Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Visualisering af Germinosomes og den indre membran i Bacillus subtilis sporer

Published: April 15, 2019 doi: 10.3791/59388
Automatic Translation
1, 1, *2,3, *4, *1
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health
* These authors contributed equally

Summary

Germinant receptor proteiner klynge i 'germinosomes' i den indre membran af Bacillus subtilis sporer. Vi beskriver en protokol bruger super opløsning mikroskopi og lysstofrør reporter proteiner til at visualisere germinosomes. Protokollen identificerer også spore indre membran domæner, der fortrinsvis farves med membran farvestof FM4-64.

Abstract

Den lille størrelse af sporer og den relativt lave overflod af spiring proteiner, forårsage vanskeligheder i deres mikroskopiske analyser ved hjælp af epifluorescensmikroskop mikroskopi. Super-opløsning tredimensional struktureret belysning mikroskopi (3D-SIM) er et lovende redskab til at overvinde denne forhindring og afsløre de molekylære detaljer af processen for spiring af Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer. Her, vi beskriver brugen af en modificeret SIMcheck (ImageJ)-assistent 3D billedprocessen og fluorescerende reporter proteiner til SIM-mikroskopi af B. subtilis sporer germinosomes, clusters af spiring proteiner. Vi præsenterer også en (standard) 3D-SIM imaging procedure for FM4-64 farvning af B. subtilis spore membraner. Ved hjælp af disse procedurer, vi opnåede uovertruffen opløsning for germinosome lokalisering og viser, at > 80% af B. subtilis KGB80 hvilende sporer fremstillet efter sporulering på definerede minimal MOPS medium har en eller to GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry Foci. Lyse foci blev også observeret i FM4-64 farves sporer 3D-SIM billeder tyder på, at indre membran lipid domæner af forskellige fluiditet sandsynligvis findes. Yderligere er undersøgelser, der bruger dobbelt mærkning procedurer med membran farvestoffer og germinosome reporter proteiner til at vurdere Co lokalisering og dermed få et optimalt overblik over organiseringen af Bacillus spiring proteiner i indre spore membran muligt.

Introduction

Sporerne af ordrerne, Bacillales og Clostridiales er metabolisk inaktive og usædvanlig modstandsdygtig over for barske dekontaminering regimer, men medmindre de spire, ikke kan forårsage skadelige virkninger i mennesker1. I næringsstof germinant udløste spiring af Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer er hændelsen indledning germinant binding til germinant receptorer (GRs) placeret i den spore indre membran (IM). Efterfølgende, transduce GRs signaler til den SpoVA kanal protein også placeret i IM. Dette resulterer i fremkomsten af udveksling af spore core pyridin-2,6-dicarboxylsyrer syre (dipicolinic syre; DPA; bestående af 20% af spore core tør wt) for vand via SpoVA kanal. Efterfølgende, DPA release udløser aktivering af cortex peptidoglycan hydrolyse, og ekstra vand optagelse følger2,3,4. Disse begivenheder medfører mekanisk stress på coat lag, dets efterfølgende brud, udbrud af udvækst og endelig vegetativ vækst. Men de præcise molekylære detaljer af spireevne processen er stadig langt fra løst.

En større spørgsmål om sporespiring vedrører de biofysiske egenskaber af lipider omkring IM spiring proteiner samt IM SpoVA kanal proteiner. Denne stort set ubevægelige IM lipid tolagede er den vigtigste permeabilitet barriere for mange små molekyler, herunder giftige kemiske konserveringsmidler, hvoraf nogle øve deres aktion i spore core eller vegetativt cellen cytoplasma5,6. IM lipid tolagede forventes i en gel, selv om der er en betydelig brøkdel af mobile lipider i IM5. Spore's IM har også potentiale for betydelig udvidelse5. Således er arealet af IM øger 1.6-fold efter spiring uden yderligere membran syntese og er ledsaget af tabet af denne membran karakteristiske lav permeabilitet og lipid immobilitet5,6.

