Summary
كتلة بروتينات مستقبلات جيرمينانت في 'جيرمينوسوميس' في الغشاء الداخلي للجراثيم العصوية نجحت . يمكننا وصف بروتوكول باستخدام القرار سوبر مجهرية وفلوري البروتينات مراسل لتصور جيرمينوسوميس. ويحدد البروتوكول أيضا مجالات الغشاء الداخلي بوغ ملطخة تفضيلي مع صبغ الغشاء FM4-64.
Abstract
الحجم الصغير للجراثيم ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، يسبب صعوبات في تحليلاتها مجهرية باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي. القرار فائقة ثلاثي الأبعاد "المركبة إضاءة مجهرية" (3D-سيم) أداة واعدة للتغلب على هذه العقبة، وتكشف عن تفاصيل الجزيئية لعملية إنبات أبواغ عصيات نجحت (نجحت باء). هنا، يمكننا وصف استخدام سيمتشيك المعدلة (إيماجيج)-مساعد عملية التصوير ثلاثي الأبعاد والبروتينات الفلورية مراسل مجهرية سيم من جيرمينوسوميس جراثيم نجحت ، cluster(s) من البروتينات الإنبات. ونقدم أيضا إجراء تصوير سيم 3D (قياسية) لتلطيخ FM4-64 باء-نجحت بوغ الأغشية. باستخدام هذه الإجراءات، ونحن الحصول على قرار غير مسبوقة للتعريب جيرمينوسومي وتبين أن > 80% KGB80 باء-نجحت جراثيم نائمة تم الحصول عليها بعد تبوغ على المعرفة المتوسطة والمماسح الحد الأدنى لها واحد أو اثنين من غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري البؤر. كما كانت البؤر مشرقة الملاحظة في FM4-64 الملون سيم 3D صور جراثيم مما يوحي بوجود مجالات الدهن الغشاء الداخلي لسيولة مختلفة يحتمل. مزيد من الدراسات أن استخدام مزدوج وسم الإجراءات مع الأصباغ الغشاء وجيرمينوسومي البروتينات مراسل لتقييم التعريب المشارك وهكذا الحصول على لمحة أمثل المنظمة عصيات إنبات البروتينات في الغشاء الداخلي بوغ ممكن.
Introduction
جراثيم بأوامر باسيلاليس وكلوستريدياليس أيضي نائمة ومقاومة غير عادية لأنظمة تطهير قاسية، ولكن إلا إذا كانت تنبت، لا يمكن أن يسبب آثار ضارة بالبشر1. في المغذيات جيرمينانت المشغلة إنبات أبواغ عصيات نجحت (باء-نجحت)، الحدث بدء جيرمينانت ملزم لمستقبلات جيرمينانت (الموارد الوراثية) الموجود في الغشاء الداخلي بوغ (IM). وفي وقت لاحق، ترانسدوسي الموارد الوراثية إشارات للبروتين قناة سبوفا الموجود أيضا في الدردشة. وهذا يؤدي في بداية تبادل بوغ الأساسية حمض بيريدين-2, 6-ديكاربوكسيليك (حمض ديبيكولينيك؛ اتفاق دارفور للسلام؛ تضم 20 في المائة من بوغ الأساسية بالوزن الجاف) للمياه عن طريق قناة سبوفا. في وقت لاحق، الإفراج عن اتفاق دارفور للسلام يطلق تنشيط التحلل peptidoglycan اللحاء، وامتصاص كميات إضافية من الماء يتبع2،،من34. هذه الأحداث التي تؤدي إلى الإجهاد الميكانيكي على طبقات معطف، انفصامه اللاحقة، وظهور ثمرة، وأخيراً النمو الخضري. ومع ذلك، لا تزال بعيدة عن تحل التفاصيل الدقيقة الجزيئية لعملية الإنبات.
مسألة رئيسية حول إنبات بوغ تتعلق بالخصائص الفيزيائية الحيوية من الدهون المحيطة بالبروتينات إنبات الدردشة فضلا عن البروتينات قناة "الدردشة سبوفا". هذا بلير الدهن إيم غير متحرك إلى حد كبير هو الحاجز الرئيسي النفاذية للعديد من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك المواد الحافظة الكيميائية السامة، التي تمارس عملها في بوغ النواة أو الخلية النباتي السيتوبلازم5،6. Bilayer الدهن إيم من المرجح في حالة جل، على الرغم من أن هناك جزءا كبيرا من الدهون المتنقلة في التراسل الفوري5. وقد إيم بوغ أيضا إمكانات التوسع الكبير5. وبالتالي، يزيد من المساحة السطحية للدردشة 1.6-fold عند الإنبات دون تركيب غشاء إضافية ومصحوبا بفقدان هذا الغشاء مميزة منخفضة النفاذية والدهن الجمود5،6.
