Summary
Germinant receptor protein kluster i 'germinosomes' i det inre membranet av Bacillus subtilis sporer. Vi beskriver ett protokoll med super upplösning Mikroskopi och fluorescerande reporter proteiner visualisera germinosomes. Protokollet identifierar också spore inre membranet domäner som är prioriterat fläckade membran färgämnet FM4-64.
Abstract
Den lilla storleken på sporer och relativt låga överflödet av grobarhet proteiner, orsaka svårigheter i deras mikroskopiska analyser med hjälp av epifluorescence mikroskopi. Super-resolution tredimensionellt strukturerad belysning mikroskopi (3D-SIM) är ett lovande verktyg för att övervinna detta hinder och avslöja de molekylära detaljerna om processen för groning av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer. Här beskriver vi användning av en modifierad SIMcheck (ImageJ)-assistent 3D avbildningsprocessen och fluorescerande reporter proteiner för SIM-mikroskopi av B. subtilis sporer germinosomes, varningsperioden av grobarhet proteiner. Vi presenterar också en (standard) 3D-SIM tänkbar procedur för FM4-64 färgning av B. subtilis spore membran. Med hjälp av dessa förfaranden, vi fått oöverträffad upplösning för germinosome lokalisering och visar att > 80% av B. subtilis KGB80 vilande sporer erhålls efter sporulering på definierade minimalmedium av moppar har en eller två GerD-GFP och GerKB-mCherry Foci. Ljusa foci var också observerade i FM4-64 målat sporer 3D-SIM bilder tyder på att inre membranet lipid domäner av olika smidighet sannolikt existerar. Ytterligare är studier som använder dubbel märkning förfaranden med membran färgämnen och germinosome reporter proteiner att bedöma samtidig lokalisering och därmed få en optimal överblick av organisationen av Bacillus grobarhet proteiner i inre spore membran möjligt.
Introduction
Sporer av order Bakteriologistubbar och Clostridiales är metaboliskt vilande och utomordentligt motståndskraftig mot hård sanering regimer, men om de gror, får inte orsaka skadliga effekter i människor1. I näringsrika germinant utlösta groning av Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer är den inledande händelsen germinant bindning till germinant receptorer (GRs) ligger i Spors inre membranet (IM). Därefter transduce GRs signaler till SpoVA kanal proteinet också ligger i IM. Detta resulterar i uppkomsten av utbyte av spore core pyridin-2,6-dicarboxylic syra (dipicolinic syra; DPA; bestående av 20% av spore core torr wt) för vatten via SpoVA kanal. Därefter DPA utgivningen utlöser aktivering av cortex peptidoglykan hydrolys, och ytterligare vattenupptaget följer2,3,4. Dessa händelser leder till mekanisk stress på coat lager, dess efterföljande bristning, uppkomsten av utväxt och slutligen vegetativ tillväxt. De exakta molekylära detaljerna grobarhet processen löses dock fortfarande långt ifrån.
En viktig fråga om sporgroning angår de lipider som omger IM grobarhet proteinerna liksom IM SpoVA kanal proteinerna biofysiska egenskaper. Detta till stor del orörliga IM lipid lipidens är den huvudsakliga permeabilitet barriären för många små molekyler, inklusive giftiga kemiska konserveringsmedel, av vilka några utöva sina åtgärder i spore core eller vegetativ cell cytoplasman5,6. Den IM lipid lipidens sannolikt i en gel stat, även om det finns en betydande del av mobila lipider i IM5. Spors IM har också potential för betydande expansion5. Ytan av IM ökar därmed, 1,6 gånger på grobarhet utan ytterligare membran syntes och åtföljs av förlust av denna membranets karakteristiska låg permeabilitet och lipid orörlighet5,6.