Mens de Molekylær oplysninger om aktivering af spiring proteiner og organisation af IM lipider i sporer er attraktive emner til undersøgelse, udgør den lille størrelse af B. subtilis sporer og den relativt lave overflod af spiring proteiner, en udfordring mikroskopiske analyser. Griffiths et al. overbevisende epifluorescensmikroskop mikroskop beviser, tyder ved hjælp af fluorescerende reportere smeltet til spiring proteiner, på, at i B. subtilis sporer stillads protein GerD arrangerer tre GR underenheder (A, B og C) for GerA, B og K GRs, i en klynge7. De opfandt udtrykket 'germinosome' for denne klynge af spiring proteiner og beskrevet strukturerne som ~ 300 nm store IM protein foci8. Ved indledningen af sporespiring, fluorescerende germinosome foci i sidste ende ændre i større sprede fluorescerende mønstre, med > 75% af spore populationer vise dette mønster i sporer spirede i 1 time med L-valin8. Bemærk, at papiret nævnt ovenfor brugte i gennemsnit billeder fra snesevis af på hinanden følgende fluorescerende billeder, at få statistiske magt og overvinde forhindring af lav fluorescerende signaler observeret under imaging. Denne visualisering af disse strukturer i bakteriesporer var på kanten af hvad der er teknisk gennemførligt med klassisk mikroskopiske værktøjer og hverken en vurdering af mængden af foci i en enkelt spore var heller ikke deres mere detaljerede subcellulært lokalisering muligt med denne tilgang.

Her, demonstrere vi brugen af strukturerede belysning mikroskopi (SIM) at opnå en detaljeret visualisering og kvantificering af germinosome(s) i sporer af B. subtilissamt deres IM lipid domæner9. Protokollen indeholder også instruktioner til sporulering, dias forberedelse og billedanalyse af SIMcheck (v1.0, en imageJ plugin) samt ImageJ10,11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. B. subtillis sporulering (Timing: 7 dage før mikroskopiske Observation)

  1. Dag 1
    1. Streak en bakteriel kultur på en Luria-Bertani bouillon (LB) agar plade (1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 1% NaCl, 1% agar)13 og der inkuberes natten over ved 37 ° C til indhente enkelt kolonier. Bruge B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat, gerD-normal god landbrugspraksis kan) stamme og dens baggrund stamkulturen B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) som tidligere beskrevet7.
      Bemærk: Brugen af sporer med ΔcotEΔgerE baggrund er afgørende for germinosome visualisering, for at minimere autofluorescence af spore coat lag7.
    2. Sterilisere alle medier, rør, pipets og andre kultur materialer skal anvendes med passende metoder.
  2. Dag 2
    1. Podes en enkelt koloni i 5 mL af LB medium tidligt om morgenen og inkuberes kultur under kontinuerlig agitation i et skruelåg rør på 200 rpm/min og 37 ° C, indtil OD600 når 0,3-0,4 (ca. 7 h).
    2. Gøre 500 mL af MOPS medium (pH 7,5) indeholdende 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1.32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0.276 mM K2så4, 0,01 mM FeSO4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPS, 4 mM Tricine, 0.1 mM frihedsbevægelse2·2H2O, 10 mM D-glucose-monohydrat, og 10 mM NH4Cl.
    3. Forberede i skruelåg rør 10-1- 10-7 serielle fortyndinger af LB kultur i 5 mL MOPS medium og inkuberes kulturer natten under kontinuerlig agitation på 200 rpm/min og 37 ° C.
      Bemærk: De serielle fortyndinger forberedt her til formål at opnå en fortynding i tidlige eksponentiel fase i den næste morgen. Dette trin og det næste skridt er nødvendige for, at cellerne at tilpasse sig MOPS bufferet vækstmediet.
  3. Dag 3
    1. Vælg en af MOPS fortyndinger med en OD600 af 0,3-0,4. Podes 0,2 mL af kultur præ varmede (37 ° c) 20 mL af MOPS medium i en konisk 250 mL kolbe, og der inkuberes under kontinuerlig agitation indtil OD600 når 0,3-0,4 (~ 7 h).
    2. Podes MOPS baseret sporulering medium (250 mL) med 1% (v/v) før kultur fra trin 1.3.1 og Inkuber i 3 dage ved 37 ° C i en konisk liters kolbe under kontinuerlig agitation. For FM4-64 farvning af PS4150 sporer, der tilsættes 2 µg/mL FM4-64 sonde (Se Tabel af materialer) til sporulering medium 1 eller 2 h efter at nå peak OD600 værdi af vegetative vækst (normalt ca. 2) og kultur til efterfølgende sporulate samtidig beskytte det fra lys5.
  4. Dag 7: Høst af sporer
    1. Bestemme sporulering udbytte (sporer vs vegetative celler) ved hjælp af fase kontrast mikroskopi på 100 X forstørrelse for at skelne fase lyse sporerne fra fase mørke celler og eventuelt ikke-modne sporer. En 90% fase lyse spore udbytte forventes.
    2. Pellet sporer på 4,270 x g i 15 min. ved 4 ° C i rund bund centrifugeglas. Vask spore pellet 2 - 3 gange med 40 mL sterilt ultra-rene Type 1 demineraliseret vand i 50 mL konisk centrifugeglas (Se Tabel af materialer). Spin-ned på hver vask på 4,270 x g i 15 min. (4 ° C).
  5. Dag 7: Spore rensning
    1. Spore rensning: suspendere spore pellet i 750 µL af 20% nonionisk tæthed gradient medium (Se tabel over materialer) og indlæse på 800 µL af 50% nonionisk tæthed gradient medium i steriliseret microcentrifuge rør. Der centrifugeres i 60 min på 21,500 x g. Bundfaldet fremkommer indeholder gratis sporerne. Suspendere spore pellet i 200 µL af 20% nonionisk tæthed gradient medium og indlæse på 1 mL 50% nonionisk tæthed gradient medium i et microcentrifuge rør, og der centrifugeres i 15 min. ved 21,500 x g.
    2. Vask endelig spore tilberedning og opbevaring: pellet opnået indeholder renset hvilende sporerne. Vask spore pellet 2 - 3 gange med 1,5 mL i sterile ultra-rene Type 1 vand (Se Tabel af materialer) og spin-ned i mellem ved 9,560 x g i 15 min. ved 4 ° C. Endelig, suspendere pellet i sterile ultra-rene Type 1 vand til en afsluttende OD600 omkring 30. Delprøver af Sporerne kan opbevares ved-80 ° C til 8 uger14.