بينما التفاصيل الجزيئية تنشيط إنبات البروتينات وتنظيم الدهون إيم في جراثيم مواضيع جذابة للدراسة، صغر حجم الجراثيم ب-نجحت ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، تشكل تحديا أن التحليل المجهري. استخدام الصحفيين الفلورسنت تنصهر فيها البروتينات الإنبات، تقترح غريفيث et al ابيفلوريسسينسي المجهر أدلة دامغة، في جراثيم نجحت بروتين سقالة غيرد تنظم ثلاث مفارز غرام (ألف وباء وجيم) لغيرا وب ك الموارد الوراثية، في مجموعة7. مصطلح 'جيرمينوسومي' لهذه المجموعة من البروتينات الإنبات ووصفها الهياكل ~ 300 نانومتر كبير إيم البروتين البؤر8. عند بدء الإنبات بوغ، تفريق جيرمينوسومي نيون البؤر في نهاية المطاف تغيير إلى أكبر أنماط نيون، مع > 75% سكان بوغ عرض هذا النمط في جراثيم نامي على ح 1 مع لفالين8. لاحظ أن متوسط الورقة المذكورة أعلاه يستخدم الصور من عشرات الصور الفلورسنت على التوالي، للحصول على قوة إحصائية والتغلب على عقبة إشارات الفلورية منخفضة ولاحظ أثناء التصوير. لم هذا التصور لهذه الهياكل في الجراثيم البكتيرية على حافة ما هو ممكن من الناحية التقنية مع أدوات مجهرية الكلاسيكية ولا تقييم لمقدار البؤر في بوغ واحد لم يكن التعريب سوبسيلولار بهم أكثر تفصيلاً ممكن مع هذا النهج.
هنا، نحن توضح استخدام الإضاءة تنظيماً من (SIM) للحصول على مجموعة مرئيات تفصيلية مجهرية والتحديد الكمي ل germinosome(s) في جراثيم نجحت باء، فضلا عن تلك المجالات الدهن إيم9. ويتضمن البروتوكول أيضا تعليمات تبوغ وإعداد الشرائح وتحليل الصور التي سيمتشيك (v1.0، البرنامج المساعد إيماجيج) فضلا عن10،إيماجيج،من1112.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- باء-سوبتيليس تبوغ (التوقيت: 7 أيام قبل الملاحظة المجهرية)
-
1 يوم
- متتالية ثقافة بكتيرية في لوحة (تريبتوني 1%، استخراج الخميرة 0.5%، 1% كلوريد الصوديوم، 1% أجار) أجار مرق لوريا بيرتاني (رطل)13 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للحصول على مستعمرات واحدة. استخدام سلالة KGB80 نجحت (PS4150 جيركا القط جيركب-متشيري جيركك، وكان غيرد-التجارة والنقل) وعن سلالة الخلفية الأصل نجحت PS4150 (PS832 ΔgerE::spc، ΔcotE::tet) كما هو موضح سابقا7.
ملاحظة: استخدام الجراثيم مع الخلفية ΔcotEΔgerE ضروري في التصور جيرمينوسومي، بغية التقليل إلى أدنى حد من أوتوفلوريسسينسي من طبقات معطف سبور7. - تعقيم كل وسائل الإعلام، وأنابيب، بيبيتس وغيرها من المواد الثقافة لاستخدامه مع الأساليب المناسبة.
- متتالية ثقافة بكتيرية في لوحة (تريبتوني 1%، استخراج الخميرة 0.5%، 1% كلوريد الصوديوم، 1% أجار) أجار مرق لوريا بيرتاني (رطل)13 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للحصول على مستعمرات واحدة. استخدام سلالة KGB80 نجحت (PS4150 جيركا القط جيركب-متشيري جيركك، وكان غيرد-التجارة والنقل) وعن سلالة الخلفية الأصل نجحت PS4150 (PS832 ΔgerE::spc، ΔcotE::tet) كما هو موضح سابقا7.
-
2 يوم
- تطعيم مستعمرة واحدة إلى 5 مل متوسطة رطل في الصباح الباكر واحتضان الثقافة تحت التحريك المستمر في أنبوب ملولبة على 200 لفة في الدقيقة/دقيقة و 37 درجة مئوية حتى OD600 تصل إلى 0.3-0.4 (حوالي 7 ح).
- جعل 500 مل من والمماسح المتوسطة (درجة الحموضة 7.5) التي تحتوي على 3 نانومتر (NH4)6مو7س24·4H2س، 0.4 ميكرومتر ح3بو3و 30 نانومتر كوكل2·6H2س و 10 نانومتر CuSO4·5H2س، 10 نانومتر زنسو4·7H2س، مم 1.32 ك2هبو4، 0.4 مم مجكل2·6H2س، مم 0.276 ك2حتى4مم 0.01 فيسو4·7H2س، 0.14 ملم كاكل2·2H2س، 80 مم اجتماعات، 4 مم 10 مم تريسيني مم 0.1 الحركة2·2H2س، د-الجلوكوز-مونوهيدرات، و 10 ملم NH4Cl.
- تعد بسداده ملولبة الأنابيب 10-1-10-7 تخفيف المسلسل ثقافة رطل في 5 مل والمماسح المتوسطة واحتضانها الثقافات بين عشية وضحاها تحت التحريك المستمر في 200 لفة في الدقيقة/دقيقة و 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تخفيف المسلسل أعد هنا تهدف إلى الحصول على إضعاف في أوائل المرحلة الأسية في صباح اليوم التالي. هذه الخطوة والخطوة التالية ضرورية للسماح للخلايا لتتكيف مع متوسط النمو مخزنة والمماسح.
-
3 يوم
- حدد واحدة من تخفيف والمماسح مع OD600 من 0.3-0.4. تطعيم 0.2 مل الثقافة إلى المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) 20 مل متوسطة والمماسح في دورق مخروطي 250 مل واحتضان تحت التحريك المستمر حتى OD600 تصل إلى 0.3-0.4 (ح ~ 7).
- تطعيم والمماسح تبوغ استناداً إلى المتوسط (250 مل) مع ثقافة ما قبل 1% (v/v) من الخطوة 1.3.1 واحتضان لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية في قارورة لتر مخروطية تحت التحريك المستمر. لتلطيخ FM4-64 من جراثيم PS4150، إضافة التحقيق 2 ميكروغرام/مل FM4-64 (انظر الجدول للمواد) إلى ح متوسطة 1 أو 2 تبوغ بعد بلوغ ذروة OD600 القيمة للنمو الخضري (عادة حوالي 2) والسماح الثقافة إلى وفي وقت لاحق سبورولاتي حين حمايتها من الضوء5.