Medan de molekylära detaljerna för aktivering av grobarhet proteiner och organisationen av IM lipider i sporer är attraktiva ämnen för studien, utgör B. subtilis sporer liten storlek och relativt låga överflödet av grobarhet proteiner, en utmaning mikroskopiska analyser. Griffiths et al. övertygande epifluorescence Mikroskop bevis, antyder med hjälp av fluorescerande reportrar smält grobarhet proteiner, att proteinet byggnadsställning GerD i B. subtilis sporer organiserar tre GR subenheter (A, B och C) för GerA, B och K GRs, i ett kluster7. De myntade termen 'germinosome' för detta kluster av grobarhet proteiner och beskrivs strukturerna som ~ 300 nm stora IM protein foci8. Vid initiering av sporgroning, skingra fluorescerande germinosome foci slutändan förändra i större fluorescerande mönster, med > 75% av spore populationer visar detta mönster i sporer grodde för 1 h med L-valin8. Observera att papperet nämns ovan används i genomsnitt bilder från dussintals konsekutiva fluorescerande bilder, att få statistisk power och övervinna hindret för låg fluorescerande signaler som observerats under imaging. Denna visualisering av dessa strukturer i bakteriesporer var vid kanten av vad som är tekniskt genomförbart med klassisk mikroskopisk verktyg och varken en utvärdering av mängden foci i en enda spore inte heller deras mer detaljerad subcellulär lokalisering var möjligt med detta synsätt.
Här visar vi användning av strukturerade belysningen mikroskopi (SIM) att få en detaljerad visualisering och kvantifiering av germinosome(s) i sporer av B. subtilissamt deras IM lipid domäner9. Protokollet innehåller även instruktioner för sporulering, bild förberedelse och bildanalys av SIMcheck (v1.0, en imageJ plugin) samt ImageJ10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. B. subtillis sporulering (Timing: 7 dagar före mikroskopisk Observation)
-
Dag 1
- Streak en bakterieodling på en Luria-Bertani buljong (LB) agar plattan (1% trypton, 0,5% jästextrakt, 1% NaCl, 1% agar)13 och inkubera över natten vid 37 ° C att få enstaka kolonier. Använd den B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt, gerD-gfp kan) stammen och dess överordnade bakgrund stam B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) som tidigare beskrivits7.
Obs: Användning av sporer med ΔcotEΔgerE bakgrund är viktigt i germinosome visualisering, för att minimera autofluorescens av spore coat lager7. - Sterilisera alla media, rör, pipetter och andra kultur material som ska användas med lämpliga metoder.
- Streak en bakterieodling på en Luria-Bertani buljong (LB) agar plattan (1% trypton, 0,5% jästextrakt, 1% NaCl, 1% agar)13 och inkubera över natten vid 37 ° C att få enstaka kolonier. Använd den B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt, gerD-gfp kan) stammen och dess överordnade bakgrund stam B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) som tidigare beskrivits7.
-
Dag 2
- Inokulera en enda koloni i 5 mL LB medium tidigt på morgonen och inkubera kulturen under kontinuerlig agitation i en skruvlock tub på 200 rpm/min och 37 ° C tills den OD600 når 0,3-0,4 (ca 7 h).
- Gör 500 mL moppar medium (pH 7,5) innehållande 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0.276 mM K2så4, 0,01 mM FeSO4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPPAR, 4 mM Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glukos-monohydrat och 10 mM NH4Cl.
- Laga i skruvlock rör 10-1- 10-7 seriespädningar av LB kultur i 5 mL moppar medium varje och inkubera kulturer över natten under kontinuerlig agitation på 200 rpm/min och 37 ° C.
Obs: De seriella utspädningar beredda här syftar till att erhålla en utspädning i tidiga exponentiella fasen i nästa morgon. Detta steg och nästa steg är nödvändigt för att cellerna att anpassa sig till moppar buffrade odlingsmedium.
-
Dag 3
- Välj en av de moppar spädningarna med en OD600 av 0,3-0,4. Inokulera 0,2 mL av kulturen till pre värmde (37 ° C) 20 mL moppar medium i en konisk 250 mL kolv och Inkubera under kontinuerlig agitation tills den OD600 når 0,3-0,4 (~ 7 h).
- Inokulera moppar baserat sporulering medium (250 mL) med 1% (v/v) före kultur från steg 1.3.1 och Inkubera under 3 dagar vid 37 ° C i en konisk liters mätkolv under kontinuerlig agitation. För FM4-64 färgning av PS4150 sporer, Lägg 2 µg/mL FM4-64 sond (se Tabell för material) till sporulering medium 1 eller 2 h efter att ha nått toppen OD600 värdet av vegetativ tillväxt (vanligen cirka 2) och låt kulturen att därefter sporulate samtidigt skydda den från ljus5.