2. decoating

  1. Behandle PS4150 sporer med 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% sodium dodecyl sulfat (SDS) / 0,1 M dithiothreitol (DTT) ved 70 ° C i 1 h. vaske sporerne 10 gange med steriliseret ultra-rene Type 1 vand15,16. Ved at gøre dette, nogen adsorberet FM4-64 sonden i spore's ydre membran og ydre lag vil blive fjernet.

3. Coverslip og Slide forberedelse11 (Timing: 1 H før Observation)

  1. Pre ren høj præcision coverslips (Se tabel over materialer) med 1 M HCl i 30 min. i et forsigtigt ryste vandbad. Vask coverslips to gange i ultra-rene Type 1 vand, og gemme dem i 100% (vol/vol) EtOH. Lad dem tørre og kontrollere deres klarhed før brug. Pre rene glas dias i 70% EtOH. Lad dem tørre og kontrollere deres klarhed før brug.

4. prøveudtagning fluorescerende mikrokugler eller sporer i rammen gen Skub10 (Timing 15 Min)

  1. Pre varm to 70% EtOH rengøres og luft tørret glas dias (Se tabel over materialer) i flere sekunder på en 70 ° C varme blok, drop 65 μL af steriliseret 2% Agarosen afholdt på 70 ° C på toppen af et glas dias og placere den andre glas dias på toppen til at sprede Agarosen b ellem dias. Agarosen patch vil tørre i ca 5 min.
  2. Skær Agarosen patch i en 1 x 1cm afsnit efter fjernelse af en af glas lysbilleder, tilføje 0,4 μL af prøven (fluorescerende mikrokugler eller sporer af ~ 108/mL) og overføre patch på høj præcision coverslip ved at placere coverslip på patch og skubbe det ud.
  3. Lave en Gene Frame (1,5 x 1,6 cm2, 65 µL) i diaset tørrede, som coverslip placeres lukker alle afkroge af rammen, således afslutte dias til brug i mikroskopi.

5. imaging11,17(Timing: 1 H)