-
يوم 7: الحصاد من جراثيم
- تحديد العائد تبوغ (جراثيم مقابل الخلايا النباتية) باستخدام الطوري في 100 X التكبير لتمييز جراثيم مرحلة مشرقة من مرحلة الزنزانات المظلمة وجراثيم ربما غير ناضجة. ويتوقع عائد بوغ مشرق مرحلة 90%.
- بيليه الجراثيم في س 4,270 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في جولة أسفل أنابيب الطرد المركزي. أغسل بيليه سبور 2-3 مرات مع 40 مل الماء المعقم 1 نوع ديمينيراليزيد فائقة نقية في أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 مل (انظر الجدول للمواد). زيادة ونقصان لأسفل في كل غسل في س 4,270 ز لمدة 15 دقيقة (4 درجات مئوية).
-
يوم 7: تنقية سبور
- بوغ تنقية: تعليق بيليه بوغ في 750 ميليلتر من 20% كثافة النطاق المتوسط التدرج (انظر الجدول للمواد)، وتحميل على 800 ميليلتر من 50% كثافة النطاق المتوسط التدرج في أنابيب معقمة ميكروسينتريفوجي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في س 21,500 ز. بيليه الحصول عليها تحتوي على جراثيم مجاناً. تعليق بيليه بوغ في 200 ميليلتر من 20% كثافة النطاق المتوسط التدرج وتحميل على 1 مل من 50% كثافة النطاق المتوسط التدرج في أنبوب ميكروسينتريفوجي، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 21,500 ز.
- غسل إعداد بوغ النهائية والتخزين: بيليه الحصول عليها تحتوي على جراثيم نائمة المنقي. أغسل الماء (انظر الجدول للمواد) بيليه سبور 2-3 مرات مع 1.5 مل من 1 نوع فائقة نقية معقمة وأسفل تدور بينهما في س 9,560 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. وأخيراً، تعليق بيليه في الماء 1 نوع فائقة نقية معقمة ل التطوير التنظيمي نهائي600 من حوالي 30. ويمكن تخزين مختبرين للجراثيم في-80 درجة مئوية لمدة 8 أسابيع14.
2-نزع
- علاج الجراثيم PS4150 مع 0.1 M كلوريد الصوديوم/0.1 م NaOH/1% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)/0.1 M ديثيوثريتول (DTT) في 70 درجة مئوية حاء 1 يغسل الجراثيم 10 مرات مع الماء 1 نوع فائقة نقية معقمة15،16. بالقيام بذلك، أي تمتز مسبار FM4-64 في الغشاء الخارجي بوغ وستتم إزالة الطبقات الخارجية.
3-ساترة وإعداد الشرائح11 (توقيت: ح 1 قبل المراقبة)
- قبل تنظيف عالية الدقة كوفيرسليبس (انظر الجدول للمواد) مع HCl م 1 لمدة 30 دقيقة في حمام مائي تهتز برفق. أغسل كوفيرسليبس مرتين في نقية فائقة 1 نوع المياه، وتخزينها في 100% (المجلد/المجلد) EtOH. والسماح لهم الجافة والتحقق من الوضوح قبل الاستخدام. قبل تنظيف الشرائح الزجاجية في 70% EtOH. والسماح لهم الجافة والتحقق من الوضوح قبل الاستخدام.
4-أخذ العينات الفلورسنت الجزئي المجالات الخرز الصغير أو جراثيم في الإطار الجينات الشريحة10 (توقيت 15 دقيقة)
- الحارة قبل عامين 70% EtOH تنظيفها والهواء الشرائح الزجاجية المجففة (انظر الجدول للمواد) لعدة ثوان على كتلة تدفئة 70 درجة مئوية وإسقاط ميكروليتر 65 من تعقيم 2% [اغروس] عقد في 70 درجة مئوية فوق شريحة زجاجية واحدة ومكان الشريحة الزجاجية الأخرى على أعلى لنشر ب [اغروس] الفترة الشرائح. وسوف يجف التصحيح [اغروس] في حوالي 5 دقائق.
- قطع التصحيح [اغروس] إلى مقطع 1 × 1 سم بعد إزالة إحدى الشرائح الزجاجية وإضافة 0.4 ميكروليتر من عينة (الفلورسنت الجزئي المجالات الخرز الصغير أو جراثيم من/mL8~ 10)، ونقل التصحيح إلى ساترة عالية الدقة بوضع ساترة على التصحيح و انزلاق من إيقاف تشغيله.
- إصلاح الإطار الجينات (1.5 x 1.6 سم2, 65 ميليلتر) على شريحة المجففة، التي وضعت ساترة إغلاق جميع زوايا الإطار، ومن ثم استكمال الشريحة لاستخدامه في الفحص المجهري.
5-التصوير11،17(توقيت: ح 1)
- التقاط الصور الإرسال والأسفار من الجراثيم وكذلك خليط من الأحمر والأصفر والأخضر تعديل كاربوكسيلات نيون الجزئي المجالات الخرز الصغير في "مجهر إضاءة منظم" (انظر الجدول للمواد) مجهزة 100 × (موضوعي النفط الفتحة العددية = 1.49)، اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا والصورة برمجيات تحليل (انظر الجدول للمواد). تولد كل الصور في درجة حرارة الغرفة دون الإخلال بالإضاءة المحيطة. تأكد من تنظيف دائماً 100 × الهدف والشريحة مع الإيثانول 75% قبل التصوير.