-
Dag 7: Skörd av sporer
- Bestämma sporulering avkastningen (sporer vs vegetativa celler) med fas kontrast mikroskopi vid 100 X förstoring för att skilja fas ljusa sporer från fas mörka celler och eventuellt icke-mogna sporer. En 90% fas ljusa spore avkastning förväntas.
- Pellet sporer vid 4,270 x g i 15 minuter vid 4 ° C i rund botten centrifugrör. Tvätta spore pelleten 2 - 3 gånger med 40 mL Sterilt ultrarent Typ1 avmineraliserat vatten i 50 mL koniskt centrifugrör (se Tabell för material). Spin-ner vid varje tvätt vid 4,270 x g i 15 min (4 ° C).
-
Dag 7: Spore rening
- Spore rening: centrifugerade spore i 750 µL 20% icke-jonaktivt täthet lutning medium (se tabell av material) och lasta på 800 µL av 50% icke-jonaktivt täthet lutning medium i steriliserade mikrocentrifugrör. Centrifugera i 60 min vid 21 500 x g. Pelleten erhålls innehåller gratis sporer. Centrifugerade spore i 200 µL 20% icke-jonaktivt täthet lutning medium och lasta på 1 mL 50% icke-jonaktivt täthet lutning medium i en mikrocentrifug rör och Centrifugera under 15 minuter vid 21 500 x g.
- Tvätta den slutliga spore beredning och lagring: pelleten erhålls innehåller renade vilande sporer. Tvätta spore pelleten 2 - 3 gånger med 1,5 mL Sterilt ultrarent Typ1 vatten (se Tabell av material) och spin-ner emellan vid 9,560 x g i 15 minuter vid 4 ° C. Slutligen, centrifugerade i Sterilt ultrarent Typ1 vatten till en slutlig OD600 på cirka 30. Alikvoter av sporer kan lagras vid-80 ° C i 8 veckor14.
2. decoating
- Behandla PS4150 sporer med 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% sodium dodecyl sulfate (SDS) / 0.1 M Ditiotreitol (DTT) vid 70 ° C för 1 h. tvätt sporer 10 gånger med steriliserad ultrarent Typ1 vatten15,16. Så någon adsorberat FM4-64 probe i spore: s yttre membran och yttre lager tas bort.
3. täckglas och bild förberedelse11 (Timing: 1 H före Observation)
- Före rena hög precision coverslips (se tabell material) med 1 M HCl i 30 min i ett försiktigt skakar vattenbad. Tvätta coverslips två gånger i ultrarent Typ1 vatten, och lagra dem i 100% (vol/vol) EtOH. Låt dem torka och kontrollera deras klarhet före användning. Pre Rengör glas glasen i 70% EtOH. Låt dem torka och kontrollera deras klarhet före användning.
4. provtagning fluorescerande mikrosfärer eller sporer i gen ram glida10 (Timing 15 Min)
- Pre värma två 70% EtOH rengöras och luft torkad objektglas (se tabell material) i flera sekunder på en 70 ° C värmeblock, släppa 65 μL av steriliserad 2% agaros som hölls vid 70 ° C ovanpå en glasskiva och placera den andra glasskiva på toppen att sprida agaros b mellan bilderna. Agaros plåstret kommer att torka i ca 5 min.
- Skär agaros plåstret i en 1 x 1cm avsnitt efter borttagning av en av glasskivor, tillsätt 0,4 μL av provet (fluorescerande mikrosfärer eller sporer av ~ 108/ml) och överföra plåstret på det hög precision täckglaset genom att placera täckglaset på plåstret och glider den av.
- Fixa en Gene Frame (1,5 x 1,6 cm2, 65 µL) in i torkade bilden, på vilken täckglaset placeras stänga alla hörn av ramen, vilket innebär att bilden för användning i mikroskopi.
5. imaging11,17(Timing: 1 H)
- Fånga överförings- och fluorescens bilder av sporer samt en blandning av röd och gul-grön bildas modifierade fluorescerande mikrosfärer på strukturerade belysningen Mikroskop (se tabell material) utrustad med en 100 x objektiv () olja Numerisk bländare = 1.49), en CCD kamera och bild analys programvara (se tabell material). Generera alla bilder i rumstemperatur utan störning av omgivande ljus. Se till att alltid rengöra 100 x mål och bilden med 75% etanol innan imaging.