  1. Fange transmission og fluorescens billeder af sporer og en blanding af rød og gul-grøn carboxylat-ændret fluorescerende mikrokugler på en struktureret belysning mikroskop (Se tabel over materialer) udstyret med et 100 x olie objektiv ( Numerisk blænde = 1,49), en CCD kamera og billede analyse software (Se tabel over materialer). Generere alle billeder ved stuetemperatur uden forstyrrelse af omgivende lys. Sørg for at altid rene 100 x mål og dias med 75% ethanol før billeddannelse.
  2. Fokusere på 100 nm (diameter) fluorescerende mikrokugler og optimere funktionen punkt spredt (psf) ved at justere korrektion ring på 100 x mål indtil en symmetrisk psf er opnået, hvilket minimerer sløring af billedet. Psf er impuls svar eller svar på en billedbehandlingssystem en punktkilde eller punkt objekt.
  3. Vælg et synsfelt med ca. 10 runde fluorescerende mikrokugler. Anvende en rist fokus justering for begge 561 nm og 488 nm excitation bølgelængder som vejledning for billede analyse software.
  4. Fokusere sporer med transmission lys og fange en transmission lys billede i tilstanden 16 × gennemsnitlig med 200 ms engagementer for hvert billede.
  5. Fange 3D-SIM rå fluorescerende billeder af sporer med belysning mode "3D-SIM", kamera-indstillinger til udlæsning tilstand elektron multiplikation (EM) gevinst 10MHz på 14-bit, og EM gevinst på 175. Excite FM4-64 sonden i PS4150 sporer med 561 nm laserlys på 20% laser power, og en belysning tid af 400 ms.
  6. Excite GerKB-mCherry og GerD-normal god landbrugspraksis i KGB80 sporer med henholdsvis 561 nm laser lys på 30% laser power for 1 s og 488 nm laserlys på 60% laser power for 3 s. Z-stakken indstillinger er i top til bund tilstand, 0,2 µm / step, 7 trin og 20 trin for germinosome og IM analyse, henholdsvis.
    Bemærk: Disse laser parametre blev anvendt for at sikre en maksimal lysstyrkeværdi af vinduet histogram af omkring 4.000.

6. rekonstruere 3D-SIM Raw billeder af FM4-64 farves PS4150 sporer

  1. Udføre N-SIM skive genopbygning for FM4-64 farves PS4150 sporer rådata. Klik på knappen Param for Rekonstruere skive på N-SIM pad under fanen ark at åbne vinduet N-SIM skive genopbygning.
  2. Genopbygning parametre er angivet i vinduet N-SIM skive genopbygning . For at få perfekte rekonstruerede billeder, følge forslaget om N-SIM instruktioner og klik på de relevante kontrolelementer i vinduet N-SIM skive genopbygning at indstille Belysningen graduering kontrast (IMC) til Auto, høj Opløsning støj Suppression (HRNS) til 1,00 og Ud af fokus sløring Suppression (OFBS) til 0,05 som udgangspunkter.
  3. Klik på knappen Rekonstruere skive i vinduet N-SIM skive genopbygning at rekonstruere billedet. Evaluere kvaliteten af de rekonstruerede billeder af Fast Fourier omdannet (FFT) billeder og genopbygning score, som vises efter genopbygning12.
  4. Justere HRNS fra 0,10 til 5,00 og OFBS fra 0,01 til 0,50 ved at klikke på de passende kontrol i vinduet N-SIM skive genopbygning indtil de bedste parameterindstillinger er opnået.
  5. Klik på knappen Anvend i vinduet N-SIM skive Reconstuction at anvende ændrede parametre. Klik på lukknappen for at lukke vinduet .
  6. Gøre en FM4-64 farves PS4150 sporer HUDLØS billed aktive og klik på knappen Rekonstruere skive på N-SIM Pad under fanen ark til at udføre Skive genopbygning. Gem den rekonstrueret image.

7. billedanalyse

  1. Konvertere Pseudo-Widefield billeder af KGB80 germinosome
    1. Konvertere 3D-SIM raw billeder af KGB80 til Pseudo-Widefield billeder af aktivering med en venstre klik ImageJ plugin SIMcheck nytte Rå Data SI - Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield gennemsnit billeder fra SIM rådata og samler, til sammenligning, et billede svarende til konventionel widefield belysning12. ImageJ finder sig https://imagej.net/Welcome. Tilfældigt vælge ~ 25 sporer i hvert inverteret transmission billede for senere germinosome analyse i fluorescerende Pseudo-Widefield billeder.
    2. Vælg i alt ca 350 (i dette eksempel, 346) KGB80 sporer i 14 felter i lyset fra to dias. GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry fluorescerende foci numrene i valgte KGB80 sporer bør tælles uafhængigt af to forskere. Forskeren kan referere tilbage til 3D-SIM HUDLØS billeder når i tvivl om tilstedeværelsen af separate fluorescerende germinosome foci i sporer.
    3. Vurdere de maksimale intensiteter af hver GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry fokus og integreret intensiteten af hver KGB80 spore 3D billede med ImageJ.
  2. Analysere Pseudo-Widefield billeder af KGB80 germinosome
    1. Brug intensitetsværdien betyder integreret for de 7 stakke som integreret signal intensiteten af KGB80 spore. Bestemme baggrunden intensiteter af imaging baggrund stamme PS4150 med identiske indstillinger. Betragte fluorescerende steder i individuelle KGB80 sporer som germinosome foci, når de er tydeligt adskiller sig fra baggrunden.
    2. Anvende en-vejs ANOVA-tests for betydning bestemmelse med software oprindelse 9.0. betragtning P værdier < 0,05 som statistisk signifikant. Bruge Spearmans rang korrelationskoefficienten18 til at vurdere sammenhængen af GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry foci tal og målinger af integrerede signal intensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den nuværende protokol præsenterer en SIM mikroskop imaging procedure for bakteriesporer. Sporedannelse og dias forberedelse procedurer blev gennemført som vist i figur 1 før billeddannelse. Senere, procedurerne, billedbehandling og analyse blev anvendt både for dim (fluorescerende proteiner mærket spiring proteiner) og lyse (lipofile sonde farves IM) spore prøver som vist i følgende tekst.