- التركيز على 100 نانومتر (قطر) الفلورسنت الجزئي المجالات الخرز الصغير وتحسين انتشار النقطة الدالة (psf) عن طريق ضبط الطوق التصويب على الهدف 100 x حتى يتم الحصول على psf متماثل، وبالتالي التقليل من عدم وضوح الصورة. Psf هو استجابة الدافع أو رد نظام التصوير إلى نقطة المصدر أو كائن نقطة.
- حدد مجال رؤية مع الجزئي المجالات الفلورسنت الخرز الصغير الجولة حوالي الساعة 10. تطبيق [غرتينغ] التركيز التكيف لكلا 561 نانومتر و 488 نانومتر الإثارة أطوال الموجه كدليل لبرامج تحليل الصورة.
- تركز الجراثيم مع انتقال الضوء والتقاط صورة انتقال ضوء في وضع متوسط 16 × مع التعرض 200 مللي ثانية لكل صورة.
- التقاط الصور 3D-سيم الفلورية الخام من الجراثيم مع وضع الإضاءة "3D-سيم"، إعدادات الكاميرا إلى وضع قراءات كسب الإلكترون (م) ضرب 10 ميغاهيرتز في 14-بت، وكسب م في 175. تثير المسبار FM4-64 في جراثيم PS4150 مع 561 ضوء الليزر في شمال البحر الأبيض المتوسط في 20% طاقة الليزر، ووقت إضاءة 400 مللي ثانية.
- تثير جيركب-مشري والجراثيم غيرد-التجارة والنقل في KGB80 مع، على التوالي، 561 نانومتر الليزر الخفيفة في قوة الليزر 30% 1 s، وشمال البحر الأبيض المتوسط 488 الليزر الضوء على 60% الليزر السلطة لضبط المكدس ض س. 3 في الأعلى أسفل وضع، 0.2 ميكرون/الخطوة والخطوات 7 20 خطوات جيرمينوسومي و تحليل التراسل الفوري، على التوالي.
ملاحظة: وقد طبقت هذه المعلمات الليزر بغية ضمان قيمة سطوع الحد أقصى من إطار الرسم البياني من حوالي 4000.
6-إعادة بناء سيم 3D صور Raw من FM4-64 الملون جراثيم PS4150
- تؤدي "إعادة شريحة" سيم ن FM4-64 الملون PS4150 الجراثيم البيانات الخام. انقر فوق الزر بارام إعادة بناء شريحة على ورقة التبويب لوحة سيم ن لفتح نافذة سيم ن "شريحة الإعمار".
- تعيين معلمات التعمير في إطار إعادة الإعمار شريحة سيم ن . للحصول على صور مثالية أعيد بناؤها، اتبع اقتراح التعليمات سيم ن وانقر فوق عناصر التحكم المناسبة في إطار سيم ن شريحة الإعمار لضبط التباين تعديل الإضاءة (IMC) السيارات، عالية قمع الضوضاء القرار (هرنس) إلى 1.00 و الخروج من قمع طمس التركيز (أوفبس) إلى 0.05 كنقطة انطلاق.
- انقر فوق الزر إعادة شريحة في نافذة سيم ن شريحة الإعمار لإعادة بناء الصورة. تقييم جودة الصور أعيد بناؤها بالصور سريعة فورييه تحويل (FFT) ونقاط إعادة الإعمار، مما عرض بعد إعادة إعمار12.
- ضبط هرنس من 0.10 إلى 5.00 و أوفبس من 0.01 إلى 0.50 بالنقر فوق عناصر التحكم المناسبة في إطار إعادة الإعمار شريحة سيم ن حتى يتم الحصول على أفضل إعدادات المعلمة.
- انقر فوق الزر " تطبيق " في إطار Reconstuction شريحة سيم ن لتطبيق تغيير المعلمات. انقر فوق الزر إغلاق لإغلاق الإطار.
- جعل FM4-64 الملون PS4150 جراثيم الخام الصورة النشطة، وانقر فوق الزر إعادة شريحة على صفحة التبويب لوحة سيم ن لتنفيذ إعادة الإعمار شريحة. حفظ الصورة أعيد بناؤها.
7-صورة التحليل
-
تحويل الصور الزائفة-ويديفيلد من جيرمينوسومي KGB80
- تحويل سيم 3D صور خام من KGB80 إلى الصور الزائفة-ويديفيلد بتفعيل البرنامج المساعد إيماجيج سيمتشيك الأداة المساعدة SI البيانات الخام إلى ويديفيلد الزائفة12مع النقر على يسار. المتوسطات الصور من البيانات الخام سيم ويديفيلد الزائفة وتجمع، على سبيل المقارنة، أي ما يعادل ويديفيلد التقليدية إنارة12صورة. ل ImageJ نفسها انظر https://imagej.net/Welcome. حدد جراثيم ~ 25 عشوائياً في كل صورة الإرسال المعكوس لتحليلها في وقت لاحق جيرمينوسومي في الصور الزائفة-ويديفيلد نيون.
- حدد في مجموعها ما يقرب من 350 (في هذا المثال، 346) KGB80 الجراثيم في الحقول لعرض 14 من شريحتين. ينبغي أن يحسب الأرقام البؤر الفلورسنت غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري في جراثيم KGB80 المحدد بشكل مستقل باثنين من الباحثين. الباحث يمكن الرجوع إلى الصور 3D-سيم الخام كلما كان في شك وجود بؤر جيرمينوسومي نيون منفصلة في الجراثيم.