- Fokusera på 100 nm (diameter) fluorescerande mikrosfärer och optimera funktionen punkt spridning (psf) genom att justera korrigering ringen på 100 x målet tills en symmetrisk polyesterstapelfibrer erhålls, sålunda minimizing oskärpa i bilden. Polyesterstapelfibrer är impulssvaret eller om ett bildsystem svar till en punktkälla eller point-objekt.
- Välj ett synfält med ca 10 runda fluorescerande mikrosfärer. Tillämpa ett galler fokus justering för båda 561 nm och 488 nm excitation våglängder som guide för analys bildbehandlingsprogram.
- Fokusera sporer med överföring ljuset och fånga en överföring ljus bild i 16 × genomsnittliga läge med 200 ms exponeringar för varje bild.
- Fånga 3D-SIM fluorescerande råbilder av sporer med belysningsläge ”3D-SIM”, kamerainställningar till uppläsningen läge Electron att multiplicera (EM) vinst 10MHz på 14-bitars, och EM vinst på 175. Excitera FM4-64 sonden i PS4150 sporer med 561 nm laserljus på 20% lasereffekt och en brinntid på 400 ms.
- Excitera den GerKB-mCherry och GerD-GFP i KGB80 sporer med, respektive 561 nm laser ljus på 30% lasereffekt för 1 s och 488 nm laserljus på 60% laser power för 3 s. Z-Stack inställningar är i toppen till botten läge, 0,2 µm / step, 7 steg och 20 steg för germinosome och IM analys, respektive.
Obs: Dessa laser parametrar tillämpades för att säkerställa maximal ljusstyrka värdet fönstret histogram på runt 4.000.
6. rekonstruera 3D-SIM Raw-bilder FM4-64 målat PS4150 sporer
- Utföra N-SIM Slice återuppbyggnaden FM4-64 målat PS4150 sporer rådata för. Klicka på knappen Param för Rekonstruera Slice på N-SIM pad fliken blad att öppna fönstret N-SIM Slice återuppbyggnad.
- Ställ in parametrarna för återuppbyggnad i fönstret N-SIM Slice återuppbyggnad . För att få perfekta rekonstruerade bilder, Följ förslag av N-SIM instruktionerna och klicka på lämpliga kontroller i fönstret N-SIM Slice återuppbyggnad att ställa in Belysningen modulering kontrast (IMC) till Auto, hög Upplösning Noise Suppression (HRNS) till 1,00 och Ur fokus oskärpa Suppression (OFBS) till 0,05 som utgångspunkt.
- Klicka på knappen Rekonstruera segment i fönstret N-SIM Slice återuppbyggnad att rekonstruera bilden. Utvärdera kvaliteten på de rekonstruerade bilderna av Fast Fourier omvandlas (FFT) bilder och återuppbyggnad poäng, som visas efter återuppbyggnaden12.
- Justera den HRNS 0,10 till 5.00 och OFBS från 0,01 till 0,50 genom att klicka på lämpliga kontroller i fönstret N-SIM Slice återuppbyggnad tills bästa parameterinställningarna erhålls.
- Klicka på knappen Verkställ i fönstret N-SIM Slice Reconstuction att tillämpa ändrade parametrarna. Klicka på knappen Stäng för att stänga fönstret.
- Göra en FM4-64 målat PS4150 sporer raw image active och klicka på knappen Rekonstruera Slice på N-SIM Pad fliken blad att köra Slice återuppbyggnad. Spara rekonstruerade bilden.
7. bildanalys
-
Konvertera Pseudo-Widefield bilder av den KGB80 germinosome
- Konvertera 3D-SIM raw-bilder av KGB80 till Pseudo-Widefield bilder genom att aktivera med ett vänsterklick ImageJ plugin SIMcheck nytta Raw Data SI till Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield genomsnitt bilder från SIM rådata och monterar, för jämförelse, en bild som är likvärdig med konventionell widefield belysning12. Se https://imagej.net/Welcome för ImageJ själv. Välj slumpmässigt ~ 25 sporer i varje inverterad överföring bild för senare germinosome analys i fluorescerande Pseudo-Widefield bilder.