Lokalisering af germinosomes i B. subtilis sporer

Niveauer af GerD og GerKB er rapporteret at være ~ 3.500 og ~ 700 molekyler per spore, henholdsvis, baseret på vestlige skamplet analyser af uddrag af sporer tilberedt i en rig sporulering medium19. Både gerD-normal god landbrugspraksis og gerKB-mCherry gener i KGB80 stammen er under kontrol af deres indfødte promotor. Den relative lave overflod af fusion proteiner førte til et lavt fluorescerende signal under imaging, så det var vanskeligt at rekonstruere sådanne dim rå SIM-billeder af SIM genopbygning algoritme. SIM-mikroskop anvendtes dog stadig for germinosome image erhvervelse, selv om de rå SIM billeder blev omdannet til Pseudo-Widefield billeder af SIMcheck (ImageJ plugin). Derudover blev en syv stak 3D imaging implementeret for at få et bedre overblik over denne IM fokus. Som vist i det venstre panel i figur 2, optrådte to foci af GerD-normal god landbrugspraksis i forskellige stakke. Den, i alt tre GerD-normal god landbrugspraksis foci er angivet af de hvide pile i kolonnens compositive Z3 stak. Det højre panel i figur 2 viser en spore med kun én GerD-BNP omdrejningspunkt i spore som det fremgår af den hvide pilen i kolonnens sammensatte Z4 stak. I alt omkring 40% og 50% af sporerne havde to eller ét GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry klynge, henholdsvis (tabel 1). Blandt de 346 sporer undersøgt, to havde 4 GerD-normal god landbrugspraksis foci, og en spore havde selv 5 GerD-normal god landbrugspraksis foci. Mærkbart, i vores hænder var antallet af GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry foci i samme spore ikke altid den samme18. Som SIM mikroskopet havde ingen fase kontrast indstilling, brugte vi transmission lysmikroskopi til spore lokalisering. Således vises sporer med en mørk og tæt kerne omgivet af en lysere ring.

Integreret fluorescens-intensiteten af KGB80 sporer blev målt af ImageJ. Sporer, som havde 0, 4 eller 5 foci indgik ikke i vores statistiske analyse på grund af deres lave hyppighed. Der var en høj positiv korrelation mellem GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry integreret intensiteter (Spearman rang korrelationskoefficienten = 0,73). Mens den integrerede intensiteten af GerD-normal god landbrugspraksis stillads protein var anderledes mellem forskellige befolkningsgrupper (figur 3 c), var integreret intensiteten af GerKB-mCherry omtrent det samme i forskellige populationer (figur 3D). Maksimale fluorescens-intensiteten af GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry foci tendens til at falde, når spore havde flere foci (figur 3A, B). Den maksimale fluorescens af alle lyse pletter, betragtet som germinosome foci, var højere end den maksimale auto-fluorescens af PS4150 sporer (sporer fra baggrunden stamme KGB80; Figur 3A B).