- تقييم الكثافات كحد أقصى لكل بؤرة غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري وكثافة صورة كل بوغ KGB80 في ثلاثية الأبعاد مع إيماجيج المتكاملة.
-
تحليل الصور الزائفة-ويديفيلد من جيرمينوسومي KGB80
- استخدام قيمة كثافة متكامل يعني مكدسات 7 ككثافة إشارة المتكاملة بوغ KGB80. تحديد كثافة الخلفية بالتصوير الخلفية سلالة PS4150 باستخدام إعدادات متطابقة. تعتبر البقع الفلورسنت في فرادى KGB80 جراثيم البؤر جيرمينوسومي عندما تكون واضحة يمكن تمييزها عن الخلفية.
- تطبيق اختبارات ANOVA أحادي الاتجاه لتحديد أهمية مع البرمجيات 9.0 المنشأ. النظر في القيم ف < 0.05 إحصائيا هامة. استخدام معامل ارتباط الرتب سبيرمان18 لتقييم الترابط بين عدد البؤر غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري وقياسات كثافة إشارة المتكاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويقدم البروتوكول الحالي إجراء تصوير مجهر سيم للجراثيم البكتيرية. وأجريت إجراءات إعداد تبوغ والشريحة كما هو مبين في الشكل 1 قبل التصوير. في وقت لاحق، تم تطبيق إجراءات التصوير والتحليل سواء بالنسبة لتعتيم (الفلورسنت البروتين المسمى البروتينات الإنبات) ومشرق عينات سبور (المسبار محبتين الملون إيم) كما هو مبين في النص التالي.
تعريب جيرمينوسوميس في جراثيم نجحت
مستويات غيرد وجيركب يقال أن جزيئات ~ 3,500 و ~ 700 كل بوغ، على التوالي، استناداً إلى تحليلات لطخة غربية لمقتطفات من الجراثيم التي أعدت في تبوغ غنية متوسطة19. الجينات غيرد-التجارة والنقل و جيركب-مشري على السواء في سلالة KGB80 الخاضعة لسيطرة على مروج الأصلي. الوفرة النسبية منخفضة من البروتينات الانصهار أدى إلى إشارة فلورية منخفضة أثناء التصوير، حيث كان من الصعب لإعادة بناء تلك الصور سيم الخام خافت قبل خوارزمية إعادة الإعمار سيم. بيد المجهر سيم كان مطبقاً لاقتناء الصور جيرمينوسومي، على الرغم من أن الصور سيم الخام تم تحويلها إلى الصور الزائفة – ويديفيلد من سيمتشيك (إيماجيج المساعد). وباﻹضافة إلى ذلك، نفذ تصوير ثلاثي الأبعاد مكدس سبعة الحصول على نظرة أفضل من هذا التركيز إيم. كما هو موضح في لوحة اليد اليسرى من الشكل 2، ظهرت بؤر اثنين من غيرد-التجارة والنقل في مكدسات مختلفة. ، في المجموع، ترد ثلاثة بروتينات فلورية خضراء-غيرد البؤر بالأسهم البيضاء الموجودة في Z3 المكدس العمود compositive. لوحة اليد اليمنى الشكل 2 يظهر سبور مع جهة واحدة فقط في غيرد--الناتج المحلي الإجمالي في بوغ كما يدل على ذلك السهم الأبيض في مكدس العمود المركب Z4. وفي المجموع، حوالي 40% و 50% من الجراثيم قد اثنين أو مجموعة واحدة غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري، على التوالي (الجدول 1). بين الجراثيم 346 بحث، اثنتان منهن 4 غيرد-بروتينات فلورية خضراء البؤر وبوغ واحد حتى لو كان 5 البؤر غيرد-التجارة والنقل. ملحوظة، في أيدينا، عدد البؤر غيرد-التجارة والنقل وجيركب-متشيري في بوغ نفسها لم تكن دائماً نفس18. كما كان المجهر سيم أي خيار التباين المرحلة، قمنا باستخدام مجهر الضوء للتعريب بوغ. وهكذا تظهر جراثيم مع نواة داكنة وكثيفة محاطة بهالة أكثر إشراقا.
كان تقاس كثافة fluorescence المتكاملة من جراثيم KGB80 إيماجيج. ولم تدرج جراثيم، الذي كان 0, 4 أو 5 البؤر في تحليلنا الإحصائي بسبب ما تردد منخفض. كان هناك ارتباط إيجابي عالية بين غيرد-التجارة والنقل وكثافة جيركب-مشري المتكاملة (معامل ارتباط الرتب سبيرمان = 0.73). بينما كثافة البروتين سقالة غيرد-التجارة والنقل المتكاملة كان مختلفاً بين مختلف قطاعات السكان (الشكل 3)، كانت كثافة المتكاملة جيركب-مشري عن نفسه في مختلف قطاعات السكان (الشكل 3D). كثافة البؤر غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري fluorescence أقصى تميل إلى الانخفاض، عندما كان بوغ متعددة البؤر (الشكل 3 أ، ب). الأسفار الحد الأقصى من جميع النقاط المضيئة، تعتبر البؤر جيرمينوسومي، كان أعلى من الحد الأقصى التلقائي-الأسفار من الجراثيم PS4150 (جراثيم من سلالة الخلفية KGB80؛ الشكل 3 ألف ب.)
