies SQK-LSK308 1D² Sequencing Kit
Blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent Zymo Research R1150 DNA/RNA Shield - Blood Collection Tube
Blunt/TA ligase master mix New England Biolabs M0367S Blunt/TA Ligase Master Mix
DNA-low binding reaction tube Eppendorf 30108051 DNA LoBind Tube
DNase buffer and DNase ThermoFisher Scientific 11766050 SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme
Flow cell Oxford Nanopore Technologies FLO-MIN105.24 flow cell R9.4
Hot start high fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0493L Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U)
Magnetic beads Beckman Coulter A63881 Agencourt AMPure XP beads
Magnetic rack ThermoFisher Scientific 12321D DynaMag-2 Magnet
Nanopore sequencing device Oxford Nanopore Technologies - MinION Mk 1B
PCR barcoding kit Oxford Nanopore Technologies EXP-PBC001 PCR Barcoding Kit I (R9)
Reverse transcriptase master mix ThermoFisher Scientific 11766050 SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme
RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer Zymo Research R1151 Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit
Rotating mixer ThermoFisher Scientific 15920D HulaMixer Sample Mixer
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0287S LongAmp Taq 2x Master Mix
Ultra II End-prep kit New England Biolabs E7546S NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul
UV spectrophotometer Implen - NanoPhotometer
Vacuum manifold Zymo Research S7000 EZ-Vac Vacuum Manifold

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References

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Mueller, A., Fischer, K., Suluku, R., Hoenen, T. Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing. J. Vis. Exp. (148), e59377, doi:10.3791/59377 (2019).

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