Organisationen af den indre membran

Som nævnt i indledningen, er germinosome proteiner placeret i den spore IM. Dog er få detaljer kendt om de biofysiske egenskaber af dette stort set ubevægelige membran. At udforske flere detaljer, såsom IMS lokale organisation, ville fremme forståelsen af tilrettelæggelsen af IM proteiner, især GRs og kanal proteiner. B. subtilis sporerne har en struktur bestående af flere koncentriske lag, og en lipofile sonde kan ikke let passere gennem disse flere lag for at plette IM omkring spore kernen. Passage af sådanne sonder er sandsynligvis hæmmet af protein-rige frakke lag og måske også ydre membran20,21. For at løse dette problem, blev lipofile membran farvestof FM4-64 tilføjet til en PS4150 kultur under sporedannelse. Dermed PS4150 vegetative cellemembranen blev plettet af FM4-64, og dermed membraner i forespores indhentet fra denne kultur på den asymmetriske sporulering celledeling og efterfølgende forespore engulfment farves godt5. Derfor, den modne spore membraner kan visualiseres. En tidligere undersøgelse viste, at de fleste hvis ikke alle FM4-64 er i IM i renset sporer5. I en ca. 2 ugers periode af inkubation og spore rensning behandlinger fjerne vask procedurer anvendes enhver FM4-64 fra den ydre membran, den sidstnævnte effektivt bliver fjernet efter den decoating behandling og omfattende vaske trin 5. er imidlertid den decoating procedure fjerner ingen FM4-64 fra IM, eller har nogen effekt på germinosome foci5,6. Hvad begejstrede os er at lysere FM4-64 steder svarende til germinosome foci dukkede op i både intakt (figur 4A, B) og decoated sporer (figur 4 c, D) af PS4150 sporer. Disse lysere FM4-64 steder kan være involveret i klynger af germinosome proteiner i IM.

Figure 1
Figur 1: oversigt over sporulering og dias forberedelse. En oversigt viser de indledende skridt før billeddannelse. Detaljerede oplysninger findes i protokollen. (A) skematisk af proceduren sporulering i definerede minimal MOPS medium. En B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) eller KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat gerD-normal god landbrugspraksis kan) enkelt koloni var kulturperler i 5 mL af LB rig medium, og tilpasset i 5 mL og 20 mL af MOPPER medium igen, og endelig sporeform i 250 mL af MOPS medium. En tidlig eksponentiel fase kultur (OD600, 0,3-0,4) bruges i alle mellemliggende kulturer. FM4-64 (2 µg/mL) blev føjet til PS4150 sporulering medium for sporedannelse membran farvning 1 eller 2 timer efter at have nået peak OD600 værdi. (B) metoden til høst sporer fra MOPS sporulering kultur og rensende sporer af tæthed gradient centrifugering. (C) proceduren for at stabilisere sporer på 1% Agarosen pad i et gen ramme kammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative Pseudo-Widefield (PWF) 3D billeder af GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry foci i to KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat gerD-normal god landbrugspraksis kan) hvilende sporer 3D-SIM raw billeder blev taget med dual channel excitation (561nm, 30% laser power, 1 s og 488nm, 60% laser power, 3 s) ved hjælp af 7 trin fra top til bund Z-stakke. Efterfølgende, blev de rå SIM billeder omdannet til Pseudo-Widefield 3D billeder af ImageJ plugin SIMcheck. Fra venstre mod højre, 3D billeder (Z2-Z5) af GerD-normal god landbrugspraksis (grøn), er GerKB-mCherry (rød) og de tilsvarende sammensatte billeder af to KGB80 sporer (i og ii) vist i panelet. Transmission (Trans) lys billeder af to sporer (i og ii) angivet placeringen af sporer, der vises som mørke tætte billeder omgivet af en lysere ring. Skalalinjen = 1 µm og alle paneler er på samme forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Maksimale fluorescens-intensiteten af GerD-normal god landbrugspraksis i KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat gerD-normal god landbrugspraksis kan) hvilende sporer, og maksimal auto-fluorescens-intensiteten af PS4150 sporer i arbitrære enheder. Alle sporerne var oplyst af indstillingerne er angivet i protokollen. Paneler (A) og (B) Vis maksimale fluorescens-intensiteten af GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry foci, henholdsvis i KGB80 hvilende sporer såvel som i begge tilfælde maksimal auto-fluorescens-intensiteten af overordnede PS4150 sporer. Paneler (C) og (D) Vis integreret fluorescens-intensiteten af GerD-normal god landbrugspraksis foci og integreret fluorescens-intensiteten af GerKB-mCherry foci, henholdsvis i B. subtilis KGB80 hvilende sporer. Vi brugte en-vejs ANOVA-tests for betydning bestemmelse af forskelle i maksimal omdrejningspunkt intensitet og integreret spore fluorescens intensiteter med software oprindelse 9,0 overvejer P værdier < 0,05 som væsentlige. Sporer med 4 eller 5 foci blev udelukket fra analysen på grund af deres lave overflod. Data, der er repræsenteret i indskåret boxplots. Hak i parceller er omkring de mediane værdier observeret deres bredde er proportional med den interkvartil vifte (IQR). Whiskers vist repræsenterer maksimalt 1,5 IQR. Stjerner angiver en betydelig forskel på median værdier. GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry integreret fluorescens intensiteter har en stærk positiv sammenhæng (Spearman korrelationskoefficienten = 0,73)18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative Pseudo-Widefield (PWF) billeder (A og C) og rekonstruerede SIM-billeder (B og D) FM4-64 farves IM af B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) sporer. FM-464 blev indarbejdet i sporerne under sporedannelse. 3D-SIM raw billeder af intakt sporer (A og B) og decoated sporer (C og D) blev taget med én kanal excitation (561 nm laser, 20% laser power, 400 ms) ved hjælp af en 25 skridt fra top til bund Z-stakken. Efterfølgende, den rå SIM data blev rekonstrueret af mikroskopet imaging software (Se Tabel af materialer) i 3D-SIM billeder, eller omdannes til PWF af SIMcheck (ImageJ plugin). Cyan pilene peger på FM4-64 foci i IM i panelet B og D. Skalalinjen = 1 μm og alle paneler er på samme forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Stamme Sporer tælles Foci Foci per spore (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 346 GerD-normal god landbrugspraksis 2 46 40 11 1 0
GerKB-mCherry 2 53 40 5 0 0