منظمة الغشاء الداخلي
كما ذكر في المقدمة، والبروتينات جيرمينوسومي يقع في الدردشة بوغ. ومع ذلك، معروفة إلا القليل من التفاصيل حول الخصائص الفيزيائية لهذا الغشاء غير متحرك إلى حد كبير. استكشاف مزيد من التفاصيل، مثل منظمة محلية للدردشة، سيعزز فهم تنظيم البروتينات إيم، بخاصة الموارد الوراثية والبروتينات القناة. باء-نجحت الجراثيم بنية تتألف من عدة طبقات متحدة المركز، وتحقيق محبتين لا تمر عبر هذه بسهولة طبقات متعددة لوصمة عار إيم المحيطة بنواة بوغ. الأرجح يعوقها مرور هذه المسابر الطبقات معطف الغنية بالبروتين، وربما أيضا20،الغشاء الخارجي21. للتغلب على هذه المشكلة، تمت إضافة صبغ الغشاء محبتين FM4-64 لثقافة PS4150 خلال تبوغ. بالقيام بذلك، كان الملون غشاء الخلية النباتية PS4150 طريق FM4-64، وهكذا ملطخة أغشية في فوريسبوريس التي تم الحصول عليها من هذه الثقافة في انقسام الخلية تبوغ غير متماثلة والإحاطة فوريسبوري اللاحقة أيضا5. ونتيجة لذلك، يمكن تصور الأغشية في بوغ ناضجة. دراسة سابقة أشارت إلى أن معظم، أن لم يكن كل من FM4-64 في الدردشة في تنظيفها من الجراثيم5. إزالة الغسيل الإجراءات المطبقة خلال فترة أسبوع تقريبا 2 حضانة والعلاجات تنقية بوغ، أي FM4-64 من الغشاء الخارجي، وهذه الأخيرة فعالية يتم إزالتها بعد العلاج ديكواتينج والغسيل خطوات واسعة 5-ومع ذلك، الإجراء ديكواتينج الذي يزيل لا FM4-64 من الدردشة ولا له أي تأثير على5،البؤر جيرمينوسومي6. ما متحمس لنا هو أن أكثر إشراقا FM4-64 بقع مشابهة للبؤر جيرمينوسومي ظهرت في كلا سليمة (الشكل 4 أ، ب) وديكواتيد جراثيم (الشكل 4, D) من جراثيم PS4150. يمكن أن تشترك هذه البقع FM4-64 أكثر إشراقا في تجميع البروتينات جيرمينوسومي في الدردشة.
رقم 1: نظرة عامة على إعداد تبوغ والشريحة. نظرة عامة عرض الخطوات الأولية اللازمة قبل التصوير. وترد معلومات مفصلة في البروتوكول. (أ) التخطيطي الإجراء تبوغ في الممسحات الحد الأدنى المحددة المتوسطة. PS4150 ب-نجحت (PS832 Δجير::توافق آراء ساو باولو Δكوت::تيت) أو KGB80 (PS4150 جيركا جيركك جيركب-مشري القط كان غيرد-التجارة والنقل) مستعمرة واحدة كان مثقف في 5 مل متوسطة الغنية رطل، وتكييفها في 5 مل و 20 مل من والمماسح المتوسطة بدوره، وأخيراً سبورولاتيد في 250 مل متوسطة والمماسح. ثقافة مرحلة مبكرة من أسي (OD600، 0.3-0.4) يستخدم في جميع الثقافات الوسيطة. FM4-64 (2 ميكروغرام/مل) أضيفت إلى المتوسطة تبوغ PS4150 للغشاء بوغ تلطيخ 1 أو 2 ح بعد بلوغ ذروة OD600 القيمة. (ب) طريقة الحصاد جراثيم من الثقافة تبوغ والمماسح وتنقية الجراثيم بكثافة التدرج الطرد المركزي. (ج) إجراء تحقيق استقرار جراثيم على 1% [اغروس] لوح في دائرة إطار جينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تم أخذ صور 3D الزائفة-ويديفيلد الممثل (بوف) بؤر غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري في اثنين KGB80 (PS4150 جيركا جيركك جيركب-مشري القط كان غيرد-التجارة والنقل) نائمة جراثيم سيم 3D صور خام مع الإثارة قناة مزدوجة (561nm، السلطة الليزر 30%، 1 s، و 488nm، 60% بالليزر السلطة، 3 s) استخدام الخطوات 7 من أعلى إلى أسفل Z-مداخن- وفي وقت لاحق، الصور سيم الخام تم تحويلها إلى الزائفة-ويديفيلد 3D صور بالبرنامج المساعد إيماجيج سيمتشيك. من اليسار إلى اليمين، 3D صور (Z2-Z5) غيرد-التجارة والنقل (الأخضر)، يرد في لوحة جيركب-مشري (أحمر) والصور المركبة المقابلة لاثنين من الجراثيم KGB80 (الأولى والثانية). وأشار إلى انتقال (ترانس) الصور الخفيفة من جراثيم اثنين (الأولى والثانية) موقع الجراثيم التي تظهر كصور كثيفة مظلمة محاطة بهالة أكثر إشراقا. مقياس بار = 1 ميكرومتر وكل اللوحات في التكبير نفسه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: Fluorescence أقصى كثافة غيرد-التجارة والنقل في KGB80 (PS4150 جيركا جيركك جيركب-متشيري كات كان غيرد-التجارة والنقل) جراثيم نائمة، وكثافة السيارات الحد الأقصى-الأسفار جراثيم PS4150 في وحدات التعسفي. كانت مضيئة في جراثيم جميع الإعدادات أشارت إلى البروتوكول. لوحات (أ) و (ب) إظهار كثافة fluorescence الحد الأقصى من البؤر غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري، على