- Välj i totalt cirka 350 (i detta exempel, 346) KGB80 sporer i 14 synfält från två bilder. GerD-GFP och GerKB-mCherry fluorescerande foci siffrorna i valda KGB80 sporer bör räknas självständigt av två forskare. Forskaren kan hänvisa tillbaka till 3D-SIM raw-bilder när i tvivel om förekomsten av separata fluorescerande germinosome foci i sporer.
- Bedöma de maximala stödnivåerna varje GerD-GFP och GerKB-mCherry fokus och integrerad intensiteten i varje KGB80 spore: s 3D-bild med ImageJ.
-
Analysera Pseudo-Widefield bilder av den KGB80 germinosome
- Använda intensitetsvärdet medelvärdet integrerad 7 stackar som integrerad signal intensiteten av KGB80 spor. Fastställa bakgrunden intensiteter av imaging bakgrund stammen PS4150 med identiska inställningar. Betrakta fluorescerande ställen i enskilda KGB80 sporer som germinosome foci när de är klart urskiljbara från bakgrunden.
- Gäller envägs ANOVA-test för betydelse bestämning med programvara Origin 9.0. med tanke på P värden < 0,05 som statistiskt signifikanta. Använd den Spearman's rank korrelationskoefficienten18 att utvärdera korrelationen av GerD-GFP och GerKB-mCherry foci nummer och mätningar av den integrerade signalintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det nuvarande protokollet presenterar ett SIM Mikroskop avbildning förfarande för bakteriesporer. Sporulering och skjut förberedelse förfarandena genomfördes som visas i figur 1 innan imaging. Senare, bildbehandling och analys förfarandena tillämpades både för dim (fluorescerande protein märkt grobarhet proteiner) och ljusa (lipofila probe målat IM) spor prov som visas i följande text.
Lokalisering av germinosomes i B. subtilis sporer
Nivåer av GerD och GerKB uppges vara ~ 3500 och ~ 700 molekyler per spore, respektive, baserat på Western blot analyser av extrakt från sporer som tillagas i en rik sporulering medium19. Både gerD-gfp och gerKB-mCherry gener i KGB80 stam är under kontroll av deras infödda promotor. Relativa låga överflödet av fusionsproteinerna ledde till en låg fluorescerande signal under imaging, så det var svårt att rekonstruera sådana dim SIM råbilder av SIM återuppbyggnad algoritmen. Mikroskopet SIM tillämpades dock fortfarande för germinosome bild förvärv, även om raw SIM-bilder konverterades in i Pseudo-Widefield bilder av SIMcheck (ImageJ plugin). Dessutom genomfördes en sju stack 3D imaging för att få en bättre överblick över detta IM fokus. I panelen till vänster i figur 2visas två foci av GerD-GFP dök upp i olika högar. Totalt tre GerD-GFP foci indikeras av de vita pilarna i kolumnen compositive Z3 stack. Den högra panelen i figur 2 visar en spor med endast en GerD-BNP brännpunkt i spor vilket framgår av den vita pilen i kolumnens sammansatta Z4 stack. Sammanlagt cirka 40% och 50% av sporer hade två eller en GerD-GFP och GerKB-mCherry-kluster, respektive (tabell 1). Bland 346 sporer undersökt, två hade 4 GerD-GFP foci och en spor hade även 5 GerD-GFP foci. Märkbart, i våra händer var antalet GerD-GFP och GerKB-mCherry foci i samma spor inte alltid den samma18. Som mikroskopet SIM hade inget fas kontrast alternativ, använde vi överföring ljusmikroskopi för spore lokalisering. Således, sporer visas med en mörk och tät kärna omgiven av en ljusare halo.
Integrerad fluorescensintensiteten hos KGB80 sporer mättes av ImageJ. Sporer som hade 0, 4 eller 5 foci ingick inte i vår statistiska analys på grund av deras låga frekvenser. Det fanns en hög positiv korrelation mellan GerD-GFP och GerKB-mCherry integrerade stödnivåer (Spearman rang korrelationskoefficienten = 0,73). Medan integrerade intensiteten av proteinet GerD-GFP byggnadsställning var olika mellan olika populationer (figur 3 c), var integrerad intensiteten i GerKB-mCherry ungefär densamma i olika populationer (figur 3D). Maximala fluorescensintensiteten hos GerD-GFP och GerKB-mCherry foci tenderade att minska, när spor hade flera foci (figur 3A, B). Den maximala fluorescensen av alla ljuspunkter, anses germinosome foci, var högre än den maximala auto-fluorescensen av PS4150 sporer (sporer från bakgrunden stammen KGB80; Figur 3A ” B).