Tabel 1: Tilstedeværelse af foci i KGB80 sporer. Nummeret germinosome foci per spore i en population af dobbelt mærket B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kat gerD-normal god landbrugspraksis kan) hvilende sporer. Fluorescens i sporer blev regnet som germinosome foci når fokus maksimal intensitet var højere end auto-fluorescens-intensiteten, som var den maksimale intensitet af PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) hvilende sporer ophidset af de samme belysning indstillinger som KGB80 sporer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen præsenteret indeholder en standard 3D-SIM procedure for analyse af FM4-64 farves B. subtilis sporer, der omfatter sporulering, dias forberedelse og imaging processer. Derudover protokollen beskriver en modificeret SIMcheck (ImageJ)-assisteret 3D imaging proces for SIM-mikroskopi af B. subtilis spore germinosomes mærket med fluorescerende journalister. Den sidstnævnte procedure tillod os at observere denne dim Underskabet med øget kontrast. Ved at koble to billeddiagnostiske procedurer, er det muligt at visualisere diskrete sub strukturer i den samme spore med samme SIM mikroskop, dermed forbedre vores grundlag for en mekanistisk forståelse af spiringsproces. Bemærk, at proceduren, der opererer med en lateral opløsning på ~ 100 nm og en aksial opløsning af ~ 200-250 nm. Dette er bedre end Differential interferens kontrast (DIC) wide-felt mikroskopi tilgang anvendes af Griffith7. Tiden løst analyse af germinosome udseende ved indledningen af spiring ville være en ønskede næste skridt. Desværre, selvom SIM-mikroskopi er i princippet kompatibel med live-imaging, på grund af germinosome dim signaler sådan tidsopløst SIM, analyser er ikke mulig på grund af hurtig blegning af prøverne under image erhvervelse. For at opnå tilstrækkelig sporer for analyse, er det afgørende at sikre, at sporulering effektivt finder sted. Forskere skal derfor tjekke sporulering effektivitet omhyggeligt med 90% effektivitet som mål. I de repræsentative resultater har i hvilende sporer, henholdsvis ~ 50% og 40% af alle sporerne én eller to GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry foci (tabel 1). Procentdelen af sporer med to foci er langt højere end rapporteret af Griffiths tidligere7. Der er flere grunde, der kunne forklare de forskellige resultatet i det aktuelle arbejde. Først, 3D imaging proces kunne lette påvisning af flere foci. Forskellige foci i samme spore er placeret forskellige steder i den lodrette retning som vist i figur 1. Andet, CCD kamera (Table of Materials) og laser enhed udstyret til SIM mikroskop bidrage væsentligt til de imaging resultater. Tredje, svarende til Griffithss tilgang7 til gennemsnitlige snesevis af på hinanden følgende billeder for bedre billedanalyse, Pseudo-Widefield billede af germinosome var også en gennemsnitlig billede fra raw SIM-billeder (5 faser og 3 retningslinjer billeder). Endelig er sporulering medium og sporulering betingelser, en vigtig variabel ved fastsættelsen af spore egenskaber, forskellige i vores arbejde fra der tidligere har brugt. Griffiths et al.7 anvendes rige 2 x Schaeffers-glucose (2 x SG) medium for sporulering, mens en defineret minimal MOPS bufferet medium var ansat her. Flere papirer har vist at sporulering medium og betingelser har væsentlig indvirkning på protein sammensætning, modstand, og spiring af B. subtilis sporer22,23,24 , 25. ja, det har vist sig at GR underenheder er 3 til 8 gange lavere i sporer fremstillet på en dårlig medium versus dem, der opnås på rich-medium. GerD niveauer var også omkring 3.5-fold lavere i fattige medium sporer, og disse sporer tog længere tid at begynde at spore spiring26. Det er imidlertid ikke klart, om sporulering betingelser også påvirke antallet af observerede germinosome foci.