التوالي، في KGB80 جراثيم نائمة كذلك كما هو الحال في كلتا الحالتين كثافة الجراثيم الأصل PS4150 fluorescence السيارات كحد أقصى. لوحات (ج) و (د) إظهار كثافة fluorescence المتكاملة البؤر غيرد-التجارة والنقل وكثافة fluorescence المتكاملة من بؤر جيركب-مشري، على التوالي، في KGB80 ب-نجحت جراثيم نائمة. كنا أحادي الاتجاه ANOVA-اختبارات لتحديد أهمية الاختلافات في كثافة الحد الأقصى من جهة وكثافات fluorescence بوغ متكاملة مع برامج 9.0 الأصل النظر في القيم ف < 0.05 ككبير. استبعدت الجراثيم مع البؤر 4 أو 5 من التحليل بسبب ما وفرة منخفضة. يتم تمثيل البيانات في بوكسبلوتس مسنن. الشقوق في المؤامرات حول القيم الوسطية لاحظ مع انتهاء العرض تتناسب مع نطاق المجال (IQR). تمثل شعرات سيظهر كحد أقصى 1.5 IQR. تشير العلامات النجمية إلى فرقا ملحوظا من متوسط القيم. غيرد-التجارة والنقل والمتكاملة جيركب-مشري fluorescence الكثافات لها ارتباط إيجابي قوي (معامل الارتباط سبيرمان = 0.73)18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: الصور الزائفة-ويديفيلد الممثل (بوف) (ألف وجيم) وأعيد بناؤها سيم الصور (ب ود) FM4-64 الملون إيم PS4150 نجحت (PS832 ΔgerE::spc، ΔcotE::tet) جراثيم. أدرج وزير الخارجية-464 جراثيم خلال تبوغ. واتخذت سيم 3D صور raw من جراثيم سليمة (A و B) وجراثيم ديكواتيد (C و D) مع الإثارة قناة واحدة (561 نانومتر الليزر، الليزر 20% طاقة، 400 مللي ثانية) استخدام خطوة 25 من أعلى إلى أسفل Z-المكدس. وفيما بعد، أعيد البيانات الخام سيم بالمجهر برامج التصوير (انظر الجدول للمواد) إلى صور 3D-سيم، أو تحويلها إلى بوف من سيمتشيك (المساعد إيماجيج). الأسهم السماوي أشر إلى بؤر FM4-64 في الدردشة في لوحة ب ود. مقياس بار = 1 ميكرومتر وكل اللوحات في التكبير نفسه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| إجهاد | جراثيم عد | مجالات التركيز | مجالات التركيز الواحدة سبور (%) | |||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||
| KGB80 | 346 | غيرد-بروتينات فلورية خضراء | 2 | 46 | 40 | 11 | 1 | 0 | ||
| جيركب--مشري | 2 | 53 | 40 | 5 | 0 | 0 | ||||
الجدول 1: وجود البؤر في جراثيم KGB80. عدد البؤر جيرمينوسومي كل بوغ في عدد سكانها المزدوج المسمى KGB80 نجحت (PS4150 جيركا جيركك جيركب--القط مشري غيرد-التجارة والنقل كان) جراثيم نائمة. الأسفار في جراثيم كانت تحسب كبؤر جيرمينوسومي عندما كان الأقصى كثافة التركيز أعلى من كثافة السيارات-الأسفار، الذي كان أقصى شدة PS4150 (PS832 Δجير::توافق آراء ساو باولو Δكوت::تيت) جراثيم نائمة متحمس بضبط الإضاءة نفس الجراثيم KGB80.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتضمن البروتوكول عرضت إجراء سيم 3D قياسية لتحليل الملون جراثيم نجحت 64 FM4 يتضمن تبوغ وإعداد الشرائح وعمليات التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، وصف البروتوكول تعديل سيمتشيك (إيماجيج)-ساعدت 3D التصوير عملية مجهرية سيم من جيرمينوسوميس بوغ نجحت المسمى مع الصحفيين الفلورسنت. الإجراء الأخير الذي سمح لنا بمراقبة هذه الهيكلية خافت مع التباين المحسن. باقتران إجراءات التصوير اثنين، فإنه من الممكن تصور الهياكل الفرعية المنفصلة في بوغ نفس مع المجهر سيم ذاتها، وبالتالي تحسين لدينا أساسا لفهم ميكانيكية لعملية الإنبات. علما بأن الإجراء يعمل بدقة أفقية ~ 100 نانومتر وقرار محوري ~ 200-250 نيوتن متر. وهذا أفضل من التباين التدخل التفاضلية (DIC) مجهرية واسع المجال النهج المتبع من قبل غريفيث7. حل وقت تحليل المظهر جيرمينوسومي عند بدء الإنبات سيكون خطوة تالية المرجوة. ولسوء الحظ، على الرغم من سيم مجهرية من حيث المبدأ متوافقة مع العيش-التصوير، نظراً لطبيعة قاتمة جيرمينوسومي إشارات مثل سيم حل الوقت، التحليلات ليست مجدية بسبب التبييض السريع للعينات أثناء الحصول على الصور. بغية الحصول على جراثيم كافية للتحليل، من الأهمية بمكان التأكد من أن تبوغ يجري كفاءة. يجب أن تحقق الباحثين ولذلك كفاءة تبوغ دقة مع 90% من الكفاءة كالهدف. في نتائج تمثيلية، جراثيم نائمة، على التوالي ~ 50% و 40% من كافة الجراثيم، لدى واحد أو اثنين من غيرد-التجارة والنقل والبؤر جيركب-مشري (الجدول 1). النسبة المئوية للجراثيم مع البؤر اثنين أعلى بكثير من التي أوردها غريفيث سابقا7. وهناك العديد من الأسباب التي يمكن أن تفسر على نتيجة مختلفة في العمل الحالي. أولاً، يمكن أن تسهل 3D التصوير عملية الكشف عن مزيد من البؤر. وتقع بؤر مختلفة في بوغ نفسه في مواقع مختلفة في الاتجاه الرأسي كما هو مبين في الشكل 1. وثانيا، CCD الكاميرا (جدول المواد) ووحدة ليزر مجهزة بالمجهر سيم تسهم إسهاما كبيرا نتائج التصوير. الثالث، على غرار غريفيث في نهج7 متوسط عشرات الصور على التوالي لتحليل الصورة أفضل، الصورة الزائفة-ويديفيلد جيرمينوسومي كان أيضا متوسط صورة من صور raw سيم (5 مراحل و 3 توجهات الصور). وأخيراً، تبوغ المتوسطة وظروف تبوغ، متغيراً هاما في تحديد خصائص بوغ، تختلف في عملنا المستخدمة سابقا. تستخدم غريفيث et al.7 2 الغنية x شيفر للسكر (2 × سان جرمان) المتوسطة تبوغ، بينما والمماسح الحد أدنى معرفة المتوسطة المخزن كان يعمل هنا. وقد أثبتت عدة ورقات أن تبوغ المتوسطة وظروف لها آثار هامة على تكوين البروتين، المقاومة، وإنبات باء-نجحت الجراثيم22،،من2324 , 25-وفي الواقع، فقد ثبت أن مستويات الموارد الوراثية مفارز 3 إلى 8 إضعاف أقل في جراثيم الحصول على وسيلة فقراء مقابل تلك التي تم الحصول عليها في الغنية والمتوسطة. غيرد مستويات أقل بحوالي 3.5-fold في جراثيم المتوسطة الفقيرة أيضا، وهذه الجراثيم قد استغرق وقتاً أطول لبدء الإنبات سبور26. ومع ذلك، هو ليس من الواضح ما إذا كانت شروط تبوغ تؤثر أيضا على عدد البؤر جيرمينوسومي الملاحظة.
راميريز-بيرالتا et al.' نتائج s26 أشارت إلى أن معدلات من المغذيات إنبات جراثيم على مستويات السكان تتأثر إلى حد كبير بمستويات البروتينات الإنبات وغيرد. وإذا كان شدة الفلورسنت متكامل كل بوغ من الصحفيين الفلورسنت طرديا مع مستويات البروتينات الانصهار غيرد وجيركب، تختلف مستويات البروتينات الانصهار على حد سواء على نطاق واسع في جراثيم KGB80، وهو الاتفاق مع الأعمال السابقة 7-تباين مستوى هذا البروتين قد يكون مرتبطاً بعدم تجانس الإنبات بوغ لاحظ بوغ وحيدة على الصعيد، وقد يكون عدد البؤر جيرمينوسومي عامل آخر يسهم في عدم تجانس الإنبات بوغ. تجارب أخرى سوف تركز على تحليل للأثر المحتمل أن عدد البؤر جيرمينوسومي ويمكن أن يكون تكوين البروتين إنبات البؤر (قد يكون جيرمينوسوميس ليست كلها متساوية في تكوين البروتين الإنبات) على عدم تجانس الإنبات. البيانات يثير عددا من الأسئلة البحثية الحالية بما في ذلك: أنا) ما هو دور غيرد في تجميع الموارد الوراثية في التراسل الفوري؛ وثانيا) كيف يتم الاثنين الأخرى الموارد الوراثية وغيرا وجيرب، نظمت في بوغ إيم؟
البروتوكول لعينات بوغ قاتمة ومشرقة يجعل من الممكن تصور الهياكل الفرعية المنفصلة في بوغ نفس طريق الفحص المجهري سيم. قد يرجع FM4-64 النقاط المضيئة التي لوحظت في جراثيم قابلة للطي واسعة النطاق ل الدردشة27. وبدلاً من ذلك، نحن افترض أن هذه المناطق هي مناطق للدردشة حيث الصبغ يمكن أكثر سهولة الوصول إلى سبب زيادة السيولة المحلية عن الدردشة. يمكن تنظيم مثل هذه "المناطق لزيادة السيولة" (ريفس) قبل المناظرة أكتين cytoskeletal مريب، معروفة جيدا لتركيز السائل اشيل قصيرة السلسلة الدهون28،29. ملحوظة، تطبيق نفس الإجراء إلى البرية من نوع باء-نجحت الجراثيم يؤدي أيضا إلى نمط مماثل من النقاط المضيئة FM4-64 (ملاحظاتنا غير منشورة). في الخلايا النباتية نجحت ، نتائج محتملة غشاء المنهار في تجميع مريب وريفس29. الغشاء الداخلي لجراثيم نائمة المحتمل غشاء منخفض نسبي محتملة20،21 ويحتوي على مستويات ملحوظة من مريب30 التي قد تؤدي إلى تجميع ريفس إلى مجالات أكبر من سيولة عالية29 . ويجري حاليا التحقيق ما إذا كانت هذه المجالات يمكن أن يتزامن مع وجود جيرمينوسوميس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون كريستيان زيلينبيرج لمساعدته أثناء تصوير سيم. جي دبليو يقر "مجلس المنح الدراسية الصيني" لزمالة درجة دكتوراه وشكرا إيرين ستيلينجويرف لمساعدة لها المرحلة الأولية من التصوير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| ImageJ | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