Organisationen av det inre membranet
Som nämnts i inledningen, ligger germinosome proteiner i Spors IM. Men är några detaljer känt om detta till stor del orörliga membran biofysiska egenskaper. Utforska fler detaljer, såsom IMS lokal organisation, skulle främja förståelsen av organisationen av IM proteiner, i synnerhet GRs och kanal proteiner. B. subtilis sporer har en struktur bestående av flera koncentriska lager, och en lipofila sond kan inte enkelt passera genom dessa flera lager för att färga det IM som omger spore kärnan. Passage av sådan sonder hämmas sannolikt av de proteinrika coat lagrarna och kanske också den yttre membran20,21. För att lösa detta problem lades lipofila membran färgämnet FM4-64 till en PS4150 kultur under sporulering. På så sätt PS4150 vegetativa cellmembranet var målat av FM4-64 och membran i forespores som erhållits från denna kultur vid asymmetrisk sporulering celldelning och efterföljande forespore omvälvning färgas således väl5. Följaktligen, mogen Spors membran kan visualiseras. En tidigare studie visade att de flesta om inte alla av FM4-64 är i IM i rengjorda sporer5. Under en cirka 2 veckors ruvning och spore rening behandlingar bort tvätt förfaranden som tillämpas någon FM4-64 yttre membranet, den sistnämnda effektivt tas bort efter decoating behandling och omfattande tvätt steg 5. dock decoating förfarandet tar bort ingen FM4-64 från IM, inte heller har någon effekt på germinosome foci5,6. Vad glada vi är att ljusare FM4-64 ställen liknar germinosome foci dök upp i både intakt (figur 4A, B) och decoated sporer (figur 4 c, D) av PS4150 sporer. Dessa ljusare FM4-64 ställen kan vara inblandade i det kluster av germinosome proteiner i IM.
Figur 1: översikt över sporulering och bild förberedelse. En översikt som visar de inledande steg som krävs innan imaging. Detaljerad information ges i protokollet. (A) schematiskt sporulering förfarandet i definierade minimal moppar medium. En B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) eller KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt gerD-gfp kan) enda koloni var odlade i 5 mL LB rikt medium, och anpassad i 5 mL och 20 mL av moppar medium i sin tur, och slutligen sulfitreducerande i 250 mL moppar medium. En tidiga exponentiella fasen kultur (OD600, 0,3-0,4) används i alla mellanliggande kulturer. FM4-64 (2 µg/mL) lades till PS4150 sporulering medium för spore membran färgning 1 eller 2 h efter att ha nått OD600 toppvärdet. (B) metoden för skörd sporer från moppar sporulering kultur och renande sporer av täthet lutning centrifugering. (C) förfarandet för att stabilisera sporer på 1% agaros pad i en gen ram kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa Pseudo-Widefield (PWF) 3D bilder av GerD-GFP och GerKB-mCherry foci i två KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt gerD-gfp kan) vilande sporer 3D-SIM raw-bilder tagna med dubbla kanaler excitation (561nm, 30% lasereffekt, 1 s, och 488nm, 60% laser power, 3 s) med hjälp av 7 steg från topp till botten Z-stackar. Därefter, var raw SIM-bilder konverteras till Pseudo-Widefield 3D-bilder av ImageJ plugin SIMcheck. Från vänster till höger, 3D bilder (Z2-Z5) av GerD-GFP (grön) visas GerKB-mCherry (röd) och motsvarande sammansatta bilder av två KGB80 sporer (i och ii) i panelen. Överföring (Trans) ljus bilder av två sporer (i och ii) anges placeringen av sporer som visas som mörka täta bilder omges av en ljusare halo. Skalstapeln = 1 µm och alla paneler är vid samma förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Maximala fluorescensintensiteten hos GerD-GFP i KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt gerD-gfp kan) vilande sporer och maximal auto-fluorescensintensiteten hos PS4150 sporer i godtyckliga enheter. Alla sporer var upplyst av inställningarna som anges i protokollet. Paneler (A) och (B) Visa maximal fluorescensintensiteten hos de GerD-GFP och GerKB-mCherry foci, respektive, i KGB80 vilande sporer samt som i båda fallen maximal auto-fluorescensintensiteten hos förälder PS4150 sporer. Paneler (C) och (D) Visa integrerad fluorescensintensiteten hos de GerD-GFP foci och integrerad fluorescensintensiteten hos de GerKB-mCherry foci, respektive, i B. subtilis KGB80 vilande sporer. Vi använde one-way ANOVA-test för betydelse bestämning av skillnader i maximal brännpunkt intensitet och integrerad spore fluorescens stödnivåer med programvara Origin 9.0 med tanke P värden < 0,05 som betydande. Sporer med 4 eller 5 foci uteslöts från analysen på grund av deras låga överflöd. Data representeras i spårat boxplots. Skårorna i Tomterna är runt de medianvärden som observerats med deras bredd proportionellt mot interkvartilintervall (IQR). Morrhåren visas representerar högst 1,5 IQR. Asteriskerna visar en signifikant skillnad av medianvärden. GerD-GFP och GerKB-mCherry integrerade fluorescens stödnivåer har en stark positiv korrelation (Spearman korrelationskoefficienten = 0,73)18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa Pseudo-Widefield (PWF) bilder (A och C) och rekonstruerade SIM-bilder (B och D) av FM4-64 målat IM av B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) sporer. FM-464 införlivades sporer under sporulering. 3D-SIM raw-bilder av intakt sporer (A och B) och decoated sporer (C och D) togs med en kanal excitation (561 nm laser, 20% lasereffekt, 400 ms) med en 25 steg uppifrån och ned Z-stack. Därefter SIM rådata rekonstruerades av mikroskopet bildhanteringsprogram (se Tabell för material) till 3D-SIM bilder, eller omvandlas till PWF av SIMcheck (ImageJ plugin). Cyan pilarna pekar på FM4-64 foci i IM i panelen B och D. Skalstapeln = 1 μm och alla paneler är vid samma förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Stam | Sporer räknas | Foci | Foci per spore (%) | |||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||
| KGB80 | 346 | GerD-GFP | 2 | 46 | 40 | 11 | 1 | 0 | ||
| GerKB-mCherry | 2 | 53 | 40 | 5 | 0 | 0 | ||||
Tabell 1: Förekomst av foci i KGB80 sporer. Germinosome foci antalet per spore i en population av dubbla märkt B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry katt gerD-gfp kan) vilande sporer. Fluorescens i sporer räknades som germinosome foci när fokus maximal intensitet var högre än auto-fluorescensintensiteten, vilket var den högsta stödnivån PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) vilande sporer upphetsad av samma belysning inställningar som KGB80 sporer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras innehåller en standard 3D-SIM procedur för analys av FM4-64 målat B. subtilis sporer som innehåller sporulering, bild förberedelse och imaging processer. Protokollet beskrivs dessutom en modifierad SIMcheck (ImageJ)-assisted 3D imaging process för SIM-mikroskopi av B. subtilis spore germinosomes märkt med fluorescerande reportrar. Det sistnämnda förfarandet tillät oss att iaktta denna dim underkonstruktionen med förbättrad kontrast. Genom koppling två imaging förfaranden, är det möjligt att visualisera diskreta sub strukturer i samma spor med samma SIM-mikroskopet, därmed förbättra vår grund för en mekanistisk förståelse av grobarhet processen. Observera att förfarandet fungerar med en lateral upplösning på ~ 100 nm och en axiell upplösning på ~ 200-250 nm. Detta är bättre än den differentiella störningar kontrast (DIC) wide-fältet mikroskopi metod används av Griffith7. Tid beslöt analys av germinosome utseende vid inledandet av grobarhet skulle vara en önskad nästa steg. Tyvärr även SIM-mikroskopi är i princip förenligt med live-imaging, på grund av germinosome dim signaler sådan tid-löst SIM, analyser är inte genomförbara på grund av snabb blekning prover under bild förvärv. För att erhålla tillräcklig sporer för analys, är det viktigt att se till att sporulering sker effektivt. Forskare måste därför kontrollera sporulering effektivitet minutiöst med 90% verkningsgrad som mål. I de representativa resultat har i vilande sporer, respektive ~ 50% och 40% av alla sporer en eller två GerD-GFP och GerKB-mCherry foci (tabell 1). Andelen av sporer med två foci är mycket högre än vad som rapporterats av Griffiths tidigare7. I området i närheten finns det flera orsaker som kan förklara olika resultatet i det nuvarande arbetet. Första kunde 3D imaging process underlätta upptäckt av mer foci. Olika foci i samma spor finns på olika platser i vertikal riktning som visas i figur 1. Andra, den CCD-kamera (Tabell av material) och laser enhet utrustad att mikroskopet SIM bidra avsevärt till de bildbehandling resultat. Tredje, liknar Griffithss metod7 till genomsnittliga dussintals på varandra följande bilder för bättre bildanalys, Pseudo-Widefield bilden av germinosome var också en genomsnittlig bild från raw SIM-bilder (5 faser och 3 inriktningar bilder). Slutligen, sporulering medellång och sporulering villkor, en viktig variabel spore egenskaper, är olika i vårt arbete som använts tidigare. Griffiths et al.7 används rik 2 x Schaeffer's-glukos (2 x SG) medium för sporulering, medan en definierad minimal moppar buffrat medium var anställd här. Flera uppsatser har visat att sporulering medium och villkor har betydande effekter på protein sammansättning, motstånd, och groning av B. subtilis sporer22,23,24 , 25. det har faktiskt visat att GR subenheter är 3 - 8 gånger lägre i sporer som erhållits på en dålig medium jämfört med dem som erhålls på rik-medium. GerD nivåer var också runt 3.5-fold lägre i fattiga medelstora sporer, och dessa sporer tog längre tid att starta spore grobarhet26. Det är dock inte klart huruvida sporulering villkor påverkar också antalet observerade germinosome foci.
Ramirez-Peralta et al.' s resultat26 anges att andelen näringsämnen groning av sporer på befolkningsnivåer påverkas avsevärt av nivåerna av grobarhet proteiner och GerD. Om de integrera fluorescerande stödnivåerna per spore från fluorescerande reportrar är direkt proportionell till nivåerna av GerD och GerKB fusionsproteinerna, nivåer av både fusionsproteinerna skiljer i KGB80 sporer, som är överens med tidigare arbete 7. detta protein nivå heterogenitet kan vara relaterat till spore grobarhet heterogenitet observerats på nivån enda spore och germinosome foci nummer kan vara en annan bidragande faktor till spore grobarhet heterogenitet. Ytterligare experiment kommer att fokusera på en analys av den möjliga effekten germinosome foci numret och foci grobarhet protein sammansättning (inte alla germinosomes kan vara lika i grobarhet protein sammansättning) kunde ha på grobarhet heterogenitet. Data gav upphov till ett antal aktuella forskningsfrågor inklusive: jag) Vad är rollen som GerD i det kluster av GRs i IM; och ii) hur är två andra GRs, GerA och GerB, organiserade i spor IM?
Det protokoll som presenteras för dim och ljusa spore prover gör det möjligt att visualisera diskreta sub strukturer i samma spor av SIM-mikroskopi. De ljusa FM4-64 fläckar som observerades i sporer kan bero på omfattande vikning av IM27. Alternativt, hypotes vi att dessa regioner finns områden im där färgämnet lättare kunde få tillgång till på grund av ökad lokal IM smidighet. Sådana regioner av ökad smidighet (RIFs) kan ordnas av det cytoskeletal aktin homologt MreB, känd för sin koncentration av vätska kort acyl kedja lipider28,29. Märkbart, tillämpa samma förfarande till vildtyp B. subtilis sporer leder också till ett liknande mönster av ljuspunkter FM4-64 (våra opublicerade observationer). I B. subtilis vegetativa celler, resulterar en kollapsad membranpotentialen i det kluster av MreB och RIFs29. Det inre membranet av vilande sporer sannolikt har en relativ låg membran potentiella20,21 och innehåller detekterbara halter av MreB30 vilket kan leda till den klustring av RIFs i större domäner av hög flytbarhet29 . Huruvida sådana domäner skulle kunna sammanfalla med förekomsten av germinosomes är för närvarande under utredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Christiaan Zeelenberg för hans hjälp under SIM-bildtagning. JW erkänner Kina stipendium rådet för ett PhD stipendium och tack Irene Stellingwerf för hennes hjälp under den primära fasen av imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| ImageJ | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