Ramirez-Peralta mfl.' s resultater26 angivet, at satserne for næringsstof spiring af sporer på befolkning niveauer påvirkes væsentligt af niveauer af spiring proteiner og GerD. Hvis de integrerede fluorescerende intensiteter pr. spore fra de fluorescerende reportere er direkte proportional med niveauer af GerD og GerKB fusion proteiner, niveauer af både fusion proteiner er meget forskellige i KGB80 sporer, som er i overensstemmelse med tidligere arbejde 7. dette protein niveau heterogenitet kan være relateret til spore spiring heterogenitet observeret på niveauet enkelt sporedannelse og germinosome foci antallet kan være en anden faktor, der bidrager til at spore spiring heterogenitet. Yderligere eksperimenter vil fokusere på en analyse af den mulige virkning at germinosome foci antallet og foci spiring protein sammensætning (ikke alle germinosomes kan være lig i spiring protein sammensætning) kunne have på spiring heterogenitet. Dataene, der gav anledning til en række aktuelle forskningsspørgsmål herunder: Jeg) Hvad er rollen som GerD i klynger af GRs i IM; og ii) Hvordan er to andre GRs, GerA og GerB, organiseret i spore IM?

Protokollen præsenteret for svagt og lyse sporedannelse proever gør det muligt at visualisere diskrete sub strukturer i den samme spore af SIM-mikroskopi. FM4-64 lyspunkter, der blev observeret i sporer kan skyldes omfattende foldning af IM27. Alternativt, vi hypotesen om, at disse regioner er områder af IM hvor farvestoffet lettere kunne få adgang til på grund af øget lokal IM mere flydende. Sådanne regioner af øget viskositeten (RIFs) kan være organiseret efter cytoskeletal actin homolog PRT, kendt for sin koncentration af flydende kort acyl kæde lipider28,29. Mærkbart, gælder den samme procedure for wild-type B. subtilis sporer også fører til et lignende mønster af lyse FM4-64 steder (vores upublicerede observationer). I B. subtilis vegetative celler, resulterer en skjult membran potentiale i klynger i PRT og RIFs29. Den indre membran af hvilende sporer sandsynligvis har en relativ lav membran potentielle20,21 og indeholder påviselige mængder af PRT30 , hvilket kan føre til klynger af RIFs i større domæner af høje flydende29 . Om disse domæner kan falde sammen med tilstedeværelsen af germinosomes er i øjeblikket under efterforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forfatterne takke Christiaan Zeelenberg for hans hjælp under SIM-billeddannelse. JW erkender at Kina stipendium Rådet for et ph.d.-stipendium og tak Irene Stellingwerf for hendes hjælp i den primære fase af billedbehandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
  3. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
  4. Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
  5. Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
  6. Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
  7. Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
  8. Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
  9. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
  10. Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
  11. Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
  12. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
  13. Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
  14. Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
  15. Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
  16. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
  17. Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  18. Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
  19. Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
  20. Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
  21. Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
  22. Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
  23. Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
  24. Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
  25. Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
  26. Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
  27. Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
  28. Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
  29. Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
  30. Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 146 Gram-Positive bakterier Bacillales mikroskopi mikrobiologi organismer bakterier analytisk diagnostiske og terapeutiske teknikker og udstyr efterforskningsteknikker Life sciences Life Sciences (generelt) Bacillus Sporer spiring proteiner Germinosomes Spore indre membran super opløsning mikroskopi Fluorescens mikroskopi
Visualisering af Germinosomes og den indre membran i <em>Bacillus subtilis</em> sporer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M.… More

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M. M., Setlow, P., Brul, S. Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (146), e59388, doi:10.3791/59388 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter